CN107384932B - 抗人cd20人源化单克隆抗体mil62、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗人CD20人源化单克隆抗体，以及编码所述抗人CD20人源化单克隆抗体的核酸分子。本发明还涉及所述抗人CD20人源化单克隆抗体的制备方法，所述核酸分子用于制备所述人源化单克隆抗体的用途，以及所述人源化单克隆抗体用于制备抗肿瘤、自身免疫疾病及炎症的药物的用途。与现有的抗人CD20人源化单克隆抗体Rituximab和GA101相比，本发明的抗人CD20人源化单克隆抗体具有增强的ADCC活性。

Description

抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62及编码所述人源化单克隆抗体的核酸分子。本发明还涉及所述人源化单克隆抗体的制备方法，和所述核酸分子用于制备所述抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62的用途，以及所述人源化单克隆抗体用于制备抗肿瘤、自身免疫疾病及炎症的药物的用途。

背景技术

白细胞分化抗原(CD)是指血细胞在分化、成熟过程中的细胞表面标记。CD20表达于除浆细胞(分泌免疫球蛋白的B细胞)外的发育分化各阶段的B细胞的表面，可能通过调节跨膜钙离子流动直接对B细胞起作用，在B细胞增殖和分化中起重要的调节作用。CD20抗原是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95％以上的B细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。

正是由于CD20的重要性，罗氏公司成功研发的以CD20为抗原目标的单抗药物Rituximab(利妥昔单抗，商品名Rituxan，Mabthera)是FDA批准的第一个治疗淋巴癌的嵌合单抗药物，自1997年在美国获准上市以来一直位列全球畅销药前列，该药物用于治疗类风湿性关节炎和B细胞型非霍奇金淋巴瘤。

本发明的目的是通过密码子优化和基因敲除技术获得编码抗人CD20人源化单克隆抗体的核酸分子及该抗体，以期通过去除岩藻糖糖基化增强抗体的ADCC(抗体依赖的细胞毒性)活性和降低CDC(补体依赖的细胞毒性)活性。

发明内容

本发明通过密码子优化和基因敲除技术获得编码抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62的核酸分子，通过基因构建、分子克隆、转染细胞、细胞株筛选、发酵培养、分离纯化等手段获得岩藻糖完全敲除的重组抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62，进一步通过分析鉴定及活性检测确定该抗体更高的ADCC(抗体依赖的细胞毒性)活性和降低的CDC(补体依赖的细胞毒性)活性。具体地，本发明包括以下几个方面：

本发明第一方面涉及编码抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62的核酸分子，抗体MIL62的轻链核苷酸序列为：

gatatcgtgatgacccagactccactctccctgcccgtcacccctggagagcccgccagcattagctg caggtctagcaagagcctcttgcacagcaatggcatcacttatttgtattggtacctgcaaaagccagggcagtct ccacagctcctgatttatcaaatgtccaaccttgtctctggcgtccctgaccggttctccggatccgggtcaggca ctgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggagtttattactgcgctcagaatctagaact tccttacaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID NO：1)，其中带有下划线的序列为可变区序列；

抗体MIL62的重链核苷酸序列为：

caggtgcaattggtgcagtctggcgctgaagttaagaagcctgggagttcagtgaaggtctcctgcaa ggcttccggatacgccttcagctattcttggatcaattgggtgcggcaggcgcctggacaagggctcgagtggatg ggacggatctttcccggcgatggggatactgactacaatgggaaattcaagggcagagtcacaattaccgccgaca aatccactagcacagcctatatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagaaa tgtctttgatggttactggcttgtttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgactgtgccctctagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO：2)，其中带有下划线的序列为可变区序列。

抗体MIL62的轻链氨基酸序列为：

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：3)；

抗体MIL62的重链氨基酸序列为：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：4)，其中带有下划线的序列为可变区序列。

本发明第二方面涉及重组载体，其含有本发明第一方面任一项的核酸分子。

在本发明中，所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述载体含有本发明第一方面任一项所述的核酸分子，所述载体可以通过例如将上述核酸分子插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。

在本发明中，所述表达载体例如为原核表达载体，真核表达载体，噬菌体载体或病毒载体。其中所述原核表达载体例如为PET载体、PGEX载体，所述真核表达载体例如为pcDNA3.1、pEGFP-C1、pPIC9K，所述噬菌体载体例如为λ噬菌体载体λgt、λgt-λB，所述病毒载体例如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。

在本发明的实施方案中，所述载体为真核表达载体pTGS-FRT-DHFR。

在本发明的实施方案中，将真核表达载体pTGS-FRT-DHFR做了进一步改造。在本发明的实施方案中，所述改造方法为去除潮霉素选择标签，并加入谷氨酰胺合成酶表达盒子。在本发明的具体实施方案中，所述表达载体为载体GS。

在本发明中，在所述真核表达载体pTGS-FRT-DHFR或载体GS中连接SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列后，即得到重组载体。

本发明第三方面涉及重组细胞，其含有本发明第二方面任一项的重组载体。

根据本发明第三方面任一项的重组细胞，其为哺乳动物细胞。在本发明的实施方案中，所述哺乳动物细胞为适合表达人源化抗体的细胞，例如来源于人、鼠或猴的哺乳动物细胞。在本发明的实施方案中，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。

在本发明的实施方案中，所述哺乳动物细胞为岩藻糖基因敲除的细胞，例如为岩藻糖基因敲除的CHO-K1细胞。在本发明的具体实施方案中，所述岩藻糖基因敲除CHO-K1细胞是通过敲除CHO-K1细胞中岩藻糖修饰途径的关键蛋白GFT基因获得的。

在本发明的具体实施方案中，所述岩藻糖基因敲除的CHO-K1细胞是经过目标培养基驯化后的细胞。

在本发明的实施方案中，所述目标培养基是指无血清、化学成分确定的动物细胞培养基。

在本发明的实施方案中，所述目标培养基中含有Pluronic F-68、葡萄糖、培养基干粉Maxgrow 202、碳酸氢钠、氯化钠和HEPES；

在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基的成分为Pluronic F-681.0g/L、葡萄糖8.8g/L、培养基干粉Maxgrow 202 7.44g/L、碳酸氢钠1.98g/L、氯化钠3.47g/L和1MHEPES 15ml/L，并调节pH至7.0±0.1。在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基用于细胞驯化和种子培养。在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基为表1-1的种子培养基。

在本发明的实施方案中，所述驯化培养的方法为本领域所公知，例如先将细胞在含有10％小牛血清的目标培养基中贴壁培养，按照50％的比例逐级去除血清，例如小牛血清浓度从10％逐级降至5％、2.5％、1.25％、直至完全不含血清，然后继续传代数次，至宿主细胞完全悬浮，成倍增长稳定，最终获得能够在目标培养基中生长的稳定宿主细胞。

本发明的第四方面涉及抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62，其由本发明第一方面任一项的核酸分子、第二方面任一项的重组载体、或者第三方面任一项的重组细胞制备得到。

在本发明的实施方案中，所述抗CD20人源化单克隆抗体MIL62几乎或完全不具有岩藻糖糖基化修饰。

在本发明的实施方案中，所述抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62具有增强的ADCC活性。

在本发明的实施方案中，所述抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62的ADCC活性强于利妥昔单抗和GA101单抗。

本发明的第五方面涉及本发明第四方面任一项的抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62的制备方法，其包括利用本发明第一方面任一项的核酸分子、第二方面任一项的重组载体、或者第三方面任一项的重组细胞制备该抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62的步骤。

根据本发明第五方面任一项的制备方法，其具体包括以下步骤：

1)将本发明第一方面的核酸分子的核苷酸序列克隆入表达载体中，得到重组表达载体，优选地，所述重组表达载体是在载体pTGS-FRT-DHFR的基础上改造获得，优选地，所述改造是指去除潮霉素选择标签，并加入谷氨酰胺合成酶表达盒子；

2)将重组表达载体转入宿主细胞，例如岩藻糖基因敲除的CHO-K1细胞中，得到重组宿主细胞CHOK1-AF，优选地，所述宿主细胞是经过目标培养基驯化后的岩藻糖基因敲除的CHO-K1细胞；

3)将步骤2)获得的重组宿主细胞在目标培养基中进行培养，获得能够高效表达抗体的单克隆细胞株；

4)逐步放大培养步骤3)获得的单克隆细胞株，收获培养上清；

5)将步骤4)获得的培养上清进行纯化，获得本发明第四方面任一项的抗CD20人源化单克隆抗体MIL62。

在本发明的实施方案中，所述重组表达载体是GS载体。

在本发明的实施方案中，所述目标培养基是指无血清、化学成分确定的动物细胞培养基。

在本发明的实施方案中，所述目标培养基中含有Pluronic F-68、葡萄糖、培养基干粉Maxgrow 202、碳酸氢钠、氯化钠和HEPES；

在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基的成分为Pluronic F-681.0g/L、葡萄糖8.8g/L、培养基干粉Maxgrow 202 7.44g/L、碳酸氢钠1.898g/L、氯化钠3.47g/L和1MHEPES 15ml/L，并调节pH至7.0±0.1。在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基用于细胞驯化和种子培养。在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基为表1-1的种子培养基。

在本发明的实施方案中，所述驯化培养的方法为本领域所公知，例如先将细胞在含有10％小牛血清的目标培养基中贴壁培养，按照50％的比例逐级去除血清，例如小牛血清浓度从10％逐级降至5％、2.5％、1.25％、直至完全不含血清，然后继续传代数次，至宿主细胞完全悬浮，成倍增长稳定，最终获得能够在目标培养基中生长的稳定宿主细胞。

在本发明的实施方案中，步骤3)的具体方法为：将步骤2)获得的重组宿主细胞在目标培养基中进行培养，向培养基中加入适当浓度的MSX(例如50μM MSX)，在培养箱中培养一段时间，挑选出可以在此培养基中存活并表达抗体的细胞，然后进行亚克隆筛选，获得能够高效表达抗体的单克隆细胞株。

在本发明的实施方案中，步骤4)的具体方法为：将能够高效表达抗体的单克隆细胞株经过目标培养基多步扩大培养，培养基为生产培养基：种子培养基为1：1，培养周期为12-14天，培养第3、6、9天加入10％体积的流加培养基，培养结束后收获上清。

在本发明的具体实施方案中，所述种子培养基即为目标培养基。

在本发明的实施方案中，所述生产培养基中含有氢氧化钠、培养基干粉Maxpro302、维生素B12、硫酸亚铁、磷酸二氢钠一水合物、葡萄糖、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、Pluronic F-68、氯化钠、HCl、碳酸氢钠和HEPES。

在本发明的具体实施方案中，所述生产培养基中含有氢氧化钠0.8g/L、培养基干粉Maxpro 302 11.5g/L、1g/L维生素B12贮存液(1-2)ml/L、10g/L硫酸亚铁贮存液(0.4-0.6)ml/L、磷酸二氢钠一水合物0.35g/L、葡萄糖8.8g/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物(0.3-0.375)g/L、Pluronic F-68 1g/L、氯化钠1.55g/L、5M HCl 5.6ml/L、碳酸氢钠1.22g/L和1MHEPES7.5ml/L，并调节pH至7.0±0.1。在本发明的具体实施方案中，所述生产培养基用于抗体生产。在本发明的具体实施方案中，所述生产培养基为表1-2的生产培养基。

在本发明的实施方案中，所述流加培养基中含有氢氧化钠、无水磷酸氢二钠、流加培养基干粉Maxfeed 402、L-酪氨酸二钠盐二水物、L-半胱氨酸盐酸盐一水物、天冬酰胺、葡萄糖、维生素B12、硫酸亚铁、Pluronic F-68、氯化钠、HCl、碳酸氢钠。

在本发明的具体实施方案中，所述流加培养基中含有5M氢氧化钠7.325mL、无水磷酸氢二钠3.09g/L、流加培养基干粉Maxfeed 40239.03g/L、50g/L L-酪氨酸二钠盐二水物23.8mL、50g/L L-半胱氨酸盐酸盐一水物23.2mL、葡萄糖50g/L、1.75g/L维生素B12贮存液0.3ml/L、5g/L七水硫酸亚铁贮存液0.3ml/L、Pluronic F-68 0.3g/L、氯化钠0.24g/L和碳酸氢钠0.366g/L。在本发明的具体实施方案中，所述流加培养基用于流加培养。在本发明的具体实施方案中，所述流加培养基为表1-3的流加培养基。

在本发明的实施方案中，所述步骤5)的纯化依次包括亲和层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析。

在本发明的具体实施方案中，所述步骤5)的纯化步骤具体包括：首先收集过蛋白A亲和层析柱pH在3.4-3.6范围(用280nm进行监测)的洗脱液，调pH值至7～9，上样到阴离子交换层析柱，280nm进行监控和收集样品，将收集液pH值调节至5～7，上样到阳离子交换层析柱，收集样品，超滤浓缩后获得抗CD20人源化单克隆抗体。

在本发明的实施方案中，所述蛋白A亲和层析柱选自Mabselect SuRe、ProSepUltra Plus、ProSep vA Ultra、MabCapture A或具有类似功能的蛋白A亲和层析介质。

在本发明的实施方案中，所述阴离子交换层析柱选自Q Sepharose FF、FractogelTMAE、Poros HQ、Captol Q或具有类似功能的阴离子交换层析介质。

在本发明的实施方案中，所述阳离子交换层析柱选自Poros HS、Poros XS、SPSepharose FF、Fractogel SO₃ ^-、Fractogel SH Hicap或具有类似功能的阳离子交换层析介质。

本发明第六方面涉及组合物，其含有本发明第四方面任一项的抗人CD20人源化单克隆抗体，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明还涉及本发明第一方面任一项的核酸分子、第二方面任一项的重组载体、或者第三方面任一项的重组细胞在制备抗人CD20人源化单克隆抗体中的用途。

在本发明的实施方案中，其中所述抗人CD20人源化单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还涉及本发明第四方面任一项的抗CD20人源化单克隆抗体在制备预防或治疗肿瘤、自身免疫疾病及炎症等的药物中的用途。

在本发明中，所述肿瘤例如为B细胞型非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病。

在本发明中，所述自身免疫疾病例如为自身免疫溶血性贫血或原发性血小板减少性紫癜。

在本发明中，所述炎症疾病例如为类风湿性关节炎或多发性硬化症等。

在本发明中，所述ADCC活性是指表达IgG Fc受体的NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等效应细胞，通过与已结合在病毒感染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀伤这些靶细胞的作用。

在本发明中，所述对细胞的驯化培养是指使细胞能够在新培养基中生长繁殖的过程。

在本发明中，如未特别指明，则百分比(％)是指重量百分比。

发明的有益效果

本发明获得了岩藻糖几乎或完全敲除的抗人CD20人源化单克隆抗体，由于其具有更高的ADCC活性，更有利于保证抗体的质量和活性。

附图说明

图1：PCR扩增MIL62/VH、MIL62/Vκ基因片段的琼脂糖电泳结果；其中泳道D为分子量Marker DL2000，泳道1为MIL62/VH的PCR产物，泳道2为MIL62/Vκ的PCR产物。

图2岩藻糖敲除宿主细胞CHOK1-AF构建技术路线图。

图3流式细胞术检测细胞表面岩藻糖的表达水平。和之后细胞表面岩藻糖的表达水平。图3A为岩藻糖敲除之前(宿主细胞CHO-K1)；图3B为岩藻糖敲除之后(1G7细胞)。

图4：宿主细胞驯化培养流程图。

图5：宿主细胞CHO-K1无血清悬浮驯化过程中细胞生长曲线图。

图6：MIL62抗体的制备、纯化流程图。

图7：MIL62抗体的IEC色谱图。

图8：MIL62抗体的SEC色谱图。

图9：MIL62抗体的CE-SDS色谱图。

图10：质谱分析MIL62抗体的糖型结果图。

图11：质谱分析MIL62抗体的完整蛋白结果图，其中图11A是完整蛋白分子量；图11B是完整蛋白的糖型分布。

图12：MIL62、利妥昔单抗、TGLA抗体的ADCC活性对比图。

图13：MIL62、Rituximab和GA101的FcγRIIIa(158V)结合活性曲线；其中图13A中靠上方的曲线样品为MIL62，图13B中靠上方的曲线样品为MIL62。

图14：MIL62、GA101和Rituximab对Daudi细胞的直接杀伤活性；其中每个柱形图中从左往右依次为GA101、MIL62、Rituximab。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：抗体MIL62核苷酸序列的设计

抗体MIL62的轻链核苷酸序列为：

gatatcgtgatgacccagactccactctccctgcccgtcacccctggagagcccgccagcattagctg caggtctagcaagagcctcttgcacagcaatggcatcacttatttgtattggtacctgcaaaagccagggcagtct ccacagctcctgatttatcaaatgtccaaccttgtctctggcgtccctgaccggttctccggatccgggtcaggca ctgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggagtttattactgcgctcagaatctagaact tccttacaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID NO：1)，其中带有下划线的序列为可变区序列；

抗体MIL62的重链核苷酸序列为：

caggtgcaattggtgcagtctggcgctgaagttaagaagcctgggagttcagtgaaggtctcctgcaa ggcttccggatacgccttcagctattcttggatcaattgggtgcggcaggcgcctggacaagggctcgagtggatg ggacggatctttcccggcgatggggatactgactacaatgggaaattcaagggcagagtcacaattaccgccgaca aatccactagcacagcctatatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagaaa tgtctttgatggttactggcttgtttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgactgtgccctctagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO：2)，其中带有下划线的序列为可变区序列。

抗体MIL62的轻链氨基酸序列为：

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：3)；

抗体MIL62的重链氨基酸序列为：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：4)。

实施例2：抗体MIL62基因的克隆

实验材料：

Phusion聚合酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、pGEM-T-easy载体、Pyrobest DNApolymerase均为NEB公司产品；

dNTP、DNA Marker标准为TaKaRa产品；

DNA回收试剂盒为Qiagen公司产品；

Trans2-Blue感受态为全式金公司产品；

小提中量质粒试剂盒(DP107-02)为天根生化公司产品；

大提质粒试剂盒(DP117)为天根生化公司产品；

OPD为Sigma公司产品；

FITC标记的羊抗人抗体：为Pierce公司产品；

引物设计为Biosun软件；

引物合成(Genewiz)，金唯智生物科技(北京)有限公司；

基因测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

实验方法和结果：

通过PCR的方法合成抗体的轻重链可变区基因，即为MIL62抗体的轻重链可变区基因。测序正确的克隆，装配表达质粒。使用PCR技术全合成MIL62/VH、MIL62/Vκ基因片段，并引入合适的酶切位点，在抗体轻链可变区基因5，和3，端引入ClaI和BsiwI位点，在抗体重链可变区基因5，和3，端引入EcoR I和Nhe I位点。

2.1引物设计

根据基因全合成的原理，利用计算机辅助设计软件，设计引物，考虑引物的二级结构、GC含量等相关参数。每条基因设计10条引物，分别编号为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10，用于基因全合成。

2.2全基因合成

1)引物合成后以无菌水稀释，方法如下：

a)取引物管12000rpm离心2min，引物按100μM的浓度稀释，-20℃保存；

b)取少量引物P2～P9混合成终浓度为10μM作为使用液；

c)取少量引物P1和P10混合稀释成终浓度为10μM作为使用液P1/P10；

2)基因全合成，采用Pyrobest DNA polymerase，方法如下：

a)取1μL P2～P9混合引物作为模版，配制如下Overlap PCR体系：

无菌水补足总体积为50μL

b)将以上PCR体系进行如下反应：

反应结束后，降到室温。

加入引物P1/P10，进行如下PCR反应：

反应结束后，降至室温。

c)1～2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，抗体重链基因回收440bp大小片段，轻链基因回收400bp大小片段。

d)回收加尾(Pyrobest DNA polymerase不能在PCR产物3’端加尾A，所以不能直接连接T载体)，作如下10μL体系：

反应条件如下：72℃20mins，反应结束后，降到室温。

e)取加尾产物，连接pGEM-TEasy载体：

室温连接2h或者4℃连接过夜，连接产物转化JM109大肠杆菌，涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒(博大泰克公司)提取质粒，获得的质粒进行核酸测序鉴定。

在上述步骤中，Overlap PCR扩增后经过琼脂糖凝胶电泳分析，获得特异大小的目的条带(图1)；产物经过回收、加尾、克隆等分子生物学技术，成功克隆入pGEM-TEasy载体；经过测序鉴定，合成的基因与目的序列一致。

琼脂糖电泳结果：VH约为440bp目的基因片段，Vκ约为410bp目的片断，分别命名为MIL62/VH和MIL62/Vκ。

实施例3：MIL62抗体的制备

实验材料

委托Hyclone加工的干粉培养基，经配制后用于宿主细胞的驯化、细胞株筛选以及抗体制备过程中培养细胞，细胞筛选时向配置的培养基中加入从Sigma购买的蛋氨酸砜亚胺(Methionine sulfoximine，MSX)，用从sigma购买的台盼蓝干粉自己配制成溶液后用于进行细胞计数。

方法和结果

3.1抗体真核表达载体的构建

选择本申请人获得的表达载体pTGS-FRT-DHFR(专利授权号：ZL200510064335.0)，去除潮霉素选择标签，通过PshA1和Xho1酶切位点加入GS(glutamine synthetase,谷氨酰胺合成酶)表达盒子，作为筛选标记；其中GS cDNA从表达GS的细胞系CHO中通过RT-PCR获得。经过改造后的载体命名为GS载体。将获得MIL41抗体轻重链可变区基因克隆载体用相应的内切酶消化(轻链可变区基因用ClaI和BsiwI消化，重链可变区基因用EcoR I和Nhe I消化)后，与经相同内切酶消化的载体连接。经过转化等分子生物学常用技术，构建获得真核表达载体。具体实施如下：

a)在实施例2中，将MIL62轻重链可变区基因构建到pGEM-TEasy载体中，获得的载体分别命名为MIL62/Vκ和MIL62/VH；

b)取MIL62/Vκ用ClaI和BsiwI消化，得到MIL62轻链可变区基因；

c)取1μg GS载体，用ClaI和BsiwI消化。用T4 DNA连接酶连接所得的经ClaI和BsiwI消化的GS载体和用ClaI和BsiwI消化的抗体MIL62轻链可变区基因。连接产物转化XLI-blue大肠杆菌，涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒(天根生化公司)提取质粒。所提取的质粒经ClaI和BsiwI消化后，用1％琼脂糖凝胶电泳分析，选择一个携带有抗体MIL62轻链可变区基因的克隆。获得的携带抗体MIL62轻链可变区基因的质粒命名为pTGS-MIL62Vκ。

d)取MIL62/VH用EcoR I和Nhe I消化，得到MIL62重链可变区基因；

e)取1μg pTGS-MIL62Vκ载体，用EcoR I和Nhe I消化。用T4DNA连接酶连接所得的经EcoR I和Nhe I消化的pTGS-MIL62Vκ载体和用MIL62/VH载体消化的抗体MIL62重链可变区基因。连接产物转化XLI-blue大肠杆菌，涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒(天根生化公司)提取质粒。所提取的质粒经EcoR I和Nhe I消化后，用1％琼脂糖凝胶电泳分析，选择一个携带有抗体MIL62重链可变区基因的克隆。

在pTGS-MIL62Vκ基础上获得的携带抗体MIL62重链可变区基因的质粒命名为MIL62。

3.2宿主细胞岩藻糖敲除及悬浮驯化

将从ATCC购买的CHO-K1细胞进行GFT基因的敲除使其自身表达的蛋白几乎或完全不具有岩藻糖基化修饰，获得的岩藻糖敲除宿主细胞命名为CHOK1-AF，具体方法是通过基因工程技术改造表达系统，定点敲除抗体表达宿主细胞CHO-K1中岩藻糖修饰途径的关键蛋白GFT，从而有效降低抗体岩藻糖修饰水平。该方法可以同时阻断岩藻糖基化经典途径及补偿途径，从而达到完全去除岩藻糖基化的目的。具体技术路线如图2所示，利用锌指酶技术，针对GFT基因SLC35c1的序列(编号GenBank:BAE16173.1)优化设计了两个GFT zinc-fingernuclease锌指酶序列G1F1、G2F2，用以分别结合目的基因的双链DNA。构建相应的表达载体质粒pCDNA3.1-G1F1、pCDNA3.1-G2F2，并将两个质粒共转染CHO-K1细胞。利用糖结合凝集素LCA(Lens culinaris agglutinin)对蛋白岩藻糖基的特异性亲和力，将共转染后的细胞使用biotin-LCA染色、结合anti-biotin microBeads和MACs LD柱进行负性分选，进一步克隆化培养，利用流式技术分析细胞克隆岩藻糖敲除水平；经多轮负性筛选、克隆化培养，获得了不含岩藻糖修饰的克隆1G7。流式细胞术结果显示，与原宿主细胞CHO-K1相比，1G7细胞表面岩藻糖的表达显著下降(图3A和图3B)。提取1G7细胞总RNA，反转录后调取GDP转运蛋白编码基因，经测序确认该基因突变成功，不能正常表达。将获得的细胞克隆命名为CHOK1-AF。

进一步按图4所示流程进行驯化培养，将宿主细胞CHOK1-AF在种子培养基(参见表1－1)(含10％小牛血清)中进行贴壁培养，逐级去除血清(10％-->5％-->2.5％-->1.25％-->完全不含血清)，转置摇瓶培养，继续传代数次后，宿主细胞完全悬浮，成倍增长稳定，最终获得能够在种子培养基中生长的稳定宿主细胞。宿主细胞驯化过程中细胞生长的结果如图5所示。

3.3特有培养基的制备

按照表1-1、1-2、1-3成分进行培养基的配制。经0.22μm膜无菌过滤后，供细胞培养使用。

表1-1：种子培养基

表1-2：生产培养基

表1-3：流加培养基

3.4MIL62抗体的制备

使用电转染方法将步骤3.2获得的MIL62抗体真核表达载体转入目的宿主细胞(实施例3步骤3.2筛选获得的宿主细胞)中，向种子培养基中加入75μM MSX，在37℃CO₂培养箱中培养2～4周，挑选出可以在此培养基中存活的细胞，通过ELISA法检测获得能够表达抗体的细胞。经过有限稀释法进行亚克隆筛选，经过6～8周的培养及筛选，获得能够高效表达MIL62抗体的单克隆细胞株。

细胞株经过培养基多步的扩大培养，接种密度为0.5×10⁶cells/ml，每三天传代一次，扩充至足够细胞量后转移至发酵培养基(培养基为生产培养基：种子培养基(1：1))，在发酵培养基中的培养周期为12-14天，培养第3、6、9天加入10％体积的流加培养基，培养结束后收获上清，将上清进行纯化。

采用AKTA(GE公司)进行MIL62抗体的分离纯化。首先收集过蛋白A亲和层析柱(MabSelect SuRe)pH在3.4-3.6范围(用280nm进行监测)的洗脱液，调pH值至8.0，上样到阴离子交换层析柱(Q-Sepharose FF)，280nm进行监控和收集样品。将收集液pH值调节至5.5，上样到阳离子交换层析柱(Poros)收集样品。超滤浓缩后获得MIL62抗体。具体流程如图6所示。

按照上述方法制备得到抗体MIL62用于以下各实施例。

实施例4：MIL62抗体的分析以及活性鉴定

实验材料

用从Thermo购买的离子交换色谱柱(型号：Propac WCX-10,4.0mm×250mm，生产商：戴安公司)进行离子交换色谱(简称IEC)分析，从sigma购买的HEPES、以及从国药集团购买的NaCl配置IEC流动相，上海雅心生物技术有限公司购买的羧肽酶(CpB)进行样品处理

用从TOSOH购买的凝胶色谱柱(型号：TSK-GEL SW3000,7.8mm×300mm,生产商：TOSOH)进行尺寸排阻色谱(简称SEC)分析，从国药集团购买的磷酸钾以及氯化钾配置SEC流动相。

4.1MIL62抗体的分析

4.1.1MIL62抗体的电荷变量(IEC)分析

实验方法：

流动相：流动相A:20mM HEPES，PH7.5±0.05；流动相B:20mM HEPES，150mM氯化钠PH7.5±0.05。

样品制备：用流动相A将样品稀释为1mg/ml，按照1％w/w的比例加入1mg/ml CpB(如：加10μl 1mg/ml CpB到1000μl浓度为1mg/ml的样品中)，于37±2℃孵育30±2min。

色谱条件：进样器温度6℃，进样量：25μl，流速0.8ml/min，信号280nm，柱温30℃。流动相梯度：0-8min流动相B保持0％，8-23min流动相B升为30％，23-25min流动相B升为100％，25-30min流动相B保持100％，30-35min流动相B降为0％，35-45min流动相B保持0％，运行时间45min。

实验结果：

MIL62抗体的IEC图谱，结果如图7所示。

4.1.2MIL62抗体的体积排阻色谱(SEC)

实验方法：

流动相：0.2moL/L磷酸钾缓冲液、0.25moL/L的氯化钾，pH6.2±0.1

样品制备：MIL62待测样品用流动相稀释至2mg/mL

色谱条件：进样器温度6℃，进样量：25μl，流速0.5ml/min，信号280nm，柱温30℃，等度运行30min。

实验结果：

MIL62抗体的SEC图谱，结果如图8所示。

4.1.3MIL62抗体毛细管电泳检测(CE-SDS)

样品制备

1、1M碘乙酰胺溶液：称取920mg碘乙酰胺粉末溶于5ml水中，震荡混匀，分装，-80℃保存，备用。

2、按照下表制备进样溶液

试剂	体积
		样品缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 9.0,1％SDS)	50μl
碘乙酰胺(1M)	1.5μl
		25mg/ml样品溶液	4μl
H<sub>2</sub>O	44.5μl

将上述溶液混匀，在70℃水浴10min，冷却至室温，在12000g条件下，离心1分钟，量取80μl上层清液并加入内插管中，将内插管放入样品瓶中待测。

实验过程：

毛细管电泳仪购自Beckman，型号PA800+，数据处理软件：32Karat V9.1build 10。

检测条件：卡盒温度：25℃；样品存放温度：8℃；检测器：PDA检测器；检测波长：220nm；进样电压：5.0kv；进样时间：20.0sec；分离电压：15.0kv；分离时间：40.0min。

实验结果：

MIL62抗体的CE-SDS检测的主峰比例为95.9％，如图9所示。

4.1.4MIL62抗体的糖型分析和完整蛋白分析

4.1.4.1抗体糖型分析

实验方法：

取MIL62抗体500μg，10kD超滤管除盐，加入10μL G7酶切缓冲液、3μL PNGase F、补加超纯水至100μL，混匀后用封口膜包上，置于37℃水浴锅内温浴过夜。将酶切好的样品加入300μL预冷乙醇，混匀后静置30min，12000rpm离心5min，取上清真空浓缩干燥。DMSO和乙酸按照350μL:150μL比例混匀，取5mg 2-AB、6mg Sodium Cyanoborohydride溶于100μL的DMSO和乙酸混合液中，取混合液10μL，65℃烘箱中，生3小时，之后，加入80％的乙腈和水混合液200μL，离心2mins，取上清。

HILIC-UPLC分析：

柱子：WATERS Acquity UPLC BEH Amide 1.7μm,2.1*50mm Column；

柱温：40℃；

激发波长：λex＝330nm；λem＝420nm；

进样量：10μL；

以20％流动相A(100mM甲酸铵pH4.5)、80％流动相B(100％乙腈)平衡色谱柱，进样后，在36min将A相的比例增至40％。

实验结果：

根据不同糖型的出峰位置和标准的参照谱图确定抗体MIL62的糖型比例如下表所示。与GA101的糖型对比结果图如图10所示。

MIL62的糖型比例

糖型	G0-GN	G0	G0F	Man5	G1	G1'	G2	其它
									比例	2.03	74.84	0.43	1.06	11.77	7.24	1.33	1.3

4.1.4.2完整蛋白分析

实验方法：

脱糖MIL62样品：MIL62抗体500μg，10kD超滤管除盐，加入10μL G7酶切缓冲液、3μLPNGase F、补加超纯水至100μL，混匀后用封口膜包上，置于37℃水浴锅内温浴过夜；

液质联用分析：将MIL62或脱糖样品稀释至2.5mg/ml，利用PLRP-S色谱柱脱盐：由95％的流动相A(0.1％FA水)，5％流动相B(0.1％FA乙腈)在10min梯度至95％的流动相B，并维持10min；反向色谱柱脱盐后，TripleTOF 4600(AB Sciex)质谱分析，数据由AnalystTF1.6去卷积分析。

实验结果：脱糖后和未脱糖的完整蛋白的图谱如图11A和11B所示。

4.1.5MIL62抗体活性分析

4.1.5.1ADCC活性分析

实验方法：

效应细胞的获得与制备：正常人的外周血用生理盐水稀释后(外周血生理盐水＝1:2)，加入到含有3ml Ficoll液的10ml试管中，2000rpm离心30分钟，取中间单核细胞层，生理盐水洗涤，1400rpm室温离心5分钟，弃上清，重复洗涤一次，重悬于无血清的1640培养液当中，将细胞密度调至5×10⁶cells/ml。

靶细胞标记：用无血清的1640培养液将Daudi细胞调至1×10⁶cells/ml，取2～4ml细胞与5μl BATDA试剂混合后37℃孵育5～10分钟，离心将细胞洗3遍，重新悬浮细胞并调至1×10⁵cells/ml。

分别加入不同浓度的抗体，终浓度为0.00001μg/ml、0.0001μg/ml、0.001μg/ml、0.01μg/ml0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml，加入效应细胞和靶细胞(效靶比50:1)，在37℃条件孵育2小时，取20μL反应上清分别加入96孔板，同时加入Europium液，200μL/孔，避光室温放置15分钟。在PE多功能酶标仪测定。

计算杀伤率：

背景组：单独培养基组

最小释放组：靶细胞组

最大释放组：靶细胞+裂解液组

实验组：靶细胞+效应细胞

杀伤率(％)＝〔(实验组-最小释放组)/(最大释放组-最小释放组)〕×100实验结 果：

从图12可以看出，MIL62与的ADCC活性显著强于Rituximab和GA101，并呈现抗体剂量依赖的杀伤效应。

4.1.5.2MIL62抗体FcγRIIIa结合活性分析

实验方法：

用碳酸包被缓冲液(pH 9.6)将anti-His抗体稀释到1μg/mL，以100μl/孔的量加入到酶标板中，4℃孵育过夜。PBST洗板后以封闭液(含5％脱脂奶粉的PBS)在37℃封闭1.5小时。PBST洗板后加入1μg/ml的FcγRIIIa(158V)，37℃孵育1h。同时将MIL62、GA101、Rituximab和anti-humanκ以1:2(质量比)的比例混匀，37℃孵育1h后对混合液进行稀释，当比较MIL62和Rituximab与FcγRIIIa的结合活性时，将抗体稀释到75μg/ml，再进行2.5倍的梯度稀释获得10个浓度点(包括75μg/ml)。当MIL62和GA101进行比较时，将其稀释到10μg/ml，再进行3倍的梯度稀释获得10个浓度点(包括10μg/ml)。酶标板洗板后每孔加入稀释后的CD 20抗体和anti-humanκ的混合液100μl，37℃孵育2小时。洗板后将HRP偶联的goat F(ab′)2anti-human IgG F(ab′)2以1:5000的比例稀释(母液浓度为1mg/ml)，以100μl/孔的量加入到酶标板中，37℃孵育1h。洗板后加100μl/孔的TMB室温显色30min，最后加入100μl/孔的2N H2SO4终止显色反应，酶标仪450nm处读取OD值，使用酶标仪自带分析软件SoftMaxPro 6.3软件，以样品浓度为横坐标，吸光度平均值为纵坐标，选择四参数方程的回归模型做四参数方程曲线，软件自动生成半最大效应浓度(EC₅₀)，EC₅₀越低，说明样品的活性越高。

实验结果：

MIL62和Rituximab与FcγRIIIa(158V)的结合活性实验结果如图13A所示，MIL62和Rituximab的EC₅₀分别为0.124μg/ml、0.805μg/ml，当比较MIL62和GA101与FcγRIIIa(158V)的结合活性时，得到的MIL62和GA101的EC₅₀分别为0.109μg/ml、0.207μg/ml(图13B)，由以上可知，MIL62与FcγRIIIa(158V)的结合活性显著强于Rituximab和GA101。

4.1.5.3MIL62抗体对Daudi细胞的直接杀伤活性分析

实验方法：

将对数生长期的人B细胞淋巴瘤Daudi细胞计数，活率＞90％，以20000/孔的细胞数量铺于96孔培养板中，50μl/孔。然后将GA101、MIL62、Rituximab三种抗体药物稀释后以50μl/孔加入已铺好细胞的96孔培养板中，每种抗体药物分别设置0.1μg/ml、1.5μg/ml、6.25μg/ml三个浓度，每个浓度都设有复孔，另外设有不加药物的对照组及只含细胞培养基的空白组。培养板放到细胞培养箱中孵育24小时后向每孔加入10μl的CCK-8溶液，震荡后将培养板放在培养箱内孵育5小时，酶标仪测定OD450，药物对细胞的抑制率计算公式为：抑制率＝(1－(加药组OD450-空白组OD450)/(对照组OD450-空白组OD450))*100％。

实验结果：

如图14所示，GA101、MIL62在0.1μg/ml、1.5μg/ml、6.25μg/ml时对Daudi细胞的抑制率要明显高于Rituximab，而GA101和MIL62对Daudi细胞的杀伤能力相差不大。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (1)

1.一种制备抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62的方法，包括以下步骤：

1)将编码抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62的核酸分子克隆入表达载体中，得到重组表达载体，其中：

所述抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，

所述表达载体是在载体pTGS-FRT-DHFR的基础上改造获得，并且

所述改造是指去除潮霉素选择标签，并加入谷氨酰胺合成酶表达盒子；

2)将重组表达载体转入岩藻糖基因敲除的宿主细胞，所述宿主细胞为岩藻糖基因敲除的CHO-K1细胞，得到重组宿主细胞，其中，所述岩藻糖基因敲除CHO-K1细胞是通过敲除CHO-K1细胞中岩藻糖修饰途径的关键蛋白GFT基因获得的，并且所述宿主细胞是经过目标培养基驯化后的岩藻糖基因敲除的CHO-K1细胞；GFT基因编号为GenBank:BAE16173.1；

3)将步骤2)获得的重组宿主细胞在目标培养基中进行培养，获得能够高效表达抗体的单克隆细胞株；

4)逐步放大培养步骤3)获得的单克隆细胞株，收获培养上清；和

5)将步骤4)获得的培养上清进行纯化获得抗人CD20人源化单克隆抗体MIL62；其中，所述纯化包括亲和层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析；

其中步骤2)和步骤3)中，所述目标培养基按照如下成分配制：

25±5℃的注射用水0.9L、Pluronic F-68 1.0g/L、葡萄糖8.8g/L、培养基干粉Maxgrow202 7.44g/L、碳酸氢钠1.98g/L、氯化钠3.47g/L、1M HEPES15ml/L、5M HCl或5MNaOH调节pH为7.0±0.1；

定容至1L，并经0.22μm膜无菌过滤。

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