KR20210125885A - Cd73의 면역관문을 억제하기 위한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Cd73의 면역관문을 억제하기 위한 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

CD73의 면역관문을 억제하기 위한 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD73에 특이적으로 결합하여, CD73 단백질의 효소 활성 저해능력을 감소시킬 뿐만 아니라 암의 전이 또는 암의 성장을 저해할 수 있으므로 암의 치료제로 활용될 수 있다.

Description

CD73의 면역관문을 억제하기 위한 항체 및 이의 용도{Antibody for suppress the immune checkpoint of CD73 and uses thereof}
CD73의 면역관문을 억제하기 위한 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
전통적인 암 치료 방법은 방사선치료, 화학적 요법 그리고 항암제 치료가 있고, 이와 같은 방법은 직접적으로 암의 성장을 저해함으로써 암을 치료할 수 있다. 그러나 암 세포들은 항암제에 저항성을 나타내고 항암제 사용은 암 세포가 아닌 다른 세포들도 공격해서 부작용 문제가 발생 할 수 있다. 이러한 문제들은 극복하고자 새로운 암 치료 방법으로 면역치료제가 개발되었다. 면역치료제는 암 세포가 아닌 면역세포를 표적으로 해서 면역세포가 암 세포를 공격하는 것을 유도한다.
면역치료제 중에서 면역 관문 억제제(immune checkpoint blockade)가 최근 주목 받고 있다. 면역 관문(immune checkpoint)은 면역반응을 촉진하거나 억제하는 수용체이다. 면역 관문은 면역반응을 조절하는데 필수적이며 암에서도 면역 관문이 작동하므로 암은 면역 관문을 통해 면역 회피를 나타낸다. 최근에는 면역 관문을 이용해서 암을 치료하고자 하는 많은 연구가 보고되었다. 먼저 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4) 와 PD-1(programmed cell death protein 1) 면역 관문을 이용하는 항체가 개발되었고, 흑색종 암 환자에서 생존율 증가를 보여주었다. CTLA-4와 PD-1 면역 관문 억제제는 다양한 암에서 사용되었고 여러 암에서도 효능을 보여주었다. 그러나 일부 환자들은 CTLA-4와 PD-1을 이용한 면역 관문 억제제 치료에서 효과가 나타나지 않았다. 그러므로 새로운 면역 관문에 대한 많은 연구가 진행되었고 암의 면역 회피 기작들 중 한가지는 면역 억제 아데노신의 높은 농도로 인한 것으로 알려졌다.
한편, "CD73(Cluster of Differentiation 73)"은 5' 뉴클레오타이드의 탈인산화를 촉매하는 외부 뉴클레오티다아제(ecto-nucleotidase)로 주로 AMP(adenosine monophosphate)를 아데노신으로 변환시키는 역할을 한다. CD73은 GPI 앵커(anchor)를 통해 세포막에 호모다이머(homodimer) 형태로 존재하며 모노머(monomer)는 65 kDa이고, N 말단과 C 말단 도메인이 유동성 있는 나선형의 링커로 연결되어 있는 구조이다. 즉, CD73은 아데노신의 생성에 관여하며 암세포에서 과발현되고 면역억제작용을 유도한다. 따라서 면역 억제 아데노신의 농도에 기인한 새로운 면역 관문 치료제의 연구가 필요하다.
일 양상은 CD73에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
일 양상은 CD73에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 구체적으로, 서열번호 1, 4, 7, 10, 14 및 17로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH1, 서열번호 2, 5, 8, 11, 15 및 18로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH2, 및 서열변호 3, 6, 9, 12, 13, 16 및 19로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20, 23, 26 및 29으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL1, 서열번호 21, 24, 27 및 30으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL2, 및 서열번호 22, 25, 28 및 31로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하고, CD73과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 12 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역; 또는 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역인 것일 수 있다.
또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37 및 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39, 40, 41 및 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 66, 69, 72, 75 및 78로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH1, 서열번호 67, 70, 73, 76 및 79로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH2, 및 서열변호 68, 71, 74, 77 및 80으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 81, 84, 87, 90 및 93으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL1, 서열번호 82, 85, 88, 91 및 94로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL2, 및 서열번호 83, 86, 89, 90 및 95로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하고, CD73과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 66으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 68로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 82로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 70으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 86으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 73으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 74로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 75으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 76으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 90으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 91로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 92로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역; 또는 서열번호 78로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 80으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 95로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역인 것일 수 있다.
또한, 상기 항체의 중쇄불변영역 및 경쇄불변영역은 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 또는 이들의 조합인 항체 불변영역일 수 있다. 상기 불변영역은 예를 들어, IgG1 항체 불변영역으로부터 유래된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 개체의 종간 교차 반응성(species cross-reactivity)을 가지는 것일 수 있다. 상기 개체는 척추동물일 수 있고, 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등인 것일 수 있으며 종(species)은 예를 들어, 인간(Homo sapiens), 원숭이, 랫트, 마우스 등인 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 항-CD73 항체는 CD73이 활성 구조로 변환되는 것을 저해하거나 CD73에 결합하는 저해제와 경쟁적으로 결합함으로써 CD73의 효소 활성을 저해하는 것을 확인하였다. 또한, 양성대조군인 MEDI9447 또는 CPI-006과 유사한 에피토프에 결합함으로써 세포내이입 활성이 나타나는 것을 확인하였다. 따라서, 일 양상에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CD73에 특이적으로 결합하면서, 종간 교차 반응성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 명세서 내 용어, "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위(determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
본 명세서 내 용어, "항체(antibody)"는 바이러스, 세균 등 항원을 비활성화시키고 신체에 침입한 미생물에 대항하여 세포 외부 자극을 유도하는 당단백질을 의미하며, 특히 면역글로불린를 의미한다. 본 발명은 항-CD73 항체에 관한 것이므로, 특별히 다른 지칭이 없는 경우에 수식 없이 사용된 '항체'라는 용어는 CD73의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-CD73 항체를 의미할 수 있다. 본 발명의 범위에는 CD73에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다. 완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO88/106630, WO88/07085, WO88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
일 실시예에서, 상기 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태(IgG)이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서 내 용어, "중쇄(Heavy Chain: HC 또는 CH)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역(Variable Region: VR) 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체 길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, "경쇄(Light Chain: LC 또는 CL)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
상기 항체는 단일 클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 단일 클론 항체이면서 완전인간항체 또는 인간-마우스 키메라 항체일 수 있다. 상기 단일 클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체 중 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일 클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다. 일 실시예에서 본 발명은 의도치 않은 면역반응을 최소화할 수 있는 완전인간항체에 관한 것이다.
상기 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린)뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
상기 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (Complementary Determining Region: CDR. 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인(Variable Region of Heavy Chain)을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인(Variable Region of Light Chain)을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (Complementarity Determining Region: CDR. 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
본 명세서 내 용어 "골격 영역"(Framework Region: FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
본 발명에서 "항원 결합 단편"이란, 항원결합능력을 지니는 항체의 단편을 의미한다. "Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다. "Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항 체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다. "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서 내 용어 "파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술을 의미한다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만 개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 Ⅲ 단백질 또는 유전자 VⅢ 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열을 유전자 Ⅲ 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 Ⅲ 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이 시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 CD73을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 상기 항-CD73 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상기 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press,New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 구체적으로, 서열번호 32 또는 서열번호 33의 중쇄가변영역, 및 서열번호 39 또는 서열번호 40의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 서열번호 32의 중쇄가변영역 및 서열번호 39의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산 또는 서열번호 33의 중쇄가변영역 및 서열번호 40의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산을 제공한다. 예를 들어, 상기 서열번호 32의 중쇄가변영역을 코팅하는 핵산은 서열번호 43으로 표시되는 것일 수 있으며, 상기 서열번호 39의 경쇄가변영역을 코팅하는 핵산은 서열번호 44로 표시되는 것일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 33의 종쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 45로 표시되는 것일 수 있으며, 상기 서열번호 40의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 46으로 표시되는 것일 수 있다. 또한, 서열번호 96, 98, 100, 102 또는 104의 중쇄가변영역, 및 서열번호 97, 99, 101, 103 또는 105의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 서열번호 96의 중쇄가변영역 및 서열번호 97의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산, 서열번호 98의 중쇄가변영역 및 서열번호 99의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산, 서열번호 100의 중쇄가변영역 및 서열번호 101의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산, 서열번호 102의 중쇄가변영역 및 서열번호 103의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산 또는 서열번호 104의 중쇄가변영역 및 서열번호 105의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산을 제공한다. 예를 들어, 서열번호 96의 중쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 106으로 표시되는 것일 수 있고, 상기 서열번호 97의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 107로 표시되는 것일 수 있다. 서열번호 98의 중쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 108으로 표시되는 것일 수 있고, 상기 서열번호 99의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 109로 표시되는 것일 수 있다. 서열번호 100의 중쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 110으로 표시되는 것일 수 있고, 상기 서열번호 101의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 111로 표시되는 것일 수 있다. 서열번호 102의 중쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 112으로 표시되는 것일 수 있고, 상기 서열번호 103의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 113로 표시되는 것일 수 있다. 서열번호 104의 중쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 114으로 표시되는 것일 수 있고, 상기 서열번호 105의 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 115로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 명세서 내 용어 "핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 핵산은 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서 내 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6xHis(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다. 다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다. 상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 예방용, 개선용 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적 조성물 또는 건강기능식품인 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 면역관문 억제제 또는 화학항암제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 면역관문 억제제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 등인 것일 수 있고, 상기 화학항암제는 예를 들어, 화학요법 제제(chemotherapy drug), 티로신 키나아제 억제제(tyrosine　kinase　inhibitor) 등인 것일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 방사선 치료제와 병용 투여되는 것일 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물은 CD73을 발현하는 다양한 암 종에서 항암 활성이 증가하는 바 암의 치료제로 사용될 수 있다.
예를 들어, (a) 상기 CD73에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방용 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 CD73에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
상기 조성물은 상술한 본 발명의 항- CD73 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CD73에 높은 친화도로 결합하여 CD73을 과발현하는 암세포의 이동을 억제할 수 있으므로, 암의 예방 및 치료에 사용 가능하다. "예방"은 상기 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암의 발전의 억제, 암의 경감 또는 암의 제거를 의미한다.
"CD73을 과발현하는 암"은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교하여 유의적으로 더 높은 수준으로 CD73을 암 세포 표면에 갖고 있는 암을 의미한다. 상기 조성물에 적용되는 질환인 암은 CD73을 과발현하는 암이고, 예를 들어 유방암, 대장암, 교모세포종, 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 흉선종, 식도암, 취암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 또는 피부암 등일 수 있다.
다른 양상은 상기 CD73에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암세포의 전이 또는 침윤을 억제하기 위한 조성물일 수 있다. 또한, 상기 CD73에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 처리하여 암세포의 전이 또는 침윤을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여일 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 일 실시예에서, 정맥 주사 형태로 투여되는 것일 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 암 예방 또는 개선용 건강기능식품에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 분획물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 수면 개선용 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 건강기능식품 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 CD73에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 처리하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 CD73에 대한 항체를 통해 샘플에서의 CD73 발현 수준을 측정함으로써 암을 진단할 수 있다. 발현 수준은 통상적인 면역분석 방법에 따라 측정할 수 있으며, 상기 CD73에 대한 항체를 이용한 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 통해 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 마커의 단백질이 고발현 되어 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 정상 위조직, 혈액, 혈장 또는 혈청) 보다 강하게 나오는 경우에는 암으로 진단된다.
다른 양상은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 발명에 따른 CD73에 대한 항체를 포함하고, 시료와 항체가 반응함으로써 나타내는 시그널을 분석하여, 암을 진단할 수 있다. 이 때, 상기 시그널은 항체에 결합된 효소 예를 들어 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 또는 사이토크롬 P450을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이 때 효소에 대한 기질은 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 키트는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 포함할 수 있으며, 상기 레이블은 화학물질 (예컨대, 바이오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, -β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 암 진단을 위해 사용되는 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이를 통해 CD73 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다.
일 양상에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD73에 특이적으로 결합하는 것으로서, CD73 단백질의 효소 활성 저해능력을 감소시킬 뿐만 아니라 암의 전이 또는 암의 성장을 저해할 수 있으므로 암의 치료제로 활용될 수 있다. 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종간 교차 반응성을 나타냄으로써, 전임상 단계인 동물실험에 사용될 수 있으므로 면역치료제의 부작용, 독성 및/또는 안정성을 시험에 소요되는 시간, 비용 등을 절약할 수 있다.
도 1은 바이오패닝을 통해 선별된 항-CD73 항체의 CD73에 대한 결합력을 나타내는 그래프이다. 파지 항체의 CD73 결합은 450㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였고 데이터의 표준편차는 오차막대로 표시하였다.
도 2a는 항-CD73 파지 항체의 VH와 VL 유전자 서열을 CH와 CL 유전자 서열을 포함하는 pdCMV-dhfr 벡터에 클로닝하여 제조한 인간 IgG1 발현 벡터를 나타낸다.
더 2b는 인간 IgG1 항체의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것으로 Lane 1~12부터 차례대로 L2-3, L2-47, L4-1, L4-4, L4-5, L4-46, L4-66, L6-1, L6-7, L6-30, L6-37, L8-24이다.
도 3a는 정제된 12가지 인간 IgG1 isotype 항체의 CD73에 대한 결합여부를 확인하기 위하여 ELISA를 수행한 결과를 나타낸다.
도 3b는 정제된 12가지 인간 IgG1 isotype 항체의 CD73 효소 활성 저해 여부를 비교하기 위하여 MDA-MB-231 세포에서 in vitro assay를 수행한 결과를 나타낸다. CD73 효소 활성은 malachite green reagent로, CD73에 의해 분해된 인산염을 측정하여 확인하였다.
도 3c는 인간, 원숭이, 랫트, 그리고 마우스 CD73에 교차 결합력을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것으로 CD73에 대한 항체의 결합은 450 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.
도 4는 APBA2-01, APBA2-02 항체와 수용성 CD73의 결합력을 비교한 그래프로 A~D는 각각 인간, 원숭이, 랫트 및 마우스 CD73에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 5a는 인간 CD73을 발현하는 MDA-MB-231 세포에서 APBA2-01, APBA2-02 항체와 멤브레인 CD73의 결합력 비교를 유세포분석으로 확인한 그래프이다.
도 5b는 마우스 CD73을 발현하는 4T1 세포에서 APBA2-01, APBA2-02 힝체와 멤브레인 CD73의 결합력 비교를 유세포분석으로 확인한 그래프이다.
도 6a는 APBA2-01, APBA2-02 항체가 CPI-006의 에피토프에 경쟁적으로 결합하는지 여부를 bio-Layer Interferometry로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 APBA2-01, APBA2-02 항체가 MEDI-9447의 에피토프에 경쟁적으로 결합하는지 여부를 bio-Layer Interferometry로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 수용성 CD73 에 대한 APBA2-01, APBA2-02 항체의 효소 활성의 저해를 malachite green assay로 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8a는 MDA-MB-231 세포에서 APBA2-01, APBA2-02 항체의 멤브레인 CD73 효소 활성의 저해를 malachite green assay로 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8b는 4T1 세포에서 APBA2-01, APBA2-02 항체의 멤브레인 CD73 효소 활성의 저해를 CellTiter-Glo® assay로 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8c는 MDA-MB-231 세포에서 APBA2-01, APBA2-02 항체의 멤브레인 CD73 효소 활성의 저해를 malachite green assay로 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. 표준편차는 오차막대로 표시하였고 세로축은 RUL(relative light units)로 표시하였다.
도 8d는 4T1 세포에서 APBA2-01, APBA2-02 항체의 멤브레인 CD73 효소 활성의 저해를 CellTiter-Glo® assay로 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. 표준편차는 오차막대로 표시하였고 세로축은 RLU(relative light units)로 표시하였다.
도 9는 APBA2-01, APBA2-02 항체의 멤브레인 CD73 세포 내 이입 여부를 주사현미경으로 확인한 결과이다. FITC 시그널에 해당하는 CD73은 녹색으로 표현하였고 눈금자를 함께 표시하였다.
도 10a는 전이성 유방암 마우스 모델에서 평균 폐 무게를 측정하여 APBA2-01, APBA2-02 항체의 항암 효능을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다; *: P< 0.05 (one-way ANOVA).
도 10b는 전이성 유방암 마우스 모델에서 폐 전이 콜로니 수를 측정하여 APBA2-01, APBA2-02 항체의 항암 효능을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다; *: P< 0.05 (one-way ANOVA).
도 11a는 유방암 마우스 모델에서 종양 부피를 측정하여 APBA2-01, APBA2-02 mIgG 항체의 암 성장 저해 효능을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다; *: P< 0.05. **: P< 0.01, ns(not significant: P> 0.05 (two-way ANOVA).
도 11b는 유방암 마우스 모델에서 항체 시료간 종양 성장 억제력 비교하여 APBA2-01, APBA2-02 mIgG 항체의 암 성장 저해 효능을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다
도 11c는 유방암 마우스 모델에서 마우스의 무게를 측정하여 APBA2-01, APBA2-02 mIgG 항체의 암 성장 저해 효능을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다; *: P< 0.05. **: P< 0.01, ns(not significant: P> 0.05 (two-way ANOVA).
도 12a는 MDA-MB-231 세포에서 멤브레인 CD73에 대한 항-CD73 항체의 효소 활성 저해 능력을 malachite green assay 방법으로 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12b는 MDA-MB-231 세포에서 CDC73에 대한 항-CD73 항체의 효소 활성 저해를 CellTiter-Glo® assay 방법으로 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13a는 4T1 세에서 Myxengo 3, 4, 6, 7, 및 15 항체의 멤브레인 CD73 단백질에 대한 결합력을 확인한 그래프이다.
도 13b는 4T1.2 세포에서 Myxengo 3, 4, 6, 7, 및 15 항체의 멤브레인 CD73 단백질에 대한 결합력을 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
제조예 1. 바이오 패닝(bio panning)을 통한 항-CD73 항체의 선별
1-1. CD73에 특이적으로 결합하는 파지 항체 선별
인간과 마우스 CD73 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 클론을 선별하고자 HuDVFab-8L 파지 항체 라이브러리를 이용한 바이오 패닝을 수행하였다. 먼저, 재조합 인간 CD73 단백질(Sino Biological, China) 재조합 마우스 CD73 단백질(Sino Biological)을 각각 Dynabeads?? M-280 Tosylactivated 비드로 4℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 각각의 CD73 단백질이 결합된 비드를 HuDVFab-8L (HuDVFab-L1~L6, L8, L12) 재조합 항체(Fab가 파지의 외피단백질인 pⅢ에 디스플레이) 라이브러리가 함유된 블로킹 버퍼[blocking buffer: 3% 스킴 밀크(skim milk), 0.1% tween-20이 함유된 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline; PBS)]에 처리하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이후, CD73 단백질에 비특이적으로 결합하는 재조합 파지를 KingFisher mL 장비를 이용하여 제거하였다. CD73 단백질에 특이적으로 결합하는 파지는 0.2 M 글라이신(glycine, pH 2.2) 버퍼를 처리하여 용출한 후 1 M tris-HCl(pH 9.0) 버퍼를 처리하여 중화시켰다. 항체 라이브러리의 경쇄 유전자가 내재되어 있는 각각의 TG1 세포(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)에 중화된 파지를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 감염시켰다. 파지가 감염된 TG1 세포를 LB/ACT 고체 배지(50 ㎍/㎖ 앰피실린(ampicillin), 10 ㎍/㎖ 카르베니실린(carbenicillin), 및 10 ㎍/㎖ 테트라사이클린(tetracycline)이 포함된 LB 배지)에 도말하였고 27℃에서 16시간 동안 배양하여 감염되지 않은 TG1 세포를 제거하였다. 배양된 콜로니가 포함된 플레이트에 10 ㎖의 액체 배지를 첨가하여 풀어준 후 4.8 × 108 세포/㎖로 희석하고 Ex-phage를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 TG1 세포에 감염시켰다. 이후 원심분리기를 사용하여 감염된 TG1 세포를 가라앉히고 상등액을 제거한 후에 5 ㎖의 2×YT/ACTKA 배지(50 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin), 10 ㎍/㎖ 카르베니실린(carbenicillin), 10 ㎍/㎖ 테트라사이클린(tetracycline), 50 ㎍/㎖ 카나마이신(kanamycin), 0.001% 아라비노스(arabinose)가 포함된 2×YT 배지)로 TG1 세포를 재현탁하여 27℃에서 6시간 동안 배양하였다. 이후, 원심 분리기를 이용하여 파지가 포함된 상등액을 확보하였고 CD73 단백질이 결합된 Dynabeads?? M-280 Tosylactivated 비드와 4℃에서 약 20시간 동안 반응하여 결합시켰다. 이후, 상기 바이오 패닝 과정을 3회 반복 수행하여 CD73에 특이적으로 결합하는 파지 항체를 선별하였다. 그 결과, HuDVFab-8L 파지 항체 라이브러리로부터 CD73에 결합하는 L2, L4, L6, L8 경쇄를 포함하는 다클론성 항체(polyclonal antibody)들을 선별하였다.
1-2. CD73에 특이적으로 결합하는 단일클론 파지 항체 선별
상기 1-2에서 선별한 다클론성 항체 중 CD73에 특이적으로 결합하면서 중쇄의 CDR(HCDR) 서열이 서로 다른 단일클론 항체(monoclonal antibody)를 파지 ELISA(phage enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하여 선별하였다. 재조합 인간 CD73 단백질과 재조합 마우스 CD73 단백질을 코팅 버퍼(coating buffer, 0.1 M NaHCO3, pH 9.6)에 2 ㎍/㎖ 농도로 희석한 후 96-웰 Maxisorp ELISA 플레이트(Nunc, Denmark)에 웰당 50 μL씩 분주하고 4℃에서 16시간 동안 반응하여 CD73 단백질을 플레이트에 코팅하였다. 코팅되지 않은 단백질과 버퍼는 모두 제거하고 블로킹 버퍼를 웰당 200 μL씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후 버퍼를 모두 제거하고 0.1% tween-20이 포함된 PBS(PBS-T) 버퍼를 모든 웰에 200 μL씩 분주하였으며, 이러한 세척 과정을 3회 반복하였다. 블로킹 버퍼에 파지가 포함된 상등액을 1/10로 희석하여 각 웰에 50 μL씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기와 동일한 방법으로 세척을 하고 goat anti-M13 HRP(horseradish peroxidase)(GE Healthcare, Chicago, Illinois) 항체를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기와 동일한 방법으로 세척한 후 플레이트의 모든 웰에 TMB (3,3',5,5
Figure pat00001
(BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey) 기질을 50 μL씩 분주하였다. 이후, Model 680 Microplate Reader(Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) 장비로 450㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 CD73에 특이적인 단일클론 파지 항체 14가지를 선별하였다.
도 1은 바이오패닝을 통해 선별된 항-CD73 항체의 CD73에 대한 결합력을 나타내는 그래프이다.
도 1에 나타난 바와 같이, L2-20을 제외한 파지 항체들은 모두 인간 CD73에 결합하였다. 또한, L2-47, L4-66, L6-1, L6-30, L6-37 파지 항체들은 인간 CD73에 대한 결합력의 50% 이상에 해당하는 결합력으로 마우스 CD73에 결합하였다. L8-34 파지 항체는 CD73이 아닌 CD32b 단백질에 비 특이적으로 결합하였다. HCDR 서열이 다른 14가지 중에서 인간 CD73에 대해 결합이 약한 L2-20과 비특이적으로 결합하는 L8-34를 제외한 항-CD73 파지 항체 12가지를 선별하여 이후 실험에 이용하였다.
제조예 2. 인간 항-CD73 IgG1 항체의 생산 및 선별
2-1. 항-CD73 인간 IgG1 isotype 발현 벡터의 제조
상기 제조예 1에서 선별된 12가지의 항-CD73 파지 항체를 클로닝하여 인간 IgG1 항체로 제조하였다. 구체적으로, 상기 제조예 1을 통해 선별된 파지 항체의 VL (light chain variable region, 경쇄가변영역)과 VH (heavy chain variable region, 중쇄가변영역) 유전자 서열을 인간 IgG1 (immunoglobulin G1) isotype의 CL (constant light chain, 경쇄불변영역)과 CH1-CH2-CH3 (constant heavy chain, 경쇄불변영역) 유전자 서열을 포함하는 pdCMV-dhfr(강원대학교 홍효정 교수님 제공) 발현벡터에 클로닝하여 온전한 IgG1 형태로 제작하였다(도 2a). 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)은 Pyrobest?? DNA 중합효소(Takara, Japan)를 이용하였으며 T100 Thermal Cycler 장비로 실험을 진행하였다. 상기 제조예 1에서 선별된 파지 항체의 경쇄 서열을 클로닝하기 위하여 하기 표 1의 서열번호 47, 서열번호 48을 이용해 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 20초 조건에서 PCR 반응을 수행하여 경쇄 리더 서열(leader sequence)을 증폭하였다. 상기 제조예 1에서 선별된 파지 항체의 VL 유전자로부터 서열번호 49, 서열번호 50을 이용해 PCR 반응을 수행하여 VL 서열의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 두 가지의 PCR 생성물을 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 60초 조건에서 조합 중합효소연쇄반응(assembly PCR)으로 융합하였다. 이후, 상기 PCR 생성물과 pdCMV-dhfr 벡터를 37℃와 55℃에서 HindⅢ와 BsiWI (Takara) 제한 효소로 각각 처리하여 반응시켰다. 두 가지 제한 효소가 처리된 리더 서열-VL 유전자 절편과 pdCMV-dhfr 벡터를 T4 DNA Ligase 를 이용하여 라이게이션 과정을 수행하고 CaCl2가 처리된 수용성 세포(competent cell)에 열 충격을 가하여 형질전환 하였다. 다음으로, 상기 제조예 1에서 선별된 파지 항체의 중쇄 서열을 클로닝하기 위하여 서열번호 51, 서열번호 52를 이용해 EcoRI 서열이 포함된 중쇄 리더 서열을 PCR 반응으로 증폭하였다. 서열번호 53, 서열번호 54를 이용해 ApaI 서열이 포함된 VH 서열의 유전자를 PCR 반응으로 증폭하였다. 증폭된 두 가지의 PCR 생성물을 assembly PCR 반응을 통해 융합(리더 서열-VH)하였고 EcoRI와 ApaI 제한효소를 처리였다. 제한효소가 처리된 리더 서열-VH 유전자 절편을 경쇄(VL-CL) 유전자와 CH1-CH2-CH3 유전자가 삽입된 pdCMV-dhfr 벡터에 상기와 동일한 방법으로 클로닝하여 인간 IgG1 발현 벡터를 제조하였다.
한편, 양성대조군으로 사용된 CPI-006 (Corvus Pharmaceuticals, Burlingame, California)와 MEDI9447 (MedImmune, Gaithersburg, Maryland)의 중쇄, 경쇄 유전자(WO 2018/013611 A1, WO 2016/075099 A1)는 코스모진텍에서 합성하였고 경쇄 제한효소로 HindⅢ (Takara)와 XbaI (Takara) 및 중쇄 제한 효소로 EcoRⅠ(Takara)와 NotI (Takara)을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 pdCMV-dhfr 벡터에 클로닝 하였다.
컨스트럭트 서열번호 올리고뉴클레오티드 서열 (5′- 3′)
Human IgG1
(경쇄)		 서열번호 47 gatcaacaagcttgccaccatggagacccacagccag
서열번호 48 cccctccaccccgctcagccacag
서열번호 49 ctgagcggggtggagggggacatccagatgacccagtctccatcttccctgtct
서열번호 50 ccaccgtacgtttgatttccagcttggtcccttggccgaaggt
Human IgG1
(중쇄)		 서열번호 51 gatcaacgaattcgccaccatggagtggtcctgggtc
서열번호 52 ggaaagcactccggtggtcacgctgag
서열번호 53 gcgtgaccaccggagtgctttcccaggtgcagctggtgcagtctgg
서열번호 54 cagtgggcccttggtggaggctgaggagacggtgaccagggtgccttg
2-2. 항-CD73 인간 IgG1 isotype 항체의 생산 및 정제
선별된 12가지의 항-CD73 인간 IgG1 항체를 생산하기 위하여 상기 2-1에서 클로닝한 pdCMV-dhfr 벡터를 ExpiCHO-S™ (Gibco) 세포에 형질주입(transfection)하였다. 구체적으로, ExpiCHO-S™ 세포는 ExpiCHO-S™ 발현배지(Gibco, ThermoFisher scientific)를 사용하여 37℃, 140 rpm, 습도 80%, CO2 5% 조건의 진탕배양기(shaking incubator)에서 배양하였다. 최소 3회 계대 배양된 ExpiCHO-S™ 세포에 선별된 12가지의 항체 유전자가 삽입된 벡터를 ExpiFectamine CHO Transfecton kit와 OptiPROTM SFM (1
Figure pat00002
)(Gibco)를 이용하여 형질 주입하였다. 이후 20시간 동안 상기와 동일한 조건의 진탕배양기에서 배양하였다. 배양된 세포에 ExpiFectamineTM CHO 피드(feed)와 인핸서(enhancer)를 처리하고, 7일 동안 상기와 동일한 조건으로 배양하였다. 배양액을 회수하고 4,000 rpm, 15분, 4℃에서 원심분리하여 단백질 시료가 함유된 상등액을 확보한 후 상등액을 0.2 ㎛ 여과지에 여과하여 불순물을 제거하였다. 이후, CHO 세포로부터 생산된 항체 시료를 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 구체적으로, CaptureSelect IgG-CH1 Affinity Matrix 레진을 불순물이 제거된 배양액에 4℃에서 16시간 동안 반응시켜 배양액의 항체 시료를 레진에 결합시켰다. 반응시킨 레진을 TBS 버퍼(pH7.4)를 사용하여 10 CVs (column volume, 컬럼부피)만큼 세척한 후에 100 mM 시트르산(citric acid, pH 3.0) 버퍼를 흘려주어 항체 시료를 용출하였고 1M의 Tris-HCl(pH 9.0) 버퍼를 첨가하여 약산성(pH6.0~6.5)으로 중화시켰다. 중화된 버퍼를 0.2 ㎛ 여과지로 여과하여 불순물을 제거한 후 단백질을 UV 280 ㎚ 파장에서 측정하여 정량 분석하였다.
2-3. 항-CD73 인간 IgG1 isotype 항체 단백질의 크기 분석
상기 2-2에서 생산 및 정제된 항체 단백질의 크기를 SDS-PAGE로 분석하였다. 먼저, 항체 단백질을 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 Pierce™ LDS 샘플 버퍼와 비-환원(4
Figure pat00003
; Thermo Fisher Scientific) 버퍼에 희석한 후 5분 동안 시료를 가열하였다. 이후 단백질 시료를 4~15% Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel (Bio-Rad) 구배(gradient)로 하여 웰당 1 ㎍씩 로딩한 후 PowerPac™ Basic Power Supply 를 이용하여 140 V에서 40분 동안 전기영동하였다. 전기영동이 완료된 겔을 Brilliant Blue R 250 단백질 염색 용액(ELPISBIO, 대한민국)에 60분 동안 반응시킨 후 탈색 버퍼[30% 메탄올(methanol), 10% 아세트산(acetic acid)]를 처리하여 단백질 밴드를 관찰하였다.
도 2b는 인간 IgG1 항체의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 2b에 나타난 바와 같이, 12가지의 정제된 항체의 중쇄과 경쇄은 각각 50 kDa 및 25kDa의 크기를 나타내며 상기 단백질 밴드는 모두 이론적 크기와 유사한 위치에서 관찰되었다.
2-3. 항-CD73 인간 IgG1 isotype 항체의 CD73에 대한 결합력 확인
상기 2-2에서 생산 및 정제된 12 가지의 인간 항-CD73 IgG1 항체의 CD73에 대한 결합력을 비교하기 위해 ELISA 실험을 수행하였다. 재조합 인간 CD73 단백질을 카보네이트 코팅 버퍼에 1 ㎍/㎖의 농도로 희석한 후 96-웰 Maxisorp ELISA 플레이트에 웰당 100 μL씩 분주하고 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 코팅되지 않은 단백질과 버퍼는 모두 제거하고 3% BSA와 0.1% tween-20이 포함된 PBS 버퍼(pH 7.4)를 웰당 300 μL씩 분주한 후 상온에서 2시간 동안 반응시켜 블로킹을 수행하였다. 2시간 후 남아있는 버퍼를 제거하고 PBS-T 버퍼를 모든 웰에 300 μL씩 분주한 후 제거하는 과정을 3회 반복하여 세척하였다. 상기 PBS 버퍼에 100 nM의 농도로 순차적으로 희석하여 항-CD73 IgG1 항체를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후에 Donkey anti-human IgG Fc HRP(Jackson ImmunoResearch, West Grove, Baltimore Pike) 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 방법과 동일한 세척 과정을 수행한 후, TMB 기질을 모든 웰에 100 μL씩 분주하여 7분 동안 반응시키고 Model 680 Microplate Reader기로 450㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군(Rituximab) 및 양성대조군(CPI-006, MEDI9447) 시료에 대하여도 상기와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다.
도 3a는 정제된 12가지의 인간 항-CD IgG1 항체의 인간 CD73에 대한 결합력을 확인한 그래프이다.
도 3a에 나타난 바와 같이, 정제된 12가지의 항체 중 9가지와 두 가지 양성대조군은 BSA에 비해 인간 CD73에 현저하게 강하게 결합하였고 나머지 3가지의 항체(L4-46, L6-7 및 L6-37)는 상대적으로 약하게 결합하였다. 또한, 음성대조군(rituximab IgG1) 항체는 인간 CD73에 결합하지 못하였다.
2-4. 멤브레인 CD73 단백질에 대한 효소 활성 확인
상기 2-2에서 생산 및 정제된 12가지의 인간 항-CD73 IgG1 항체의 멤브레인 CD73에 대한 효소 활성의 저해능력을 비교하기 위하여, 세포 표면에 멤브레인 CD73을 발현하는 MDA-MB-231 세포(한국세포주은행)에서 malachite green assay를 수행하였다. MDA-MB-231 세포를 2.0 × 104 세포/웰이 되도록 96 웰 플랫 플레이트에 분주하고 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 20시간 동안 배양하였다. 배양 후, assay 버퍼로 2회씩 세척을 하고 12가지의 인간 항-CD73 IgG1 항체 시료를 500 nM 농도로 assay 버퍼에 희석한 후 각 웰에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 250 μM의 AMP를 각 웰에 첨가하여 37℃에서 20분 동안 반응시키고 세포를 제외한 40 μL의 상등액을 새로운 96 웰 플레이트에 분주하였다. CD73의 효소 활성을 측정하기 위해 Malachite Green Phosphate Detection Kit를 사용하여 상등액에 포함된 인산염를 검출하고 Epoch Microplate Spectrophotometer 장비로 620㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군(Rituximab) 및 양성대조군(CPI-006, MEDI9447) 시료에 대하여도 상기와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다.
도 3b는 정제된 12가지의 인간 항-CD73 IgG1 isotype 항체가 CD73 효소 활성을 저해하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 3b에 나타난 바와 같이, 12가지의 항-CD73 인간 IgG1 항체 중 5가지의 항체(L2-3, L4-4, L4-5, L4-66 및 L6-1)는 음성대조군과 비교하여 50% 이상의 CD73 효소 활성 저해 능력을 나타내었고 이들 중 L6-1 항체는 90%의 CD73 효소 활성의 저해를 보여 CPI-006(91%)과 유사하게 높은 저해 능력을 보여주었다. 나머지 4가지의 항체(L2-3, L4-4, L4-5, L4-66)는 순서대로 63%, 61%, 58%, 50%의 CD73 효소 활성을 저해하여 MEDI9447 (34%)과 비슷하거나 높은 저해 능력을 보여주었다.
2-5. 항-CD73 인간 IgG1 isotype 항체의 CD73에 대한 교차결합력 확인
상기 2-3에서 양성대조군과 유사하거나 상대적으로 높은 CD73 효소 활성의 저해 능력을 나타내는 5가지의 인간 항-CD73 IgG1 항체(L2-3, L4-4, L4-5, L4-66, L6-1)의 인간, 원숭이, 랫트 및 마우스 CD73 단백질(Sino Biological)에 대한 교차결합력을 비교하기 위해 상기 2-3과 동일한 방법으로 ELISA 실험을 수행하였다.
도 3c는 인간, 원숭이, 랫트 및 마우스 CD73에 대한 교차결합력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3c는 L4-66, L6-1 항체와 MEDI9447 항체는 인간, 원숭이, 랫트 및 마우스 CD73에 모두 반응하였으나 L2-3, L4-5 항체와 CPI-006 항체는 인간과 원숭이 CD73에만 반응하였고 L4-4 항체는 인간, 원숭이 및 랫트 CD73에만 반응하여 서로 다른 결합 패턴을 보여주었다. 이상의 결과를 토대로, MEDI9447 항체와 유사하게 인간과 마우스 CD73에 교차 결합하는 2가지의 항체(L4-66, L6-1)를 선별하였고 각각 APBA2-01과 APBA2-02로 명명하였다.
제조예 3. APBA2-01 및 APBA2-02 항체의 제조
3-1. APBA2-01 및 APBA2-02 단일클론 항체의 제조
상기 제조예 2-5에서 선별된 APBA2-01 및 APBA2-02 단일클론 IgG 항체를 발현하는 안정적인 세포 풀(cellpool)을 생산하였다. 먼저, APBA2-01 및 APBA2-02 단일클론 항체의 경쇄과 중쇄 유전자를 각각 pD2539와 pD2535nt(Horizon Discovery, United Kingdom) 벡터에 클로닝하였다. APBA2-01 및 APBA2-02 항체의 VL, VH과 인간 IgG isotype의 CL, CH 유전자는 차이니즈 햄스터 난소(chinese hamster ovary, CHO) 세포에 최적화된 코돈 서열로 합성하였다. 합성된 APBA2-01 항체의 경쇄 유전자에 Bbs1 (Thermo Fisher Scientific)와 BsrG1 (Thermo Fisher Scientific) 제한 효소를 처리하였고 동일한 제한 효소로 처리된 pD2539 벡터에 라이게이션 하였다. 합성된 APBA2-01 항체의 VH 유전자는 상기 표 1의 서열번호 51, 및 하기 표 2의 서열번호 55를 이용해 PCR 반응으로 증폭하였고 인간 IgG의 CH 유전자는 하기 표 2의 서열번호 56, 서열번호 57을 이용해 PCR 반응으로 증폭하였다. 증폭된 두 가지의 PCR 생성물을 assembly PCR 반응을 통해 융합하였다. 융합된 중쇄 유전자와 pD2535nt 벡터를 Bbs1 제한 효소로 처리하여 반응시켰다. 합성된 APBA2-02 항체의 VL 유전자는 상기 표 1의 서열번호 47, 및 하기 표 2의 서열번호 58을 이용해 PCR 반응으로 증폭하였고 인간 IgG의 CL 유전자는 하기 표 2의 서열번호 59, 서열번호 60을 이용해 PCR 반응으로 증폭하였다. APBA2-02 항체의 VH는 상기 표 1의 서열번호 51, 및 하기 표 2의 서열번호 61을 이용해 PCR 반응으로 증폭하였고 인간 IgG의 CH 유전자는 하기 표 2의 서열번호 57, 서열번호 62를 이용해 PCR 반응으로 증폭하였다. 각각의 증폭된 두 가지의 PCR 생성물은 assembly PCR 반응을 통해 융합하였다. 이후, 상기와 동일한 방법으로 클로닝하였다.
컨스트럭트 서열번호 올리고뉴클레오티드 서열(5′- 3′)
APBA2-01
(hIgG1 중쇄)		 서열번호 55 gctagacacggtcaccagggtg
서열번호 56 caccctggtgaccgtgtctagcgcatcaacaaaaggtccttcagttttcccc
서열번호 57 aggaagacgcttttagaggcggccgctcactttcctggtgaaag
APBA2-02
(hIgG1 경쇄)		 서열번호 58 ctaggagcggccacggtccgcttgatctccagcttggtgccctg
서열번호 59 cggaccgtggccgctcctag
서열번호 60 ccactctagagaagacgcttttagatcaacactc
APBA2-02
(hIgG1 중쇄)		 서열번호 61 ggagctcacggtcaccagggtgccctg
서열번호 62 gtgaccgtgagctccgcatcaacaaaaggtccttcagttttcccc
APBA2-01
(mIgG1 중쇄)		 서열번호 63 caccctggtgaccgtgtctagcgctaagactaccccaccatcagtctatccc
서열번호 64 atcggcggccgcgaagacgcttttagatca
APBA2-01
(mIgG2a 중쇄)		 서열번호 65 caccctggtgaccgtgtctagcgctaaaactaccgcacctagcgtgtatcct
3-2. APBA2-01 및 APBA2-02 키메릭(chimeric) 항체의 제조
APBA2-01과 APBA2-02 항체를 인간 VL와 VH 유전자 서열 및 마우스 항체 서열의 CL 서열과 마우스 CH 서열을 가진, 인간-마우스 IgG1 및 IgG2a 키메릭 항체 서열로 제조하였다. 합성된 APBA2-01과 APBA2-02의 인간 VL-마우스 CL 키메릭 항체 유전자 절편을 pD2539 벡터에 상기 3-1과 동일한 방법으로 삽입하여 클로닝 하였다. 합성된 마우스 IgG1과 IgG2a의 CH 유전자는 각각 서열번호 63, 서열번호 64 및 서열번호 64, 서열번호 65를 이용하여 PCR 반응으로 증폭하였다. 이후, 상기 3-1과 동일한 방법으로 APBA2-01 항체의 VH 유전자와 assembly PCR 반응을 진행하여 융합하였다. 융합된 APBA2-01 항체 유전자와 합성된 APBA2-02 항체의 VH-마우스 IgG1 및 마우스 IgG2a 유전자 절편을 pD2535nt 벡터에 상기와 동일한 방법으로 클로닝 하였다.
3-3. APBA2-01 및 APBA2-02 항체 단백질의 안정적인 풀 제작
상기 제조예 3-1 및 3-2의 항체 단백질을 생산하는 안정적인 풀을 제작하였다. 먼저, GS null CHO K1 (Horizon Discovery) 세포를 CDfortiCHO (Thermo Fisher Scientific)에 4 mM의 L-글루타민(L-glutamine)(Gibco)이 첨가된 배지에 분주하여 37℃, 125 rpm, 습도 80%, CO2 5% 조건의 진탕배양기에서 배양하였다. Freestyle™ MAX Reagent (Invitrogen)를 사용하여 APBA2-01, APBA2-02 각각의 경쇄와 중쇄 유전자가 삽입된 벡터를 1:3 [pD2539(경쇄): pD2535nt(중쇄)]의 비율로 하여 배양된 세포에 공동-형질 주입하였으며, 총 37.6 ㎍의 플라스미드 벡터를 사용하여 상기와 동일한 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 배양된 세포를 50 ㎖ 코니칼 튜브(conical tube) (Nunc)에 옮긴 후 원심분리하여 L-글루타민이 첨가되지 않은 CDfortiCHO 배지로 재현탁하였고 50 μM 메티오닌 설폭시민(methionine sulfoximine)(MSX, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)을 처리하여 48시간 동안 1차 선별하였다. 이후, 10 ㎍/㎖의 퓨로마이신(puromycin)(Gibco)을 처리하여 48시간 동안 2차 선별하였다. 이후, 침전된 세포의 농도가 0.5
Figure pat00004
106 세포/㎖이 되도록 L-글루타민이 첨가되지 않은 배지로 풀어준 뒤 MSX와 퓨로마이신을 함께 처리하여 약 3주간 추가적인 선별 과정을 진행하였다. 이때, 세포의 농도가 2.0
Figure pat00005
106 세포/㎖ 이하로 유지되게 배지를 주기적으로 교체해 주었고 세포의 생존력(viability)이 90% 이상이 될 때까지 배양하여 안정적인 풀 세포 스탁(cell stock)을 제작하였다. 세포 농도와 생존력은 COUNTESSⅡ automated cell counter를 이용하여 측정하였다.
3-4. APBA2-01 및 APBA2-02 키메릭 항체 단백질의 생산 및 정제
상기 3-3에서 제작된 안정적인 풀로부터 APBA2-01 및 APBA2-02 인간-마우스 키메릭 항체 단백질을 생산하였다. 먼저, 세포의 농도가 0.2
Figure pat00006
106 세포/㎖ 이 되도록 CDfortiCHO 배지에 세포를 풀어준 뒤 37℃, 125 rpm, 습도 80%, CO2 5% 조건의 진탕배양기에서 배양하였다. 배양 후 세포의 농도가 2.0
Figure pat00007
106 세포/㎖에 도달하였을 때 32℃, 125 rpm, 습도 80%, CO2 5%가 유지되는 조건의 진탕배양기로 옮겨 7일 동안 항체 시료를 생산하였다. 이후, 원심분리하여 항체 시료가 함유된 상등액을 확보하고, 0.2 ㎛ 여과지로 여과하여 불순물을 제거하였다. 이후, CHO 세포로부터 생산된 항체 시료를 3단계의 크로마토그래피(친화성 크로마토그래피, 양이온 교환정제, 음이온 교환정제) 과정을 거쳐 정제하였다. 먼저, MabSelect SuRe LX 레진을 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. TBS (tris-buffered saline) 버퍼로 10 CVs만큼 레진을 세척한 후 항체 시료를 포함하는 상등액을 20 ㎖/분의 유속으로 레진에 통과시켰다. 5 CVs의 TBS 버퍼와 5 CVs의 3% D-만니톨이 포함된 TBS 버퍼를 25 ㎖/분의 유속으로 흘려주어 레진에 비특이적으로 결합된 물질을 제거하였다. 50 mM 시트르산(pH 3.5), 3% D-만니톨 (D-mannitol) 버퍼를 20 ㎖/분의 유속으로 흘려주어 레진에 특이적으로 결합된 항체 시료를 레진으로부터 용출하였다. 이후, 단백질 시료가 용출된 버퍼에 1 M tris-HCl, pH 8.0 버퍼를 처리하여 중화하고 0.2 ㎛ 여과지로 여과하여 불순물을 제거하였다. 다음으로, 50 mM tris, 200 mM 시트르산, pH 7.0 버퍼로 평형화한 Capto adhere ImpRes multimodal chromatography 레진을 사용하여 양이온 교환 정제를 수행하였다. 친화성 크로마토그래피로부터 확보한 항체 시료를 멸균증류수에 1/4로 희석하였다. 이후, 5 ㎖/분의 유속으로 항체 시료를 레진에 결합시킨 후 50 mM tris, 200 mM 시트르산, 1M NaCl, pH 7.0 버퍼 5 CVs로 세척하였다. 이후, 50 mM tris, 200 mM 시트르산, pH 7.0 버퍼 5 CVs로 25 ㎖/분의 유속으로 세척하여 레진에 비특이적으로 결합된 물질을 제거하였다. 이후 50 mM tris, 200 mM 시트르산, pH 3.0 버퍼를 20%-30%-40%-50%-70%-100% 단계별로 순차적으로 흘려주어 레진에 특이적으로 결합된 항체 시료를 용출하였다. 각 단계별 용출액을 수집하여 0.2 ㎛ 여과지로 여과한 후 불순물을 제거하였다. 마지막으로, POROS™ 50 HQ Strong Anion Exchange resin을 사용하여 음이온 교환 정제를 수행하였다. 먼저 2 M NaCl 버퍼를 3 ㎖/분의 유속으로 레진에 흘려주어 세척하고 20 mM 인산나트륨(sodium phosphate), pH 6.5 버퍼 5 CVs를 흘려주어 평형화 하였다. 양이온 교환 정제로 확보한 항체 시료를 레진에 결합시키기 위해 시료를 20 mM 인산나트륨, pH 6.0 버퍼로 투석하여 pH와 염의 농도를 조정하였다. 투석한 시료를 레진에 5 ㎖/분의 유속으로 흘려주고 수집된 단백질을 포함하는 버퍼를 0.2 ㎛ 여과지로 여과하여 불순물을 제거한 후 단백질을 정량 및 분석하였다.
[실시예]
실시예 1. CD73 단백질에 대한 결합력 비교
1-1. 수용성 CD73 단백질에 대한 결합력
상기 제조예 3에서 생산 및 정제된 APBA2-01 및 APBA2-02 항체의 수용성 CD73 단백질에 대한 결합력을 ELISA 실험을 통해 확인하였다. 항체를 1,500 ng/㎖ 내지 0.019 ng/㎖의 농도로 순차적으로 희석하여 첨가하였다는 점을 제외하고 상기 제조예 2-3과 동일한 방법으로 수행하였다. 양성대조군(MEDI9447, CPI-006) 및 음성대조군(Rituximab)에 대하여도 동일한 방법으로 수행하였다.
도 4는 인간, 원숭이, 랫트 및 마우스 CD73에 대한 APBA2-01 및 APBA2-02 항체의 결합력을 확인한 그래프이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 인간 CD73 단백질(A)에 대하여 MEDI9447 > APBA2-01 > APBA2-02 > CPI-006의 순서로 결합력이 높았고 원숭이 CD73 단백질(B)에 대해서는 MEDI9447=APBA2-01 > CPI-006 > APBA2-02의 순서로 결합력이 높았다. 또한, 랫트 CD73 단백질(C)에서는 MEDI9447 > APBA2-02 > APBA2-01의 순서로 결합력이 높았고, 마우스 CD73 단백질(D)에서는 MEDI9447 > APBA2-01 > APBA2-02 의 순서로 결합력을 보여주었다. 즉, APBA2-01은 MEDI9447 다음으로 CD73 단백질(인간, 원숭이 및 마우스)에 높은 결합력을 보여주었고 APBA2-02은 MEDI9447 및 APBA2-01과 비교하여 상대적으로 CD73에 낮은 결합력을 보였으나 CPI-006과는 비슷한 결합력을 나타내었다.
1-2. 멤브레인 CD73 단백질에 대한 결합력
상기 제조예 3에서 생산 및 정제된 APBA2-01 및 APBA2-02 항체가 멤브레인 CD73 단백질에 대해 결합 능력을 갖는지 여부를 유세포 분석(flow cytometry)으로 확인하였다. 먼저, 인간 CD73을 과발현하는 유방암 세포 주인 MDA-MB-231(한국세포주은행) 세포와 마우스 CD73을 과발현하는 유방암 세포 주인 4T1(ATCC) 세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) (Gibco)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)(Gibco)이 첨가된 RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) 배지에 분주하여 37℃, 5% CO2 조건의 습윤 인큐베이터(humidified incubator)에서 배양하였다. 세포의 수와 생존력은 Vi-cell automated cell analyzer를 사용하여 측정하였다. MDA-MB-231 세포와 4T1 세포를 각각 2.0 × 105 세포 수로 멸균된 마이크로튜브에 분주하고 MACS 버퍼(0.5% BSA, 2 mM EDTA가 함유된 PBS)로 2회씩 세척하였다. 이후, APBA2-01, APBA2-02 항체를 MACS 버퍼에 40 nM 농도로 희석하고 MDA-MB-231 및 4T1 세포에 각각 처리하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후에 MACS 버퍼로 3회씩 세척하고 goat anti-human IgG Fc FITC (Invitrogen) 항체를 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응하였다. 상기와 동일한 방법으로 MDA-MB-231 및 4T1 세포를 세척하고 1% 포름알데히드를 처리하여 상기 세포를 고정시킨 후 BD FACSVERSE 장비를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 양성대조군(CPI-006, MEDI9447) 및 음성대조군(Rituximab)도 동일한 방법으로 분석하였다.
도 5a는 MDA-MB-231 세포에서 APBA2-01 및 APBA2-02 항체의 멤브레인 CD73 단백질에 대해 결합력을 비교한 그래프이고, 도 5b는 4T1 세포에서의 결합력을 비교한 그래프이다.
도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, MDA-MB-231와 4T1 세포에 대해 MEDI9447 > APBA2-01 > APBA2-02 > CPI-006 순서로 항원 결합력을 나타내었다. 또한, MEDI9447, APBA2-01 및 APBA2-02 항체는 음성 대조군(rituximab)에 비해 강한결합력을 나타내었다. 그러나, 양성대조군인 CPI-006 항체는 MEDI9447, APBA2-01 및 APBA2-02 항체와 비교하여 약한 결합력을 나타내었다.
실시예 2. 에피토프 비교 분석
상기 제조예 3에서 생산 및 정제된 APBA2-01 및 APBA2-02 항체와 양성대조군(CPI-006, MEDI9447)의 CD73에 대한 에피토프를 Bio-layer interferometry (BLI)로 비교 분석하였다. 먼저, anti-human IgG Fc Capture (AHC) 칩을 멸균증류수에 15분 동안 반응시켜 수화(hydration)를 진행하고 0.1% BSA가 첨가된 PBS, pH 7.4 (0.1% PBA) 버퍼와 10 mM 글리세린(glycine), pH 1.7 버퍼에 각각 20초 동안 3회씩 반복 반응시켜 컨디셔닝(conditioning)을 진행하였다. 다음으로, 양성 대조 물질인 CPI-006, MEDI9447 항체 시료를 0.1% PBA 버퍼에 200 nM의 농도로 희석하여 각각 AHC 칩에 600초 동안 로딩한 후 0.1% PBA 버퍼에 20 nM의 농도로 희석된 재조합 인간 CD73 단백질 시료와 900초 동안 반응시켜 결합하였다. 마지막으로 APBA2-01, APBA2-02 시료를 0.1% PBA 버퍼에 20 nM의 농도로 희석하여 재조합 인간 CD73 단백질이 결합되어 있는 CPI-006에 900초 동안 반응시켰다. 모든 실험 과정은 30℃, 1,000 rpm 쉐이킹(shaking) 조건에서 수행되었고 실험 결과는 ForteBio Data analysis 8 소프트웨어로 분석하였다.
도 6a는 APBA2-01, APBA2-02 항체가 CPI-006의 에피토프에 경쟁적으로 결합하는지 분석한 결과를 나타내고, 도 6b는 MEDI9447의 에피토프에 경쟁적으로 결합하는지 분석한 결과를 나타낸다.
도 6a에 나타난 바와 같이, CPI-006과 에피토프를 공유하는 항체는 관찰되지 않았다. 한편, 도 6b에 나타난 바와 같이, 양성대조군(MEDI9447, CPI-006) 및 APBA2-01 항체는 인간 CD73 단백질에 결합하지 못하였으나 APBA2-02 항체는 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 MEDI9447 항체가 결합된 인간 CD73 단백질에 APBA2-01 항체가 결합하지 못하였기 때문에 APBA2-01 항체는 MEDI9447 항체와 유사한 에피토프에 경쟁적으로 결합할 수 있는 가능성을 나타낸다. 한편 CPI-006 항체는 도 6a의 결과와 다르게 MEDI9447 항체가 결합되어 있는 인간 CD73 단백질에 결합하지 못하였다. 즉, CPI-006은 AMP가 CD73에 결합하는 장소인 C-말단 쪽으로 에피토프가 존재하여 AMP와 경쟁적으로 결합하므로 CD73 효소 활성을 저해한다. 반면, MEDI9447은 호모다이머인 CD73의 N-말단쪽 도메인에 결합하는 것으로 CD73의 활성 구조로 변환되는 것을 막아 CD73 효소 활성을 저해한다. 따라서 MEDI9447과 유사한 활성 저해 패턴을 나타내는 APBA2-01 항체는 CD73의 활성 구조로 변환되는 것을 저해하는 것으로 예상되고, CPI-006과 비슷한 활성 저해 패턴을 나타내는 APBA2-02 항체는 AMP가 CD73에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하는 것으로 예상된다.
실시예 3. in vitro CD73 효소 활성 저해 능력 평가
3-1. 수용성 CD73에 대한 활성 저해 능력 평가
상기 제조예 3에서 생산 및 정제된 APBA2-01 및 APBA2-02 항체가 수용성 CD73 단백질의 효소 활성을 저해하는지 여부를 확인하기 위하여 인산염을 정량화할 수 있는 malachite green assay를 수행하였다. 먼저, 재조합 인간 CD73 단백질을 assay 버퍼(25 mM tris, 5 mM MgCl2, pH 7.5)에 2 nM 농도로 희석하고 APBA2-01, APBA2-02 항체 시료를 상기 assay 버퍼에 50 nM부터 0.7813 nM의 농도로 순차적으로 희석하였다. 희석된 CD73 단백질과 각각의 항체 시료를 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, AMP 를 최종 농도 400 μM로 첨가하고 37℃ 에서 20분 동안 반응시켰다. 이후, Malachite Green Phosphate Detection Kit 를 사용하여 20분 동안 반응시킨 후 Epoch Microplate Spectrophotometer 로 620㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군(CPI-006, MEDI9447) 및 음성대조군(인간 IgG1 isotype)(BIO X Cell, West Lebanon, New Hampshire)도 상기와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다.
도 7은 수용성 CD73에 대한 APBA2-01 및 APBA2-02 항체의 효소 활성 저해 능력을 malachite green assay 방법으로 평가한 결과이다.
도 7에 나타난 바와 같이, 수용성 CD73에 대한 항-CD73 항체의 효소 활성 저해 능력은 CPI-006> APBA2-01 > APBA2-02 > MEDI9447의 순서로 나타났다.
3-2. 멤브레인 CD73에 대한 활성 저해 능력 평가
상기 제조예 3에서 생산한 APBA2-01 및 APBA2-02 항체가 멤브레인 CD73 단백질의 효소 활성을 저해하는지 여부를 확인하기 위하여 인산염 정량(malachite green assay) 및 루시페린의 산화 측정(CellTiter-Glo® assay)을 각각 수행하였다.
malachite green assay를 이용하여 CD73의 효소 활성을 분석하였다. 먼저, CD73의 효소 활성을 측정하기 위하여 MDA-MB-231 세포와 4T1 세포를 각각 2 × 104 세포/웰과 1.0 × 104 세포/웰로 분주하고, APBA2-01, APBA2-02 항체 시료를 400 nM 내지 0.0244 nM 농도로 순차적으로 희석하여 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 제조예 2-4와 동일한 방법으로 수행하였다. 음성대조군(Rituximab) 및 양성대조군(CPI-006, MEDI9447) 시료에 대하여도 상기와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다.
다음으로, CellTiter-Glo® assay를 이용하여 CD73의 효소 활성을 분석하였다. 먼저, MDA-MB-231 세포와 4T1 세포를 각각 2.0 Х 104 세포/웰, 1.0 Х 104 세포/웰로 96 웰 플랫 플레이트(SPL)에 분주하고 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 20시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상등액을 제거하였고 FBS가 포함되지 않은 RPMI-1640 배지로 세척하였다. 이후 APBA2-01, APBA2-02 항체 시료를 배지에 500 nM 내지 0.0305 nM 농도로 순차적으로 희석하고 각 웰에 처리하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 AMP를 400 μM의 농도로 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후 상등액을 200 μM 농도의 ATP 와 새로운 96 웰 화이트 플레이트에서 반응시켰고 CellTiter-Glo®를 처리하여 제조사에서 제공한 표준 방법에 따라 Synergy M1 reader장비로 루미네선스(luminescence)를 측정하였다. 음성대조군(Rituximab) 및 양성대조군(CPI-006, MEDI9447) 시료에 대하여도 상기와 동일한 방법으로 루미네선스를 측정하였다.
도 8a는 MDA-MB-231 세포에서 멤브레인 CD73에 대한 항-CD73 항체의 효소 활성 저해 능력을 malachite green assay 방법으로 평가한 결과이고, 도 8c는 CellTiter-Glo® assay 방법으로 평가한 결과이다.
도 8a에 나타난 바와 같이, 멤브레인 CD73에 대한 활성 저해의 능력은 MDA-MB-231 세포에서 APBA2-02 > CPI-006 > MEDI9447 > APBA2-01의 순서로 측정되었고 도 8c에 나타난 바와 같이, MEDI9447 = APBA2-01 > CPI-006> APBA2-02 순서로 측정되었다.
도 8b는 4T1 세포에서 멤브레인 CD73에 대한 항-CD73 항체의 효소 활성 저해 능력을 malachite green assay 방법으로 평가한 결과이고, 도 8d는 CellTiter-Glo® assay 방법으로 평가한 결과이다.
도 8b에 나타난 바와 같이, 4T1 세포에서 APBA2-02 > MEDI9447 > APBA2-01의 순서로 측정되었고, 도 8d에 나타난 바와 같이, MEDI9447 > APBA2-01 > APBA2-02 순서로 측정되어 측정법에 따라 저해 능력의 차이를 보였다.
즉, Malachite green assay 결과에서 APBA2-02 항체는 상대적으로 가장 높은 수치의 활성 저해를 보였으나(도 8a, 8b) CellTiter-Glo® assay 결과에서는 가장 낮은 수치의 활성 저해를 보였다(도 8c, 8d). 또한, APBA2-01 항체와 MEDI9447은 MDA-MB-231 세포에서 CD73의 활성을 50% 정도만 저해하였으나(도 8a) 4T1 세포에서는 90% 이상을 저해하였다(도 8b). 한편 CPI-006 항체는 마우스 CD73에 교차 결합하지 않아 마우스 4T1 세포에서는 반응하지 않았다(도 8b, 8d).
실시예 4. 항-CD73 항체의 멤브레인 CD73 세포 내 이입
상기 제조예 3에서 생산 및 정제된 APBA2-01 및 APBA2-02 항체가 세포 표면의 멤브레인 CD73에 결합하여 세포 내로 이입(internalization)되는지 여부를 면역형광법 현미경(immunofluorescence microscopy)으로 확인하였다. 먼저, 12 웰 플레이트(SPL)에 멸균된 커버글라스(Paul Marienfeld, Germany)를 넣고 MDA-MB-231 세포(1.0 × 105)를 각 웰에 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고 APBA2-01, APBA2-02 항체를 배지에 10 ㎍/㎖ 농도로 각 웰에 처리하여 37℃에서 20분, 40분, 60분 및 120분 동안 각각 반응시켰다. 양성대조군(CPI-006, MEDI9447)도 동일한 방법으로 반응시켰다. 이후 반응이 완료된 배양액을 각각 제거하고 부착된 세포를 PBS 버퍼로 3회씩 세척한 후, 4% 포름알데히드를 1 ㎖씩 분주하여 37℃에서 15분 동안 세포를 고정시켰다. 상기와 동일한 방법으로 세척을 한 후, 0.05% Triton-X 100를 웰당 1 ㎖씩 분주하고 상온에서 15분 동안 반응하여 세포에 구멍이 생기도록 유도하였다. 이후, 상기 세포를 세척하고, 2% PBA 버퍼를 첨가하여 상온에서 50분 동안 블로킹 하였다. 세척한 후에 FITC가 컨쥬게이션된 항-인간 Fc 항체를 첨가하고 상온에서 50분 동안 반응시켰다. 상기와 동일한 방법으로 세척을 한 후, 세포가 고정되어 있는 커버슬립(coverslips)을 4', 6-디아미디노2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole: DAPI)을 함유하는 VECTASHIELD HardSet Antifade 마운팅 배지(Mounting Medium) 용액과 함께 슬라이드 글라스 위에 고정시켰다. 이후, 고정된 세포를 초고감도 고해상력 공초점 레이저 주사 현미경으로 분석하였다.
도 9는 APBA2-01, APBA2-02 항체의 멤브레인 CD73 세포 내 이입 여부를 고해상력 공초점 레이저 주사현미경(SR-CLSM)으로 확인한 이미지이다.
도 9에 나타난 바와 같이, APBA2-01, APBA2-02 항체와 MEDI9447의 경우, MDA-MB-231 세포에 처리하고 20분 후에 MDA-MB-231 세포의 멤브레인 주위로 CD73 시그널이 확인되었고 40분 이후부터 CD73의 세포내이입이 관찰되었다. 그러나 CPI-006의 경우 세포내이입을 확인하지 못하였다.
실시예 5. In vivo 모델에서의 효능 평가
5-1. 전이성 유방암 마우스 모델에서의 항암 효과 확인
상기 제조예 3에서 생산 및 정제된 APBA2-01 및 APBA2-02 항체의 항암 효능을 전이성 유방암 마우스 모델에서 확인하였다. 유방암 세포주 4T1 (5.0 × 105)을 6주령의 암컷 BALB/c 마우스의 꼬리 정맥에 투여하여 폐암을 유도하였다. 3일 후 APBA2-01, APBA2-02 항체 20㎎/㎏을 각각 복강 투여(3일 간격, 4회)하였다. 양성대조군(MEDI9447 hIgG1) 및 음성대조군(isotype 대조군 IgG)도 동일한 용량 및 방법으로 투여하였다. 마우스의 몸무게는 매회 약물 투여 시 측정하였고 실험이 종료된 후 마우스의 폐와 비장을 적출하여 무게를 측정하였다. 적출된 폐를 bouin's solution으로 염색하여 콜로니의 수를 확인하였다. GraphPad Prism Version 5.0 프로그램을 사용하여 통계 분석하였다. 몸무게 및 종양의 크기는 one-way ANOVA로 분석하였고 p<0.05인 경우 유의성 있는 것으로 판정하였다.
도 10a는 전이성 유방암 마우스 모델에서 평균 폐 무게를 측정한 그래프이다.
도 10a에 나타난 바와 같이, 양성대조군 및 APBA2-01 항체의 경우, 음성대조군과 비교하여 마우스 폐의 무게 변화가 없었고 APBA2-02의 경우 마우스 폐의 무게가 10.85% 감소한 것을 확인하였다.
도 10b는 전이성 유방암 마우스 모델에서 폐 전이 콜로니 수를 측정한 그래프이다.
도 10b에 나타난 바와 같이, 양성대조군, APBA2-01 및 APBA2-02 투여군의 경우, 음성대조군과 비교하여 폐 전이된 콜로니 수가 각각 0.04%, 13%, 및 16%가 감소하였으나, 통계학적 유의성은 없었다.
한편, 마우스 몸무게 및 비장 무게의 경우, 음성대조군과 비교하여 APBA2-01 및 APBA2-01 항체와 양성대조군에서 유의적인 변화가 관찰되지는 않았다.
5-2. 유방암 마우스 모델에서의 암 성장 저해 확인
상기 제조예 3에서 생산 및 정제된 APBA2-01 및 APBA2-02 항체의 암 성장 저해 효능을 유방암 마우스 모델에서 확인하였다. 유방암 세포주 4T1 (5.0 × 105)을 mammary fat pad에 투여하여 유방암을 유도하였다. 3일 후, APBA2-01, APBA2-02 항체를 각각 TBS, pH 7.4 버퍼와 혼합하여 총 20 ㎎/㎏ 용량으로 마우스에 복강 투여(2일 간격, 6회)하였다. 양성대조군(MEDI9447 마우스 IgG1, IgG2a) 및 음성대조군(isotype 대조군 마우스 IgG1, IgG2a)(Bio X Cell)도 동일한 용량 및 방법으로 투여하였다. 유방암 크기는 캘리퍼스(calipers)를 이용하여 2일 간격으로 측정하였다. 마지막 항체 투여가 종료되고 6일 후에 마우스의 폐를 적출하여 암세포의 전이 유무를 관찰하였다.
도 11a는 유방암 마우스 모델에서 종양 부피를 측정하여 APBA2-01의 mIgG1, mIgG2a 및 APBA2-01의 mIgG1, mIgG2a 항체의 암 성장 저해 효능을 확인한 그래프이고, 도 11b는 종양성장 억제력을 비교하여 암 성장 저해 효능을 확인한 그래프이다.
도 11a 및 도 11b에 나타난 바와 같이, APBA2-01 항체는 항체의 Fc 기능에 관계없이 음성대조군에 비해 약 17%의 유방암 성장 저해를 나타냈고 APBA2-02 항체는 Fc 기능이 있는 mIgG2a가 33%, Fc 기능이 없는 mIgG1이 18%의 유방암 성장 저해효과를 나타냈다. 한편, 양성대조군은 Fc기능이 있는 mIgG2a가 23%의 성장 저해를 나타냈고, Fc기능이 없는 mIgG1은 35%의 활성 저해를 나타냈다.
도 11c는 유방암 마우스 모델의 무게를 측정한 그래프이다.
도 11c에 나타난 바와 같이, 실험이 진행되는 동안 마우스의 몸무게는 변화가 관찰되지 않았다. 또한, 암세포의 폐 전이도 발생하지 않았다.
실시예 6. In vitro 세포 모델에서의 효능 평가
6-1. 단일클론 항체의 제조
Myxengo 사(미국)에 CD73 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 선별을 의뢰하였다. Myxengo 사는 보유하고 있는 naive human scFv library를 이용하였으며 바이오패닝을 수행하여 후보 항체클론들을 선별하였다. 선별된 클론들을 IgG4 항체로 발현하였고 해당 배양액을 Myxengo 사로부터 전달 받았다. 전달 받은 각각의 배양액을 CaptureSelect IgG-CH1 Affinity Matrix 레진을 사용한 친화성 크로마토그래피를 통해 각각의 IgG4 항체 단백질을 분리 및 정제하였으며 제조예 2-2와 동일한 방법으로 수행하였다.
6-2. 멤브레인 CD73 단백질에 대한 효소 활성 확인
상기 실시예 6-1에서 제조한 7가지 인간 항-CD73 IgG1 항체의 멤브레인 CD73에 대한 효소 활성의 저해능력을 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 확인하였다. 이때, 양성대조군으로 CPI-006, MEDI9947을 사용하였다.
도 12a는 MDA-MB-231 세포에서 멤브레인 CD73에 대한 항-CD73 항체의 효소 활성 저해 능력을 malachite green assay 방법으로 평가한 결과이고, 도 12b는 CellTiter-Glo® assay 방법으로 평가한 결과이다.
도 12a 및 도 12b에 나타난 바와 같이, 7가지 항체 중 5가지 항체(No. 3, 4, 6, 7, 15)는 음성대조군과 비교하여 CD73 효소 활성 저해 능력이 유의적으로 높은 것을 확인하였다.
실시예 7. 멤브레인 CD73 단백질에 대한 결합력 확인
상기 실시예 6에서 선별된 항-CD73 항체(Myxengo 항체 3, 4, 6, 7, 15)의 종간 교차 결합을 확인하기 위해 마우스 세포막 CD73 발현 세포주(4T1 (ATCC, CRL-2539) 및 4T1.2 (ATCC, CRL-3406))를 이용하여 항체 결합 확인 실험을 수행하였다. 먼저, 4T1 세포는 RPMI-1640 (Gibco, Cat No. A10491-01) 배지에 소태아혈청 (Fetal bovine serum; FBS)(Gibco, Cat No. 16000-044)을 10% 첨가한 배지에 배양하였고 4T1.2 세포는 AlphaMEM (Minimum Essential Medium; Corning Fisher Sci, 10-022-CV) 배지에 소태아혈청을 10% 첨가한 배지에 배양하였다. 이후, 배양 접시에 부착된 세포를 트립신-EDTA(Gibco, Cat No. 25200-056)를 이용하여 분리한 뒤, 1.5 ㎖ 튜브에 2.0 105 cells 씩 분주하였다. 이후, 원심분리기로 세포를 가라앉힌 뒤 상등액을 제거하여 MACS 버퍼 [0.5% 소혈청알부민(sigma), 2 mM EDTA(Intron bio)를 첨가한 DPBS 버퍼(Gibco)] 에 100 nM 농도로 희석된 항체 시료 100 ㎕로 세포를 풀어준 뒤 4℃ 조건에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 800 ㎕ 의 MACS 버퍼를 더해 원심분리하여 상등액을 제거하였다. MACS 버퍼에 1:500 비율로 희석된 2차 항체 Goat Anti-human IgG Fc FITC (Novex, A18830) 50 ㎕ 를 추가하여 세포를 풀어주었다. 4℃ 조건에서 1시간동안 반응시킨 후 500 ㎕ 의 MACS 버퍼를 더해 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이후, 0.4% 파라포름알데히드(T&I, PBS에 희석) 200 ㎕로 세포를 풀어 고정시킨 뒤, 준비된 시료를 유세포분석기(BD, FACSVerse)를 이용하여 분석하였다.
도 13a는 4T1 세에서 Myxengo 3, 4, 6, 7, 및 15 항체의 멤브레인 CD73 단백질에 대한 결합력을 확인한 그래프이다.
도 13b는 4T1.2 세포에서 Myxengo 3, 4, 6, 7, 및 15 항체의 멤브레인 CD73 단백질에 대한 결합력을 확인한 그래프이다.
그 결과, 도 13a 및 도 13b에 나타난 바와 같이, 5가지 항체(No. 3, 4, 6, 7, 15) 중 1가지 항체(No. 15)는 음성대조군과 비교하여 마우스 멤브레인 CD73에 강하게 결합하였으며 APBA2-02 항체와 유사한 수준의 항원 결합력을 나타내었다. 그러나, 4가지 항체(No. 3, 4, 6, 7)는 마우스 멤브레인 CD73에 결합하지 않았다. 즉, Myxengo 15 항체는 APBA2-02 항체와 유사한 수준의 항원 결합력을 나타내는 바, APBA2-02와 유사한 특성을 가질 것으로 예상된다. 따라서, Myxengo 15 항체는 CD73에 특이적으로 결합하면서, 종간 교차 반응성을 가질 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> AprilBio Co., Ltd <120> Antibody for suppress the immune checkpoint of CD73 and uses thereof <130> PN131667 <150> KR 10-2020-0043607 <151> 2020-04-09 <160> 115 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of L4-66 <400> 1 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of L4-66 <400> 2 Gly Ile Ser Asp Gly Gly Ser Ala Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of L4-66 <400> 3 Ala Gly Ser Ser Trp Tyr Phe Gly Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of L6-1 <400> 4 Thr His Gly Met His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of L6-1 <400> 5 Ala Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Gly Glu Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of L6-1 <400> 6 Asp Val Asp Trp Gly Leu Pro Tyr 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Sequence <220> <223> Heavy chain of Mouse IgG1(APBA2-01) <400> 64 atcggcggcc gcgaagacgc ttttagatca 30 <210> 65 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of Mouse IgG2a(APBA2-01) <400> 65 caccctggtg accgtgtcta gcgctaaaac taccgcacct agcgtgtatc ct 52 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of 59H VH3-9 <400> 66 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of 59H VH3-9 <400> 67 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of 59H VH3-9 <400> 68 Ala Arg Gly Tyr Ser Tyr Gly Glu Gly Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of 60H VH3-9 <400> 69 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of 60H VH3-9 <400> 70 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 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ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagcccgt 300 ggatacagct atggcgaggg ggcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 107 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 59L VL1-44 <400> 107 agctatgagc tgactcagcc accctcagcc tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtgatactg tgacctggta ccagaacctc 120 ccaggaacgg ccccccatgt cgtcatatat agtaatagtc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgcttct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcac tggtctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca acatgggatg ccagtctgaa ggccgtggtc 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 108 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 60H VH3-9 <400> 108 cagctgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatt 300 tggtatggtg gcttctttgg ggcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 109 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 60L VL1-47 <400> 109 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcactatt 60 ccttgttctg gaagcagctc caacatcgga actaattctg tttattggta ccagcaattt 120 ccaggaacgg cccccaagct cctcatctat aggaattttc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgatttt ctggctccaa gtctggcacc tccgcctccc tggccatcgc tggactccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttattgtgcg ggatgggatg acagtgtgag gggttatgtc 300 ttcggaactg ggaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 110 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 69H VH3-9 <400> 110 gaagtgcagc tggtggagac tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagggggc 300 tttggagtgg ttacggccct tacagtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcgagc 360 360 <210> 111 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 69L VK1-16 <400> 111 gccatccagt tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataaaagtt acccgctcac attcggcgga 300 gggaccaaag tggatatcaa acgt 324 <210> 112 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 75H VH1-18 <400> 112 caggtacagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctacggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagggacc 300 tactacatgg acgtctgggg caaagggacc acggtcaccg tctcgagc 348 <210> 113 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 75L VK1-12 <400> 113 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgactgcat ctgtaggaga cagagtcagc 60 atcacttgtc gggcgaatca ggatattact tggttagtct ggtatcagca gaaaccaggg 120 aaagccccta agttcctgat gtctggtgca tccagttcgc aaggtggggc cccatcaagg 180 ttcagcgtca gtgaatctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct gcagccggaa 240 gattttgcaa cttactattg tcaacaggct gacagatatc cgctcacttt cggcggaggg 300 accaaggtgg agatcaaacg t 321 <210> 114 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 290H VH3-30 <400> 114 caggtacagc tgttggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agatatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggggat 300 agtagtgggt tcttgaatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcg 360 agc 363 <210> 115 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 290L VK1-33 <400> 115 gtcatctgga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tccccctcac tttcggcgga 300 gggaccaaag tggatatcaa acgt 324

Claims (13)

  1. 서열번호 1, 4, 7, 10, 14 및 17로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH1, 서열번호 2, 5, 8, 11, 15 및 18로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH2, 및 서열변호 3, 6, 9, 12, 13, 16 및 19로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH3를 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 20, 23, 26 및 29으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL1, 서열번호 21, 24, 27 및 30으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL2, 및 서열번호 22, 25, 28 및 31로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하고, CD73과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 12 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역; 또는
    서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역;인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서, 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37 및 38로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39, 40, 41 및 42로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄가변영역을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 청구항 1에 있어서, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 서열번호 66, 69, 72, 75 및 78로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH1, 서열번호 67, 70, 73, 76 및 79로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH2, 및 서열변호 68, 71, 74, 77 및 80으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRH3를 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 81, 84, 87, 90 및 93으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL1, 서열번호 82, 85, 88, 91 및 94로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL2, 및 서열번호 83, 86, 89, 90 및 95로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 CDRL3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하고, CD73과 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편.
  7. 청구항 6에 있어서, 서열번호 66으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 68로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 82로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 70으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 86으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 73으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 74로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 75으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 76으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 90으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 91로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 92로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역; 또는
    서열번호 78로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 80으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 95로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 청구항 1 또는 6에 있어서, 상기 항체는 단일클론항체이며 완전인간항체 또는 키메라(chimera) 항체인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 청구항 1 또는 6의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  10. 청구항 9의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  11. 청구항 10의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  12. 청구항 1 또는 6의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 면역관문 억제제 또는 화학항암제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
KR1020200144595A 2020-04-09 2020-11-02 Cd73의 면역관문을 억제하기 위한 항체 및 이의 용도 KR20210125885A (ko)

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