JP6713059B2 - 安定性が改善されたｈｅｒ２に特異的に結合する抗体 - Google Patents
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Description
本願は、２０１６年４月１２日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１６−００４４７４７号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参考として組み込まれる。
本発明は、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）関連疾患、特に、癌の予防または治療に用いられる安定性が向上したＨＥＲ２抗体に関する。
ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）遺伝子は、１８５ｋＤａ細胞膜通過糖タンパク質をコードし、これは、ＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）のファミリーの１つである。ＨＥＲ２タンパク質は、６２０個のアミノ酸残基からなる細胞外ドメイン、２３個のアミノ酸残基の細胞膜通過ドメイン及びチロシンキナーゼ活性を有する４９０アミノ酸残基の細胞内ドメインで構成されている（非特許文献１）。
一方、多様な特性を有するＨＥＲ２抗体が多くの文献に開示されており、これらＨＥＲ２抗体のうちから商業的に最も成功した抗体は、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）抗体（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭで商業化される、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８２１，３３７）である（非特許文献２〜４）。
トラスツズマブ抗体が商業的には成功したが、この抗体は、ＨＥＲ２が過発現された一部の患者のみでその効果を示す。したがって、トラスツズマブとの併用投与を通じて、トラスツズマブに反応しないか、微かに反応する癌患者の予後を改善しようとする試みがある。その例として、ＷＯ２００８／０３１５３１は、同じ標的であるＨＥＲ２と結合するトラスツズマブとペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）とを併用投与して、癌転移を抑制する方法を開示しており、ＷＯ２０１４／１８５７０４は、トラスツズマブとＨＥＲ２の異なるエピトープに結合するｈｚ１Ｅ１１とを併用投与して、坑癌活性を示す方法を開示している。
治療用抗体の安定性の向上は、コスト節減及び効能増大、副作用減少などの総合的な効率性を高める方法になりうる。したがって、治療用抗体の配列に対する変形を通じて安定性が向上した抗体を確保する研究が行われている（特許文献１；非特許文献５〜６）。
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
Ａｋｉｙａｍａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２（４７５８）：１６４４−１６４６（１９８６）
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Ｂｕｓｓｏｌａｔｉ，Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（２００５）９２，１２６１−１２６７
Ｇｌａｚｙｒｉｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）５５（１）：２５−３３
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Ｃｏｒｒｅｉａ，ＩＲ．，ＭＡｂｓ（２０１０）２（３）：２２１−２３２
本発明者らは、本発明者によって既に開発された抗体であるｈｚ１Ｅ１１（参照：大韓民国特許第１４５３４６２号）の構造的安定性を改善するために努力した。抗体の構造的安定性は、医薬の商業的開発過程において重要な考慮要素であって、構造の安定性に優れていなければ、品質管理が不利になり、効能が減少し、副作用が増加するという問題点がある。本発明者らは、ｈｚ１Ｅ１１の多様な位置のアミノ酸残基のうちから、安定性に大きく影響を及ぼしうるアミノ酸残基を４個見い出し、このアミノ酸残基の置換変異体を製造して、安定性が改善され、生産性と効能とを親抗体と類似したｈｚ１Ｅ１１の変異体を完成させた。
したがって、本発明の目的は、改善された安定性を示すＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片を提供することである。
本発明の他の目的は、改善された安定性を示すＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、癌の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記癌の予防または治療用薬剤学的組成物を対象体に投与する段階を含む癌の予防または治療方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、癌診断用キットを提供することである。
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
本発明の一態様によれば、本発明は、（ａ）（ｉ）配列表の配列番号１のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）Ｈ１、（ｉｉ）配列表の配列番号２のＣＤＲＨ２、及び（ｉｉｉ）配列表の配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；前記配列表の配列番号２で４番目のアミノ酸残基及び５番目のアミノ酸残基のうち少なくとも１つは、他のアミノ酸に置換変異されたものであり；（ｂ）配列表の配列番号４のＣＤＲＬ１、配列表の配列番号５のＣＤＲＬ２及び配列表の配列番号６のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む改善された安定性を示すＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明者らは、本発明者によって既に開発された抗体であるｈｚ１Ｅ１１（参照：大韓民国特許第１４５３４６２号）の構造的安定性を改善するために努力した。抗体の構造的安定性は、医薬の商業的開発過程において重要な考慮要素であって、構造の安定性に優れていなければ、品質管理が不利になり、効能が減少し、副作用が増加するという問題点がある。本発明者らは、ｈｚ１Ｅ１１の多様な位置のアミノ酸残基のうちから、安定性に大きく影響を及ぼしうるアミノ酸残基を４個見い出し、このアミノ酸残基の置換変異体を製造して、安定性が改善され、生産性と効能とを親抗体と類似したｈｚ１Ｅ１１の変異体を完成させた。
本発明者らが究明した４個のアミノ酸のうちから、２個のアミノ酸残基は、重鎖可変領域のＣＤＲＨ２に位置する。具体的に、配列表の配列番号２のＣＤＲＨ２の４番目のアミノ酸残基及び５番目のアミノ酸残基が構造的安定性に影響を及ぼす残基である。前記２つのアミノ酸のうち少なくとも１つを他のアミノ酸に置換する場合、親抗体の生産性及び効能は保持しながら、安定性は改善される。
本発明によれば、ＣＤＲＨ２の４番目のアミノ酸残基であるＡｓｎは、他の如何なるアミノ酸にも置換可能である。
本発明の一具現例によれば、ＣＤＲＨ２の配列表の配列番号２で４番目のアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＶａｌに置換され、より具体的に、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌに置換され、さらに具体的に、ＡｌａまたはＧｌｙに置換され、最も具体的に、Ａｌａに置換される。
本発明によれば、ＣＤＲＨ２の５番目のアミノ酸残基であるＧｌｙは、他の如何なるアミノ酸にも置換可能である。
本発明の一具現例によれば、ＣＤＲＨ２の配列表の配列番号２で５番目のアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＶａｌに置換され、より具体的に、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌに置換され、さらに具体的に、ＡｌａまたはＶａｌに置換され、最も具体的に、Ａｌａに置換される。
本発明で採択されたアミノ酸置換戦略は、元のアミノ酸を他のアミノ酸に置換するが、置換するアミノ酸は、可能な限り反応性が低いＲ基を有し、構造的に小さく、安定したものを選択する。
本発明の一具現例によれば、前記置換変異された配列表の配列番号２のＣＤＲＨ２は、配列表の配列番号９のアミノ酸配列、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列または配列表の配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
本発明の一具現例によれば、本発明の変異体抗体は、重鎖可変領域の以外に、軽鎖可変領域に変異を加えて安定性を向上させることができる。具体的に、本発明の抗体の可変領域は、配列表の配列番号１２、配列表の配列番号１３または配列表の配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様によれば、本発明は、（ａ）（ｉ）配列表の配列番号１のＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列表の配列番号２のＣＤＲＨ２、及び（ｉｉｉ）配列表の配列番号３のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；及び（ｂ）配列表の配列番号８を含む軽鎖可変領域を含み、前記配列表の配列番号８の５６番目のアミノ酸残基及び５７番目のアミノ酸残基のうち少なくとも１つが、他のアミノ酸に置換変異されたことを特徴とする改善された安定性を示すＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明者らが究明した４個のアミノ酸のうちから、２個のアミノ酸残基は、軽鎖可変領域のＣＤＲではないフレームワーク部位に位置している。具体的に、配列表の配列番号８の５６番目のアミノ酸残基及び５７番目のアミノ酸残基が構造的安定性に影響を及ぼす残基である。前記２つのアミノ酸のうち少なくとも１つを他のアミノ酸に置換する場合、親抗体の生産性及び効能は保持しながら、安定性は改善される。
本発明によれば、配列表の配列番号８の５６番目のアミノ酸残基であるＡｓｐは、他の如何なるアミノ酸にも置換可能である。
本発明の一具現例によれば、配列表の配列番号８の５６番目のアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＶａｌに置換され、より具体的に、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌに置換され、さらに具体的に、ＡｌａまたはＧｌｙに置換され、最も具体的に、Ａｌａに置換される。
本発明によれば、配列表の配列番号８の５７番目のアミノ酸残基であるＧｌｙは、他の如何なるアミノ酸にも置換可能である。
本発明の一具現例によれば、配列表の配列番号８の５７番目のアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＶａｌに置換され、より具体的に、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌに置換され、さらに具体的に、ＡｌａまたはＶａｌに置換され、最も具体的に、Ａｌａに置換される。
本発明の一具現例によれば、前記置換変異された配列表の配列番号８のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２のアミノ酸配列、配列表の配列番号１３のアミノ酸配列または配列表の配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、親抗体の特定部位のアミノ酸残基を置換して、抗体の安定性を向上させて、医薬適合性（ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）を改善した発明である。
（ｂ）本発明の変異体抗体は、親抗体であるｈｚ１Ｅ１１と比較して、生産性と効能とがほぼ同一でありながら、安定性が大きく向上している。
（ｃ）したがって、本発明の変異体抗体は、ＨＥＲ２−特異的抗体の開発において、生産コスト節減、効能減少抑制及び副作用減少などの優れた特性を示す。
（ａ）本発明は、親抗体の特定部位のアミノ酸残基を置換して、抗体の安定性を向上させて、医薬適合性（ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）を改善した発明である。
（ｂ）本発明の変異体抗体は、親抗体であるｈｚ１Ｅ１１と比較して、生産性と効能とがほぼ同一でありながら、安定性が大きく向上している。
（ｃ）したがって、本発明の変異体抗体は、ＨＥＲ２−特異的抗体の開発において、生産コスト節減、効能減少抑制及び副作用減少などの優れた特性を示す。
本発明の抗体は、多様なＨＥＲ２発現の癌細胞に対して優れた殺傷能または増殖抑制能を有する。本明細書において、癌細胞を言及しながら使われる用語「殺傷」または「増殖抑制」は、同じ意味として混用される。
本明細書において、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ＨＥＲ２に対する特異抗体であって、完全な抗体の形態だけではなく、抗体分子の抗原結合断片を含む。
完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｏｎｓｉｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｊ．，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４５，ｐｐ．４１−５０，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９１）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，ｐｐ．４５−６５，ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４））。
本明細書において、用語「抗原結合断片」は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）とを有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体切片であって、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６、及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位とが連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されるか、またはＣ末端で直ちに連結されており、二本鎖Ｆｖのように、ダイマーのような構造をなしうる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得られ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すれば、Ｆａｂが得られ、ペプシンで切断すれば、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる）、または遺伝子組換え技術を通じて製作することができる。
本発明において、抗体は、望ましくは、Ｆａｂの形態であるか、完全な抗体の形態である。また、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）のうちの何れか１つのイソタイプから選択されうる。望ましくは、不変領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）及びガンマ４（ＩｇＧ４）であり、最も望ましくは、ガンマ１（ＩｇＧ１）イソタイプである。軽鎖不変領域は、カッパまたはラムダ型であり、望ましくは、カッパ型である。したがって、本発明の望ましい抗体は、カッパ（κ）軽鎖とガンマ１（γ１）重鎖とを有するＦａｂの形態またはＩｇＧ１の形態である。
本明細書において、用語「重鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長の重鎖及びその断片をいずれも意味する。また、本明細書において、用語「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長の軽鎖及びその断片をいずれも意味する。
本明細書において、用語「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））。重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）には、それぞれ３個のＣＤＲｓが含まれている。ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するに当たって、主な接触残基を提供する。
本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、そして、前記抗体のエピトープ結合断片などを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した本発明のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供する。
本明細書において、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、そして、ＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子で基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけではなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０））。
本発明の他の態様によれば、本発明は、前述した本発明の核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
本明細書において、用語「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター；コズミドベクター；そして、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどが含まれる。
本発明の望ましい具現例によれば、本発明のベクターで軽鎖可変領域をコードする核酸分子及び重鎖可変領域をコードする核酸分子は、プロモーターと作動的に結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）されている。
本明細書において、用語「作動的に結合された」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／または翻訳を調節する。
本発明の組換えベクターシステムは、当業者に公知の多様な方法を通じて構築され、これについての具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は、本明細書に参考として組み込まれる。
本発明のベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されうる。また、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築されうる。
例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、βアクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
本発明のベクターは、それから発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合されることもある。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトス結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘＨｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。
また、本発明のベクターによって発現されるタンパク質が抗体であるために、精製のための追加的な配列なしにも、発現された抗体は、タンパク質Ａカラムなどを通じて容易に精製することができる。
一方、本発明の発現ベクターは、選択標識であって、当業者に通用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明のベクターを安定しながら連続してクローニング及び発現させることができる宿主細胞は、当業者に公知されて、如何なる宿主細胞も利用することができ、例えば、前記ベクターの適した真核細胞宿主細胞は、猿の腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髓種細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ−２９３細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した（ａ）本発明のＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
また、本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した本発明のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片；及び１〜２００ｍＭのヒスチジンを含むヒスチジン緩衝液を含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
本発明の一具現例によれば、前記ヒスチジン緩衝液に含まれたヒスチジンの濃度は、１〜２００ｍＭであり、より具体的には、１〜１５０ｍＭ、１〜１００ｍＭ、１〜５０ｍＭ、１〜４０ｍＭ、１〜３０ｍＭ、１〜２０ｍＭであり、最も具体的には、１０ｍＭであり得る。
また、本発明の他の具現例によれば、前記ヒスチジン緩衝液のｐＨは、５〜７であり、より具体的には、５〜６．５、５．５〜６．５であり、最も具体的には、６であり得る。
また、本発明のさらに他の具現例によれば、前記ヒスチジン緩衝液は、５０〜３００ｍＭの塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を含み、より具体的には、１０〜２００ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜２００ｍＭであり、最も具体的には、１５０ｍＭであり得る。
本発明の一実施例によれば、本発明のＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片は、前記ヒスチジン緩衝液で保管される場合に、ＰＢＳ緩衝液で保管される場合と比較して、過酷な条件でも格段に優れた安定性を示す。したがって、本発明のヒスチジン緩衝液を含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物は、本発明のＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む薬剤学的組成物の安定性の向上に卓越した効果がある。
本発明の薬剤学的組成物は、前述した本発明のＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として利用するために、両者間の共通内容は、繰り返し記載によって、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
下記の実施例から立証したように、本発明のＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブと併用投与する場合、癌細胞（特に、乳房癌細胞、より具体的に、ＨＥＲ２発現乳房癌細胞）を大きく改善された細胞殺傷能で殺傷させて、癌（特に、乳房癌、より具体的に、ＨＥＲ２発現乳房癌）の治療に非常に有効である。本発明の一具現例によれば、薬剤学的組成物は、トラスツズマブ抗体をさらに含む。
本発明の組成物によって予防または治療される癌は、当業者に公知の多様な癌を含み、例えば、乳房癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵膓癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、子宮頸部癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、頭頸部癌、皮膚癌、甲状腺癌、副甲状線癌または尿管癌を含む。
具体的に、本発明の組成物によって予防または治療される癌は、ＨＥＲ２発現癌であり、より具体的に、ＨＥＲ２発現乳房癌である。
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与し、例えば、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などに投与することができる。
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様であり、通常熟練された医師は、希望する治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の望ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書において、用語「薬剤学的有効量」は、癌の予防または治療するのに十分な量を意味する。
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、散剤、座剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
本発明の一具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物は、トラスツズマブ抗体をさらに含む。本明細書において、用語「トラスツズマブ」は、米国特許第５，８２１，３３７号に開示された抗体を意味する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した本発明のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む薬剤学的組成物を対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む癌の予防または治療方法を提供する。
本明細書で使われた用語、「投与」または「投与する」は、本発明の組成物の治療的有効量を前記組成物を必要とする対象体（個体）に直接に投与することにより、対象体の体内で同量を形成させることを言う。
組成物の「治療的有効量」は、組成物を投与しようとする対象体に治療的または予防的効果を提供するのに十分な組成物の含量を意味し、これにより、「予防的有効量」を含む意味である。まは、本明細書で使われた用語、「対象体」は、制限なしにヒト、マウス、ラット、ギニーピッグ、犬、猫、馬、牛、豚、猿、チンパンジー、ヒヒまたは赤毛猿を含む。具体的には、本発明の対象体は、ヒトである。
本発明の前記癌の予防または治療方法は、本発明の一態様である癌の予防または治療用薬剤学的組成物を投与する段階を含む方法なので、重複される内容については、本明細書の記載の過度な複雑性を避けるために省略する。
本発明の前述したＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片は、診断、例えば、癌の診断に用いられうる。
したがって、本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した本発明のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片を含む癌診断用キットを提供する。
本発明の診断キットは、前述した本発明のＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片を含み、本発明の薬剤学的組成物と同じ疾患を診断するので、両者間の共通内容は、繰り返し記載による本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
前述したキットは、抗体を含むために、基本的に多様な免疫分析（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）または免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）に適するように製作することができる。前記免疫分析または免疫染色は、放射能免疫分析、放射能免疫沈澱、免疫沈澱、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、キャプチャーＥＬＩＳＡ、抑制または競争分析、サンドイッチ分析、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色及び免疫親和性精製（ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むが、これらに限定されるものではない。前記免疫分析または免疫染色の方法は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅ．Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８０；Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ），ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，１９８４；及びＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されており、前記文献は、本明細書に参考として組み込まれる。
例えば、本発明の方法が、放射能免疫分析方法によって実施される場合、放射性同位元素（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）でラベリングされた抗体が、ＨＥＲ２タンパク質の検出に用いられうる。本発明が、ＥＬＩＳＡ方式で実施される場合、本発明の特定の実施例は、（ｉ）分析しようとする試料を固体基質の表面にコーティングする段階；（ｉｉ）一次抗体としてのＨＥＲ２抗体と前記試料とを反応させる段階；（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）の結果物を酵素が結合された二次抗体と反応させる段階；及び（ｉｖ）前記酵素の活性を測定する段階を含む。
前記固体基質として適したものは、炭化水素ポリマー（例えば、ポリスチレン及びポリプロピレン）、ガラス、金属またはゲルであり、最も具体的には、マイクロタイタープレートである。
前記二次抗体に結合された酵素は、発色反応、蛍光反応、発光反応または赤外線反応を触媒する酵素を含むが、これに限定されず、例えば、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ及びシトクロムＰ４５０を含む。前記二次抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼが用いられる場合には、基質としてブロモクロロインドルイルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ−ＡＳ−Ｂ１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＥＣＦ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のような発色反応基質が用いられ、西洋ワサビペルオキシダーゼが用いられる場合には、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムニトラート）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アームフレックスレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ ａｎｄ ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２−Ａｚｉｎｅ−ｄｉ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）及びナフトール／ピロニン、グルコースオキシダーゼとｔ−ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）及びｍ−ＰＭＳ（ｐｈｅｎｚａｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）のような基質が用いられうる。
本発明が、キャプチャーＥＬＩＳＡ方式で実施される場合、本発明の特定の実施例は、（ｉ）捕獲抗体（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）としてＨＥＲＲ２抗体を固体基質の表面にコーティングする段階；（ｉｉ）捕獲抗体と試料とを反応させる段階；（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）の結果物をシグナルを発生させるラベルが結合されているＨＥＲ２検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と反応させる段階；及び（ｉｖ）前記ラベルから発生するシグナルを測定する段階を含む。
前記検出抗体は、検出可能なシグナルを発生させるラベルを有している。前記ラベルは、化学物質（例えば、ビオチン）、酵素（アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びシトクロムＰ４５０）、放射能物質（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン）、発光物質、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）及びＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含むが、これらに限定されるものではない。多様なラベル及びラベリング方法は、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。
前記ＥＬＩＳＡ方法及びキャプチャーＥＬＩＳＡ方法で、最終的な酵素の活性測定またはシグナルの測定は、当業者に公知の多様な方法によって実施される。もし、ラベルとしてビオチンが用いられた場合には、ストレプトアビジンに、ルシフェラーゼが用いられた場合には、ルシフェリンにシグナルを容易に検出することができる。
本発明のキットに適用可能な試料は、細胞、組織または組織由来の抽出物、破砕物（ｌｙｓａｔｅ）または精製物、血液、血しょう、血清、リンパまたは腹水を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の抗体は、インビボまたはインビトロイメージングに用いられうる。本発明の他の態様によれば、本発明は、前述した本発明の抗体及び前記抗体に結合された検出可能な信号を発生させるラベルが結合された結合体を含むイメージ用組成物を提供する。
前記検出可能な信号を発生させるラベルは、Ｔ１造影物質（例えば、Ｇｄキレート化合物）、Ｔ２造影物質（例えば、超常磁性物質（例：マグネタイト、Ｆｅ３Ｏ４、γ−Ｆｅ２Ｏ３、マンガンフェライト、コバルトフェライト及びニッケルフェライト）、放射性同位元素（例えば、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、Ｐ３２、Ｓ３５、４４Ｓｃ、４５Ｔｉ、１１８Ｉ、１３６Ｌａ、１９８Ｔｌ、２００Ｔｌ、２０５Ｂｉ及び２０６Ｂｉ）、蛍光物質（フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ローダミン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、そして、Ｃｙ３とＣｙ５）、化学発光団、磁気粒子、マス標識または電磁密集粒子を含むが、これらに制限されるものではない。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
実施例１：安定性の向上のための抗体の変形
開発された抗体であるｈｚ１Ｅ１１（参照：大韓民国特許第１４５３４６２号）の安定性を向上させるために、多様な位置のアミノ酸残基が、抗体の安定性に如何なる影響を及ぼすか否かを分析した。分析結果を通じて安定性に影響を及ぼしうる部位に重鎖及び軽鎖の可変部位の４箇所のアミノ酸が確認された。親抗体であるｈｚ１Ｅ１１の重鎖及び軽鎖の可変部位のアミノ酸配列は、表１のようであり、重鎖の部位のうち、Ｋａｂａｔナンバリングによって、５２ａ、５３に該当するＡｓｎ（Ｎ）及びＧｌｙ（Ｇ）と軽鎖の部位のうち、５６、５７に該当するＡｓｐ（Ｄ）及びＧｌｙ（Ｇ）をオーバーラッピングＰＣＲを用いてＡｌａ（Ａ）に変形させた。
開発された抗体であるｈｚ１Ｅ１１（参照：大韓民国特許第１４５３４６２号）の安定性を向上させるために、多様な位置のアミノ酸残基が、抗体の安定性に如何なる影響を及ぼすか否かを分析した。分析結果を通じて安定性に影響を及ぼしうる部位に重鎖及び軽鎖の可変部位の４箇所のアミノ酸が確認された。親抗体であるｈｚ１Ｅ１１の重鎖及び軽鎖の可変部位のアミノ酸配列は、表１のようであり、重鎖の部位のうち、Ｋａｂａｔナンバリングによって、５２ａ、５３に該当するＡｓｎ（Ｎ）及びＧｌｙ（Ｇ）と軽鎖の部位のうち、５６、５７に該当するＡｓｐ（Ｄ）及びＧｌｙ（Ｇ）をオーバーラッピングＰＣＲを用いてＡｌａ（Ａ）に変形させた。
重鎖及び軽鎖の可変部位と不変領域部分とを増幅した後に、それを連結してクローニングした。増幅に使われたプライマーは、表２のようであり、前述したプライマー及びＧｏＴａｑ ＤＮＡ重合酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ３００５）を用いて９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で６０秒のＰＣＲ反応を３０回繰り返した。増幅された可変領域と不変領域との各ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動後、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｇｅｌ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６）を用いて精製した。可変領域と不変領域とを連結するために、可変領域のＰＣＲ産物と不変領域のＰＣＲ産物とを同量混合した後、可変領域の順方向プライマー及び不変領域の逆方向プライマーを用いて重畳延長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）を行って、遺伝子産物を製造し、前記と同じ方法で精製した。前記重畳延長ＰＣＲは、ＧｏＴａｑ ＤＮＡ重合酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ３００５）を用いて９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で１２０秒の反応を３０回繰り返して実施した。
それぞれの部位が安定性に及ぼす影響を確認するために、単独で変形された抗体と２箇所のアミノ酸配列を変形させた抗体まで総８種の抗体を確保した（表３）。
実施例２：変形された抗体の生産性の確認
安定性を向上させるための変形が、親抗体であるｈｚ１Ｅ１１の生産性に影響を及ぼすか否かを確認するために、生産性分析を行った。実施例１の変異された抗体のクローニングベクターを大韓民国特許第１４５３４６２号に開示された方法によって製作した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７９０−０７）動物細胞にポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．２３９６６）を用いて、前記クローニングされたベクターを日時形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、細胞培養液からＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆレジン（ＰＡＬＬ，Ｃａｔ Ｎｏ．２００７８−０２８）を用いて変形された抗体を精製した。精製された抗体は、ＵＶ分析を用いて定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシーブルー染色を通じて濃度及び純度を確認した。生産性分析によれば、重鎖のみ単独で変形させたｈｚ１Ｅ１１．１０とｈｚ１Ｅ１１．２０は、親抗体であるｈｚ１Ｅ１１よりも生産性がさらに良くなったことを確認することができた。しかし、軽鎖のみを単独で変形させたｈｚ１Ｅ１１．０１とｈｚ１Ｅ１１．０２は、むしろ生産性が悪くなることを確認した。軽鎖と重鎖とを同時に変形させた抗体は、親抗体であるｈｚ１Ｅ１１の生産性よりも少し低いレベルの生産性を示すという事実が表４に示されている。
安定性を向上させるための変形が、親抗体であるｈｚ１Ｅ１１の生産性に影響を及ぼすか否かを確認するために、生産性分析を行った。実施例１の変異された抗体のクローニングベクターを大韓民国特許第１４５３４６２号に開示された方法によって製作した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７９０−０７）動物細胞にポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．２３９６６）を用いて、前記クローニングされたベクターを日時形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、細胞培養液からＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆレジン（ＰＡＬＬ，Ｃａｔ Ｎｏ．２００７８−０２８）を用いて変形された抗体を精製した。精製された抗体は、ＵＶ分析を用いて定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシーブルー染色を通じて濃度及び純度を確認した。生産性分析によれば、重鎖のみ単独で変形させたｈｚ１Ｅ１１．１０とｈｚ１Ｅ１１．２０は、親抗体であるｈｚ１Ｅ１１よりも生産性がさらに良くなったことを確認することができた。しかし、軽鎖のみを単独で変形させたｈｚ１Ｅ１１．０１とｈｚ１Ｅ１１．０２は、むしろ生産性が悪くなることを確認した。軽鎖と重鎖とを同時に変形させた抗体は、親抗体であるｈｚ１Ｅ１１の生産性よりも少し低いレベルの生産性を示すという事実が表４に示されている。
実施例３：ＨＥＲ２に対する抗体の開発
安定性が向上したＨＥＲ２に対する抗体が、標的であるＨＥＲ２に結合するか否かを確認するための方法としては、ＥＬＩＳＡ方法を利用した。ＥＬＩＳＡを進行するために、ＥＲＢＢファミリータンパク質の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａＣｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、ＥＣＤ）部位を動物細胞を用いて生産した後、抗原として使用した。ＥＣＤのＣ末端にヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃ部位（ＣＨ２−ＣＨ３）が結合された形態のＤＮＡをｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ０４４−５０）にＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ制限酵素を用いてクローニングした。引き続き、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７９０−０７）細胞にポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．２３９６６）を用いて、前記クローニングされたベクターを日時形質転換させ、細胞培養液からＥＧＦＲ−ＥＣＦ Ｆｃ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ Ｆｃ、ＨＥＲ３−ＥＣＤ Ｆｃ融合タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆレジン（ＰＡＬＬ，Ｃａｔ Ｎｏ．２００７８−０２８）を用いて精製した。精製されたタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｄｙｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５００−０００６）を用いて定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシーブルー染色を通じて濃度及び純度を確認した。
安定性が向上したＨＥＲ２に対する抗体が、標的であるＨＥＲ２に結合するか否かを確認するための方法としては、ＥＬＩＳＡ方法を利用した。ＥＬＩＳＡを進行するために、ＥＲＢＢファミリータンパク質の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａＣｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、ＥＣＤ）部位を動物細胞を用いて生産した後、抗原として使用した。ＥＣＤのＣ末端にヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃ部位（ＣＨ２−ＣＨ３）が結合された形態のＤＮＡをｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ０４４−５０）にＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ制限酵素を用いてクローニングした。引き続き、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７９０−０７）細胞にポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．２３９６６）を用いて、前記クローニングされたベクターを日時形質転換させ、細胞培養液からＥＧＦＲ−ＥＣＦ Ｆｃ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ Ｆｃ、ＨＥＲ３−ＥＣＤ Ｆｃ融合タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆレジン（ＰＡＬＬ，Ｃａｔ Ｎｏ．２００７８−０２８）を用いて精製した。精製されたタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｄｙｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５００−０００６）を用いて定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシーブルー染色を通じて濃度及び純度を確認した。
ＥＧＦＲ−ＥＣＦ−Ｆｃ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ、ＨＥＲ３−ＥＣＤ−ＦｃあるいはＣｈｒｏｍＰｕｒｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（ｈＩｇＧ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．００９−０００−００３）を１μｇ／ｍＬの濃度でＣｏｓｔａｒ ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５９０）に常温で１時間固着させた。ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で３回洗浄後、３００μｌのＴＢＳ−Ｔ／ＳＭ（２％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）で常温で３０分間ブロッキングした。ブロッキングされたプレートを３回洗浄後、安定性が向上したＨＥＲ２抗体を入れ、３７℃で１時間抗体を結合させた。３回洗浄後、２次抗体で抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３１４３９）をＴＢＳ−Ｔ／ＳＭに１：５，０００に希釈して入れ、３７℃で１時間抗体を結合させた。３回洗浄後、ＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＴＭＢＣ−１０００−０１）を入れ、常温で５分間発色し、１Ｎ硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ、ＤｕｋＳａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２５４）を追加して発色を停止させた。４５０ｎｍで吸光度をＶｉｃｔｏｒ Ｘ３（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２０３０−００３０）を用いて測定し、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに特異的に結合するか否かを確認した。ＥＬＩＳＡが正常に行われたか否かを確認するための対照群としてＥＧＦＲに結合するａｎｔｉ−ＥＧＦＲ Ａｂ（ｈｚ１５Ｅ３）、Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２ Ａｂ（トラスツズマブ）、ａｎｔｉ−ＨＥＲ３ Ａｂ（ＡＭＧ−８８８）を使用した。安定性の向上のために変形された８種の抗体は、ＨＥＲ２のみに特異的に結合することを確認した（図１）。
実施例４：開発された抗体の細胞成長抑制効能の比較
安定性の向上のために変形された抗体の細胞増殖抑制効能を確認するための細胞生存率分析（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ）を行った。
安定性の向上のために変形された抗体の細胞増殖抑制効能を確認するための細胞生存率分析（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ）を行った。
細胞生存率分析は、ＨＥＲ２が過発現される代表的な胃癌細胞株であるＮＣＩ−Ｎ８７細胞を対象にして単独あるいはトラスツズマブと併用処理して進められた。併用処理の場合、開発された抗体とトラスツズマブとを１：１比率（重量比）で混合して使用した。９６ウェルプレートにＮＣＩ−Ｎ８７（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＣＲＬ−５８２２，１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を８０μｌの体積で９６ウェルプレートに分注して、２４時間培養しながら固着させた。翌日、抗体４０μｌを前記培養中である細胞に添加した。処理した抗体の最終濃度は、それぞれの抗体当たり最大２０μｇ／ｍＬであり、１：４に順次に希釈して、９個の濃度で進行した。トラスツズマブと併用処理の場合には、開発された抗体とトラスツズマブとを１：１比率にした（例えば、図３で、投与量が１μｇ／ｍＬである場合、ＴＲＡ １μｇ／ｍＬ及び開発された抗体１μｇ／ｍＬを投与したものである）。抗体処理後、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を４日間追加培養した後、ＣＣＫ−８を最終１０％になるように添加し、３７℃で３時間処理した。以後、Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ−３を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。抗体を処理していない細胞の吸光度を１００％に設定し、相対的な生存率を計算した（図２及び図３）。
安定性が向上した８種のＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブに反応するＮＣＩ−Ｎ８７細胞株に対して増殖抑制効能を示した。さらに、開発された抗体は、親抗体であるｈｚ１Ｅ１１と同様にトラスツズマブとの併用処理時に、トラスツズマブ単独に比べて、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株に対して癌細胞増殖抑制効能に優れた（図２及び図３）。
実施例５：親抗体及び開発された抗体の保管緩衝液による安定性の比較
本発明者らは、開発された変異抗体の安定性を確認するために、ＣＨＯ細胞から収得した親抗体ｈｚ１Ｅ１１と変異抗体であるｈｚ１Ｅ１１．１０、ｈｚ１Ｅ１１．１１とに対して加速／苛酷テスト（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｔｅｓｔ、Ｓｔｒｅｓｓ ｔｅｓｔ）を行った。
本発明者らは、開発された変異抗体の安定性を確認するために、ＣＨＯ細胞から収得した親抗体ｈｚ１Ｅ１１と変異抗体であるｈｚ１Ｅ１１．１０、ｈｚ１Ｅ１１．１１とに対して加速／苛酷テスト（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｔｅｓｔ、Ｓｔｒｅｓｓ ｔｅｓｔ）を行った。
前記それぞれの抗体は、ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、２．７ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、４．３ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１．４ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ、ｐＨ７．４）、またはヒスチジン緩衝液（１０ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、１５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐＨ６．０）に緩衝液別に保管した。前記各緩衝液に保管されているそれぞれの抗体をＨＰＬＣ用バイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１８８−６５９１）に２００μＬずつ分注して、ブルースクリューキャップ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１８２−０７１７）で蓋を閉じてサンプルを準備した。
サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）サンプルは、１ｍｇ／ｍＬの濃度で準備し、陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＣＥＸ）サンプルは、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で準備した。
前記準備したサンプルをそれぞれ恒温恒湿槽（Ｊｅｉｏ Ｔｅｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＴＨ−ＤＧ−１５０）と冷蔵庫（Ｊｅｉｏ Ｔｅｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＣＬＧ−１５０Ｓ）とを用いて、４±３℃、２５±３℃（湿度６０±５％）、４０±３℃（湿度７５±５％）の温度／湿度条件で保管し、保管時点から０週、４週に、各サンプルの安定性を分析した。サンプルに対する分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣ装備を使用し、サイズ排除クロマトグラフィーとしては、単量体の比率を確認して、条件による安定性を確認し、陽イオン交換クロマトグラフィーとしては、主成分（ｍａｉｎ ｐｅａｋ）の比率を確認して、安定性を確認した。
具体的に、単量体の比率分析のために、各抗体タンパク質５０μＬを１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．８）（Ｍｏｎｏｂａｓｉｃ，Ｆｌｕｋａ，Ｃａｔ Ｎｏ．１７８４４；Ｄｉｂａｓｉｃ，Ｆｌｕｋａ，Ｃａｔ Ｎｏ７１６３３）溶液移動相条件下でＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８Ｘ３００ｍＭ）ＨＰＬＣカラム（ＴＯＳＯＨ，Ｐａｒｔ Ｎｏ．８５４１）に注入した後、０．８ｍＬ／ｍｉｎの速度で２０分間流しながら、ＵＶ２８０ｎｍでタンパク質ピークを検出した。タンパク質の凝集体は、カラムから主ピークよりも先立って溶出され、凝集体のピーク面積と主ピークの面積とを比較して、単量体の純度を計算した。
主成分（Ｍａｉｎ ｐｅａｋ）の比率の分析のために、タンパク質を１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）（Ｍｏｎｏｂａｓｉｃ，Ｆｌｕｋａ，Ｃａｔ Ｎｏ．１７８４４；Ｄｉｂａｓｉｃ，Ｆｌｕｋａ，Ｃａｔ Ｎｏ７１６３３）バッファで１ｍｇ／ｍＬに希釈して、２０μＬをＢｉｏ Ｍａｂ（ＮＰ１０，ＰＫ，４．６ｘ２５０ｍＭ）ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９０−２４１５）に注入した後、１ｍＬ／ｍｉｎの速度で１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）（Ｍｏｎｏｂａｓｉｃ，Ｆｌｕｋａ，Ｃａｔ Ｎｏ．１７８４４；Ｄｉｂａｓｉｃ，Ｆｌｕｋａ，Ｃａｔ Ｎｏ．７１６３３）、１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＧＥＮＥＲＡＹ，Ｃａｔ Ｎｏ．０２４１）バッファを０〜１０％の濃度勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）で４０分間流しながら、ＵＶ２８０ｎｍでタンパク質ピークを検出した。
ＰＢＳ組成の緩衝液でのサイズ排除クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーとを通じる抗体の安定性の分析結果は、表５及び表６に示した。
また、ヒスチジン組成の緩衝液でのサイズ排除クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーとを通じる抗体の安定性の分析結果は、表７及び表８に示した。
ＳＥＣ分析結果、３種のあらゆる抗体が、９５％以上の単量体を有すると確認され、ＣＥＸ分析結果、親抗体であるｈｚ１Ｅ１１よりも本発明の変異抗体であるｈｚ１Ｅ１１．１０とｈｚ１Ｅ１１．１１との主成分含量が高いと確認された。特に、ヒスチジン組成の緩衝液の場合、ＰＢＳ組成の緩衝液と比較して、これで変異抗体が親抗体よりも向上した安定を示すと確認された。
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
Claims (9)
- ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）に対する抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体は、
（Ｉ）配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；前記配列表の配列番号７の５３番目のアミノ酸残基及び５４番目のアミノ酸残基のうち少なくとも１つは、Ａｌａに置換変異されたものであり；及び配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域：
（ＩＩ）配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；前記配列表の配列番号７の５３番目のアミノ酸残基及び５４番目のアミノ酸残基のうち少なくとも１つは、Ａｌａに置換変異されたものであり；及び配列表の配列番号１２、配列表の配列番号１３または配列表の配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域：又は
（ＩＩＩ）配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列表の配列番号１２、配列表の配列番号１３または配列表の配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域：
を含むＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片。 - 請求項１に記載のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子。
- 請求項２に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
- 請求項３に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
- （ａ）請求項１に記載のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物。
- 前記薬剤学的組成物は、トラスツズマブ抗体をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の薬剤学的組成物。
- 請求項１に記載のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合断片；及び１〜２００ｍＭのヒスチジンを含むヒスチジン緩衝液を含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物。
- 前記ヒスチジン緩衝液のｐＨは、５〜７であることを特徴とする請求項７に記載の薬剤学的組成物。
- 前記ヒスチジン緩衝液は、５０〜３００ｍＭの塩化ナトリウムを含むことを特徴とする請求項８に記載の薬剤学的組成物。
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