CN105399830B - 抗egfr人源化单克隆抗体、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗EGFR人源化单克隆抗体,以及编码所述抗EGFR单克隆抗体的核酸分子。本发明还涉及所述抗EGFR单克隆抗体的制备方法,以及所述抗EGFR单克隆抗体用于制备抗肿瘤药物的用途。与现有的抗EGFR单克隆抗体Erbitux相比,本发明的抗EGFR单克隆抗体具有更好的质量均一性和增强的ADCC活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种人源化抗EGFR单克隆抗体,以及编码所述抗EGFR单克隆抗体的核酸分子。本发明还涉及所述抗EGFR单克隆抗体的制备方法,以及所述抗EGFR单克隆抗体用于制备抗肿瘤药物的用途。
背景技术
EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物,是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面,EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常,均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。因此,如果有药物能阻断EGFR的活性,那将会抑制其信号传导,从而起到多重途经的抗肿瘤作用。
EGFR抑制剂主要包括单克隆抗体和一些小分子化合物。其中EGFR单克隆抗体是与内源性配体竞争结合EGFR,通过抑制酪氨酸激酶的激活、促进EGFR内化等作用产生抗肿瘤效应。目前已上市的3种抗EGFR单克隆抗体与化疗药相比,这些抗体作用特异性更强,副作用小,在临床上取得了很好的疗效。
Erbitux(爱必妥)是2004年二月美国FDA批准上市,用于治疗EGFR过度表达的恶性结肠直肠癌,是百时美施贵宝和免疫克隆系统公司联合研制的,可与多种化疗药联合应用,对晚期非小细胞肺癌(NSCLC)疗效显著。泰欣生(尼妥珠单抗注射液),是我国第一个人源单克隆抗体药物,2006年4月被SFDA批准上市,适用于与放疗联合治疗表皮生长因子受体(EGFR)表达阳性的III/IV期鼻咽癌。Vectibix(panitumumab、帕尼单抗)是第一个完全人源化单克隆抗体,其靶向作用于表皮生长因子受体(EGFR)。2005年7月,Vectibix获得FDA快速通道审批资格。2005年底,安进公司及其合作伙伴Abgenix公司共同向FDA提交了该生物制剂许可申请,用于治疗化疗失败后转移性结直肠癌。
本领域仍需要进一步提高抗EGFR抗体的质量均一性,同时尽可能提高其活性,降低其毒副作用。
发明内容
本发明的目的是通过改造抗体的氨基酸序列和去除岩藻糖糖基化技术大大提高抗EGFR抗体产品的质量均一性和减少可能的免疫毒副作用,同时增强抗体的ADCC(抗体依赖的细胞毒性)活性。具体地,本发明包括以下几个方面:
本发明第一方面涉及抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分,其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTQGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:5)。
EVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:6)。
在本发明的一个实施方案中,所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的重链恒定区选自来源于人的IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。
在本发明的一个实施方案中,所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的重链恒定区选自来源于人的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在本发明的一个具体实施方案中,所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的重链恒定区来源于人的IgG1。
在本发明的一个实施方案中,所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链恒定区为来源于人的κ或λ。
在本发明的一个具体实施方案中,所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链恒定区来源于人的κ。
在本发明的一个实施方案中,所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分为全抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
在本发明的一个实施方案中,所述抗EGFR单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
在本发明的一个实施方案中,所述抗EGFR单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
在本发明的一个实施方案中,所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的岩藻糖的含量占总含糖量的5%以下,例如2.5%以下,例如1.8%以下。
本发明还涉及核酸分子,其含有编码本发明第一方面任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的序列。
在本发明的一个实施方案中,所述核酸分子含有SEQ ID NO:7所示的序列,和/或SEQ ID NO:8所示的序列。
gatatcctgctgacccagagccccgtgatcctgagcgtgagccccggcgagcgcgtgagcttctcctgccgcgccagccagagcatcggcaccaacatccactggtaccagcagcgcaccCAGggcagcccccgcctgctgatcaagtacgccagcgagagcatcagcggcatccccagccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgatttcaccctgagcatcaacagcgtggagagcgaggacatcgccgattactactgccagcagaacaacaactggcccaccaccttcggcgccggcaccaagctcgagctgaag(SEQ ID NO:7)
gaggtgcagctgaagcagagcggccccggcctggtgcagcccagccagagcctgagcatcacctgcaccgtgagcggcttcagcctgaccaactacggcgtgcactgggtgcgccagagccccggcaagggcctggagtggctgggcgtgatctggagcggcggcaacaccgattacaacacccccttcaccagccgcctgagcatcaacaaggataacagcaagagccaggtgttcttcaagatgaacagcctgcagagcCaggataccgccatctactactgcgcccgcgccctgacctactacgattacgagttcgcctactggggccagggcaccctggtcaccgtgagcgcc(SEQ ID NO:8)
在本发明的一个实施方案中,所述核酸分子含有SEQ ID NO:1所示的序列,和/或SEQ ID NO:2所示的序列。
本发明还涉及重组载体,其含有本发明任一项的核酸分子。
在本发明中,所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述载体含有本发明任一项所述的核酸分子,所述载体可以通过例如将上述核酸分子插入克隆载体或表达载体而得到,或者可以通过人工合成得到。
在本发明中,所述表达载体例如为原核表达载体,真核表达载体,噬菌体载体或病毒载体。其中所述原核表达载体例如为PET载体、PGEX载体,所述真核表达载体例如为pcDNA3.1、pEGFP-C1、pPIC9K,所述噬菌体载体例如为λ噬菌体载体λgt、λgt-λB,所述病毒载体例如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。
在本发明的一个实施方案中,所述载体为真核表达载体pTGS-FRT-DHFR。
在本发明的一个实施方案中,将真核表达载体pTGS-FRT-DHFR做了进一步改造。在本发明的一个实施方案中,所述改造方法为去除潮霉素选择标签,并加入谷氨酰胺合成酶表达盒子。在本发明的具体实施方案中,所述表达载体为载体GS。
在本发明的一个实施方案中,在所述真核表达载体pTGS-FRT-DHFR或载体GS中连接SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列后,即得到重组载体。
本发明还涉及重组细胞,其含有本发明任一项的重组载体。
在本发明的一个实施方案中,所述细胞为哺乳动物细胞,所述哺乳动物细胞为适合表达抗体的细胞,例如为来源于人、鼠或猴的哺乳动物细胞。在本发明的具体实施方案中,所述哺乳动物细胞为CHO细胞,例如为CHO-K1细胞;
在本发明的一个实施方案中,所述哺乳动物细胞对其表达的蛋白部分地、几乎完全地或者完全地不具有岩藻糖修饰功能,例如通过完全或部分抑制岩藻糖修饰途径中相关蛋白的功能来实现。在本发明的一个实施方案中,所述哺乳动物细胞为岩藻糖修饰途径相关基因敲除的细胞。
在本发明的具体实施方案中,其中所述岩藻糖修饰途径相关基因为gft基因。
在本发明的具体实施方案中,通过敲除哺乳动物细胞的gft基因获得了对其表达的蛋白部分地、几乎完全地或者完全地不具有岩藻糖修饰功能的细胞;具体地,针对GFT基因SLC35c1的序列(编号GenBank:BAE16173.1)优化设计了两个GFT zinc-finger nuclease锌指酶序列G1F1、G2F2,进而达到基因敲除的目的。
在本发明的具体实施方案中,所述对其表达的蛋白部分地、几乎完全地或者完全地不具有岩藻糖修饰功能的哺乳动物细胞是经过目标培养基驯化后的细胞。
在本发明的实施方案中,所述目标培养基是指无血清、化学成分确定的动物细胞培养基。
在本发明的实施方案中,所述目标培养基中含有Pluronic F-68、葡萄糖、培养基干粉Maxgrow 202、碳酸氢钠、氯化钠和HEPES;
在本发明的具体实施方案中,所述目标培养基的成分为Pluronic F-68 1.0g/L、葡萄糖8.8g/L、培养基干粉Maxgrow 202 7.44g/L、碳酸氢钠1.98g/L、氯化钠3.47g/L和1MHEPES 15ml/L,并调节pH至7.0±0.1。在本发明的具体实施方案中,所述目标培养基用于细胞驯化和种子培养。在本发明的具体实施方案中,所述目标培养基为表1-1的种子培养基。
在本发明的实施方案中,所述驯化培养的方法为本领域所公知,例如先将细胞在含有10%小牛血清的目标培养基中贴壁培养,按照50%的比例逐级去除血清,例如小牛血清浓度从10%逐级降至5%、2.5%、1.25%、直至完全不含血清,然后继续传代数次,至宿主细胞完全悬浮,成倍增长稳定,最终获得能够在目标培养基中生长的稳定宿主细胞。
本发明还涉及组合物,其含有本发明任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分、本发明任一项的核酸分子、本发明任一项的重组载体、或者本发明任一项的重组细胞,以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还涉及本发明任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的制备方法,其包括使用本发明任一项的核酸分子、本发明任一项的重组载体、或者本发明任一项的重组细胞的步骤。
在本发明的一个实施方案中,其具体包括以下步骤:
1)将本发明任一项的核酸分子的核苷酸序列克隆入表达载体中,得到重组表达载体;
2)将重组表达载体转入宿主细胞,得到重组细胞;
3)将步骤2)获得的重组细胞在目标培养基中进行培养,获得能够表达抗体的细胞株;
4)逐步放大培养步骤3)获得的细胞株,收获培养上清;
5)将步骤4)获得的培养上清进行纯化获得本发明任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分。
在本发明的一个实施方案中,所述细胞为哺乳动物细胞,所述哺乳动物细胞为适合表达抗体的细胞,例如为来源于人、鼠或猴的哺乳动物细胞。在本发明的具体实施方案中,所述哺乳动物细胞为CHO细胞,例如为CHO-K1细胞;
在本发明的一个实施方案中,所述哺乳动物细胞对其表达的蛋白部分地、几乎完全地或者完全地不具有岩藻糖修饰功能,例如通过完全或部分抑制岩藻糖修饰途径中相关蛋白的功能来实现。在本发明的一个实施方案中,所述哺乳动物细胞为岩藻糖修饰途径相关基因敲除的细胞。
在本发明的具体实施方案中,其中所述岩藻糖修饰途径相关基因为gft基因。
在本发明的具体实施方案中,通过敲除哺乳动物细胞的gft基因获得了对其表达的蛋白部分地、几乎完全地或者完全地不具有岩藻糖修饰功能的细胞;具体地,针对GFT基因SLC35c1的序列(编号GenBank:BAE16173.1)优化设计了两个GFT zinc-finger nuclease锌指酶序列G1F1、G2F2,进而达到基因敲除的目的。在本发明的具体实施方案中,所述gft基因敲除的细胞为CHOK1-AF。
在本发明的一个实施方案中,所述重组表达载体是在载体pTGS-FRT-DHFR的基础上改造获得,优选地,所述改造是指去除潮霉素选择标签,并加入谷氨酰胺合成酶表达盒子。
在本发明的实施方案中,所述重组表达载体是GS载体。
在本发明中,所述目标培养基是适合哺乳动物细胞生长、适合抗体表达的培养基,其为本领域所公知,优选为无血清培养基。在本发明的实施方案中,所述步骤3)中的目标培养基是指无血清、化学成分确定的动物细胞培养基。
在本发明的实施方案中,所述目标培养基中含有Pluronic F-68、葡萄糖、培养基干粉Maxgrow 202、碳酸氢钠、氯化钠和HEPES;
在本发明的具体实施方案中,所述目标培养基的成分为Pluronic F-68 1.0g/L、葡萄糖8.8g/L、培养基干粉Maxgrow 202 7.44g/L、碳酸氢钠1.898g/L、氯化钠3.47g/L和1MHEPES 15ml/L,并调节pH至7.0±0.1。在本发明的具体实施方案中,所述目标培养基用于细胞驯化和种子培养。在本发明的具体实施方案中,所述目标培养基为表1-1的种子培养基。
在本发明的实施方案中,所述驯化培养的方法为本领域所公知,例如先将细胞在含有10%小牛血清的目标培养基中贴壁培养,按照50%的比例逐级去除血清,例如小牛血清浓度从10%逐级降至5%、2.5%、1.25%、直至完全不含血清,然后继续传代数次,至宿主细胞完全悬浮,成倍增长稳定,最终获得能够在目标培养基中生长的稳定宿主细胞。
在本发明的实施方案中,步骤3)的具体方法为:将步骤2)获得的重组宿主细胞在目标培养基中进行培养,向培养基中加入适当浓度的MSX(例如50μM MSX),在培养箱中培养一段时间,挑选出可以在此培养基中存活并表达抗体的细胞,然后进行亚克隆筛选,获得能够高效表达抗体的单克隆细胞株。
在本发明的实施方案中,步骤4)的具体方法为:将能够高效表达抗体的单克隆细胞株经过目标培养基多步扩大培养,培养基为生产培养基:种子培养基为1:1,培养周期为12-14天,培养第3、6、9天加入10%体积的流加培养基,培养结束后收获上清。
在本发明的具体实施方案中,所述种子培养基即为目标培养基。
在本发明的实施方案中,所述生产培养基中含有氢氧化钠、培养基干粉Maxpro302、维生素B12、硫酸亚铁、磷酸二氢钠一水合物、葡萄糖、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、Pluronic F-68、氯化钠、HCl、碳酸氢钠和HEPES。
在本发明的具体实施方案中,所述生产培养基中含有氢氧化钠0.8g/L、培养基干粉Maxpro 302 11.5g/L、1g/L维生素B12贮存液(1-2)ml/L、10g/L硫酸亚铁贮存液(0.4-0.6)ml/L、磷酸二氢钠一水合物0.35g/L、葡萄糖8.8g/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物(0.3-0.375)g/L、Pluronic F-68 1g/L、氯化钠1.55g/L、5M HCl 5.6ml/L、碳酸氢钠1.22g/L和1MHEPES7.5ml/L,并调节pH至7.0±0.1。在本发明的具体实施方案中,所述生产培养基用于抗体生产。在本发明的具体实施方案中,所述生产培养基为表1-2的生产培养基。
在本发明的实施方案中,所述流加培养基中含有氢氧化钠、无水磷酸氢二钠、流加培养基干粉Maxfeed 402、L-酪氨酸二钠盐二水物、L-半胱氨酸盐酸盐一水物、天冬酰胺、葡萄糖、维生素B12、硫酸亚铁、Pluronic F-68、氯化钠、HCl、碳酸氢钠。
在本发明的具体实施方案中,所述流加培养基中含有5M氢氧化钠7.325mL、无水磷酸氢二钠3.09g/L、流加培养基干粉Maxfeed 402 39.03g/L、50g/L L-酪氨酸二钠盐二水物23.8mL、50g/L L-半胱氨酸盐酸盐一水物23.2mL、葡萄糖50g/L、1.75g/L维生素B12贮存液0.3ml/L、5g/L七水硫酸亚铁贮存液0.3ml/L、Pluronic F-68 0.3g/L、氯化钠0.24g/L和碳酸氢钠0.366g/L。在本发明的具体实施方案中,所述流加培养基用于流加培养。在本发明的具体实施方案中,所述流加培养基为表1-3的流加培养基。
在本发明的实施方案中,所述步骤5)的纯化依次包括亲和层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析。
在本发明的具体实施方案中,所述步骤5)的纯化步骤具体包括:首先收集过蛋白A亲和层析柱pH在3.4-3.6范围(用280nm进行监测)的洗脱液,调pH值至7~9,上样到阴离子交换层析柱,280nm进行监控和收集样品,将收集液pH值调节至5~7,上样到阳离子交换层析柱,收集样品,超滤浓缩后获得抗EGFR人源化单克隆抗体。
在本发明的实施方案中,所述蛋白A亲和层析柱选自Mabselect SuRe、ProSepUltra Plus、ProSep vA Ultra、MabCapture A或具有类似功能的蛋白A亲和层析介质。
在本发明的实施方案中,所述阴离子交换层析柱选自Q Sepharose FF、FractogelTMAE、Poros HQ、Captol Q或具有类似功能的阴离子交换层析介质。
在本发明的实施方案中,所述阳离子交换层析柱选自Poros HS、Poros XS、SPSepharose FF、Fractogel SO3 -、Fractogel SH Hicap或具有类似功能的阳离子交换层析介质。
本发明还涉及本发明任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途;优选地,所述肿瘤为发生于上皮组织的肿瘤;进一步优选地,所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肝癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、阴道癌、膀胱癌、食管癌、口腔癌、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和鼻咽癌。
以下对本发明做进一步描述:
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
在本发明中,术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991)),或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如,其包括,特别地,重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体,例如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。
在本发明中,术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分,所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如,PCSK9)的能力,与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见,Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文,用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下,抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如,scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
在本发明中,术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段;术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段;术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature341:544-546(1989));术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段;术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下,抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如,scFv),其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见,例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头(连接肽)由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如,可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头,但也可使用其变体(Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。在本发明的实施方案中,所述连接肽的序列为(GGGGS)3。
在一些情况下,抗体是双特异性抗体,其能够分别和两种抗原或抗原表位结合,其包括特异性结合第一抗原的抗体的轻链、重链或其抗原结合部分,以及特异性结合第二抗原的抗体的轻链、重链或其抗原结合部分。在本发明的实施方案中,所述双特异性抗体中结合第一抗原的抗体的轻链、重链或其抗原结合部分可以为本发明任一项的抗体或其抗原结合部分,所述特异性结合第二抗原的抗体的轻链、重链或其抗原结合部分可以为其它抗EGFR抗体或其抗原结合部分或者针对其它抗原的抗体或其抗原结合部分。
在一些情况下,抗体是双抗体,即,双价抗体,其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达,但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对,从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见,例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993),和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如单克隆抗体2E12)获得抗体的抗原结合部分(例如,上述抗体片段),并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。
在本发明中,所述抗原结合部分包括单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体、scFv-Fc二价分子、dAb和互补决定区(CDR)片段、Fab片段、Fd片段、Fab'片段、Fv和F(ab')2片段。
在本发明中,所述λ轻链恒定区包括各种同种异型,如λⅠ、λⅡ、λⅢ、λⅥ。在本发明的的实施方案中,所述λ轻链恒定区为λⅡ型。
本发明涉及的抗体核酸分子也可以利用传统的基因工程重组技术或化学合成方法获得。一方面,本发明涉及的抗体核酸分子的序列包含了抗EGFR抗体的重链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面,本发明涉及的抗体核酸分子的序列也包括抗EGFR抗体的轻链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面,本发明涉及的抗体核酸分子的序列还包括重链或轻链可变区的CDR序列。互补决定区(complementary determinant region,CDR)是与抗原表位结合的部位,本发明中的CDR序列通过IMGT/V-QUEST(http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)进行确定。但是不同的划分方法得到的CDR序列稍有不同。
本发明涉及含有所述核酸分子的重组表达载体,也涉及转化了这些分子的宿主细胞。而且,本发明还涉及利用包含了所述核酸分子的宿主细胞在特定条件下培养并分离得到发明所述抗体的方法。
在本发明中,术语“载体”指的是,可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说,载体包括:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件,包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分,如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳,但不仅仅只有这些物质。
在本发明中,术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞,包括如下许多细胞类型,如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。
本发明的抗体片段可以利用水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外,这些抗体片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed in Hudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999);Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如,Fab'片段可以直接从E.coli细胞中获得或化学藕联形成F(ab')2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。再如,F(ab')2片段可以用亮氨酸拉链GCN4连接获得。另外,Fv、Fab或F(ab')2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备抗体片段的其它技术。
在本发明中,“特异性结合”指的是,指两分子间的非随机结合反应,如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处,结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到或很弱。在某些实施方式中,一个某抗原特异性抗体是指以亲和力(KD)≤10-5M(如10- 6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M等)结合该抗原,其中KD指解离率与结合率的比值(koff/kon),其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行测定。
在本发明中,所述ADCC活性是指表达IgG Fc受体的NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等效应细胞,通过与已结合在病毒感染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合,而杀伤这些靶细胞的作用。
在本发明中,所述对细胞的驯化培养是指使细胞能够在新培养基中生长繁殖的过程。
在本发明中,20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其通过引用合并入本文。
在本发明中,如未特别指明,则百分比(%)是指重量百分比。
发明的有益效果
本发明通过对抗体的氨基酸序列进行改造和去除岩藻糖修饰技术获得了性质更均一、几乎或完全不含有岩藻糖修饰且毒副作用更小的抗EGFR单克隆抗体,该抗体具有更好的质量均一性,更有利于保证抗体生产的质量稳定性,并且由于其具有更高的ADCC活性和更小的毒副作用,因而具有更好的临床应用前景。
附图说明
图1MIL70/Vκ和MIL70/VH的PCR产物琼脂糖电泳结果。1:MIL70/VH的PCR产物;2:MIL70/Vκ的PCR产物;M:DL2,000DNA
图2岩藻糖敲除宿主细胞CHOK1-AF构建技术路线图
图3流式细胞术检测CHO-K1细胞表面岩藻糖的表达水平
图4宿主细胞驯化培养流程图。
图5宿主细胞驯化过程中细胞生长曲线图。
图6MIL70抗体的制备、纯化流程图。
图7MIL70抗体的iCIEF色谱图。
图8MIL70抗体的SEC色谱图。
图9MIL70抗体的非还原CE-SDS色谱图。
图10MIL70抗体的还原CE-SDS色谱图。
图11MIL70和ERBITUX的糖型图谱
图12(1)MIL70的完整蛋白图谱;(2)ERBITUX的完整蛋白图谱
图13(1)MIL70样品针对MIL70氨基酸序列进行检索(阴影部分为质谱鉴定到序列);(2)MIL70样品针对Erbitux氨基酸序列进行检索(阴影部分为质谱鉴定到序列)
图14MIL70和Erbitux的C1q结合活性结果
图15MIL70和Erbitux的FcγRIIIa(158V)结合活性结果
图16MIL70和Erbitux的EGFR结合活性结果
图17MIL70和Erbitux对A-431细胞的直接杀伤活性结果
图18MIL70和Erbitux对A-431细胞的ADCC活性结果
图19MIL70和Erbitux的CDC活性结果
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1抗体MIL70核苷酸序列的获得
在重组人鼠嵌合抗体Erbitux序列的基础上,对其轻链和重链框架区的三个氨基酸进行了突变。选择在哺乳动物细胞中使用频率较高的密码子进行反向翻译,通过生物信息学技术合理优化,利用分子建模和分子生物学突变实验,获得了本发明抗体MIL70的核苷酸序列。
抗体MIL70的轻链核苷酸序列为:
gatatcctgctgacccagagccccgtgatcctgagcgtgagccccggcgagcgcgtgagcttctcctg ccgcgccagccagagcatcggcaccaacatccactggtaccagcagcgcaccCAGggcagcccccgcctgctgatc aagtacgccagcgagagcatcagcggcatccccagccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgatttcaccctga gcatcaacagcgtggagagcgaggacatcgccgattactactgccagcagaacaacaactggcccaccaccttcgg cgccggcaccaagctcgagctgaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID NO:1),其中带有下划线的序列为可变区序列(SEQ ID NO:7);
抗体MIL70的重链核苷酸序列为:
gaggtgcagctgaagcagagcggccccggcctggtgcagcccagccagagcctgagcatcacctgcac cgtgagcggcttcagcctgaccaactacggcgtgcactgggtgcgccagagccccggcaagggcctggagtggctg ggcgtgatctggagcggcggcaacaccgattacaacacccccttcaccagccgcctgagcatcaacaaggataaca gcaagagccaggtgttcttcaagatgaacagcctgcagagcCaggataccgccatctactactgcgcccgcgccct gacctactacgattacgagttcgcctactggggccagggcaccctggtcaccgtgagcgccgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgactgtgccctctagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagggtggagcccaaatctcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQID NO:2),其中带有下划线的序列为可变区序列(SEQ ID NO:8)。
抗体MIL70的轻链氨基酸序列为:
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRAS WYQQRT GSPRLLIK SGIPS RFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC TFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:3)其中带有下划线的序列为可变区序列(SEQ ID NO:5),带有单划线的序列为框架区序列,带有双划线的序列为CDR区序列,有阴影和序列为与爱必妥不同的序列;
抗体MIL70的重链氨基酸序列为:
VQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSG WVRQSPGKGLEWL TSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQS DTAIYYCAR WGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:4),其中带有下划线的序列为可变区序列(SEQ ID NO:6),带有单划线的序列为框架区序列,带有双划线的序列为CDR区序列,有阴影和序列为与爱必妥不同的序列。
实施例2抗体MIL70基因的克隆
实验材料:
Phusion聚合酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、pGEM-T-easy载体、Pyrobest DNApolymerase均为NEB公司产品;
dNTP、DNA Marker标准为TaKaRa产品;
DNA回收试剂盒为Qiagen公司产品;
Trans2-Blue感受态为全式金公司产品;
小提中量质粒试剂盒(DP107-02)为天根生化公司产品;
大提质粒试剂盒(DP117)为天根生化公司产品;
OPD为Sigma公司产品;
FITC标记的羊抗人抗体:为Pierce公司产品;
引物设计为Biosun软件;
引物合成(Genewiz),金唯智生物科技(北京)有限公司;
基因测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。
实验方法和结果:
通过PCR的方法合成抗体的轻重链可变区基因,即为MIL70抗体的轻重链可变区基因。测序正确的克隆,装配表达质粒。使用PCR技术全合成MIL70/VH、MIL70/Vκ基因片段,并引入合适的酶切位点,在抗体轻链可变区基因5’和3’端引入ClaI和BsiwI位点,在抗体重链可变区基因5’和3’端引入EcoR I和Nhe I位点。
2.1引物设计
根据基因全合成的原理,利用计算机辅助设计软件,设计引物,考虑引物的二级结构、GC含量等相关参数。每条基因设计10条引物,分别编号为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10,用于基因全合成。
2.2全基因合成
1)引物合成后以无菌水稀释,方法如下:
a)取引物管12000rpm离心2min,引物按100μM的浓度稀释,-20℃保存;
b)取少量引物P2~P9混合成终浓度为10μM作为使用液;
c)取少量引物P1和P10混合稀释成终浓度为10μM作为使用液P1/P10;
2)基因全合成,采用Pyrobest DNA polymerase,方法如下:
a)取1μL P2~P9混合引物作为模版,配制如下Overlap PCR体系:
无菌水补足总体积为50uL
b)将以上PCR体系进行如下反应:
反应结束后,降到室温。
加入引物P1/P10,进行如下PCR反应:
反应结束后,降至室温。
c)1~2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,抗体重链基因回收440bp大小片段,轻链基因回收400bp大小片段。
d)回收加尾(Pyrobest DNA polymerase不能在PCR产物3’端加尾A,所以不能直接连接T载体),作如下10μL体系:
反应条件如下:72℃20mins,反应结束后,降到室温。
e)取加尾产物,连接pGEM-TEasy载体:
室温连接2h或者4℃连接过夜,连接产物转化JM109大肠杆菌,涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB液体培养基中培养,用质粒提取试剂盒(博大泰克公司)提取质粒,获得的质粒进行核酸测序鉴定。
在上述步骤中,Overlap PCR扩增后经过琼脂糖凝胶电泳分析,获得特异大小的目的条带(图1);产物经过回收、加尾、克隆等分子生物学技术,成功克隆入pGEM-TEasy载体;经过测序鉴定,合成的基因与目的序列一致。
琼脂糖电泳结果:VH约为440bp目的基因片段,Vκ约为410bp目的片断,分别命名为MIL70/VH和MIL70/Vκ。
实施例3MIL70抗体的制备
实验材料
委托Hyclone加工的干粉培养基,经配制后用于宿主细胞的驯化、细胞株筛选以及抗体制备过程中培养细胞,细胞筛选时向配置的培养基中加入从Sigma购买的蛋氨酸砜亚胺(Methionine sulfoximine,MSX),用从sigma购买的台盼蓝干粉自己配制成溶液后用于进行细胞计数。
方法和结果
3.1抗体真核表达载体的构建
选择本申请人获得的表达载体pTGS-FRT-DHFR(专利授权号:ZL200510064335.0),去除潮霉素选择标签,通过PshA1和Xho1酶切位点加入GS(glutamine synthetase,谷氨酰胺合成酶)表达盒子,作为筛选标记;其中GS cDNA从表达GS的细胞系CHO中通过RT-PCR获得。经过改造后的载体命名为GS载体。将获得MIL70抗体轻重链可变区基因克隆载体用相应的内切酶消化(轻链可变区基因用ClaI和BsiwI消化,重链可变区基因用EcoR I和Nhe I消化)后,与经相同内切酶消化的载体连接。经过转化等分子生物学常用技术,构建获得真核表达载体。具体实施如下:
a)在实施例2中,将MIL70轻重链可变区基因构建到pGEM-TEasy载体中,获得的载体分别命名为MIL70/Vκ和MIL70/VH;
b)取MIL70/Vκ用ClaI和BsiwI消化,得到MIL70轻链可变区基因;
c)取1μg GS载体,用ClaI和BsiwI消化。用T4DNA连接酶连接所得的经ClaI和BsiwI消化的GS载体和用ClaI和BsiwI消化的抗体MIL70轻链可变区基因。连接产物转化XLI-blue大肠杆菌,涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB液体培养基中培养,用质粒提取试剂盒(天根生化公司)提取质粒。所提取的质粒经ClaI和BsiwI消化后,用1%琼脂糖凝胶电泳分析,选择一个携带有抗体MIL70轻链可变区基因的克隆。获得的携带抗体MIL70轻链可变区基因的质粒命名为pTGS-MIL70Vκ。
d)取MIL70/VH用EcoR I和Nhe I消化,得到MIL70重链可变区基因;
e)取1μg pTGS-MIL70Vκ载体,用EcoR I和Nhe I消化。用T4DNA连接酶连接所得的经EcoR I和Nhe I消化的pTGS-MIL70Vκ载体和用MIL70/VH载体消化的抗体MIL70重链可变区基因。连接产物转化XLI-blue大肠杆菌,涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB液体培养基中培养,用质粒提取试剂盒(天根生化公司)提取质粒。所提取的质粒经EcoR I和Nhe I消化后,用1%琼脂糖凝胶电泳分析,选择一个携带有抗体MIL70重链可变区基因的克隆。
在pTGS-MIL70Vκ基础上获得的携带抗体MIL70重链可变区基因的质粒命名为MIL70。
3.2宿主细胞岩藻糖敲除及悬浮驯化
将从ATCC购买的CHO-K1细胞进行gft基因的敲除使其自身表达的蛋白几乎或完全不具有岩藻糖基化修饰,获得岩藻糖敲除宿主细胞命名为CHOK1-AF,具体方法是通过基因工程技术改造表达系统,定点敲除抗体表达宿主细胞CHO-K1中岩藻糖修饰途径的关键蛋白GFT,从而有效降低抗体岩藻糖修饰水平。该方法可以同时阻断岩藻糖基化经典途径及补偿途径,从而达到完全去除岩藻糖基化的目的。具体技术路线如图2所示,利用锌指酶技术,针对GFT基因SLC35c1的序列(编号GenBank:BAE16173.1)优化设计了两个GFT zinc-fingernuclease锌指酶序列G1F1、G2F2(其中G1、G2、F1、F2的序列分别如SEQ ID NO:9、10、11、12所示),用以分别结合目的基因的双链DNA。构建相应的表达载体质粒pCDNA3.1-G1F1、pCDNA3.1-G2F2,并将两个质粒共转染CHO-K1细胞。利用糖结合凝集素LCA(Lens culinarisagglutinin)对蛋白岩藻糖基的特异性亲和力,将共转染后的细胞使用biotin-LCA染色、结合anti-biotin microBeads和MACs LD柱进行负性分选,进一步克隆化培养,利用流式技术分析细胞克隆岩藻糖敲除水平;经多轮负性筛选、克隆化培养,获得了不含岩藻糖修饰的克隆1G7。流式细胞术结果显示,与原宿主细胞CHO-K1相比,1G7细胞表面岩藻糖的表达显著下降(图3)。提取1G7细胞总RNA,反转录后调取GDP转运蛋白编码基因,经测序确认该基因突变成功,不能正常表达。将获得的细胞克隆命名为CHOK1-AF。
进一步按图4所示流程进行驯化培养,将岩藻糖敲除的宿主细胞CHO-K1在种子培养基(参见表1-1)(含10%小牛血清)中进行贴壁培养,逐级去除血清(10%-->5%-->2.5%-->1.25%-->完全不含血清),转置摇瓶培养,继续传代数次后,宿主细胞完全悬浮,成倍增长稳定,最终获得能够在种子培养基中生长的稳定宿主细胞。宿主细胞驯化过程中细胞生长的结果如图5所示。
3.3特有培养基的制备
按照表1-1、1-2、1-3成分进行培养基的配制。经0.22μm膜无菌过滤后,供细胞培养使用。
表1-1:种子培养基
表1-2:生产培养基
表1-3:流加培养基
3.4MIL70抗体的制备
使用电转染方法将步骤3.2获得的MIL70抗体真核表达载体转入目的宿主细胞(实施例3步骤3.2筛选获得的宿主细胞)中,向种子培养基中加入75μM MSX,在37℃CO2培养箱中培养2~4周,挑选出可以在此培养基中存活的细胞,通过ELISA法检测获得能够表达抗体的细胞。经过有限稀释法进行亚克隆筛选,经过6~8周的培养及筛选,获得能够高效表达MIL70抗体的单克隆细胞株。
细胞株经过培养基多步的扩大培养,接种密度为0.5×106cells/ml,每三天传代一次,扩充至足够细胞量后转移至发酵培养基(培养基为生产培养基:种子培养基(1:1)),在发酵培养基中的培养周期为12-14天,培养第3、6、9天加入10%体积的流加培养基,培养结束后收获上清,将上清进行纯化。
采用AKTA(GE公司)进行MIL70抗体的分离纯化。首先收集过蛋白A亲和层析柱(MabSelect SuRe)pH在3.4-3.6范围(用280nm进行监测)的洗脱液,调pH值至8.0,上样到阴离子交换层析柱(Q-Sepharose FF),280nm进行监控和收集样品。将收集液pH值调节至5.5,上样到阳离子交换层析柱(Poros)收集样品。超滤浓缩后获得MIL70抗体。具体流程如图6所示。
按照上述方法制备得到的抗体MIL70用于以下各实施例。
实施例4MIL70抗体的分析以及活性鉴定
实验材料
用从Thermo购买的离子交换色谱柱(型号:Propac WCX-10,4.0mm×250mm,生产商:戴安公司)进行离子交换色谱(简称IEC)分析,从sigma购买的HEPES、以及从国药集团购买的NaCl配置IEC流动相,上海雅心生物技术有限公司购买的羧肽酶(CpB)进行样品处理。
用从TOSOH购买的凝胶色谱柱(型号:TSK-GEL SW3000,7.8mm×300mm,生产商:TOSOH)进行尺寸排阻色谱(简称SEC)分析,从国药集团购买的磷酸钾以及氯化钾配置SEC流动相。
4.1MIL70抗体的分析
4.1.1MIL70抗体的等电点及电荷变量测定分析(iCIEF法)
实验方法:
8M尿素溶液及样品溶液的配制:
8M尿素溶液:准确称取2.4g尿素溶解于少量纯水,并定容至5.0ml,振荡混匀。
2mg/ml的样品溶液:取10mg/ml样品溶液30μl,加入浓度为1mg/ml的CpB酶溶液3μl,加入超纯水117μl,振荡混匀。在37℃水浴30min,冷却至室温,待用。
按照表2配制进样溶液:
表2
试剂 | 体积 |
1%Methyl Cellulose | 70μl |
Pharmalyte 3–10 | 2μl |
Pharmalyte 8–10.5 | 8μl |
Marker:pI=7.05,pI=9.77 | 各0.5μl,共1.0μl |
2mg/ml样品溶液 | 50μl |
8M尿素溶液 | 40μl |
H2O | 29μl |
将上述溶液在12000rpm条件下,离心3分钟。量取160μl上层清液并加入内插管中,将内插管置于离心管中,在12000rpm条件下,再离心3分钟,将内插管放入样品瓶中待测。
等电聚焦电泳条件见表3:
表3
Method Parameters | Status |
Focus Period 1Time | 1min |
Focus Period 1Voltage | 1500V |
Focus Period 2Time | 10min |
Focus Period 2Voltage | 3000V |
Sample Transfer Time(sec): | 115 |
Wash Duration(sec): | 0 |
Scans Averaged: | 16 |
仪器及其他参数见表4:
表4
仪器名称 | 成像等电聚焦毛细管电泳仪 |
厂家 | Protein Simple |
设备型号 | iCE3 |
毛细管规格 | FC-coated |
自动进样器温度 | 8℃ |
实验结果:
MIL70样品与原研药Erbitux等电点及电荷异质性(icIEF法)检测结果见表5:
表5
样品名称 | 酸性峰比例% | 主峰比例% | 碱性峰比例% | 等电点 |
MIL70 | 33.244 | 64.525 | 2.231 | 8.30 |
Erbitux | 62.104 | 36.507 | 1.389 | 8.31 |
可以看出,抗体MIL70具有更高的主峰比例。
MIL70样品与Erbitux(CAS No.205923-56-4,杭州海正提供)icIEF测定谱图叠加图如图7。可以看出,抗体MIL70具有更高的主峰比例。
4.1.2MIL70抗体的体积排阻色谱(SEC)
方法:
参照《中华人民共和国药典》2010年版三部附录ⅢD分子排阻色谱法,凝胶色谱柱为TSK-GEL G3000SWxl 7.8×300mm,流动相为0.2M磷酸钾缓冲液、0.25M的氯化钾(pH6.2),流速为0.5ml/min,进样器:6℃,柱温:30℃,波长280nm检测,运行时间30min,本品用流动相稀释至2mg/ml,进样25μl。
实验结果:
结果如图8和如表6所示,Erbitux出峰时间略早,且主峰后有肩峰存在,表明其分子大小异质程度高于MIL70,MIL70单体的比例高于ERBITUX。
表6 MIL70与ERBITUX的SEC检测结果
聚体(%) | 主峰(%) | 碎片(%) | |
MIL70 | 0.2 | 99.8 | 0.1 |
Erbitux | 0.4 | 98.9 | 0.4 |
4.1.3MIL70抗体毛细管电泳检测(非还原CE-SDS和还原CE-SDS)
(1)非还原CE-SDS
实验方法:
样品和其他溶液制备:
1M碘乙酰胺溶液:称取185mg碘乙酰胺粉末溶于1ml水中,振荡混匀,分装,-80℃保存,备用。
按照表7制备进样溶液:
表7
试剂 | 体积 |
样品缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 9.0,1%SDS) | 50μl |
碘乙酰胺(1M) | 1.5μl |
10mg/ml样品溶液 | 10μl |
H<sub>2</sub>O | 38.5μl |
将上述溶液振荡混匀,在70℃水浴10min,冷却至室温,在12000rpm条件下,离心2分钟,量取80μl上层清液并加入内插管中,将内插管放入样品瓶中待测。
检测条件见表8:
表8
实验结果:
MIL70样品与Erbitux纯度(非还原CE-SDS法)检测结果见表9:
表9
样品名称 | 主峰比例% |
MIL70样品 | 91.318 |
Erbitux | 97.209 |
MIL70样品与Erbitux非还原CE-SDS测定谱图叠加图如图9。
可以看出,抗体MIL70具有更高的主峰比例,因而纯度更高。
(2)还原CE-SDS
实验方法:
按照表10制备进样溶液:
表10
试剂 | 体积 |
样品缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 9.0,1%SDS) | 50μl |
β-巯基乙醇 | 5μl |
10mg/ml样品溶液 | 10μl |
H2O | 35μl |
将上述溶液振荡混匀,在70℃水浴10min,冷却至室温,在12000rpm条件下,离心2分钟,量取80μl上层清液并加入内插管中,将内插管放入样品瓶中待测。
检测条件见表11:
表11
仪器名称 | 毛细管电泳仪 | 检测器 | PDA检测器 |
厂家 | Beckman Coulter | 检测波长 | 220nm |
设备型号 | PA800plus | 进样电压 | 5.0kV |
毛细管内径 | 50μm | 进样时间 | 20.0Sec |
毛细管有效长度 | 20cm | 分离电压 | 15.0kV |
卡盒温度 | 25℃ | 分离时间 | 40.0min |
样品存放温度 | 8℃ |
实验结果:
MIL70样品与Erbitux纯度(还原CE-SDS法)检测结果见表12:
表12
样品名称 | 轻链和重链比例之和% |
MIL70样品 | 97.871 |
Erbitux | 96.482 |
MIL70样品与Erbitux还原CE-SDS测定谱图叠加图见图10。
4.1.4MIL70抗体的糖型分析和完整蛋白分析
4.1.4.1抗体糖型分析
糖型分析:
主要设备与试剂见表13和14。
表13
表14
样品制备
取抗体2mg,以10kD超滤管除盐,将其体系中的盐浓度稀释25倍以上,并控制体积为90μL,加入10μL G7PNGaseF酶切缓冲液、2.5μL PNGaseF,混匀后用封口膜封好,置于37℃水浴锅内温浴12~18hr。
温浴结束后,取出样品,在样品中加入-20℃预冷好的300μL无水乙醇,混匀,4℃放置30min后,12000rpm离心5min,吸取上清150μL至1.5ml离心管内,置于真空离心浓缩仪中,2000rpm浓缩干燥直至没有液体,浓缩过程中温度不超过35℃。
待样品中的液体蒸发完全后取出,加入DMSO和乙酸混合液(350:150):2-AB:Reductant=100μL:5mg:6mg的比例混合液10μL。用封口膜封好,用锡纸包裹避光,放入65℃烘箱中,衍生反应3小时。结束后,每个样品加入40μL流动相A和160μL流动相B,充分混匀,12000rpm离心3min,取上清上样分析,样品不可冻融。液相设置
溶液配置
流动相A(100mM甲酸铵pH4.5):
称取6.31g甲酸铵,加入800mL超纯水溶解,用甲酸调pH值至4.5,定容至1L,用0.22μm滤膜过滤,超声脱气20min,有效期1周。
流动相B(100%乙腈):
量取1L乙腈,超声脱气20min,有效期1周。
色谱条件-标准色谱条件信息见表15:
表15
进样器温度 | 6℃ |
运行时间 | 96min |
流速 | 0.25ml/min |
柱温 | 60℃ |
检测波长 | λex=330nm;λem=420nm |
注:进样量与增益设置相关,一般建议增益为8时,进样量10μl。如果样品量少,可调整增益以及进样量,以不超过荧光检测器最大量程为准。梯度洗脱时间见表16:
表16
时间(min) | 流动A%(甲酸铵) | 流动相B%(乙腈) |
0 | 20 | 80 |
20 | 20 | 80 |
25 | 25 | 75 |
75 | 40 | 60 |
80 | 65 | 35 |
85 | 65 | 35 |
86 | 20 | 80 |
96 | 20 | 80 |
MIL70和ERBITUX的糖型,如图11所示。二者的主要糖型结果如表17和表18所示,其中MIL70含有岩藻糖的糖型比例<1.8%,且糖型以G0、G1、G2等简单糖型为主;ERBITUX含有更复杂的糖型(Jun Qian,et al,Analytical Biochemistry,364(2007)8-18.)。
表17 MIL70的主要糖型比例
表18 ERBITUX的主要糖型比例
4.1.4.2完整蛋白分析
主要设备见表19:
表19
主要试剂见表20:
表20
名称 | 生产厂家 | 规格 | 货号 |
二巯基苏糖醇(DTT) | Inalco Spa | 5g/瓶 | 1758-9030 |
色谱乙腈 | Fisher | 4L/瓶 | A998-4 |
甲酸(FA) | CNW | 500ml/瓶 | XC29K200 |
方法:
本品利用R1/20色谱柱进行脱盐.
液相分离条件如表21所示:
表21
色谱柱 | R1/20 |
流动相 | 流动相A:0.1%FA水;流动相B:0.1%FA乙腈 |
流速 | 1ml/min |
进样量 | 50μg |
进样器温度 | 6℃ |
柱温 | 50℃ |
运行时间 | 25min |
洗脱梯度见表22:
表22
肽图质谱采集参数如下:
Scan Mode:None
Scan Type:Positive TOF MS
Intensity Thres.:1cps
Settling Time:0.000ms
MR Pause:1.082ms
MCA:No
GS1:55.00
GS2:55.00
CUR:35.00
TEM:400.00
ISVF:5500.00
TOF Masses(Da):Min=600.0000 Max=4000.0000
Accumulation Time(sec):0.5000
Time Bins to Sum:40 Channels:1 2 3 4
结果与分析
将本品色谱柱脱盐后,TripleTOF 4600(AB Sciex)质谱分析,本品的完整蛋白分子量见表23和图12。MIL70检测到的完整蛋白中主要的糖修饰类型为:G0/G0、G0/G1和(G1/G1)或(G0/G2)糖型修饰,其中G0/G0为最主要的完整蛋白类型,且其末端赖氨酸大部分被切除(-K/-K);与理论的分子相比,MIL70主要组分G0/G0糖型的完整蛋白误差为1.1D(7.4ppm),对于分子量在150kD的左右的抗体蛋白而言在质谱仪器测定误差范围内,故本品的完整蛋白分子量与其理论值一致。
而Erbitux由于含有两个糖基化位点,完整蛋白分子分布更为复杂,与MIL70显著不同(Daniel Ayoub,Wolfgang Jabs,Anja Resemann,et al.(2013)Correct primarystructure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by acombination of intact,middle-up,middle-down and bottom-up ESI and MALDI massspectrometry techniques,mAbs,5:5,699-710)。
表23 MIL70的完整蛋白分子量
4.1.5肽段覆盖率
主要设备见表24:
表24
主要试剂见表25:
表25
样品制备:
变性及烷基化
将40μL样品(25mg/ml)与20μL 1M的DTT和960μL的变性缓冲液(6M盐酸胍,360mMTris,2mM EDTA,pH8.6±0.1)混合,得到稀释浓度为1mg/ml样品,短暂涡旋后,在37℃下水浴1h。取出样品冷却到室温。加入50μL的1M碘乙酸溶液,短暂涡旋至混合均匀,在室温下避光孵育15min。取出样品,加入10μL 1M的DTT淬灭烷基化反应。
置换缓冲液
用至少25ml消化缓冲液(25mM Tris,2mM CaCl2,pH 8.2)平衡PD-10柱;加载1ml的样品或空白溶液到PD-10柱,弃去洗脱液;加入1.5ml消化缓冲液并使其流下,弃去洗脱液。
加入2.0ml消化缓冲液,收集含有样品的消化缓冲液。短暂涡旋。
消化
向每个小管(20μg/管)加消化缓冲液200μL,重新设定酶的浓度为100μg/ml。短暂涡漩将250μL的胰蛋白酶溶液加入到2ml的小样中。短暂涡旋,在37±2℃下孵育5h±15min;在每管小样(2.0ml)中加入68μL 10%TFA溶液淬灭消化反应。短暂涡旋。
保存
酶切的样品在分析之前,可以在2-8℃下保存72h,或者在-70℃下保存2周。
液相设置
溶液及流动相配制
流动相A:将1.0ml FA加入到1L纯水中,搅拌。室温保存,保质期1周;
流动相B:将1.0ml FA加入到1L乙腈中,搅拌。室温避光保存在玻璃容器中,保质期1个月。
标准色谱条件见表26:
表26
色谱柱 | Jupiter 5μC18 |
流动相 | 流动相A:0.1%FA水;流动相B:0.1%FA乙腈 |
流速 | 0.25ml/min |
进样量 | 100μl |
进样器温度 | 6℃ |
柱温 | 55℃ |
运行时间 | 190min |
洗脱梯度见表27:
表27
肽图质谱采集参数如下
一级质谱参数如下:
Duration:159.996mins
Cycle Time:1.8011secs
#Cycles:5330
Period Delay:0.00secs
Scan Mode:None
Scan Type:Positive TOF MS
Intensity Thres.:1cps
Settling Time:0.000ms
MR Pause:1.067ms
MCA:No
GS1:55.00
GS2:55.00
CUR:25.00
TEM:550.00
ISVF:5500.00
TOF Masses(Da):Min=350.0000 Max=2500.0000
Accumulation Time(sec):0.2500
Time Bins to Sum:4 Channels:1 2 3 4
二级质谱参数如下:
Scan Mode:None
Scan Type:Positive Product Ion
Product of Peak:IDA
Resolution Q1:UNIT
Intensity Thres.:0cps
Settling Time:0.000ms
MR Pause:1.067ms
MCA:No
GS1:55.00
GS2:55.00
CUR:25.00
TEM:550.00
ISVF:5500.00
TOF Masses(Da):Min=100.0000 Max=2500.0000
Accumulation Time(sec):0.1000
Time Bins to Sum:4 Channels:1 2 3 4
数据分析
Absciex BiopharmaBeta软件分析,按照m/z Tolerance:±10ppm选取肽段,选择一次漏切,加修饰(见表28)进行搜库。
表28
类型 | 可能的修饰 | 质量位移 |
Glu->pyro-Glu | E | -18.0106 |
去酰胺 | NQ | 0.9840 |
氧化 | M | 15.9949 |
G0 | N | 1298.4760 |
C-末端赖氨酸截除 | K | -128.0950 |
结果
将MIL70胰蛋白酶酶解后,经LC-MS/MS分析发现MIL70的肽段覆盖率为95.6%,其中重链的覆盖率为94.2%、轻链为98.6%。绝大部分理论序列都得到质谱的鉴定,没有鉴定到的肽段为DNSK、VDK、SPK、TKPR等短肽或亲水性强的肽段,在反相色谱里与色谱柱溶剂峰一同流出,不在质谱数据收集的时间段之内。
而针对ERBITUX的序列进行肽段检索可以发现,未检出【QVQLK】、【MNSLQSNDTAIYYCAR】和【TNGSPR】三个肽段。(图13)
4.2MIL70抗体活性分析
4.2.1MIL70抗体C1q结合活性分析
实验方法
用碳酸包被缓冲液(pH 9.6)稀释MIL70抗体和Erbitux,当稀释至250μg/ml时,进行3倍的梯度稀释获得10个浓度点,将稀释样品100μl/孔包被,4℃孵育过夜。第二天洗板后以200μ/孔的PBST+0.1%明胶在37℃封闭1小时。洗板后将C1q蛋白用PBST+0.1%明胶稀释液稀释至2μg/ml,以100μl/孔的量加入到酶标板中,37℃孵育2h。洗板后将anti-C1q-HRP用PBST+0.1%明胶稀释液以1:500的比例稀释,以100μl/孔的量加入到酶标板中,37℃孵育1h。洗板后加100μl TMB室温显色30min,加入100μl2N H2SO4终止液终止TMB显色液反应,450nm处读取OD值。使用酶标仪自带分析软件SoftMax Pro 6.3软件,以样品浓度为横坐标,吸光度平均值为纵坐标,选择四参数方程的回归模型做四参数方程曲线,软件自动生成半最大效应浓度(EC50)。EC50越低,说明样品的活性越高。
实验结果
MIL70和Erbitux与C1q的结合活性实验结果如图14所示,MIL70和Erbitux的EC 50分别为0.901μg/ml、1.022μg/ml,由以上可知,MIL70和Erbitux与C1q的结合活性相似。
4.2.2MIL70抗体FcγRIIIa结合活性分析
实验方法:
用碳酸包被缓冲液(pH 9.6)将anti-His抗体稀释到1μg/mL,以100μl/孔的量加入到酶标板中,4℃孵育过夜。PBST洗板后以封闭液(含5%脱脂奶粉的PBS)在37℃封闭1.5小时。PBST洗板后加入1μg/ml的FcγRIIIa(158V),37℃孵育1h。同时将MIL70、Erbitux和anti-humanκ以1:2(质量比)的比例混匀,37℃孵育1h后对混合液进行稀释,将Erbitux抗体稀释到75μg/ml,再进行2.5倍的梯度稀释获得10个浓度点(包括75μg/ml)。而MIL70将其稀释到10μg/ml,再进行3倍的梯度稀释获得10个浓度点(包括10μg/ml)。酶标板洗板后每孔加入稀释后的抗体和anti-humanκ的混合液100μl,37℃孵育2小时。洗板后将HRP偶联的goatF(ab′)2anti-human IgG F(ab′)2以1:5000的比例稀释(母液浓度为1mg/ml),以100μl/孔的量加入到酶标板中,37℃孵育1h。洗板后加100μl/孔的TMB室温显色30min,最后加入100μl/孔的2N H2SO4终止显色反应,酶标仪450nm处读取OD值,使用酶标仪自带分析软件SoftMax Pro6.3软件,以样品浓度为横坐标,吸光度平均值为纵坐标,选择四参数方程的回归模型做四参数方程曲线,软件自动生成半最大效应浓度(EC50),EC50越低,说明样品的活性越高。
实验结果:
MIL70和Erbitux与FcγRIIIa(158V)的结合活性实验结果如图15所示,MIL70和Erbitux的EC 50分别为0.079μg/ml、0.583μg/ml,由以上可知,MIL70与FcγRIIIa(158V)的结合活性显著强于Erbitux。
4.2.3MIL70抗体EGFR结合活性分析
实验方法
用碳酸包被缓冲液(pH 9.6)将EGFR抗体稀释到2μg/mL,以100μl/孔的量加入到酶标板中,4℃孵育过夜。PBST洗板后以封闭液(含5%脱脂奶粉的PBS)在37℃封闭1.5小时。对Erbitux和MIL70抗体分别进行稀释,当稀释到2μg/ml,再进行4倍的梯度稀释获得10个浓度点(包括2μg/ml)。以100μl/孔的量加入到酶标板中,37℃孵育1.5小时。洗板后将HRP标记的GAH抗体以1:5000的比例稀释(母液浓度为1mg/ml),以100μl/孔的量加入到酶标板中,37℃孵育1h。洗板后加100μl/孔的TMB室温显色30min,最后加入100μl/孔的2N H2SO4终止显色反应,酶标仪450nm处读取OD值,使用酶标仪自带分析软件SoftMax Pro 6.3软件,以样品浓度为横坐标,吸光度平均值为纵坐标,选择四参数方程的回归模型做四参数方程曲线,软件自动生成半最大效应浓度(EC50),EC50越低,说明样品的活性越高。
实验结果
MIL70和Erbitux与EGFR的结合活性实验结果如图16所示,MIL70和Erbitux的EC50分别为7.255ng/ml、7.635ng/ml,由以上可知,MIL70与Erbitux的EGFR结合活性基本相同。
4.2.4MIL70抗体细胞直接杀伤活性分析
实验方法
将A-431细胞用胰酶消化后,用含0.5%FBS的DMEM培养基将细胞重悬,计数后以100μl/孔(2000个细胞)的量接种到96孔板上,随后将细胞培养板放至37℃细胞培养箱(5%CO2)培养16-18h。对Erbitux和MIL70抗体分别用DMEM培养基(0.5%FBS)进行稀释,当稀释到5μg/ml时,再进行2倍的梯度稀释获得10个浓度点(包括5μg/ml)。将稀释后的抗体以100μl/孔加入到接种有细胞的培养板中,96孔板放置37℃细胞培养箱培养,72h后,将培养板取出,吸去96孔板中的培养液,以100μl/孔加入含10%CCK8的DMEM培养基,随后将培养板置于37℃细胞培养箱反应3h,酶标仪450nm处读取OD值,使用酶标仪自带分析软件SoftMax Pro6.3软件,以样品浓度为横坐标,吸光度平均值为纵坐标,选择四参数方程的回归模型做四参数方程曲线,软件自动生成半最大效应浓度(EC50)。
实验结果
MIL70和Erbitux对A-431细胞的直接杀伤活性实验结果如图17所示,MIL70和Erbitux的EC 50分别为0.111μg/ml、0.107μg/ml,由以上可知,MIL70与Erbitux对A-431细胞的直接杀伤活性高度相似。
4.2.5MIL70抗体ADCC活性分析
实验方法
将A-431、NK92MI-CD16a细胞离心收集,培养基重悬后将细胞密度分别调整为1.25×105个/ml、6.25×105个/ml,另外,用培养基将MIL70和Erbitux稀释为50μg/ml时,进行10倍梯度稀释获得10个浓度点。每孔加入A-431、NK-92MI-CD16a各40μl,并加入稀释好的抗体20μl,此为实验组,另设空白孔,每孔加入100μl培养基,最小释放孔和最大释放孔加入40μlA-431细胞和60μl培养基,ADCC背景孔加入40μl A-431细胞,40μl NK-92MI-CD16a细胞,20μl ADCC培养基,将96孔板置于37℃、5%CO2培养箱继续培养5h,孵育终止前15min,往最大释放孔中加入5μl/孔细胞毒检测试剂盒(LDH)中的Lysis solution,将培养板置于37℃、5%CO2培养箱培养15min;将试剂盒中的Catalyst与Dye solution以1:45比例混匀,以100μl/孔加入到培养板中,室温避光孵育20min后,每孔加入50μl试剂盒中的Stop solution终止反应,酶标仪492nm处读取OD值,所有OD值减去空白孔的值后用于数据分析,ADCC作用裂解的细胞百分比按以下公式计算:Target cell lysis(%)=(实验组OD值-ADCC背景孔OD值)/(最大释放孔OD值-最小释放孔OD值)*100%。以抗体浓度为横坐标、Target celllysis(%)为纵坐标,应用酶标仪自带软件拟合四参数方程曲线,方程为y=(A-D)/(1+(X/C)^B)+D,其中A、D分别为四参数方程拟合的ADCC作用裂解细胞最小百分比、最大百分比,B代表斜率,C代表EC50。
实验结果
根据拟合的四参数方程曲线,MIL70对A-431ADCC作用的最大杀伤率为68.39%,明显高于Erbitux的38.30%,MIL70的EC50值为4.88×10-4ug/ml、,也明显低于Erbitux的0.002ug/ml,根据最大杀伤率及EC50值,MIL70的ADCC活性显著强于Erbitux,如图18所示。
4.2.6MIL70抗体CDC活性分析
实验方法
将50μl A-431细胞悬液(细胞数为2×104个,培养基为含10%FBS的DMEM)、50μlMIL70或Erbitux(浓度为300μg/ml)、50μl正常人补体(1:4稀释)加入96孔板中,抗体和补体用DMEM稀释,培养板置于37℃5%CO2培养箱中孵育2h后每孔加入15μl CCK-8显色液,5h后酶标仪450nm处读取OD值。实验设空白组(只含DMEM培养基)、细胞对照组(只含细胞)、抗体对照组(含细胞和抗体)、补体对照组(含细胞和补体)、实验组(含细胞、抗体和补体),用于计算的各组OD值应减去空白组OD值。同时以Rituximab对Daudi细胞的CDC作用作为阳性对照,Daudi接种数为5×104个/孔(培养基为含10%FBS的1640),Rituximab终浓度为20μg/ml。抗体对细胞的CDC活性按如下公式计算:Cytotoxicity%=(1-实验组/补体对照组)×100%。
实验结果
MIL70和Erbitux对A431细胞的CDC活性如图19所示,MIL70和Erbitux对A431细胞无CDC活性,而阳性对照Rituximab对Daudi有较强的CDC活性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (30)
1.抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分,其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;其中,所述抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分为全抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
2.权利要求1的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分,其重链恒定区选自来源于人的IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。
3.权利要求2的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分,其重链恒定区选自来源于人的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
4.权利要求1的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分,其轻链恒定区为来源于人的κ或λ。
5.权利要求1-4任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分,其岩藻糖的含量占总含糖量的5%以下。
6.权利要求5的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分,其岩藻糖的含量占总含糖量的2.5%以下。
7.权利要求5的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分,其岩藻糖的含量占总含糖量的1.8%以下。
8.核酸分子,其含有编码权利要求1-7任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的序列。
9.权利要求8的核酸分子,其含有SEQ ID NO:7所示的序列,和/或SEQ ID NO:8所示的序列。
10.权利要求8的核酸分子,其含有SEQ ID NO:1所示的序列,和/或SEQ ID NO:2所示的序列。
11.重组载体,其含有权利要求8-10任一项的核酸分子。
12.重组细胞,其含有权利要求11的重组载体。
13.权利要求12的重组细胞,其中,所述细胞为哺乳动物细胞。
14.权利要求13的重组细胞,其中所述细胞为CHO细胞。
15.权利要求13的重组细胞,其中所述细胞为CHO-K1细胞。
16.权利要求13的重组细胞,其中,所述哺乳动物细胞对其表达的蛋白部分地、几乎完全地或者完全地不具有岩藻糖修饰功能。
17.权利要求16的重组细胞,其中所述哺乳动物细胞为岩藻糖修饰途径相关基因敲除的细胞。
18.权利要求17的重组细胞,其中所述岩藻糖修饰途径相关基因为gft基因。
19.组合物,其含有权利要求1-7任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分、权利要求8-10任一项的核酸分子、权利要求11的重组载体、或者权利要求12-18任一项的重组细胞,以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
20.权利要求1-7任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分的制备方法,其包括使用权利要求8-10任一项的核酸分子、权利要求11的重组载体、或者权利要求12-18任一项的重组细胞的步骤。
21.权利要求20的制备方法,其具体包括以下步骤:
1)将权利要求8-10任一项的核酸分子的核苷酸序列克隆入表达载体中,得到重组表达载体;
2)将重组表达载体转入宿主细胞,得到重组细胞;
3)将步骤2)获得的重组细胞在目标培养基中进行培养,获得能够表达抗体的细胞株;
4)逐步放大培养步骤3)获得的细胞株,收获培养上清;
5)将步骤4)获得的培养上清进行纯化获得权利要求1-7任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分。
22.权利要求21的制备方法,其中所述细胞为为哺乳动物细胞。
23.权利要求22的制备方法,其中所述细胞为CHO细胞。
24.权利要求22的制备方法,其中所述细胞为CHO-K1细胞。
25.权利要求22的制备方法,其中,所述哺乳动物细胞对其表达的蛋白部分地、几乎完全地或者完全地不具有岩藻糖修饰功能。
26.权利要求25的制备方法,其中所述哺乳动物细胞为岩藻糖修饰途径相关基因敲除的细胞。
27.权利要求26的制备方法,其中,所述岩藻糖修饰途径相关基因为gft基因。
28.权利要求1-7任一项的抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合部分在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
29.权利要求28的用途,其中,所述肿瘤为发生于上皮组织的肿瘤。
30.权利要求29的用途,其中,所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肝癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、阴道癌、膀胱癌、食管癌、口腔癌、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和鼻咽癌。
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---|---|---|---|
CN201510564917.9A CN105399830B (zh) | 2015-09-08 | 2015-09-08 | 抗egfr人源化单克隆抗体、其制备方法及用途 |
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