RU2727682C1 - Антитело, связывающееся с карбоангидразой, и его применение - Google Patents
Антитело, связывающееся с карбоангидразой, и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2727682C1 RU2727682C1 RU2019113853A RU2019113853A RU2727682C1 RU 2727682 C1 RU2727682 C1 RU 2727682C1 RU 2019113853 A RU2019113853 A RU 2019113853A RU 2019113853 A RU2019113853 A RU 2019113853A RU 2727682 C1 RU2727682 C1 RU 2727682C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- seq
- amino acid
- binding fragment
- Prior art date
Links
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 title claims description 37
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 title claims description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 131
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 131
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 131
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 95
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 77
- 102100033040 Carbonic anhydrase 12 Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 108010087312 carbonic anhydrase XII Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 8
- 101710094325 Carbonic anhydrase 12 Proteins 0.000 claims abstract 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 267
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 112
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 91
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 48
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 32
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 25
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 claims description 24
- 208000022679 triple-negative breast carcinoma Diseases 0.000 claims description 24
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 15
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 15
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 15
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 10
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 10
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 6
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 29
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 40
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 39
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 39
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 33
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 32
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 32
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 31
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 27
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 23
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 23
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 21
- 101000867855 Homo sapiens Carbonic anhydrase 12 Proteins 0.000 description 20
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 20
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 19
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 18
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 18
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 18
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 14
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 11
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000012006 liquid chromatography with tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 description 4
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 4
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 4
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- -1 CA-XII Proteins 0.000 description 3
- 208000017891 HER2 positive breast carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002843 lactate dehydrogenase assay Methods 0.000 description 3
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 3
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- 238000013377 clone selection method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000002849 thermal shift Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VWVRASTUFJRTHW-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(azetidin-3-yloxy)-4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound O=C(CN1C=C(C(OC2CNC2)=N1)C1=CN=C(NC2CC3=C(C2)C=CC=C3)N=C1)N1CCC2=C(C1)N=NN2 VWVRASTUFJRTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WWSJZGAPAVMETJ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-ethoxypyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C(=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)OCC WWSJZGAPAVMETJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-N-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)acetamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)NC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRPAUEVGEGEPFQ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 ZRPAUEVGEGEPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 229940123189 CD40 agonist Drugs 0.000 description 1
- 101150111177 Ca12 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100033041 Carbonic anhydrase 13 Human genes 0.000 description 1
- 101710094324 Carbonic anhydrase 13 Proteins 0.000 description 1
- 102100033007 Carbonic anhydrase 14 Human genes 0.000 description 1
- 101710094327 Carbonic anhydrase 14 Proteins 0.000 description 1
- 102100024650 Carbonic anhydrase 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710167915 Carbonic anhydrase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100024644 Carbonic anhydrase 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710167916 Carbonic anhydrase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100036372 Carbonic anhydrase 5A, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710133954 Carbonic anhydrase 5A, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100036376 Carbonic anhydrase 5B, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710203682 Carbonic anhydrase 5B, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100036369 Carbonic anhydrase 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710167912 Carbonic anhydrase 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100036368 Carbonic anhydrase 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710167910 Carbonic anhydrase 7 Proteins 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000000970 DNA cross-linking effect Effects 0.000 description 1
- 229940122029 DNA synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 201000007284 Her2-receptor positive breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 231100000416 LDH assay Toxicity 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 229940122255 Microtubule inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101000984244 Mus musculus Carbonic anhydrase 15 Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N Tranexamic acid Chemical compound NCC1CCC(C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- PRGGHGIYKMNFCM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;3-(aminomethyl)chromen-2-one Chemical compound CC(O)=O.C1=CC=C2OC(=O)C(CN)=CC2=C1 PRGGHGIYKMNFCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000007171 acid catalysis Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009925 apoptotic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000001437 electrospray ionisation time-of-flight quadrupole detection Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000029824 high grade glioma Diseases 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005977 kidney dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N methane;hydrate Chemical compound C.O VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 231100000782 microtubule inhibitor Toxicity 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000009562 momordin Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127084 other anti-cancer agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006506 pH homeostasis Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
- C12Y402/01001—Carbonate dehydratase (4.2.1.1), i.e. carbonic anhydrase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
- A61K2039/812—Breast
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
- A61K2039/868—Vaccine for a specifically defined cancer kidney
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N5/00—Radiation therapy
- A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
- A61N2005/1092—Details
- A61N2005/1098—Enhancing the effect of the particle by an injected agent or implanted device
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/988—Lyases (4.), e.g. aldolases, heparinase, enolases, fumarase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу к CA-XII (карбоангидраза 12) или его антигенсвязывающему фрагменту, специфично связывающемуся с CA-XII, а также к фармацевтической композиции для профилактики, облегчения или лечения солидного злокачественного новообразования, экспрессирующего CA-XII, его содержащей. Также раскрыта молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, а также вектор экспрессии и клетка-хозяин, ее содержащие. Изобретение также относится к способу выявления солидного злокачественного новообразования, экспрессирующего CA-XII, предусматривающему использование вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфично связывающегося с CA-XII. Изобретение позволяет эффективно осуществлять профилактику, облегчение или лечение солидного злокачественного новообразования, экспрессирующего CA-XII. 6 н. и 30 з.п. ф-лы, 36 ил., 20 табл., 19 пр.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к антителу, которое распознает и связывает карбоангидразу, молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей это антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору, несущему эту молекулу нуклеиновой кислоты, клетке-хозяину, включающей в себя молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, и применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в облегчении, профилактике, лечении или диагностике связанных с карбоангидразой заболеваний, например солидных опухолей.
Предшествующий уровень техники
Карбоангидраза (СА) образует семейство ферментов, которые катализируют быстрое взаимное превращение диоксида углерода и воды в бикарбонат и протон или их обратное превращение для поддержания гомеостаза рН в организме. Активный центр большинства карбоангидраз содержит ион цинка, поэтому их относят к металлоферментам.
В состав семейства карбонагидраз входит несколько представителей. Они составляют по меньшей мере пять отдельных семейств СА (α, β, γ, δ и ε). α-СА обнаружены у млекопитающих. α-СА делят на четыре широкие подгруппы, которые, в свою очередь, состоят из нескольких изоформ: цитозольных СА (CA-I, СА-II, СА-III, CA-VII и СА-XIII), митохондриальных СА (CA-VA и CA-VB), секретируемых СА (CA-VI) и мембраносвязанных СА (CA-IV, CA-IX, СА-XII, CA-XIV и CA-XV).
Изоферменты СА II, IX и XII ассоциированы с неопластическими процессами и являются потенциальными гистологическими и прогностическими биомаркерами некоторых опухолей [Nordfors et al. (2010), ВМС cancer; 10:148]. Представителем семейства генов α-СА с наиболее обширной экспрессией, присутствующим практически во всех тканях и органах человека, является СА-II. Трансмембранный фермент CA-IX впервые стал известен как новый опухолеассоциированный антиген, экспрессирующийся в некоторых типах карцином человека, а также в нормальной ткани желудочно-кишечного тракта. CA-IX функционально связан с клеточной адгезией, дифференцировкой, пролиферацией и онкогенными процессами, и его ферментативная активность сопоставима с СА II. Другой трансмембранный изофермент СА, СА-XII, был впервые обнаружен в нормальной ткани почек и почечно-клеточной карциноме. Дополнительные исследования показали, что он экспрессируется в некоторых других опухолях (Ulmasov et al. (2000)), но также и в некоторых нормальных органах, таких как ободочная кишка и матка. Кроме того, высокая экспрессия СА-II, CA-IX и СА-XII в опухолях, особенно в гипоксических условиях, позволяет предположить, что эти ферменты могут принимать функциональное участие в процессе инвазии, которому способствует повышение кислотности внеклеточного пространства.
Описание изобретения
Техническая задача
В соответствии с одним воплощением в настоящем изобретении предложено антитело, связывающееся с карбоангидразой, и его антигенсвязывающий фрагмент.
В другом воплощении настоящего изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектор, несущий эту молекулу нуклеиновой кислоты, и клетка-хозяин, включающая эту молекулу нуклеиновой кислоты.
В следующем воплощении настоящего изобретения предложен способ или набор для выявления или диагностики связанного с карбоангидразой заболевания, содержащий антитело, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор и/или клетку-хозяина.
Еще в одном воплощении настоящего изобретения предложена композиция для профилактики, лечения или облегчения связанного с карбоангидразой заболевания, содержащая антитело, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор и/или клетку-хозяина, или применение антитела, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора и/или клетки-хозяина в профилактике, лечении или облегчении связанного с карбоангидразой заболевания.
Еще в одном воплощении настоящего изобретения предложен способ профилактики, лечения или облегчения связанного с карбоангидразой заболевания, включающий введение субъекту со связанным с карбоангидразой заболеванием композиции, содержащей антитело, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор и/или клетку-хозяина.
Еще в одном воплощении настоящего изобретения предложена композиция или способ для уменьшения размера солидных опухолей или клеток солидных опухолей или для индуцирования или стимуляции регрессии опухоли.
Техническое решение
Настоящее изобретение относится к антителу, которое распознает и связывает карбоангидразу, молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей это антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору, несущему эту молекулу нуклеиновой кислоты, клетке-хозяину, включающей эту молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, и применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в облегчении, профилактике, терапии или диагностике СА-XII-положительных солидных опухолей.
В настоящем изобретении полезно антитело, которое специфично распознает карбоангидразу и связывается с ней. Конкретно антитело по настоящему изобретению связывается с СА-XII. Антигенной детерминантой, то есть эпитопом, с которым связывается антитело по настоящему изобретению, является некаталитическая область, расположенная на N-конце СА-XII. Предпочтительно СА-XII представляет собой фермент человеческого происхождения. В частности, СА-XII человеческого происхождения имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
Термин «каталитический домен» хорошо известен в данной области техники и в контексте настоящего изобретения относится к участку СА-XII, в котором протекает катализ карбоновой кислоты до бикарбоната и протонов. Напротив, термин «некаталитический домен» относится к участку, отличающемуся от каталитического домена, в котором протекает катализ карбоновой кислоты до бикарбоната и протонов. В настоящем изобретении некаталитический домен СА-XII представляет собой N-концевой некаталитический домен и может означать пептид, состоящий из 93-х аминокислотных остатков от N-концевого положения 1 до положения 93 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 для СА-XII человеческого происхождения или его фрагмента.
Область антигена, с которой связывается антитело по настоящему изобретению, может представлять собой некаталитическую область или ее фрагмент. Таким образом, эта область антигена может представлять собой пептид, состоящий из аминокислот с 1-й по 93-ю N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагмент, либо из аминокислот с 25-й по 93-ю или с 25-й по 57-ю аминокислотной последовательности СА-XII человеческого происхождения изотипа I (SEQ ID NO: 5) или ее фрагмент.
В качестве конкретного воплощения изобретения антигенсвязывающая область или эпитоп, который должно распознавать антитело по настоящему изобретению, представляет собой пептид, имеющий от 7 до 93 последовательных аминокислот, от 7 до 69 последовательных аминокислот, от 7 до 33 последовательных аминокислот, от 14 до 93 последовательных аминокислот, от 14 до 69 последовательных аминокислот, от 14 до 33 последовательных аминокислот, от 19 до 93 последовательных аминокислот, от 19 до 69 последовательных аминокислот или от 19 до 33 последовательных аминокислот, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4.
Более конкретно антигенсвязывающая область, или эпитоп, который должно распознавать антитело по настоящему изобретению, представляет собой пептид, имеющий от 7 до 93 последовательных аминокислот или 7 от 69 последовательных аминокислот, который по существу включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, предпочтительно от 14 до 93 последовательных аминокислот или от 14 до 69 последовательных аминокислот, и по существу включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, более предпочтительно от 7 до 14 последовательных аминокислот и по существу включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или наиболее предпочтительно пептид, состоящий из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
В аминокислотной последовательности СА-XII человеческого происхождения SEQ ID NO: 5 аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 может представлять собой пептид, состоящий из 32-38 последовательных аминокислот, а аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2 может представлять собой от 25 до 38 последовательных аминокислот.
Альтернативно антигенсвязывающая область, или эпитоп, который должно распознавать антитело по настоящему изобретению, представляет собой пептид, имеющий от 14 до 93 последовательных аминокислот или 14 от 69 последовательных аминокислот, который по существу включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, предпочтительно от 19 до 93 последовательных аминокислот или от 19 до 69 последовательных аминокислот, и по существу включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, более предпочтительно от 14 до 19 последовательных аминокислот и по существу включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, или наиболее предпочтительно пептид, состоящий из SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.
В аминокислотной последовательности СА-XII человеческого происхождения SEQ ID NO: 5 аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3 может представлять собой пептид, состоящий из 39-52 последовательных аминокислот, а аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 4 может представлять собой от 39 до 57 последовательных аминокислот.
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 5, которая представляет собой аминокислотную последовательность СА-XII человеческого происхождения, и эпитопы SEQ ID NO: 1-4 представлены в сводном виде в Таблице 1.
Антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело, которое специфично распознает некаталитическую область карбоангидразы и связывается с ней, и включает мышиное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело. Некаталитическая область карбоангидразы представляет собой пептид или его фрагмент, состоящий из N-концевых аминокислот 1-93 в аминокислотной последовательности СА-XII человеческого происхождения изотипа I (SEQ ID NO: 5), пептид или его фрагмент, состоящий из N-концевых аминокислот 25-93, или пептид или его фрагмент, состоящий из N-концевых аминокислот 25-57.
Пример антитела может связываться с пептидом, состоящим из N-концевых аминокислот 1-93 в аминокислотной последовательности СА-XII человеческого происхождения изотипа I (SEQ ID NO: 5), или с пептидом, по существу включающим SEQ ID NO: 1 или предпочтительно SEQ ID NO: 2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.
В одном воплощении настоящего изобретения предложено антитело, которое связывается с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где антитело представляет собой CDR(определяющая комплементарность область)1-CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и CDR1-CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого клетками гибридомы под номером по каталогу KCLRF-BP-00280. Линия клеток гибридомы была депонирована Научно-исследовательским фондом клеточных линий Кореи Фонда онкологических исследований Сеульского национального университета, расположенным в 28, Yongon-Dong, Chongno-gu, г. Сеул, Корея 14 февраля 2012 г., и ей был присвоен номер по каталогу KCLRF-BP-00280 20 февраля 2012 г. Антитело, продуцируемое гибридомой, депонированной под номером по каталогу KCLRF-BP-00280, обозначено 27В6 и включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
Конкретно в соответствии с одним воплощением настоящего изобретения антитело может содержать по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из CDR области VH, включающих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6-8, и CDR области VL, включающих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9-11. В конкретном воплощении изобретения антитело по настоящему изобретению может содержать аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6 (CDR1), SEQ ID NO: 7 (CDR2) и SEQ ID NO: 8 (CDR3) в качестве CDR для области VH и/или аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 (CDR1), SEQ ID NO: 10 (CDR2) и SEQ ID NO: 11 (CDR3) в качестве CDR для области VL. Антитело по другому воплощению настоящего изобретения может содержать область VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 и область VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
Пример антитела связывается с пептидом, состоящим из N-концевых аминокислот 1-93 в аминокислотной последовательности СА-XII человеческого происхождения изотипа I (SEQ ID NO: 5, или пептидом, по существу включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или предпочтительно SEQ ID NO: 4 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.
В соответствии с одним воплощением настоящего изобретения антитело связывается с пептидом, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и примеры этого антитела могут содержать CDR1-CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и CDR1-CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого клетками гибридомы, депонированной под номером по каталогу KCLRF-BP-00279. Линия клеток гибридомы была депонирована Научно-исследовательским фондом клеточных линий Кореи научно-исследовательского института онкологических исследований Сеульского национального университета, расположенным в 28, Yongon-Dong, Chongno-gu, г. Сеул, Корея 14 февраля 2012 г., и ей был присвоен номер по каталогу KCLRF-BP-00279 20 февраля 2012 г. Антитело, продуцируемое гибридомой, депонированной под номером по каталогу KCLRF-BP-00279, обозначено как 4В4 и включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
Конкретно антитело в соответствии с одним воплощением настоящего изобретения может включать по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из CDR, включающих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14-16, и CDR, включающих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 17-19, или предпочтительно включает аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14 (CDR1), SEQ ID NO: 15 (CDR2) и SEQ ID NO: 16 (CDR3) в качестве аминокислотных последовательностей, определяющих CDR области VH, и/или аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 17 (CDR1), SEQ ID NO: 18 (CDR2) и SEQ ID NO: 19 (CDR3) в качестве аминокислотных последовательностей, определяющих CDR области VL. Антитело по другому воплощению настоящего изобретения может содержать область VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и область VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
Последовательности CDR и последовательности вариабельной области в соответствии с примером мышиного антитела или химерного антитела, представлены в сводном виде в Таблице ниже.
В соответствии с одним воплощением настоящего изобретения антитело, связывающееся с эпитопом, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и антитело, связывающееся с эпитопом, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, могут одновременно связываться с одним и тем же антигеном. Следовательно, эти два антитела могут быть полезны в анализе антигена СА-XII методом сэндвич-варианта ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). В частности, в анализе методом сэндвич-ELISA антитело, связывающееся с эпитопом, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, такое как антитело 27В6, можно использовать в качестве захватывающего антитела, при этом связывание антитела с эпитопом, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, такого как антитело 4В4, можно использовать в качестве детектирующего антитела.
В соответствии с настоящим изобретением гуманизированное антитело (далее обозначенное в настоящем документе как DNP004), которое связывается с антигеном СА-XII, получают путем использования в качестве матрицы генов вариабельной области легкой цепи и генов вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 4В4 (номер по каталогу KCLRF-BP-00279), специфично связывающегося с СА-XII. Например, гуманизированное антитело может включать по меньшей мере одну CDR, выбранную из группы, состоящей из CDR области VH, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 28, и CDR области VL, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 29, 30 и 31.
CDR1 области VL в антителе представлена общей формулой SEQ ID NO: 29 и может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32 или 33 в качестве конкретного примера. CDR2 области VL представлена общей формулой SEQ ID NO: 30 и может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 33-42, в качестве конкретного примера.
Последовательности CDR и последовательности вариабельной области в соответствии с примером гуманизированного антитела (DNP004) представлены в сводном виде в Таблице ниже. В SEQ ID NO: 32-42 в Таблице 3 полужирным шрифтом выделена модифицированная аминокислота.
Каркасные последовательности, включенные в пример гуманизированного антитела (DNP004) в соответствии с настоящим изобретением, представлены в сводном виде в Таблице 4 ниже, где антитело включает по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из каркасных областей 1-4 вариабельной области тяжелой цепи и каркасных областей 1-4 вариабельной области легкой цепи. Аминокислотные последовательности каркасных областей 1-4 вариабельной области тяжелой цепи могут содержать SEQ ID NO: 43-46 соответственно, а аминокислотные последовательности каркасных областей 1-4 вариабельной области легкой цепи включают SEQ ID NO: 47, 48, 51 и 52 соответственно. Каркасная область 2 вариабельной области легкой цепи представлена общей формулой SEQ ID NO: 48 и может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 или 50 в качестве конкретного примера.
Каркасные последовательности в соответствии с примером гуманизированного антитела (DNP004) представлены в сводном виде в Таблице ниже.
В качестве примера гуманизированное антитело (DNP004) в соответствии с настоящим изобретением может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54-63.
Как показано на ФИГ. 31, гуманизированное антитело (DNP004) в соответствии с настоящим изобретением было выбрано из группы антител-кандидатов, обладающих более высокой аффинностью связывания с антигеном по сравнению с химерным антителом 4В4 (пример 16), которая свидетельствует о более высокой аффинности связывания гуманизированного антитела (DNP004) с различными линиями клеток (пример 18). Гуманизированное антитело характеризуется значительно сниженным иммуногенным потенциалом, свойственным мышиному антителу или химерному антителу, и превосходит химерное антитело 4В4.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению проявляет активность, вызывающую регрессию опухоли, и обладает прямым ингибирующим действием на опухолевые клеточные линии. При использовании в настоящем документе термина «регрессия опухоли» подразумевают, что он охватывает индуцирование или стимуляцию уменьшения размера опухоли и/или ингибирование, нарушение или уменьшение роста опухолевых клеток. Уменьшение размера опухоли означает, что при введении антитела или его фрагмента в соответствии с настоящим изобретением размер опухоли уменьшается, например, до 97% или менее, 95% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее или 75% или менее от размера опухоли до введения.
Антитело в соответствии с настоящим изобретением проявляет как антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), так и комплементзависимую цитотоксичность (CDC).
В соответствии с настоящим изобретением антитело может быть полностью или частично дефукозилированным в отношении связанных остатков сахара. Дефукозилированное антитело в соответствии с настоящим изобретением сохраняет активность в отношении ингибирования роста солидных опухолей и стимуляции регрессии опухоли. Например, при дефукозилировании антитело 27В6 и антитело 4В4 проявляют повышенный супрессивный эффект в отношении рака молочной железы, чем в фукозилированном состоянии (Фиг. 14 и 17).
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением может не существовать в организме или может представлять собой не встречающееся в природе вещество, например рекомбинантное или синтетическое вещество. Рекомбинантные или синтетические антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с использованием методов, хорошо известных в данной области техники.
В дополнение к этому в настоящем изобретении предложено вещество, распознающее определяющую антиген область СА-XII. Это вещество может быть выбрано из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела и лиганда. Антитело может быть поликлональным или моноклональным и может быть получено от человека или животных. Например, антитело может быть моноклональным. Моноклональные антитела могут быть получены известным в данной области техники способом, например методом фагового дисплея. Мышиное антитело и химерное антитело входят в объем определения антитела в соответствии с настоящим изобретением.
Термин «CDR (область, определяющая комплементарность)» относится к аминокислотной последовательности гипервариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь может включать три CDR (CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL1, CDRL2, CDRL3). CDR антитела могут обеспечивать необходимый контактный остаток для связывания с антигеном или эпитопом.
Во всем тексте описания термины «специфичное связывание» или «специфичное распознавание» имеют одинаковое значение, которое в целом известно обычному специалисту в данной области техники, показывающее, что антиген и антитело специфично взаимодействуют друг с другом и вызывают иммунологический ответ.
Термин «антигенсвязывающий фрагмент» означает фрагмент полной структуры иммуноглобулина, который представляет собой частичный полипептид, включающий домен, с которым может связываться антиген. Например, он может представлять собой scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' или F(ab')2, но не ограничен ими.
Антитело к СА-XII может представлять собой моноклональное антитело. Моноклональные антитела могут быть получены способами, хорошо известными в данной области техники. Например, они могут быть получены с использованием метода фагового дисплея. Альтернативно антитело к СА-XII может быть получено традиционным способом с использованием моноклонального антитела мышиного происхождения.
С другой стороны, отдельные моноклональные антитела можно подвергать скринингу на основании их способности к связыванию СА-XII с использованием типичного формата ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа). Для количественного определения молекулярного взаимодействия конъюгатов для тестирования ингибиторной активности используют функциональные анализы, такие как конкурентный ELISA (ELISA в условиях конкуренции) или анализы на основе клеток. Затем для представителей моноклональных антител, отобранных на основании сильной ингибирующей активности, проводят количественное определение аффинности (величины Kd (константы диссоциации)) каждого антитела.
Наконец, отобранные антитела можно использовать в качестве гуманизированных антител, а также антител, замещенных антителами иммуноглобулинов человека за исключением антигенсвязывающего участка. Способы получения гуманизированных антител хорошо известны в данной области техники (Almagro, J.C. and Fransson, J., \Humanization of antibodies\, Frontiers in Bioscience, 13 (2008), 1619-1633).
В другом воплощении изобретения предложена гибридома, продуцирующая указанное антитело к СА-XII. В одном воплощении изобретения гибридома может иметь номер по каталогу KCLRF-BP-00279 или KCLRF-BP-00280.
В следующем воплощении изобретения предложено антитело к СА-XII, продуцируемое указанной гибридомой, или его антигенсвязывающий фрагмент.
Другие воплощения изобретения включают области, определяющие комплементарность, тяжелой цепи (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 или их комбинацию) антитела к СА-XII, продуцируемого гибридомой, области, определяющие комплементарность, легкой цепи (CDR-L2, CDR-L3 или их комбинацию) или их комбинацию; альтернативно антитело к СА-XII или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи или их комбинацию антитела к СА-XII, продуцируемого указанной гибридомой. В этот момент область, определяющая комплементарность, может быть определена любым традиционным способом, например определения по базе данных иммуногенетики (IMGT; ImMunoGeneTics Database) (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/) или определения по Кабат (Cabat) (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/). bioinf.org.uk/abs/), но не ограниченным ими.
Антитело к СА-XII или его фрагмент можно сшивать с различными маркирующими агентами, токсинами или противоопухолевыми лекарственными средствами. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что антитело по изобретению можно сшивать с маркирующим агентом, токсином или противоопухолевым лекарственным средством способом, хорошо известным в данной области техники. Такое сшивание можно проводить химическим путем в месте присоединения после экспрессии антитела или антигена. Альтернативно продукт сшивания может быть сконструирован в антителе или антигене по изобретению на уровне ДНК. Впоследствии ДНК экспрессируют в подходящей системе-хозяине, как описано в настоящем документе ниже, и экспрессированные белки собирают и при необходимости подвергают ренатурации. Сшивание может быть достигнуто посредством линкера, известного в данной области техники. В частности, в данной технологии можно использовать различные линкеры, которые высвобождают токсин или противоопухолевое лекарственное средство в кислых или щелочных условиях или под действием специфичных протеаз. В некоторых воплощениях изобретения может быть желательным присоединение маркирующего агента, токсина или противоопухолевого лекарственного средства к спейсерным группам различной длины, чтобы уменьшить потенциальное стерическое затруднение.
Маркирующий агент может быть выбран из группы, состоящей из радиоизотопа, гаптена, флуоресцентного вещества, хромогена и красителя. В частности, маркирующий агент может быть выбран из FLAG, GFP (зеленый флуоресцентный белок), YFP (желтый флуоресцентный белок), RFP (красный флуоресцентный белок), красителя dTomato, вишнево-красного красителя, Су3, Су5, Су5.5., Су7, DNP (динитрофенол), АМСА (ацетат аминометилкумарина), биотина, дигоксигенина, Tamra (карбокситетраметилродамин), техасского красного, родамина, флуоресцентных красителей Alexa, FITC (флуоресцеинтиокарбамоилэтилендиамин) и TRITC (тетраметилродаминизотиоцианат). Альтернативно маркирующий агент может представлять собой радиоизотоп, такой как, например, 3Н, 14С, 15N, 35S, 90Y, 99Тс, 111In, 125I или 131I. Дополнительные примеры подходящего маркирующего агента включают ферментативные группы (например, пероксидазу хрена, галактозидазу хрена, люциферазу, щелочную фосфатазу), хемилюминесцентные группы, биотинильные группы или заранее определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным белком-репортером.
В настоящем изобретении можно использовать любой токсин в зависимости от того, насколько он токсичен для клеток или организмов. Например, в качестве токсина можно использовать радиоактивный изотоп, малую молекулу, пептид или белок. Антитело или его фрагмент можно сшивать с токсином с образованием слитого белка. В качестве белкового токсина можно использовать рицин, сапорин, гелонин, момордин, дифтерийный токсин или токсин псевдомонад. Что касается радиоактивного изотопа, его примеры включают 131I, 188Rh и 90Y, но не ограничены ими.
При использовании в настоящем документе термином «противоопухолевый агент» обозначают лекарственное средство, способное остановить или замедлить патологический рост тканей. Таким образом, противоопухолевые агенты особенно полезны в лечении злокачественного новообразования. Противоопухолевый агент может представлять собой ингибитор ангиогенеза, интеркалирующий ДНК агент или поперечно сшивающий ДНК агент, ингибитор синтеза ДНК, регулятор транскрипции ДНК-РНК, ингибитор фермента, регулятор гена, ингибитор микротрубочек или другие противоопухолевые агенты.
Настоящее изобретение дополнительно относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело по настоящему изобретению. Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующая антитело по настоящему изобретению, может представлять собой, например, ДНК, кДНК (комплементарная ДНК), РНК, полученную синтетическим путем ДНК или РНК или полученную рекомбинантным методом химерную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую любую из этих молекул нуклеиновой кислоты, либо отдельно, либо в комбинации. Молекула нуклеиновой кислоты может также представлять собой геномную ДНК, соответствующую полноразмерному гену или его существенному участку, либо его фрагменту или производному. Нуклеотидная последовательность молекулы нуклеиновой кислоты может представлять собой модифицированную нуклеотидную последовательность, в которой в одном или более нуклеотидных остатков произошла замена, делеция или добавление, вызывающие замену или мутацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности антитела. В конкретном воплощении настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу кДНК.
Одно воплощение настоящего изобретения также относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты в экспрессируемой форме. Вектор по настоящему изобретению может представлять собой, например, фаг, плазмиду, вирусный вектор или ретровирусный вектор. Ретровирусные векторы могут быть способными реплицироваться или с нарушенной репликацией. В последнем случае размножение вируса будет, как правило, происходить в комплементирующих клетках/хозяевах.
Упомянутая выше молекула нуклеиновой кислоты может быть включена в вектор в качестве вставки таким образом, чтобы произошло ее слияние с другим полинуклеотидом в процессе трансляции. Как правило, вектор может содержать одну или более точек начала репликации (ori) и наследственные системы для клонирования или экспрессии, один или более маркеров для отбора в клетке-хозяине, например устойчивости к антибиотикам, и одну или более экспрессионных кассет. Примеры подходящей точки начала репликации (ori) включают точки начала репликации Col E1, вируса SV40 и фага М13.
В настоящем изобретении молекула нуклеиновой кислоты может быть сконструирована для введения в хозяина, либо непосредственно, либо посредством липосомы, фагового вектора или вирусного вектора (например, аденовирусного вектора, ретровирусного вектора и т.д.). Дополнительно бакуловирусные системы или системы на основе вируса осповакцины или вируса леса Семлики можно использовать как эукариотические экспрессионные системы для молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.
Другое воплощение настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, отличающейся от человеческой, включающей в себя вектор по настоящему изобретению. Клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической. Полинуклеотид или вектор по настоящему изобретению, присутствующий в клетке-хозяине, может быть либо интегрирован в геном клетки-хозяина, либо поддерживаться экстрахромосомно.
В дополнение к этому настоящее изобретение относится к трансгенному животному, отличающемуся от человека, которое можно использовать для получения антитела по настоящему изобретению, содержащему одну или более молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Антитела можно продуцировать и выделять из тканей или жидкостей организма, таких как молоко, кровь или моча, от коз, коров, лошадей, свиней, крыс, мышей, кроликов, хомяков или других млекопитающих.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения вещества, селективно распознающего определяющую антиген область СА-XII, и линия клеток, продуцирующая антитело, селективно распознающее определяющую антиген область СА-XII. Антитело к определяющей антиген области СА-XII или его фрагмент могут быть получены типичным способом, используя в качестве антигена белок СА-XII, определяющую антиген область СА-XII, участок СА-XII, содержащий определяющую антиген область СА-XII, или клетку, экспрессирующую определяющую антиген область СА-XII. Например, способ получения антитела к СА-XII можно осуществлять посредством способа получения линии клеток, продуцирующей антитело к СА-XII, включающего: (а) инъецирование животному белка СА-XII, определяющей антиген области СА-XII, участка СА-XII, содержащего определяющую антиген область СА-XII, или клетки, экспрессирующей определяющую антиген область СА-XII, и его иммунизацию; (б) получение спленоцитов, продуцирующих антитело, специфчное к СА-XII, и (в) слияние спленоцитов с клетками миеломы с получением клеток гибридомы и отбор клетки гибридомы, продуцирующей антитело к СА-XII. Антитело можно выделять путем культивирования линии клеток in vitro или путем введения линии клеток in vivo. Например, линию клеток можно вводить мышам путем интраперитонеальной инъекции с последующим выделением и очисткой антитела из асцитов. Выделение и очистку моноклональных антител можно осуществлять, подвергая супернатант культуры и асцитов ионообменной хроматографии (DEAE (на диэтиламиноэтилцеллюлозе) или DE52 (на DEAE-целлюлозе-52)) или аффинной хроматографии с использованием колонки с антителом против иммуноглобулина или с белком А.
Определяющую антиген область, с которой связывается антитело по настоящему изобретению, характеризуется специфичной экспрессией в солидных опухолях. Следовательно, антитело к СА-XII можно не только эффективно использовать для выявления опухолевых клеток, но в том случае, когда оно несет токсическое вещество, оно также может оказывать цитотоксическое действие только на опухолевые клетки.
В следующем воплощении настоящего изобретения предложено применение СА-XII, в частности определяющей антиген области, локализованной в некаталитическом домене СА-XII, при обнаружении солидных опухолей. Также предложена композиция для выявления раковых стволовых клеток солидных опухолей, содержащая вещество, взаимодействующее с определяющей антиген областью. Взаимодействующее вещество может представлять собой любое вещество, способное взаимодействовать с СА-XII, в частности определяющей антиген областью CD-XII, локализованной в его некаталитическом домене. В частности, взаимодействующее вещество может быть выбрано из группы, состоящей из низкомолекулярного химического вещества, антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела, аптамера или их комбинации.
В другом воплощении настоящее изобретение относится к диагностической композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению или клетку-хозяин по настоящему изобретению. Используемый в настоящем документе термин «диагностическая композиция» относится к композиции, содержащей по меньшей мере одно из антитела, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора и/или клетки-хозяина по настоящему изобретению.
Диагностическая композиция по настоящему изобретению полезна при выявлении нежелательной экспрессии или сверхэкспрессии СА, в частности СА-XII, в различных клетках, тканях или другом подходящем образце путем приведения в контакт образца с антителом по настоящему изобретению и определения присутствия СА, в частности СА-XII, в этом образце. Соответственно, диагностическая композиция по изобретению может быть доступна для оценки начала или статуса заболевания, как определено в настоящем документе ниже. В частности, антитело по настоящему изобретению или его фрагмент или производное может быть нацелено на злокачественные клетки, например раковые клетки, способные экспрессировать СА, в частности СА-XII. Клетки, связавшие антитело по настоящему изобретению, могут подвергаться атаке со стороны таких функций иммунной системы, как система комплемента или клеточно-опосредованная цитотоксичность, и, следовательно, количество клеток, демонстрирующих нежелательную экспрессию или сверхэкспрессию СА, в частности СА-XII, уменьшается, или происходит их полная эрадикация.
В другом воплощении изобретения антитело по настоящему изобретению или его фрагмент или производное сшиты с маркирующим агентом. Такие антитела особенно подходят для диагностического применения.
Диагностическую композицию по изобретению можно вводить в качестве активного агента отдельно или в комбинации с другими агентами.
Еще одно воплощение настоящего изобретения относится к способу выявления опухолевой клетки, включающему: (а) взаимодействие антитела к СА-XII с образцом, включающим опухолевую клетку, и (б) определение образца как представляющего собой опухоль, если образец положителен в отношении антитела. Образец может включать, без ограничений, лимфоидную жидкость, костный мозг, кровь и кровяные тельца. Опухолевая клетка может предпочтительно представлять собой клетку рака молочной железы, клетку рака легкого, рака ободочной кишки, клетку рака желудка, клетку рака предстательной железы или клетку рака печени.
При использовании для скрининга опухолевых клеток антитело к СА-XII может быть конъюгировано с меткой, способной к выявлению реакционной способности антигена с антителом. Метка, полезная для этой цели, может включать радиоизотоп, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество, хромоген и краситель.
Антитело к СА-XII по настоящему изобретению может быть также предложено в наборе для диагностики солидных опухолей.
Диагностический набор в дополнение к антителу к СА-XII может содержать средства выявления реакции антигена с антителом. Эти средства выявления могут представлять собой агент, полезный для выполнения методики, выбранной из группы, состоящей из проточной цитометрии, иммуногистохимического окрашивания, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунологического анализа (RIA), иммуноферментного анализа (EIA), иммунофлуоресцентного анализа (FIA) и иммунолюминесцентного анализа (LIA). В этом контексте метка может представлять собой фермент, такой как HRP (пероксидаза хрена), флуоресцентную метку, такую как FITC (флуоресцеинтиокарбамоилэтилендиамин), люминесцентную метку, такую как люминол, изолюминол и люцигенин, или радиоизотоп, такой как 125I, 3Н, 14С и 131I, но не ограничена ими. Конъюгацию с меткой можно определять, используя средства для измерения ферментативной реакции с субстратом, флуоресценции, люминесценции или радиоактивного излучения. Например, антитело к СА-XII может быть подготовлено к применению в наборе для ELISA или в наборе стрипов.
Антитела 27В6 и 4В4 в соответствии с некоторыми воплощениями настоящего изобретения могут одновременно связываться с одним и тем же антигеном, поскольку их эпитопы не перекрываются. Соответственно, эти два антитела могут быть полезны в анализе сэндвич-ELISA на предмет антигена СА-XII. В частности, в сэндвич-ELISA антитело 27В6 можно использовать в качестве захватывающего антитела, а антитело 4В4 может функционировать в качестве детектирующего антитела.
В соответствии с одним его воплощением настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или клетку-хозяина по настоящему изобретению. Антитело, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или клетку-хозяина по настоящему изобретению применяют для лечения или регрессии солидной злокачественной опухоли. Лечение или регрессия солидных опухолей могут быть достигнуты посредством введения нуждающемуся в этом субъекту молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина по настоящему изобретению в эффективной дозе.
При использовании в настоящем документе термином «солидная опухоль» определяют патологическое тканевое образование, которое обычно не содержит кисты или жидкие области. Солидная опухоль может быть доброкачественной (нераковой) или злокачественной (часто называемой в данной области техники раковой). Примеры солидных опухолей, при которых применимо антитело в соответствии с изобретением, включают саркому, глиому, злокачественное новообразование, мезотелиому, лимфому, рак почки, рак легкого, рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак ободочной кишки, рак печени, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы и рак головы и шеи, и предпочтительно рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак желудка, рак предстательной железы или рак печени. Рак молочной железы может представлять собой трижды негативный рак молочной железы (TNBC), который может быть определен как негативный при использовании трех диагностических маркеров HER2, рецептора эстрогена (ER) и рецептора прогестерона (PR), поэтому его очень трудно обнаружить. Рак легкого может представлять собой мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого или плоскоклеточную карциному легкого.
Терапевтический эффект в отношении солидных опухолей в соответствии с настоящим изобретением включает эффекты подавления миграции, инвазии и метастазирования раковых клеток (в частности, раковых стволовых клеток) или тканей, включающих раковые клетки, и, следовательно, ослабления злокачественности раковой опухоли, а также ингибирования ее роста (количественного уменьшения) и апоптоза.
При использовании в настоящем документе термин «субъект» или «пациент» относится к млекопитающему, включая примата, такого как человек, обезьяна и т.д., и грызуна, такого как мышь, крыса и т.д., которое поражено или потенциально может быть поражено солидной опухолью или симптомом и, следовательно, нуждается в облегчении, профилактике и/или лечении солидной опухоли.
Введение антитела или его фрагмента в соответствии с настоящим изобретением можно выполнять любым приемлемым способом. Например, терапевтический агент, включающий антитело к СА-XII в качестве активного ингредиента, вводят субъекту, например человеку или животному, имеющему опухолевые клетки, перорально или парентерально, и предпочтительно парентерально. Этот терапевтический агент может включать фармацевтически приемлемый эксципиент, и доза терапевтического агента может изменяться в зависимости от состояния пациента и находиться в диапазоне от, например, 3 мг до 6000 мг в сутки. Терапевтический агент может находиться в таких формах, как жидкие формы, порошки, эмульсии, суспензии или формы для инъекций, но без ограничения ими.
Дополнительно в настоящем изобретении предложен способ лечения острого или хронического миелогенного или лимфоцитарного лейкоза с применением по меньшей мере одного, выбранного из антитела к определяющей антиген области СА-XII, фрагмента антитела (F(ab')2, Fab, Fv и т.д.) и лиганда к определяющей антиген области СА-XII.
Антитело или его фрагмент могут быть моноклональными или поликлональными и могут быть получены от человека или животных. Антитело к СА-XII или его фрагмент может дополнительно содержать описанный выше токсин. Токсин можно подвергать слиянию, сшиванию, конъюгации или связыванию с антителом, используя хорошо известную методику.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в виде одного активного агента или в комбинации с любыми другими агентами, предпочтительными для лечения представляющего интерес заболевания. В дополнение к этому антитело по настоящему изобретению можно применять в сочетании с другими видами противораковой терапии, такими как химиотерапия, радиотерапия, цитотерапия и т.д. В химиотерапии или цитотерапии можно применять различные хорошо известные противораковые агенты.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ скрининга терапевтического агента или ингибитора солидных опухолей, включающий приведение в контакт соединения-кандидата с СА-XII, в частности с определяющей антиген областью, локализованной в некаталитическом домене СА-XII, и отнесения соединения-кандидата к категории потенциальных терапевтических агентов для солидных опухолей, если определено, что соединение-кандидат связывается с определяющей антиген областью. В еще одном воплощении настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения солидных опухолей, содержащая прошедший скрининг терапевтический агент для солидных опухолей в качестве активного ингредиента.
Соединение-кандидат может представлять собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из различных синтетических или встречающихся в природе соединений, полипептидов, олигопептидов, пептидов или белковых конструкций (например, антител, антигенсвязывающих фрагментов, пептител, нанотел и т.д.), полинуклеотидов, олигонуклеотидов, антисмысловых РНК, кшРНК (короткой шпилечной РНК), миРНК (малой интерферирующей РНК), аптамеров и экстрактов из натуральных продуктов.
Связывание между соединением-кандидатом и определяющей антиген областью можно определить путем выявления образования комплекса, которое можно выполнять с использованием различных методик, известных в данной области техники. Например, для подтверждения связывания соединения-кандидата с определяющей антиген областью можно определять характерные ферментативные реакции, флуоресценцию, люминесценцию и/или радиоактивное излучение. Подробно методики, доступные для выявления комплекса, включают, без ограничений, иммунохроматографию, иммуногистохимию, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммунологические анализы (RIA), иммуноферментные анализы (EIA), иммунофлуоресцентные анализы (FIA), иммунолюминесцентные анализы (LIA) и Вестерн-блоттинг.
Преимущественные эффекты изобретения
Предложено антитело, распознающее и связывающее карбоангидразу, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая это антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, вектор, несущий эту молекулу нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин, включающая вектор или молекулу нуклеиновой кислоты, и применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в облегчении, профилактике или диагностике связанных с карбоангидразой заболеваний, например солидных опухолей.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 показаны титры мышиного моноклонального антитела 27В6, специфичного к солидной опухоли, в периферической крови, определенные количественно в соответствии с примером 1.
На Фиг. 2 показана антигенная специфичность и аффинность химерного антитела 27В6, определенная количественно в соответствии с примером 2.
На Фиг. 3 проиллюстрирована методика скрининга титров моноклонального антитела 4В4 в периферической крови, определенных количественно в соответствии с примером 3.
На Фиг. 4 показана антигенная специфичность и аффинность химерного антитела 4В4, определенная количественно в соответствии с примером 4.
На Фиг. 5а, 5b и 5с показаны паттерны экспрессии мышиного химерного антитела 4В4 на антигене карбоангидразы 12 в различных клетках рака молочной железы, определенные количественно в соответствии с примером 5.
На Фиг. 6 показаны электрофореграммы антигенов, выделенных и очищенных из линии клеток аденокарциномы легкого А549 с помощью колонок с пришитым химерным антителом 4В4 и химерным антителом 27В6.
На Фиг. 7 показана идентификация карбоангидразы 12 в качестве антигена для моноклонального антитела 4В4 и 27В6 на основании анализа методом ELISA.
На Фиг. 8 показана идентификация карбоангидразы 12 в качестве антигена для моноклонального антитела 4В4 и 27В6 на основании анализа методом Вестерн-блоттинга в Примере 6.
На Фиг. 9 показан процесс и результат эпитопного кртирования моноклональных антител 27В6 и 4В4.
На Фиг. 10 показаны комплементзависимые цитотоксические эффекты химерного антитела 27В6 на основании анализа в соответствии с примером 8.
На Фиг. 11 показаны антителозависимые клеточно-опосредованные цитотоксические эффекты химерного антитела 27В6 на основании анализа в соответствии с примером 9-1.
На Фиг. 12 показаны антителозависимые клеточно-опосредованные цитотоксические эффекты химерного антитела 27В6 в отношении трижды негативного рака молочной железы на основании анализа в соответствии с примером 9-2.
На Фиг. 13 показаны антителозависимые клеточно-опосредованные цитотоксические эффекты дефукозилированного химерного антитела 27В6 в различных солидных опухолях на основании анализа в соответствии с примером 10-1.
На Фиг. 14 показаны антителозависимые клеточно-опосредованные цитотоксические эффекты дефукозилированных химерных антител 4В4 и 27В6 в линии клеток рака молочной железы на основании люциферазного анализа, описанного в Примере 10-2.
На Фиг. 15 показаны уровни экспрессии антигена СА12 в линиях клеток трижды негативного рака молочной железы и связывание химерных антител 27В6 и 4В4 с клеточной поверхностью линий клеток на основании анализа в соответствии с примером 11.
На Фиг. 16 показаны ингибирующие активности химерных антител 27В6 и 4В4 против роста опухоли в животных моделях трижды негативного рака молочной железы.
На Фиг. 17 показана ингибирующая активность антитела 4В4 против трижды негативного рака молочной железы на основании анализа в соответствии с примером 11.
На Фиг. 18 и 19 показано, что связывание одного антитела 4В4 с опухолевыми клетками не влияет на рост опухолевых клеток в соответствии с примером 12.
На Фиг. 20 показан эффект комбинации антитела 27В6 и радиотерапии на основании анализа в соответствии с примером 13.
На Фиг. 21 показаны результаты тестирования аффинности связывания отобранного клона (scFv, выявленного методом фагового дисплея) с СА-XII методом ELISA.
На Фиг. 22 показана последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) и последовательности CDR1 и CDR2 10-ти клонов (номера клонов 1, 2, 8, 11, 15, 19, 22, 25, 26 и 30), отобранных в соответствии с примером 14, и последовательности матрицы CDR1 и CDR2.
На Фиг. 23 и Фиг. 24 представлены графики, показывающие результаты тестирования аффинности полноразмерного IgG 10-ти клонов (номера клонов 1, 2, 8, 11, 15, 19, 22, 25, 26 и 30), отобранных в соответствии с примером 14.
На Фиг. 25 показано связывание гуманизированного антитела DNP004 в соответствии с примером 15 в линии клеток положительного по СА-XII и трижды негативного рака молочной железы MDAMB-231.
На Фиг. 26 представлена фотография, на которой показан результат анализа физических свойств групп антител-кандидатов с помощью SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) в соответствии с примером 16.
На Фиг. 27 показана оценка силы связывания групп антител-кандидатов с положительной по СА-XII линией клеток в соответствии с примером 16.
На Фиг. 28 и Фиг. 29 показаны результаты определения профилей связывания гуманизированного антитела DNP004 против антигена карбоангидразы XII в различных клетках рака молочной железы в соответствии с примером 17.
На Фиг. 30 показаны результаты определения антителозависимого цитотоксического эффекта гуманизированного антитела DNP004 в линии клеток рака молочной железы в соответствии с примером 18.
На Фиг. 31 показаны результаты определения антителозависимого цитотоксического эффекта гуманизированного антитела DNP004 в линии клеток рака легкого в соответствии с примером 18.
На Фиг. 32 показаны результаты определения антителозависимых цитотоксических эффектов гуманизированного антитела DNP004 в линии клеток рака печени в соответствии с примером 18.
На Фиг. 33 показаны результаты определения антителозависимых цитотоксических эффектов гуманизированного антитела DNP004 в линии клеток рака желудка в соответствии с примером 18.
На Фиг. 34-35 показаны результаты определения противоопухолевого действия гуманизированного антитела DNP004 в модели трижды негативного рака молочной железы у мыши в соответствии с примером 19.
На Фиг. 36 показаны результаты определения противоопухолевого действия гуманизированного антитела DNP004 в животной модели линии клеток рака почки в соответствии с примером 19.
Способ осуществления изобретения
Лучшее понимание настоящего изобретения может быть достигнуто с помощью приведенных ниже примеров, которые представлены для иллюстрации, но не должны быть истолкованы как ограничивающие настоящее изобретение.
Пример 1. Получение моноклонального антитела к СА-XII (27В6)
В описанных ниже экспериментах была выполнена разработка новых антител, специфичных к СА 12. Наблюдали, что разработанные антитела специфичны к солидным опухолям, таким как аденокарцинома легких, рак молочной железы, колоректальный рак и рак предстательной железы, поскольку они реагировали с антигенами, специфично экспрессирующимися в этих опухолях. Они были обозначены 27В6 и 4В4 соответственно.
1-1: Дизайн целевого сайта для конструирования моноклонального антитела 27В6
Было сконструировано антитело, специфичное к клеткам солидной опухоли. Для этого мышей иммунизировали непосредственно клетками солидной опухоли, и моноклональные антитела были созданы методом слияния клеток. Затем анализировали и идентифицировали антиген, с которым связывалось моноклональное антитело, специфичное к клеткам солидной опухоли.
1-2: Иммунизация мышей
Клетки А549, представляющие собой клетки альвеолярного базального эпителия аденокарциномы человека, иммунизировали и проводили отбор антитела, проявляющего положительную реакцию с линией клеток А549, но не реагирующего с линией клеток L132, в процессе отбора гибридом методом проточной цитометрии. Процентное содержание клеток, проявляющих положительную реакцию с моноклональным антителом, рассчитывали как количество клеток, связывающихся с антителом DNP004, на 5000 клеток исследуемого субъекта, представленное в %; - (отрицательный результат) относится к случаю, где количество положительных клеток составляет менее 10%, а + (положительный результат) относится к случаю, где количество положительных клеток находится в диапазоне от 10 до 30%. ++ означает, что количество положительных клеток находится в диапазоне от 30 до 70%, и +++ означает, что количество положительных клеток составляет от 70 до 100%.
Для этого каждой самке мышей линии Balb/c возраста 6 недель вводили путем и/п (в интраперитонеальную полость) инъекции линию клеток А549 (АТСС CCL-185) в дозе 1×107 клеток три раза через регулярные интервалы в течение трех недель, после чего получали сыворотки из венозной крови. Разведение сыворотки добавляли к клеткам А549. После выдерживания в течение 30 мин при 4°С для взаимодействия разведение смешивали с 3 мл PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) и центрифугировали в течение 3 мин при 1500 об/мин. Несвязанные антитела отмывали. Для выявления связанных антител использовали вторичное антитело, представляющее собой 200-кратное разведение козьего антимышиного Ig-FITC (DINONA INC, Корея). После взаимодействия в течение 15 мин при 4°С реакционную смесь промывали 3 мл PBS таким же способом. Титр антитела к клеткам А549 в сыворотках крови измеряли методом проточной цитометрии. Наблюдали, что сыворотки, иммунизированные клетками А549, в высокой степени положительны в отношении (результаты не показаны). В кратком описании, за трое суток до эксперимента по слиянию клеток добавляли 50 мкг агонистического моноклонального антитела (mAb) к CD40 для усиления иммунной реакции, и клетки А549 (АТСС CCL-185) инъецировали в дозе 1×107 клеток для индуцирования амплификации антитела к поверхностному антигену А549.
1-3: Получение клеток гибридомы
У иммунизированных мышей вырезали селезенку, получали суспензию отдельных спленоцитов и дважды промывали их питательной средой RPMI (GIBCO). Жизнеспособные клетки считали, используя смесь 1:1 (об./об.) 0,4%-ного раствора трипанового синего (Sigma), который окрашивает только мертвые клетки. В качестве партнера слияния использовали линию клеток миеломы мыши Х63 (АТСС CRL-1580), клетки промывали и считали таким же путем, как спленоциты.
Клетки миеломы смешивали со спленоцитами в соотношении 1:5 и центрифугировали. К полученному таким образом осадку медленно добавляли в течение 1 мин 1 мл 50%-го раствора PEG (полиэтиленгликоля) 1500, подогретого до 37°С. После инкубации в течение около 1 мин смесь клеток медленно разбавляли питательной средой RPMI и центрифугировали. Полученный в результате осадок клеток ресуспендировали в среде RPMI (20% FBS (фетальная бычья сыворотка)), содержащей 1-кратный раствор HAT (гипоскантин-аминоптерин-тимидин), высевали в объеме 150 мкл/лунка в 96-луночные планшеты и выращивали в СО2 инкубаторе при 37°С. Через заданные промежутки времени после слияния проводили подпитку культуры HAT. Когда в лунках наблюдали колонию, в каждую лунку добавляли 150 мкл среды НТ с последующей инкубацией в течение 48 часов в инкубаторе при 37°С, 5% СО2. Затем перед проточной цитометрией проводили трехцветное иммунофлуоресцентное окрашивание. Кратко, проводили иммунологическое окрашивание линии клеток аденокарциномы легкого А549 и линии клеток нормального легкого L132 двумя различными красителями и смешивали в соотношении 1:1. Эту смесь клеток инкубировали со 100 мкл супернатанта культуры клеток гибридомы при 4°С в течение 30 мин и центрифугировали совместно с 3 мл PBS при 1500 об/мин в течение 3 мин для удаления несвязанных антител. Связанные антитела выявляли путем инкубации с 200-кратным разведением вторичного антитела, представляющего собой козий антимышиный Ig-APC (DINONA INC, Корея), при 4°С в течение 15 мин с последующим промыванием 3 мл PBS таким же способом. Затем клетки гибридомы измеряли методом проточной цитометрии.
Было проведено исследование, чтобы определить, связывается ли антитело с клетками периферической крови. С этой целью РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови из Корейской службы переливания крови Красного Креста) инкубировали со 100 мкл супернатанта гибридомы при 4°С в течение 30 мин и центрифугировали совместно с 3 мл PBS при 1500 об/мин в течение 3 мин для отмывки несвязанных антител. Для выявления связанных антител использовали вторичное антитело, представляющее собой 200-кратное разведение козьего антимышиного Ig-FITC (DINONA INC, Корея). После взаимодействия в течение 15 мин при 4°С реакционную смесь промывали 3 мл PBS таким же способом. Титр антитела измеряли методом проточной цитометрии, и результаты представлены на Фиг. 1. На Фиг. 1 показаны титры мышиного моноклонального антитела 27В6, специфичного к клеткам аденокарциномы легкого, в периферической крови, измеренные методом проточной цитометрии.
Таким образом, было отобрано антитело, проявляющее положительную реакцию с линией клеток рака легкого А549 и отрицательную реакцию с линией клеток нормального легкого L132 и всеми гранулоцитами, лимфоцитами и моноцитами периферической крови, и обозначено как 27В6. Наконец, следуя методике ограничивающего разведения, клетки гибридомы 27В6 разводили и отбирали для выращивания отдельных колоний.
Линия клеток гибридомы 27В6 была депонирована 14 февраля 2012 г. банком линий клеток Кореи, расположенным по адресу 28, Yongon-Dong, Chongno-gu, г. Сеул, Корея, и ей присвоен номер по каталогу KCLRF-BP-00280 20 февраля 2012 г.
1-4: Определение изотипа моноклонального антитела 27В6
Моноклональное антитело 27В6, полученное в Примере 1-3, анализировали на предмет изотипа, используя набор для изотипирования иммуноглобулинов мыши методом ELISA (BD Biosciences, США). Кратко, изотипирование проводили с антисыворотками, специфичными к изотипу (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, каппа, лямбда), при этом в качестве вторичного антитела использовали меченый пероксидазой козий антимышиный IgG. Проявление цвета индуцировали орто-фенилендиамином (OPD) и пероксидом водорода в качестве субстрата. Регистрировали оптическую плотность при 450 нм.
В результате моноклональное антитело 27В6 было идентифицировано как мышиный IgG1/легкая цепь каппа (результаты не представлены).
1-5: Последовательности CDR антитела 27В6
Процедура клонирования антитела проиллюстрирована на Фиг. 1. Конкретно ген антитела 27В6 клонировали с помощью набора праймеров к Ig мыши (Millipore, № по каталогу: 69831). Проводили PCR (полимеразная цепная реакция) с использованием набора праймеров к Ig с РНК, выделенной из гибридомы 27В6, встраивали в вектор PGem-T (Promega, № по каталогу: A3600) и секвенировали для подтверждения последовательности ДНК. Ген мышиного антитела был идентифицирован с помощью сайта IMGT (www.imgt.org). Последовательности тяжелой и легкой цепи, включая последовательности CDR Ab (антитела) 27В6, представлены SEQ ID NO: 12 и 13 соответственно. CDR1-CDR3 вариабельной области тяжелой цепи показаны в SEQ ID NO: 6-8, соответственно, a CDR1-CDR3 вариабельной области легкой цепи показаны в SEQ ID NO: 9-11 соответственно (см. Таблицу 2).
Пример 2. Получение химерного антитела 27В6
При введении моноклонального антитела мышиного происхождения в организм человека иммунная система человека распознает это моноклональное антитело как чужеродный антиген и, таким образом, продуцирует человеческое антимышиное антитело (НАМА) для элиминации мышиного антитела из крови. Кроме того, домен Fc мышиного антитела не может эффективно выполнять свои биологические функции в организме человека. Поэтому происходит не только снижение терапевтического эффекта, но также могут быть вызваны такие побочные эффекты, как тяжелые аллергические реакции и дисфункция почек. Чтобы снизить иммуногенность антитела 27В6 при введении в организм человека, было сконструировано химерное антитело, в котором мышиное антитело за исключением вариабельной области было заменено Fc человеческого антитела. Наблюдали, что это химерное антитело подобно по антигенной специфичности и аффинности исходному мышиному антителу 27В6.
Для конструирования химерного антитела линию клеток DHFR DG44, имеющую происхождение от клеток яичника китайского хомячка (СНО), трансфицировали ДНК 27B6-HuIgFc, полученной описанным выше способом, после чего проводили процедуру селективного культивирования в селективной среде для основания стабильной линии клеток, продуцирующей рекомбинантное антитело 27В6. Подробное описание приведено ниже.
Сначала за три часа до трансфекции линию клеток DG44 (Invitrogen, № по каталогу А1100001) высевали при плотности 1×106 клеток/мл в 6-луночные планшеты и инкубировали с 1 мл среды GIBCO® CD DG44 (Invitrogen, США) при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 3 часов. Затем ДНК 27B6-HuIgFc трансфицировали компетентные клетки DG 44, используя набор реагентов для трансфекции Effectene (QIAGEN, г. Хильден, Германия).
Через трое суток после трансфекции отбирали супернатант и добавляли к клеткам А549, которые впоследствии инкубировали при 4°С в течение 30 мин. Несвязанные антитела удаляли посредством совместного центрифугирования с 3 мл PBS при 1500 об/мин в течение 3 мин. Связанные антитела выявляли путем инкубации с 150-кратным разведением вторичного антитела, представляющего собой козий антимышиный Ig-APC (DINONA INC, Корея), при 4°С в течение 15 мин с последующим промыванием 3 мл PBS таким же способом. Затем титр антитела к клеткам А549 определяли количественно методом проточной цитометрии. Впоследствии была основана стабильная линия клеток. Для этого питательную среду заменяли питательной средой Power для клеток СНО (LONZA, Швейцария) с добавлением 30 нМ метотрексата (МТХ) (Sigma, США) и 200 мкг/мл G418 (Invitrogen, США), после чего начинали селекцию клонов. Концентрации МТХ и G418 в селективной среде увеличивали при повторении раундов селекции клонов. Каждый раунд составлял три недели. Окончательный раунд селекции клонов проводили в среде Power СНО с добавлением 1000 нМ МТХ и 400 мкг/мл G418. Затем методом ограничивающего разведения была основана конечная линия клеток из отдельной колонии.
На основании количественного определения методом проточной цитометрии было обнаружено, что полученное таким образом химерное антитело 27В6 обладает такой же антигенной специфичностью и аффинностью, что и исходное мышиное антитело 27В6. На Фиг. 2 показана антигенная специфичность и аффинность химерного антитела 27В6.
Пример 3. Получение моноклонального антитела к СА-XII (4В4)
3-1: «Спаренное» (pairing) антитело 27В6
Для разработки другого антитела, распознающего тот же антиген, но связывающегося с другим эпитопом, было получено «спаренное» антитело 27В6.
В первую очередь для изучения возможности разработки «спаренного» антитела 27В6 был поставлен сэндвич-ELISA с использованием химерного антитела 27В6 и мышиной сыворотки. Таким же способом, как описано в Примере 1-2, каждой самке мышей линии balb/c в возрасте 6 недель вводили путем и/п (в интраперитонеальную полость) инъекции линию клеток А549 (1×107 клеток) через регулярные интервалы в течение трех недель, после чего получали сыворотки из венозной крови.
Конкретно, очищенное химерное антитело 27В6 в концентрации 100 нг/мл добавляли в микропланшет в виде покрытия и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. В лунки микропланшета, покрытые антителом 27В6, добавляли 200 мкл/лунка блокирующего буфера (Sigma) и блокировали при 37°С в течение 1 часа. Клетки А549 в количестве 1×107 клеток/мл подвергали лизису, используя буфер для лизиса, представляющий собой 1% NP40. Полученный лизат клеток А549 добавляли в микропланшет в количестве 50 мкл/лунка, подвергали взаимодействию при 37°С в течение 1 часа, а затем промывали PBS три раза. В микропланшет добавляли 100 мкл/лунка 1000-кратного разведения сыворотки крови мышей, иммунизированных А549, и инкубировали при 37°С в течение 1 часа, а затем промывали PBS три раза. Наконец, добавляли 100 мкл/лунка 2000-кратного разведения вторичного козьего антимышиного антитела IgG-HRP (Jackson) и инкубировали при 37°С в течение 30 минут, после чего промывали PBS 3 раза. Добавляли ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) в количестве 50 мкл/лунка с последующим взаимодействием при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы индуцировать проявление цвета, и добавляли такое же количество 2 н. H2SO4 (Sigma). Затем измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм.
Как и ожидалось, при использовании химерного антитела 27В6 и мышиной сыворотки в сэндвич-ELISA наблюдали положительную реакцию (данные не представлены).
3-2: Получение моноклонального антитела
Клетки гибридомы из спленоцитов иммунизированных мышей получали так же, как в Примере 1-3.
В результате было отобрано антитело, проявляющее положительную реакцию с линией клеток рака легкого А549 и отрицательную реакцию с линией клеток нормального легкого L132 и всеми гранулоцитами, лимфоцитами и моноцитами периферической крови, и обозначено как 4В4. Наконец, следуя методике ограничивающего разведения, клетки гибридомы 4В4 разводили и отбирали для выращивания отдельных колоний (Фиг. 3). На Фиг. 3 показаны титры моноклонального антитела 4В4 в периферической крови, измеренные методом проточной цитометрии. Линия клеток гибридомы 4В4 была депонирована 14 февраля 2012 г. банком линий клеток Кореи, расположенным по адресу 28, Yongon-Dong, Chongno-gu, г. Сеул, Корея, и ей присвоен номер по каталогу KCLRF-BP-00279 20 февраля 2012 г.
3-3: Анализ антитела 4В4
Анализ аминокислотных последовательностей антитела проводили по существу таким же способом, как в Примере 1-5. Последовательности тяжелой цепи и последовательности легкой цепи, включая последовательности CDR Ab 4В4, полученного в Примере 3-2, представлены SEQ ID NO: 20 и 21 соответственно, а CDR1-CDR3 тяжелой цепи показаны в SEQ ID NO: 14 и 16 соответственно, и CDR1-CDR3 легкой цепи показаны в SEQ ID NO: 17-19 (см. Таблицу 2).
Пример 4. Получение химерного антитела 4В4
Чтобы снизить иммуногенность антитела 4В4 при введении в организм человека, в соответствии с примером 2 было сконструировано химерное антитело, в котором мышиное антитело за исключением вариабельной области было заменено Fc человеческого антитела. Наблюдали, что это химерное антитело подобно по антигенной специфичности и аффинности исходному мышиному антителу 4В4.
Способ получения химерного антитела 4В4 осуществляли таким же способом, как в Примере 2. В результате на основании количественного определения методом проточной цитометрии (Фиг. 5) было обнаружено, что полученное антитело обладает такой же антигенной специфичностью и аффинностью, что и исходное мышиное антитело 4В4. На Фиг. 5 показана антигенная специфичность и аффинность химерного антитела 4В4.
Пример 5. Анализ экспрессии антитела в различных линиях клеток
5-1: Экспрессия антитела в различных линиях клеток
Методом проточной цитометрии проводили анализ связывания химерного антитела 27В6, полученного в Примере 2, и химерного антитела 4В4, полученного в Примере 4, с различными линиями клеток, полученными из KCLB (банк линий клеток Кореи) и SNU (Сеульский национальный университет).
Конкретно из KCLB (банк линий клеток Кореи) и SNU (Сеульский национальный университет) были получены различные линии клеток. L-132, SW-900, DU145, LNCap, MCF-7, Huh7 и Hs-578T культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 в среде, представляющей собой модифицированную Дульбекко MEM (GIBCO, Invitrogen), с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS; GIBCO, Invitrogen), а А549, NCI-H460, NCI-H417, DLD-1, НСТ116, НТ-29, SW-480, SW-620, LS174T, РС-3, SNU1, SNU638, SNU719, MKN1, MKN28, MKN45, MKN74, NCI-N87, SK-BR3, MDA-MB231 и MDA-MB453 культивировали в среде RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen) с добавлением 10% инактивированной нагреванием FBS. Кроме того, инкубацию Calu-3, Нер3В, SK-HEP-1, С3А, Hep G2, PLC/PRF/5 и ВТ-20 проводили при 37°С в атмосфере 5% CO2 в среде Игла MEM (GIBCO, Invitrogen) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS; GIBCO, Invitrogen), инкубацию KATO III - в среде IMDM (GIBCO, Invitrogen) с добавлением 20% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS; GIBCO, Invitrogen) и инкубацию SW480 и MDA-MB468 - в среде L-15 Лейбовица с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS; GIBCO, Invitrogen).
Культивируемые линии раковых клеток инкубировали с моноклональным антителом 27В6 или 4В4 по настоящему изобретению при 4°С в течение 30 мин, промывали PBS и обрабатывали конъюгированным с FITC козьим антимышиным IgG (DINONA INC, Korea) при 4°С в течение 15 мин. Линии клеток снова промывали PBS, перед анализом посредством FACScaliber (Becton Dickinson, США). Сводные результаты приведены ниже в Таблице 5. Титры антител 27В6 и 4В4 также определяли количественно в различных линиях опухолевых клеток.
В приведенной ниже Таблице 5 представлен паттерн экспрессии антигена карбоангидразы 12 в различных линиях клеток солидных раковых опухолей. В Таблице 16 приведено процентное содержание клеток с положительным результатом определения моноклональных антител 27В6 и 4В4 из 5000 исследованных клеток, которое тестировали в анализе FACS, где знак - обозначает 10% или менее из числа положительных клеток, + обозначает диапазон от 10 до 30% от числа положительных клеток, ++ относится к 30-70% от числа положительных клеток, и +++ относится к 70-100% от числа положительных клеток. Если количество положительных клеток составляет менее 10%, их считают отрицательными, а при количестве положительных клеток 10% или более их считают положительными.
Профилирование связывания химерного антитела 4В4 с клетками, проведенное методом проточной цитометрии:
-: менее 10% количества положительных клеток
+: 10-30%
++: 30-70%
+++: более 70%.
Как показано в Таблице 5, моноклональные антитела 27В6 и 4В4 по настоящему изобретению демонстрировали положительную реакцию, хотя степень аффинности связывания различалась в различных типах линий клеток рака легкого, колоректального рака, рака желудка, рака печени и рака молочной железы. Напротив, все из лимфоцитов, мононуклеарных клеток и гранулоцитов периферической крови демонстрировали отрицательные результаты. Это свидетельствует о том, что антитела 27В6 и 4В4 по настоящему изобретению можно применять в качестве терапевтических агентов против солидных опухолей, экспрессирующих антиген СА-XII.
5-2: Профиль экспрессии в клетках рака молочной железы
Были выявлены положительные реакции 27В6 и 4В4 с клетками ER-, PR- и HER2-положительного рака молочной железы. Соответственно, оба антитела можно применять в качестве терапевтических агентов для различных подтипов рака молочной железы, в том числа трижды негативного рака молочной железы.
Связывание моноклонального антитела 27В6 и 4В4 с тремя линиями клеток рака молочной железы с различными фенотипами изучали методом проточной цитометрии. Культивирование клеток проводили при 37°С в атмосфере 5% CO2; для клеток MCF-7 (клетки ER-положительного рака молочной железы) использовали модифицированную Дульбекко MEM (GIBCO, Invitrogen) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS; GIBCO, Invitrogen), а для клеток MDA-MB231 (линии клеток, выделенные из злокачественной опухоли молочной железы) и клеток SK-BR-3 (линия клеток рака молочной железы человека с гиперэкспрессией продукта гена Her2 (Neu/ErbB-2)) использовали среду RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen) с добавлением 10% инактивированной нагреванием FBS.
Культуры линий раковых клеток инкубировали при 4°С в течение 30 мин с моноклональным антителом 27В6 или 4В4 по настоящему изобретению, промывали PBS и обрабатывали при 4°С в течение 15 мин конъюгированным с FITC козьим антимышиным IgG (DINONA INC, Корея). Перед анализом посредством FACScaliber (Becton Dickinson, США) линии клеток еще раз промывали PBS. Сводные результаты приведены в Таблице 6.
Таким образом, антитела 27В6 и 4В4 в соответствии с настоящим изобретением можно применять не только для трижды негативного рака молочной железы, но также для различных типов рака молочной железы, поскольку показана их положительная реакция с ER- и PR-, а также HER2-положительными клетками рака молочной железы.
5-3: IHC (иммуногистохимия)
Анализ распределения антигенов, с которыми связываются моноклональные антитела 27В6 и 4D4, в нормальных тканях организма человека проводили методом иммуногистохимии (IHC). Нормальные ткани тимуса и небной миндалины человека были получены из клиники Национального университета Чунгбук, и срезы замороженных тканей были изготовлены в отделении патологии клиники Национального университета Чунгбук.
Иммуногистохимическое окрашивание срезов замороженных тканей моноклональными антителами 27В6 и 4В4 по настоящему изобретению проводили, как описано ниже. Срезы замороженных тканей тимуса и небной миндалины, которые хранили при температуре -20°С или ниже, сушили при комнатной температуре в течение 30-60 мин и погружали в 1-кратный PBS на 60 мин. Затем ткани обрабатывали в течение 10 мин 3% Н2О2 при комнатной температуре для подавления активности эндогенной пероксидазы, промывали проточной водой и блокировали при комнатной температуре в течение 30 мин содержащей иммуноглобулин козьей сывороткой, чтобы исключить неспецифическое окрашивание мышиными антителами. Затем ткани инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин с первым антителом (27В6, 4В4). Каждое антитело использовали в концентрации 10 мкг/мл. Затем ткани промывали три раза 1-кратным PBS в течение 5 мин, инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин с конъюгированным с HRP козьим антимышиным антителом (Dako, Дания), а затем промывали три раза 1-кратным PBST (0,05% Твин 20, 1-кратный PBS) в течение 5 мин. Окрашивание проявляли диаминобензидином (DAB) с последующим промыванием в течение 5 мин проточной водой. Проводили контрастирующее окрашивание тканей гематоксилином, а затем промывали в течение 7 мин проточной водой. После окрашивания предметные стекла обезвоживали и заклеивали. Результаты окрашивания анализировали под микроскопом, как описано ниже.
Как показано в Таблице 7, распределение антигенов, распознаваемых моноклональным антителом 27В6 и 4В4 по настоящему изобретению, отсутствует в нормальных тканях тимуса и небной миндалины. В частности, ни в зрелых, ни в незрелых Т- или В-лимфоцитах эти антигены не экспрессируются. Слабое окрашивание антителом 27В6 было выявлено в базальном слое небной миндалины, что, по-видимому, является результатом неспецифического связывания.
Пример 6. Анализ антигена для моноклонального антитела
6-1: Выделение и очистка моноклональных антител 4В4 и 27В6
Культивировали линию клеток аденокарциномы легкого А549, используемую для получения моноклонального антитела 4В4 и 27В6. Затем 1×108 клеток суспендировали в 50 мл буфера для лизиса (1% Нонидет Р-40; NP-40 в 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 50 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида; PMSF) и проводили лизис в течение 15 мин. После центрифугирования обломки клеток удаляли, и клеточный лизат был получен в виде супернатанта. Клеточные лизаты использовали для разделения антигенов, распознаваемых антителами 4В4 и 27В6.
Пять мг каждого из очищенных моноклональных антител 4В4 и 27В6 подвергали диализу против связывающего буфера (раствор 0,2 М бикарбоната натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 8,3) с получением растворов двух различных антител. Колонку Fast Flow (GE Healthcare) объемом 5 мл, заполненную 2 мл смолы сефарозы, активированной NHS (N-гидроксисукцинимид), промывали 20 мл раствора 1 мМ HCl, а затем 20 мл связывающего буфера (20 мМ бикарбоната натрия, 0,5 мМ хлорида натрия, рН 8,3), чтобы дать возможность подготовленным антителам связаться с колонкой. Выходное отверстие колонки блокировали, наносили растворы каждого из двух различных антител и блокировали входное отверстие колонки. Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 4 ч. Затем через колонку пропускали 20 мл отмывочного буфера (20 мМ ацетата натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 5,4), чтобы удалить избыток антител, не связавшихся со смолой. Колонку снова промывали 50 мл блокирующего буфера (0,1 М этаноламина, 0,5 М хлорида натрия, рН 8,3) для удаления оставшихся реакционных групп. Две колонки промывали 20 мл маточного буферного раствора (20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 0,02% азид натрия, рН 8,0) и замораживали до использования.
Подготовленные колонки помещали в прибор для FPLC (экспресс-хроматографии белков) ActaFPLC, чтобы связанные со смолой антитела могли распознать антигены и, таким образом, можно было разделить эти антигены. На колонку, соединенную с прибором для FPLC, наносили лизаты линии клеток аденокарциномы легкого А549, которые использовали в качестве источника антигена, распознаваемого моноклональными антителами 4В4 и 27В6. Разделение антигенов проводили в процессе, состоящем из четырех стадий: уравновешивание; нанесение образца, отмывка и вторая отмывка; элюирование. Буфер для уравновешивания и для отмывки имеет следующий состав: 0,5% Твин-80, 20 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,4. Этот буфер использовали в количестве 10 мл для уравновешивания и в количестве 20 мл для отмывки. Буфер для элюирования содержал 0,3 М глицина, 0,1 М сахарозы, 0,1 М маннита, 1,0 М мочевины и 0,5% Твин-80, его рН составлял 3,0, и этот буфер использовали для отмывки в количестве 20 мл. Для второй отмывки использовали смесь, в которой буфер для элюирования смешивали с отмывочным буфером в соотношении 25%. К 20 мл элюированного раствора, полученного в процессе разделения антигена, добавляли 5 мл ТСА (трихлоруксусная кислота) и хранили в холодильнике в течение 30 мин. После центрифугирования осадок дополнительно дважды промывали ацетоном. Наконец, полученный осадок суспендировали в 1-кратном буфере для нанесения образца на SDS-PAGE и окрашивали Кумасси синим. Как описано выше, антигены, которые были выделены и очищены на колонках, изготовленных с антителами 4В4 и 27В6, показаны на Фиг. 6. На Фиг. 6 показаны электрофореграммы антигенов, выделенных и очищенных из линии клеток аденокарциномы легкого А549 с помощью колонок, изготовленных с моноклональными антителами 4В4 и 27В6.
6-2: Идентификация антигена для моноклональных антител 4В4 и 27В6
Антигены, выделенные и очищенные из смолы, полученной в результате сшивания с моноклональным антителом 4В4 и 27В6, визуализировали, как показано на Фиг. 7. Анализ двух основных указанных стрелками полос белка размером около 58 кДа был проведен в Seoul Pharma Laboratories. Для идентификации были получены пептиды путем расщепления в геле и проведен их анализ методом LC-MS/MS (жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией) с последующей обработкой спектров MS/MS с помощью программ PLGS (Waters) и MASCOT (Matrix Science). Была проведена серия анализов, как описано ниже.
Фрагменты геля, содержащие белки, подвергали дегидратации, используя 100% CAN (ацетонитрил) и полностью высушивали в Speed-vac. Белки, содержащиеся во фрагментах высушенного геля, расщепляли в течение 15 мин трипсином. Пептиды, образовавшиеся после расщепления трипсином, экстрагировали 60% раствором CAN, содержащим 0,1% TFA (трифторуксусная кислота). Объединенные экстракты высушивали в Speed-vac. Образцы растворяли в 20 мкл 5% CAN, 0,2% TFA (трифторуксусная кислота), после чего проводили анализ LC-MS/MS. В ходе анализа LC-MS/MS пептиды элюировали из колонки LC nanoACQUITY UPLC ВЕН С18 (1,7 мкм, внутренний диаметр 2,1 мм × 150 мм) градиентом от подвижной фазы буфера А (0,1% ТСА в 100% DW (деионизированная вода)) до подвижной фазы буфера В (0,1% ТСА в 100% ACN). Разделенные пептиды анализировали с помощью прибора нано-ESI-Q-TOF реальном времени в режиме наблюдения положительного сканирования. Затем спектральные данные обрабатывали с помощью программ PLGS и MASCOT.
Конечные результаты идентификации, полученные в описанной выше серии анализов, как показано в следующей ниже Таблице, представлены в Таблице 8 ниже.
Как и ожидалось, по результатам анализа карбоангидраза 12 была идентифицирована как общий антиген, очищенный на обоих моноклональных антителах 4В4 и 27В6, и было обнаружено, что она находится на клеточной поверхности. Другие белки не могут быть антигенами для моноклональных антител 4В4 и 27В6, поскольку они представляют собой внутриклеточные белки. Таким образом, они, по-видимому, оказались примесями, включенными вследствие недостаточного разделения и очистки.
С помощью антитела 27В6 было разделено четыре пептида: и С помощью антитела 4В4 было разделено три пептида: и Среди них была определена общая последовательность для обоих антител 4В4 и 27В6: На Фиг. 8 представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 1 карбоангидразы 12, и последовательность анализируемого пептида выделена жирным шрифтом. На Фиг. 8 приведен перечень белков, идентифицированных в анализе LC-MS/MS из очищенных антигенов. В Таблице 9 показана аминокислотная последовательность изоформы 1 карбоангидразы 12 в соответствии с примером 6 и антигенного пептидного фрагмента из антигенов, распознаваемых антителами 27В6 и 4В4, обнаруженного с помощью LC-MS/MS. Эти результаты показывают, что антигенный пептидный фрагмент из антигенов, распознаваемых антителами 27В6 и 4В4, представляет собой изоформу 1 карбоангидразы 12.
6-3: Анализ антигена для моноклональных антител 4В4 и 27В6 (ELISA)
Для оценки результатов идентификации антигена, полученных методом LC-MS/MS, изучали реакционность моноклональных антител 4В4 и 27В6 с рекомбинантным белком карбоангидразой 12 (R&D Systems) методами ELISA и Вестерн-блоттинга.
Рекомбинантный белок СА12 наносили при плотности 100 нг/лунка в лунки планшета Maxisrop ELISA и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Для блокирования в каждую из лунок, покрытых антигеном, добавляли 200 мкл 1-кратного блокирующего буфера (Sigma) с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 ч. В лунки планшетов наносили антитела 4В4, 27В6 и моноклональное антитело к СА12 (R&D Systems) со 100 мкл PBS. После инкубации в течение 1 ч при 37°С планшеты промывали PBS для удаления несвязанных антител. После этого в лунки добавляли разведение козьего антимышиного IgG-HRP (Jackson), оставляли для взаимодействия на 30 мин и промывали PBS. Проявление окрашивания осуществляли в течение 10 мин добавлением в каждую лунку 50 мкл ТМВ и останавливали реакцию 50 мкл серной кислоты. Регистрировали оптическую плотность при 450 нм. Хотя реакционность моноклонального антитела 27В6 с рекомбинантной карбоангидразой 12 была низкой, сигналы реакции 4В4, 27В6 и моноклонального антитела к СА12 (R&D Systems) с рекомбинантным антигеном показаны на Фиг. 7. На Фиг. 7 показана идентификация карбоангидразы 12 в качестве антигена для моноклонального антитела 4В4 и 27В6 на основании количественного определения методом ELISA.
6-4: Количественное определение антигена для моноклональных антител 4В4 и 27В6 (Вестерн-блоттинг)
Распознавание карбоангидразы 12 в качестве антигена моноклональными антителами 4В4 и 27В6, доказанное в предыдущем эксперименте, было подтверждено Вестерн-блоттингом. Рекомбинантную карбоангидразу 12 кипятили в течение 3 мин, наносили на 8% разделяющий полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия и проводили электрофорез. Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую после этого блокировали 5% раствором обезжиренного молока (Sigma) и обрабатывали 4В4, 27В6 или моноклональным антителом к СА12 (R&D Systems) (27В6: дорожки 1 и 2, 4В4: дорожки 3 и 4, моноклональное антитело к СА12: дорожки 5 и 6). После трех раундов отмывки в отмывочном буфере (0,1% Твин-20 в PBS) антитело сшивали с конъюгированным с пероксидазой козьим антимышиным IgG (Sigma, г. Сент-Луис, США). Затем нитроцеллюлозную мембрану промывали отмывочным буфером, полосы визуализировали с использованием системы выявления хемилюминесценции (ECL, Amersham, Швеция). Результаты показаны на Фиг. 8. На Фиг. 8 показана идентификация карбоангидразы 12 в качестве антигена для моноклонального антитела 4В4 и 27В6 на основании анализа методом Вестерн-блоттинга. Рекомбинантная СА12 была выявлена в области 40 кДа всеми антителами - 4В4, 27В6 и моноклональным антителом СА12 (R&D Systems).
6-5: Анализ антигена для моноклональных антител 4В4 и 27В6 (сэндвич-ELISA)
В анализах методами ELISA и WB (Вестерн-блоттинг) было показано, что моноклональные антитела 4В4 и 27В6 распознают карбоангидразу 12 в качестве антигена, но сигнал обнаружения моноклональным антителом 27В6 был относительно низким. Для компенсации этого относительно низкого сигнала был проведен сэндвич-ELISA. Химерное моноклональное антитело 4В4 или 27В6 наносили в концентрации 100 нг/лунка в лунки планшета Maxisrop ELISA и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Для блокирования в каждую из лунок, покрытых антигеном, добавляли 200 мкл 1-кратного блокирующего буфера (Sigma) с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 ч. В лунки добавляли двукратные серийные разведения рекомбинантной карбоангидразы 12, начиная с концентрации 100 нг/мл, инкубировали при 37°С в течение 1 ч и промывали PBS для удаления несвязанных антигенов. Затем в лунки, покрытые химерным антителом 4В4 и химерным антителом 27В6, наносили моноклональное антитело 4В4 и моноклональное антитело 27В6, соответственно, в концентрации 100 нг/лунка. После инкубации в течение 1 ч при 37°С лунки промывали PBS для удаления несвязанных антител. Далее связанные антитела инкубировали с разведением козьего антимышиного IgG-HRP (Jackson) в течение 30 мин и промывали PBS. Проявление окрашивания осуществляли в течение 10 мин добавлением в каждую лунку 50 мкл ТМВ и останавливали реакцию 50 мкл серной кислоты. Определение оптической плотности выполняли при 450 нм. При использовании химерных антител 27В6 и 4В4 в качестве захватывающего антитела и детектирующего антитела, соответственно, были зарегистрированы высокие сигналы реакции, как показано в Таблице 10. Таким образом, было доказано, что оба моноклональных антитела 4В4 и 27В6 распознают карбоангидразу 12 в качестве антигена.
В Таблице 10 показано конкурентное распознавание карбоангидразы 12 моноклональными антителами 27В6 и 4В4, определенное количественно в анализе методом сэндвич-ELISA с использованием моноклональных антител 27В6 и 4В4 в качестве захватывающих/детектирующих антител.
Пример 7. Эпитопное картирование
Для анализа эпитопов, как показано на Фиг. 13, был сконструирован рекомбинантный антиген с эпитопом или без эпитопа и проведен анализ иммунных реакций с моноклональными мышиными антителами 27В6 и 4В4 в Примере 1 и 3.
7-1: Конструирование и экспрессия мутантного рекомбинантного гена СА12
Для получения мутантных рекомбинантных генов СА12 рекомбинантный вектор pSec-Tag-CA12-full-hFc расщепляли поседством BamHI и HindIII. Рекомбинантный ген, в котором полноразмерная последовательность оснований антигена СА12 была соединена с hFc, встраивали в вектор pSec-Tag, что позволяло экспрессировать рекомбинантный гибридный белок, содержащий полноразмерный СА12 и hFc. Как видно на Фиг. 13, были получены делеционные мутантные конструкции с hFc различной длины в диапазоне от N-конца до аминокислоты 300.
Соответствующие векторы pSec-Tag, несущие конструкцию CA12-full-hFc и пять различных делеционных мутантных конструкций с hFc, вводили в клетки СНО с помощью реагента ViaFect (Promega).
Кратко, за одни сутки до трансфекции клетки СНО высевали и инкубировали. После замены среды на свежую на клетки СНО наносили комплекс вектора и реагента ViaFect и инкубировали в течение 48 часов. Через двое суток после трансфекции супернатант культуры собирали и проводили анализ экспрессии гена путем выявления человеческой Fc области (hFc) с помощью сэндвич-ELISA.
7-2: Анализ эпитопа моноклонального антитела
Чтобы определить эпитоп СА12, распознаваемый антителом по настоящему изобретению, в каждую лунку добавляли 50 нг антитела к Ig человека (Jackson Laboratory) и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Зафиксированное в лунке антитело, используемое в качестве иммобилизованного антитела, блокировали путем инкубации с 200 мкл на лунку 1-кратного блокирующего буфера (Sigma) при 37°С в течение 1 ч. В лунки планшетов добавляли каждую из соответствующих культур, содержащих СА12 full-hFc, и пять различных делеционных мутантных конструкций с hFc в концентрации 100 мкл/лунка. После инкубации в течение 1 ч при 37°С лунки промывали PBS для удаления несвязанных антител. После этого в лунки добавляли разведение антимышиного Fc-специфичного Ig, меченного HRP (Jackson Laboratory), оставляли для взаимодействия на 30 мин и промывали PBS. Проявление окрашивания осуществляли в течение 10 мин добавлением в каждую лунку 50 мкл ТМВ и останавливали реакцию 50 мкл серной кислоты. Оптическую плотность регистрировали при 450 нм. Наличие белков, содержащих мутантный СА12 и hFc, в супернатантах культуры определяли с использованием набора реагентов Capture & Detect Sandwich ELISA, при этом антитело к Ig человека служило в качестве контроля. Результаты представлены на Фиг. 9.
Как видно на Фиг. 9, эпитопы были локализованы в участке от аминокислоты 25 до аминокислоты 57, который представляет собой некаталитический домен. Следовательно, антитела по настоящему изобретению не связываются с каталитическим доменом СА-XII, поэтому они не ингибируют каталитическую активность СА-XII.
В подробном описании, на основании анализа делеционным методом было обнаружено, что эпитоп, специфичный для антитела 27В6, имеет аминокислотную последовательность (участок от 25-й аминокислоты до 38-й аминокислоты на SEQ ID NO: 5). На основании трехмерной кристаллической структуры СА12 эпитоп ограничивается 7 последовательными аминокислотами (что соответствует 32-38 SEQ ID NO: 5) на аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Кроме того, обнаружено, что эпитоп, специфичный для антитела 4В4, имеет аминокислотную последовательность (участок от 39-й до 57й аминокислоты в SEQ ID NO: 5), при этом на основании трехмерной кристаллической структуры СА12 эпитоп ограничивается 14 последовательными аминокислотами (что соответствует аминокислотам с 39-й до 52-й в SEQ ID NO: 5) на аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.
Пример 8. Терапевтический эффект химерного антитела в отношении солидной опухоли (CDC)
8-1: Действие CDC на линию клеток аденокарциномы легкого
Линию клеток аденокарциномы легкого А549 высевали при плотности 5×103 клеток/лунка в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 20-24 часов в СО2 инкубаторе при 37°С. После удаления культуральной среды из каждой лунки среду RPMI, не содержащую фетальную бычью сыворотку, смешивали с 10% сывороткой человека и добавляли в смесь химерное антитело 27В6 в конечной концентрации 10 мкг/мл. Этот раствор вносили в лунки планшета в концентрации 100 мкл/лунка.
Аналогичным образом также обрабатывали химерное антитело 4В4. После 3 часов инкубации в СО2 инкубаторе при 37°С в каждую лунку добавляли реагент Ez-СуТох (DOGEN, KOREA) в количестве 10 мкл. После инкубации в течение 3,5 часов в СО2 инкубаторе при 37°С оптическую плотность при 450 нм измеряли на ридере для планшетов. Результаты представлены на Фиг. 10. На Фиг. 10 показаны комплементзависимые цитотоксические эффекты антитела 27В6.
Как видно на Фиг. 10, химерные антитела 27В6 и 4В4, полученные в примерах 2 и 4, проявляют комплементзависимую цитотоксичность.
8-2: Эффект CDC при трижды негативном раке молочной железы
В соответствии со способом, аналогичным описанному в Примере 8-1, была проведена оценка терапевтического эффекта за исключением того, что в качестве целевой линии клеток вместо линии клеток А549 использовали линию клеток трижды негативного рака молочной железы MDAMB-231, и измеряли оптическую плотность при 450 нм, как показано в Таблице 11. В Таблице 11 показаны результаты, подтверждающие, что химерное антитело 4В4 в соответствии с Примером 8 проявляет комплементзависимую цитотоксичность при трижды негативном раке молочной железы.
Как показано в Таблице 11, моноклональное антитело 27В6 по настоящему изобретению проявляло комплементзависимую цитотоксичность против опухолей, представляющих собой аденокарциному легкого.
Пример 9. Терапевтическое действие химерного антитела на солидную опухоль (ADCC)
9-1: Анализ антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (анализ ADCC-LDH)
Для получения эффекторных клеток к образцу крови человека добавляли фиколл (кровь : фиколл = 1:2) с последующим центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин с получением РВМС. РВМС хранили при 37°С в среде RPMI с добавлением 5% FBS. Анализ антителозависимой клеточной цитотоксичности проводили в сочетании с анализом LDH (лактатдегидрогеназа) или люциферазным анализом.
В качестве мишеней использовали различные линии клеток солидных опухолей - НТ29 (колоректальный рак), А549 (аденокарцинома легкого), NCI-H460 (аденокарцинома легкого) и MCF7 (рак молочной железы), каждую из которых высевали при плотности 1×104 клеток/лунка в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 18-20 часов в CO2 инкубаторе при 37°С. После удаления культуральной среды из каждой лунки в культуральную среду с добавлением 5% FBS добавляли химерное антитело 27В6 в концентрации 0 мкг/мл, 0,1 мкг/мл или 3 мкг/мл, а затем вносили в лунки планшета в концентрации 100 мкл/лунка, после чего инкубировали в течение 30 мин в CO2 инкубаторе при 37°С. Затем эффекторные клетки, полученные, как описано выше, высевали при плотности 5×105 клеток/лунка (в 50 раз больше по сравнению с клетками-мишенями) и культивировали в течение 24 часов в СО2 инкубаторе при 37°С. В качестве положительного контроля перед инкубацией добавляли буфер для лизиса при 37°С на 24 часа. После 24 часов инкубации культуру клеток центрифугировали при 2500 об/мин в течение 5 мин. В полученном таким образом супернатанте количественно определяли активность лактатдегидрогеназы (LDH) для расчета лизиса клеток (набор для анализа Promega). Как показано на Фиг. 11, моноклональное антитело 27В6 по настоящему изобретению проявляло антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность против различных солидных опухолей (Фиг. 11). На Фиг. 10 показаны антителозависимые клеточно-опосредованные цитотоксические эффекты антитела 27В6.
9-2: Анализ антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности при трижды негативном раке молочной железы (анализ ADCC-LDH)
Эффекторные клетки были получены таким же способом, как в Примере 9-1, и проведено их тестирование для определения антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности.
Дополнительно было обнаружено, что антитело 27В6 проявляет высокую антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность в линиях клеток трижды негативного рака молочной железы (MDAMB-231, MDAMB-468, MDAMB-453, ВТ-20), для которого еще не разработаны терапевтические агенты (Фиг. 12). На Фиг. 12 показаны антителозависимые клеточно-опосредованные цитотоксические эффекты антитела 27В6 на линии клеток трижды негативного рака молочной железы.
Пример 10. Терапевтическое действие дефукозилированного антитела в отношении солидной опухоли (ADCC)
10-1: Анализ ADCC дефукозилированного химерного антитела 27В6 - рак ободочной кишки, легкого, молочной железы
Для индуцирования дефукозилирования белков антител линии клеток антитела 27В6 примера 2 и линии клеток химерного антитела 4В4 примера 4 инкубировали со 100 нг/мл кифунензина, который индуцирует дефукозилирование антитела, и дефукозилированные антитела разделяли и сравнивали с соответствующими фукозилированными антителами. Анализ ADCC обработанного кифунензином химерного антитела 27В6 с усиленной ADCC показал эффект ADCC дефукозилированного антитела при раке ободочной кишки, раке легкого и раке молочной железы.
Как видно на Фиг. 13, антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность антител, дефукозилированных кифунензином, против различных линий клеток солидных опухолей была повышена. На Фиг. 13 показана антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность дефукозилированного химерного антитела 27В6.
10-2: Анализ ADCC дефукозилированного химерного антитела 27В6 - трижды негативный рак молочной железы
С использованием люциферазного анализа ADCC был проведен анализ антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности против линии клеток трижды негативного рака молочной железы MDAMB231 и линии клеток рака молочной железы, положительного по рецептору HER2, SK-BR3. Антитела после дефукозилирования обработкой кифунензином проявляли повышенную антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность в отношении линий клеток MDAMB231 и SK-BR-3 по сравнению с соответствующими фукозилированными антителами (Фиг. 14).
На Фиг. 14 показана антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность дефукозилированных химерных антител 4В4 и 27В6, определенная посредством люциферазного анализа.
Конкретно в качестве клеток-мишеней использовали линии клеток рака молочной железы MDAMB231 и SK-BR3, которые высевали при плотности 1,25×104 клеток/лунка в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 20-24 часов в СО2 инкубаторе при 37°С. После удаления культуральной среды из каждой лунки, в которые были высеяны клетки, в лунки добавляли 25 мкл среды RPMI, содержащей 4% FBS с низкой концентрацией IgG. Проводили 3-кратное серийное разведение антител 27В6 и 4В4 от 10 мкг/мл до 1,2 нг/мл в среде RPMI, содержащей 4% FBS с низкой концентрацией IgG. Каждое серийное разведение антитела добавляли в количестве 25 мкл/лунка, планшеты закрывали крышками и оставляли в чистом лабораторном боксе. Клетки-репортеры ADCC (ADCC Reporter Bioassay, Promega) собирали из культуры клеток и суспендировали в концентрации 3×106 клеток/мл в среде RPMI, содержащей 4% FBS с низкой концентрацией IgG. В каждую лунку добавляли 25 мкл суспензии клеток-репортеров ADCC с последующей инкубацией в течение 24 часов в СО2 инкубаторе при 37°С. Перед извлечением планшетов замороженный субстрат люциферазы размораживали на водяной бане. Планшеты извлекали из чистого лабораторного бокса и оставляли при комнатной температуре на 15 мин. В лунки планшетов добавляли субстрат люциферазы в концентрации 75 мкл/лунка и оставляли для взаимодействия на 30 мин в темноте, после чего измеряли люминесценцию с помощью люминометра. Результат тестирования антителозависимой цитотоксичности дефукозилированных химерных антител 27В6 и 4В4 с использованием люциферазного анализа представлен на Фиг. 14.
Как видно на Фиг. 14, антитела 27В6 и 4В4 после дефукозилирования обработкой кифунензином проявляли повышенную антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность в отношении линий клеток MDAMB231 и SK-BR-3 по сравнению с соответствующими фукозилированными антителами.
Пример 11. Терапевтический эффект антител 27В6 и 4В4 в моделях на мышах
11-1: Основание линии клеток
Животные модели рака молочной железы человека были созданы с использованием линий клеток трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231 и MDA-MB-453. Сначала MDA-MB-231 или MDA-MB-453 вводили путем подкожной инъекции в дозе 1,5×108 клеток (в RPMI: смеси Матригель) в правый бок мышей. После инъекции мышей случайным образом распределяли в экспериментальную и контрольную группы.
На Фиг. 15 дополнительно показано связывание химерного антитела 27В6, описанного в Примере 2, и химерного антитела 4В4, описанного в Примере 4, с поверхностью клеток MDA-MB231, используемых в эксперименте с животными, а на Фиг. 16 показаны результаты эксперимента с животными с использованием антител, демонстрирующие, что эти антитела подавляют рост и размер опухоли, индуцированной MDA-МВ231.
В качестве тестируемых материалов в клетки рака молочной железы вносили фукозилированное химерное антитело 27В6, дефукозилированное химерное антитело 27В6, фукозилированное химерное антитело 4В4 и дефукозилированное химерное антитело 4В4. Спустя трое суток каждой мыши вводили клетки путем интраперитонеальной инъекции в дозе 12 мг/кг. Инъекцию проводили два раза в неделю в течение трех недель. Непосредственно перед инъекцией измеряли размер опухоли. Ингибирующую активность антител к СА12 против рака молочной железы выражали в виде объема опухоли, рассчитанного по следующей формуле: (а×b2)/2 (а представляет собой короткий диаметр, a b представляет собой длинный диаметр). Уравнение для расчета объема аналогично формуле расчета объема Примера 20-1.
[Уравнение]
Уравнение расчета объема (объем = (а×b2)/2, где а представляет собой короткий диаметр, a b представляет собой длинный диаметр).
11-2: Ингибирующая активность антител к СА12 против трижды негативного рака молочной железы
Был проведен анализ ингибирующей активности против трижды негативного рака молочной железы химерного антитела 4В4 к СА12, нацеленного на эпитоп СА12, специфично экспрессирующийся в клетках трижды негативного рака молочной железы.
Под действием антитела 4В4 опухоли молочной железы уменьшались в объеме, и активность дефукозилированного антитела превосходила активность соответствующего фукозилированного антитела против роста опухоли. Ингибирующая активность фукозилированного антитела 4В4 против роста опухолей молочной железы была обнаружена в обеих линиях клеток MDA-MB-231 и MDA-МВ-453.
В частности, в модели MDA-MB-453 наблюдали полную ремиссию, так как опухоль переставала расти после суток 21 (Фиг. 17). На Фиг. 17 показана ингибирующая активность антитела 4В4 против трижды негативного рака молочной железы.
Пример 12. Эффект антитела на выживаемость клеток
Был подтвержден эффект химерного антитела 4В4 примера 4 на жизнеспособность клеток. Эффекты антител на рост и выживаемость клеток исследовали при нанесении антител на СА12-положительные раковые клетки. Для этого за одни сутки до нанесения антитела клетки высевали в 96-луночные планшеты с плоским дном лунки при плотности 3×104 клеток/лунка (10% RPMI). Через 24 часа среду RPMI удаляли, и в каждую лунку добавляли по 100 мкл свежей 5% среды RPMI, содержащей антитело.
Через 24 часа добавляли набор CytoTox 96® для нерадиоактивного анализа цитотоксичности (Promega, номер по каталогу G1780) в концентрации 50 мкл/лунка и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Жизнеспособность клеток определяли с помощью спектрофотометра. Жизнеспособность клеток MDA-МВ231 определяли через двадцать четыре часа после нанесения антитела.
Результаты измерений показаны на Фиг. 18. Введение антител не приводило ни к стимуляции, ни к нарушению жизнеспособности клеток. Антитела не ингибировали ферментативную активность клеток СА12 и не влияли на рост опухолевых клеток. Таким образом, было обнаружено, что антитела в соответствии с настоящим изобретением осуществляют противоопухолевую активность посредством ADCC и CDC за счет иммунной системы.
Жизнеспособность клеток определяли через 24 часа, 48 часов и 72 часа после введения антитела к А549. Значимых изменений жизнеспособности клеток по сравнению с клетками, в которые не вводили антитела, не наблюдалось. На Фиг. 19 и 20 показано, что связывание одного антитела 4В4 с опухолевыми клетками не влияет на рост опухолевых клеток.
Антитело 4В4 в качестве антитела к СА12 не оказывало влияния на рост клеток только при связывании антитела с клетками. По-видимому, это объясняется тем фактом, что антитело 4В4 не влияет на ферментативную активность СА12, поскольку оно связывается с N-концевой неферментативной областью антигена СА12.
Пример 13. Оценка терапевтического эффекта комбинированной терапии антителом и радиотерапии
Было проведено исследование, чтобы определить, приведет ли комбинация антитела по настоящему изобретению и радиотерапии к повышенному противораковому эффекту.
Кратко, химерное антитело 27В6 по Примеру 2 применяли в комбинации с 5 мкг/мл цисплатина, облучением в дозе 2 Гр или 4 Гр и проводили анализ экспрессии СА12 в клетках А549 методом проточной цитометрии. В результате было обнаружено, что и цисплатин, и облучение повышают экспрессию СА12 на поверхности клеток, при этом максимальный уровень экспрессии индуцировало облучение в дозе 4 Гр. Это свидетельствует о том, что комбинация антитела к СА12 по настоящему изобретению с радиотерапией способна влиять на рост опухолевых клеток (верхняя диаграмма на Фиг. 20).
Для исследования эффекта комбинированной терапии на рост опухолевых клеток, как показано на нижней диаграмме Фиг. 20, определяли жизнеспособность линии раковых клеток А549 с помощью анализа МТТ, после чего ее подвергали воздействию комбинации антитела 27В6 и радиотерапии. На нижнем графике на Фиг. 20 показаны эффекты комбинации антитела 27В6 и радиотерапии на жизнеспособность клеток. Как видно на Фиг. 20, комбинация 27В6 и радиотерапии индуцировала гибель клеток в более высокой степени по сравнению с одним антителом или комбинацией контрольного антитела того же изотипа и радиотерапии.
Пример 14. Гуманизация химерного антитела к СА-XII
14-1: Конструирование гуманизированных вариабельных доменов (отбор формы DNP004 scFv)
Химерное антитело 4В4 в полноразмерной форме IgG, полученное в Примере 4, было преобразовано в форму scFv для скрининга антител с помощью технологии фагового дисплея, принадлежащей D.H. Lab. Для этого кодоны вариабельной области химерного антитела 4В4 были изменены на кодоны E. coli, и сконструирован ген scFv путем соединения VL и VH методом PCR. Для получения различных конструкций комбинировали порядок последовательностей VL и VH и длину линкера и лигировали их с фагмидным вектором. Лигированный плазмидный вектор подвергали анализу связывания с антигеном СА-XII и отобрали DNP004 scFv в форме VH-длинный линкер-VL, которую использовали в качестве матрицы для мутагенеза.
14-2: Конструирование и скрининг подбиблиотеки
Для полной или частичной вариабельной области было получено 11 подбиблиотек случайных мутаций или специфичных к положению мутаций методом «ноу-хау», принадлежащим D.H. Lab. Были получены следующие типы подбиблиотек:
(1) Подбиблиотека случайных мутаций: 1 вид VL, 1 вид VH, 2 вида VH и VL и
(2) Подбиблиотека специфичных к положению мутаций: три вида LCDR, три вида HCDR и 1 вид VH и VL.
Проводили биопэннинг СА-XII в этих одиннадцати (11) подбиблиотеках. В результате первого скрининга было отобрано 552 клона с высоким сигналом в области VL. Был проведен второй скрининг, и отобрано 78 клонов, сигнал которых превышал сигнал материнского клона. После подтверждения нуклеотидной последовательности было отобрано в общей сложности 32 клона с различными полинуклеотидными последовательностями.
Аффинность связывания этих отобранных 32 клонов с СА-XII повторно подтверждали методом ELISA и отобрали 10 клонов (ID (идентификационные номера) клонов 1, 2, 4, 5, 8, 15, 24, 25, 26, 28) с сигналом ELISA, в 1,5 раза превышающим сигнал химерного антитела 4В4. В результате анализа последовательностей их CDR было подтверждено наличие мутаций в областях LCDR1 и LCDR2 (Фиг. 22).
Поэтому участки LCDR1 и LCDR2 считали «горячими точками» мутаций и отобрали 10 клонов (ID клона: 1, 2, 4, 5, 8, 15, 24, 25, 26, 28) и 4 дополнительных клона с мутациями в участке LCDR2 (ID клона: 11, 22, 19, 30), которые затем были преобразованы в полноразмерный IgG (LK Sun, Р Curtis, Chimeric antibody with human constant regions and mouse variable regions directed against carcinoma-associated antigen 17-1A, Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Jan; 84 (1): 214-8) (Фиг. 21 и 22). Однако клоны ID 4, 5, 24 и 28 были исключены из этих 14 клонов в качестве материала для дальнейшего анализа в связи с низкой экспрессией. Сводные данные о сайтах мутаций из десяти отобранных клонов представлены в Таблице 12.
14-3: Трансфекция культуры гуманизированной библиотекой и количественное определение IgG
Клетки СНО (яичника китайского хомячка) высевали в 96-луночные планшеты и трансфицировали ДНК, выделенной из гуманизированных клонов минипрепаративным методом. Подробно методика эксперимента описана ниже.
Сначала за 12 часов до трансфекции линию клеток СНО высевали в 6-луночный планшет в концентрации 1×105 клеток/мл и добавляли 3 мл среды DMEM, содержащей 5% фетальную бычью сыворотку и культивировали при 37°С в 5% СО2 в течение 12 часов. Подготовленные клетки СНО трансформировали десятью видами ДНК полноразмерного IgG, используя набор реагентов ViaFect (Promega, США). Супернатанты культуры клеток собирали через 48 часов после трансфекции и подтверждали реакционность каждого гуманизированного клона и контрольного антитела IgG посредством ELISA.
В каждую лунку планшета Maxisrop ELISA добавляли 100 нг рекомбинантного белка СА-XII и подвергали взаимодействию при 37°С в течение одного часа для иммобилизации антигена в виде покрытия. Затем в каждую лунку добавляли 200 мкл 1-кратного блокирующего раствора (Sigma) и проводили реакцию блокирования при 37°С в течение одного часа. В подготовленный планшет добавляли моноклональное антитело 4В4, 27В6, антитело к СА-XII (R&D Systems) и PBS по 100 мкл, инкубировали при 37°С в течение 1 часа и промывали PBS для удаления несвязанных антител. Затем к реакционной смеси добавляли козье антитело к человеческому IgG-HRP (Jackson), инкубировали в течение 30 минут, промывали PBS, подвергали взаимодействию с раствором ТМВ в количестве 50 мкл на лунку в течение 10 минут, и реакцию гасили добавлением 50 мкл серной кислоты. Поглощение продукта реакции определяли при 450 нм.
14-4: Тестирование аффинности гуманизированного антитела-кандидата к антигену посредством ELISA
Параллельное тестирование связывания гуманизированных клонов с антигеном СА-XII проводили с использованием протоколов и антигенов, предоставленных D.H. Lab. Рассчитывали активность (аффинность) каждого клона и сравнивали с активностью положительного контроля (химерный клон 4В4) на том же планшете. Аффинность связывания 10 вариантов с антигеном (ID клона 1, 2, 4, 5, 8, 15, 24, 25, 26, 28) не превышала значительно аффинность материнского клона (химерного 4В4). Ожидаемая аффинность материнского клона, определяемая посредством ELISA, составляла около KD 10-10 М, то есть была достаточно высокой. Поэтому силу связывания 10 антител-кандидатов считают не сниженной даже в том случае, если аффинность связывания клонов-кандидатов с антигеном не достигает аффинности материнского клона (Фиг. 23 и 24).
Пример 15. Последовательность CDR/последовательность антитела гуманизированного антитела
15-1: Отбор последовательности гена гуманизированного антитела DNP004
Для получения гена гуманизированного антитела DNP004 в качестве матрицы использовали ген вариабельной области легкой цепи и ген вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела 4В4 (гибридома депонирована под номером по каталогу: KCLRF-BP-00279), специфично связывающегося с СА-XII. Для полной или частичной вариабельной области было получено 10 подбиблиотек случайных мутаций или специфичных к положению мутаций методом «ноу-хау» in silico, принадлежащим D.H. Lab.
552 клона подвергали скринингу методом фагового дисплея с использованием сконструированной библиотеки, и 78 клонов показали сигнал, превышающий сигнал при скрининге материнского клона. 32 различных клона подвергали скринингу путем анализа нуклеотидной последовательности. В результате анализа аффинности связывания 32 клонов с СА-XII было отобрано 10 клонов, сигнал которых в ELISA более чем в 1,5 раза превышал сигнал материнского клона, и участки мутаций были определены большей частью в областях LCDR1 и LCDR2. Таким образом, LCDR1 и 2 были выбраны как «горячие точки», и 4 вида (ID клона: 11, 22, 19, 30) с мутацией в области LCDR2 было отобрано для проведения преобразования в полноразмерный IgG1. Из 14 полученных IgG клоны ID 4, 5, 24 и 28 были исключены в связи с низкой экспрессией, и оставшиеся 10 клонов подвергали экспрессии и очистке, и наконец проводили ELISA для отбора конечных 10 видов.
Наконец, было отобрано антитело-кандидат №8, которое было в наибольшей степени подобно мышиному моноклональному антителу 4В4. Гены для каждого антитела-кандидата были идентифицированы путем секвенирования. Последовательности вариабельной области тяжелой цепи и последовательности вариабельной области легкой цепи анализируемого антитела DNP004 представлены ниже (Таблицы 13 и 14). Как показано ниже в Таблице 13, последовательности CDR вариабельной области тяжелой цепи могут быть одинаковыми или частично различаться, но последовательности CDR вариабельной области легкой цепи могут различаться. Аминокислоты, выделенные полужирным шрифтом в SEQ ID NO: 15, 16, 28 и 32-42 ниже, модифицированы.
В Таблице 15 ниже представлены последовательности вариабельной области тяжелой цепи и последовательности вариабельной области легкой цепи; все вариабельные области тяжелой цепи идентичны (SEQ ID NO: 53), но вариабельные области легкой цепи (SEQ ID NO: 54-63) различаются. Подчеркнутая часть последовательности соответствует последовательности CDR.
15-2: Получение гуманизированного антитела
Гуманизированное антитело было получено на основании аминокислотной последовательности полученного гуманизированного антитела к СА-XII DNP004.
Для экспрессии гуманизированных антител к СА-XII были получены плазмида для экспрессии тяжелой цепи и плазмида для экспрессии легкой цепи, соответственно. В качестве плазмиды для экспрессии тяжелой цепи использовали вектор PcDNA3.4 (Invitrogen), а в качестве плазмиды для экспрессии легкой цепи использовали вектор pOptiVEC (Invitrogen).
Для экспрессии кодирующей кДНК вариабельной области и кодирующей кДНК константной области каждого антитела в виде непрерывной аминокислотной последовательности без вставки дополнительной аминокислоты были синтезированы кодирующая последовательность клонированной вариабельной области и известной константной области IgG1 человека (тяжелая цепь) и константной области каппа (легкая цепь) (Bioneer). Для конструирования плазмиды для экспрессии полноразмерного антитела синтезированные гены тяжелой цепи и гены легкой цепи расщепляли ферментами рестрикции Xho I и Sal I, и фрагмент гена тяжелой цепи лигировали с вектором pcDNA3.4, а фрагмент гена легкой цепи лигировали с вектором pOptiVec (плазмида для экспрессии тяжелой цепи pcDNA3.4-4B4 и плазмида для экспрессии легкой цепи pOptiVEC-4B4).
Для проведения трансформации клетки DG44 (Invitrogen), имеющие происхождение от клеток СНО, трансфицировали полученными плазмидами для экспрессии тяжелой цепи pcDNA3.4-4B4 и для экспрессии легкой цепи pOptiVEC-4B4.
За трое суток до трансфекции клетки DG44 в суспензии адаптировали к питательной среде MEM, содержащей 5% FBS для их преобразования в прикрепленные клетки и повышения эффективности трансфекции. Трансфекцию проводили на 6-луночном планшете, используя реагент для трансфекции ViaFect (Promega, № по каталогу: Е4981). За сутки до трансфекции клетки DG44, адаптированные к прикрепленному состоянию, готовили к трансфекции путем субкультивирования с получением концентрации 1×105 клеток/лунка. Количество ДНК, используемое для трансфекции, было определено путем использования 3 мкг плазмиды для экспрессии легкой цепи pOptiVEC-4B4 и 1 мкг pcDNA3.4-4B4 плазмиды для экспрессии тяжелой цепи в соотношении смешивания 3:1. Трансфекцию выполняли в течение 48 часов. Для анализа популяции трансфицированных клеток использовали метод проточной цитометрии.
На Фиг. 25 показано связывание гуманизированного антитела DNP004 в линии клеток положительного по СА-XII и трижды негативного рака молочной железы MDAMB-231.
Пример 16. Оценка физических свойств группы антител-кандидатов
Для сопоставления экспрессии и физических свойств гуманизированных вариантов антитела была проведена их оценка и сравнение методами анализа SDS-PAGE, эксклюзионной хроматографии, температуры плавления, ANS-реакционность.
16-1: Анализ уровня экспрессии группы антител-кандидатов
Для подтверждения уровня экспрессии и наличия осаждения при очистке с белком А проводили транзиторную трансфекцию путем введения комбинированного вектора из 8 мутантов в клетки HEK293F.
300 мл каждой культуры наносили на колонку с белком A (GE Healthcare, № по каталогу 11-0034-93) и очищали, используя буфер для элюирования (цитратный буфер 20 мМ, рН 3,0). Полученное антитело подвергали диализу с забуференным фосфатом физиологическим раствором и определяли количественно до и после диализа для подтверждения потерь. Уровни экспрессии очень сильно различались в диапазоне 1,0-10,0 мкг/мл, и самые высокие уровни экспрессии наблюдали для вариантов под номерами 25 и 26 (Таблица 16).
16-2: SDS-PAGE-анализ антител-кандидатов
Анализ SDS-PAGE проводили, чтобы определить полноту связывания тяжелой/легкой цепи гуманизированных вариантов антитела, единства тяжелой цепи и легкой цепи.
При анализе в невосстанавливающих условиях 5 мкг антитела восстанавливали, 10 мкг антитела смешивали с 2-кратным буфером Лэммли (Bioread, № по каталогу 161-0737), кипятили при 100°С в течение 5 минут и наносили на гель ini-PROTEAN TGX Bio-Rad, № по каталогу 456-1083). Электрофорез проводили при 150 В в течение 1 часа и окрашивали красителем Simply Blue Safestain (Invitrogen, № по каталогу LC6060) в течение 2 часов и обессоливали дистиллированной водой. Из восьми гуманизированных вариантов антитела в варианте клона №15 окрашивание легкой цепи было нечетким, но ни в одном из остальных 7 вариантов отклонений не было обнаружено (Фиг. 26).
На Фиг. 26 представлена фотография, на которой показан результат анализа физических свойств группы антител-кандидатов с использованием SDS-PAGE. Из 15 гуманизированных вариантов антитела в варианте клона №15 окрашивание легкой цепи было нечетким, но ни в одном из остальных 7 вариантов отклонений не было обнаружено (Фиг. 26).
16-3: Анализ антител-кандидатов методом SE-HPLC (эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии)
Анализ методом эксклюзионной хроматографии проводили для оценки чистоты.
Каждое антитело разводили забуференным фосфатом физиологическим раствором до получения 1,0 мг/мл и наносили 20 мкл на колонку TSKgel G3000SWXL (TOSOH), уравновешенную буфером для уравновешивания (0,1 М фосфата натрия, 0,1 М хлорида натрия, рН 7,0). Буфер для уравновешивания пропускали со скоростью потока 0,5 мл/мин в течение 40 минут, и элюируемый белок выявляли при длине волны 280 нм. Для расчета площади каждого пика выявленные пики интегрировали с помощью автоматического анализа, и доля площади основного пика указана в процентах.
Доля площади основного пика большинства вариантов соответствовала 95% или более чистоты, но для вариантов №11 и №26 она составляла 94,3% и 94,1% соответственно, то есть несколько ниже (Таблица 17).
16-4: Анализ температуры плавления (Tm) группы антител-кандидатов
Для сравнительной оценки устойчивости измеряли температуру плавления гуманизированных вариантов антитела.
Краситель для определения термического сдвига белка и буфер (Invitrogen, № по каталогу 4462263) добавляли к 0,44 мкг варианта антитела в соответствии с инструкцией производителя с получением 20 мкл смешанного раствора, который вводили в прибор для PCR в реальном времени, оборудованный программным обеспечением Protein Thermal Shift™ версия 1.0. Значения флуоресценции, определяемые за счет связывания красителя для определения термического сдвига белков и антителом, определяли при непрерывном повышении температуры с 25°С до 95°С со скоростью 0,05°С/с. После завершения этого теста применяли подбор кривой Больцмана с помощью программного обеспечения ViiA (ТМ) 7 и рассчитывали температуру плавления (Tm) для каждого антитела. Самым устойчивым антителом был мутант 8, Tm которого составляла 71,41°С. Для подтверждения корреляции между Tm и чистотой каждый мутант оставляли без перемешивания при высокой температуре 62°С на 3 часа, а затем подвергали анализу методом эксклюзионной хроматографии, чтобы рассчитать долю площади основного пика.
Самое высокое соотношение пиков после выдерживания при высокой температуре 62°С было показано для мутанта 8, который был самым устойчивым вариантом при таком же анализе Tm (Таблица 18).
16-5: Оценка силы связывания с СА-XII-положительной линией клеток
Линию клеток рака молочной железы MDAMB231, экспрессирующую антиген СА-XII, культивировали в среде RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen) с добавлением 10% инактивированной нагреванием FBS, десорбировали трипсином-EDTA (Invitrogen), промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором и наливали в пробирку в количестве 2×106 клеток/пробирка.
В каждую пробирку добавляли гуманизированные варианты антитела до концентрации 1,0 мкг/мл и подвергали взаимодействию в течение 30 мин при охлаждении. Добавляли меченное FITC второе козье антитело к IgG мыши (HL) -FITC (DINONA INC, Корея), и клетки подвергали взаимодействию в течение 20 минут в холодильнике. Клетки центрифугировали еще раз с забуференным фосфатом физиологическим раствором, суспендировали их в забуференном фосфатом физиологическом растворе, содержащем 1% формальдегид, и анализировали флуоресценцию в проточном цитометре (Stratedigm, S1000EXi).
Сила связывания мутантов на основании средней интенсивности флуоресценции (MFI) химерного антитела 4В4, связанного с линией клеток MDAMB231, показана на Фиг. 28 в процентах. Для всех вариантов показано, что относительная сила связывания составляет 90% или более, а для вариантов 8, 11, 15 и 26 показана относительная сила связывания 99%, то есть незначительно отличается от химерного антитела (Фиг. 27).
Пример 17. Анализ экспрессии гуманизированного антитела в различных линиях клеток
17-1: Экспрессия антитела в различных линиях клеток
Связывание гуманизированного антитела (DNP004) в различных линиях раковых клеток, полученных из банка линий клеток Кореи (KCLB) и Сеульского национального университета (SNU), было подтверждено методом проточной цитометрии. LNCap, MCF-7, Huh7 и Hs-578T культивировали в питательной среде MEM Дульбекко (GIBCO, Invitrogen) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS; GIBCO, Invitrogen), а А549, NCI-H460, DLD-1, НТ-29, LS174T, РС-3, SNU638, SNU719, MKN45, NCI-H87, SK-BR3, MDA-МВ231, MDA-MB453 культивировали в питательной среде RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen) с добавлением 10% инактивированной нагреванием FBS в инкубаторе при 37°С и 5% СО2. В дополнение к этому Нер3В.1-7 и PLC/PRF/5 культивировали в питательной среде MEM Игла (GIBCO, Invitrogen) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS; GIBCO, Invitrogen), и KATO III культивировали в питательной среде IMDM (GIBCO, Invitrogen) с добавлением 20% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (GIBCO, Invitrogen) в инкубаторе при 37°С и 5% CO2.
После инкубации с DNP004 при 4°С в течение 30 минут раковые клетки промывали PBS и добавляли к культивируемым раковым клеткам конъюгированное с FITC козье антитело к IgG человека (DINONA INC, Корея). После отмывки PBS клетки анализировали с помощью прибора FACS caliber (Becton Dickinson, США), и результаты представлены ниже (Таблица 19). В приведенной ниже Таблице 19 представлены паттерны экспрессии антигена карбоангидразы 12 в различных линиях солидных раковых клеток. В Таблице 19 процент DNP004-положительных клеток определяли с помощью анализа FACS. Количество клеток, которые связываются с антителом DNP004 из 5000 исследованных клеток рассчитывали в %, - относится к менее 10% от числа положительных клеток, + относится к 10-30% от числа положительных клеток, ++ относится к 30-70% от числа положительных клеток, и +++ относится к 70-100% от числа положительных клеток.
Как показано в Таблице 19, даже несмотря на то, что клетки, имеющие одинаковое происхождение, получены из различных тканевых источников, используемых при конструировании линий клеток, степень положительной реакции может варьировать в зависимости от типа клеток. Однако для гуманизированного антитела DNP004 по настоящему изобретению показана положительная реакция с различными типами линий клеток - аденокарциномы легкого, рака ободочной кишки, рака желудка, рака печени и рака молочной железы, - даже несмотря на несколько различающуюся степень положительной реакции, но показана отрицательная реакция для клеток рака предстательной железы. С другой стороны, для лимфоцитов, мононуклеарных клеток и гранулоцитов периферической крови выявлен отрицательный результат. Эти результаты свидетельствуют о том, что гуманизированное антитело DNP004 по настоящему изобретению можно применять в качестве терапевтического агента для показаний при солидных опухолях, проявляющих положительную реакцию.
17-2: Паттерны экспрессии в различных типах клеток рака молочной железы
Для антитела DNP004 получена положительная реакция как в обоих ER- и PR-положительных, так и в HER2-положительных клетках рака молочной железы. Таким образом, антитело по настоящему изобретению можно применять для лечения трижды негативного рака молочной железы, а также различных типов рака молочной железы. Связывание гуманизированных антител DNP004 в линиях клеток рака молочной железы трех различных фенотипов было подтверждено проточной цитометрией и проведено сравнение со степенью связывания с химерным антителом 4В4.
В частности, линии клеток MDAMB-231 и MDAMB453, MCF-7 и SK-BR-3 культивировали таким же образом, как описано в Примере 5-2. К каждой из культивируемых линий раковых клеток добавляли гуманизированное антитело DNP004. Клетки инкубировали при 4°С в течение 30 минут, промывали PBS и инкубировали при 4°С в течение 15 минут с конъюгированным с FITC козьим антителом к IgG человека (DINONA INC, Корея). Клетки снова промывали PBS и проводили анализ с помощью прибора FACS caliber (Becton Dickinson, США), и результаты показаны на Фиг. 28 и 29.
На Фиг. 28 и 29 показаны результаты тестирования связывания гуманизированных антител DNP004 к антигену карбоангидразы 12 в различных типах клеток рака молочной железы. Таким образом, гуманизированное антитело DNP004 в соответствии с настоящим изобретением можно применять не только для трижды негативного рака молочной железы, но также для различных типов рака молочной железы, поскольку показана их положительная реакция с ER- и PR-, а также HER2-положительными клетками рака молочной железы.
Пример 18. Терапевтический эффект (ADCC) гуманизированных антител против различных солидных опухолей
Оценку антителозависимой цитотоксичности (ADCC) проводили в различных солидных опухолях путем люциферазного анализа. Линии клеток MDAMB-231 и MDAMB-453, MCF7, SK-BR3, линию клеток рака легкого А549, линии клеток рака печени Huh7 и НЕР3В и линии клеток рака желудка KATO III, SNU719 и MKN-45 высевали в концентрации 1,25×104 клеток/лунка и инкубировали при 37°С в СО2-инкубаторе в течение 20-24 часов. После удаления культуральной среды из каждой лунки с высеянными клетками добавляли 25 мкл среды RPMI, содержащей 4% FBS с низкой концентрацией IgG. Гуманизированное антитело DNP004 примера 15 разводили в 3 раза средой RPMI, содержащей 4% FBS с низкой концентрацией IgG, от максимальной концентрации 10 мкг/мл до 1,2 нг/мл. Каждый приготовленный образец антитела добавляли в соответствующие лунки в соответствующих концентрациях, крышку планшета закрывали, и планшет выдерживали в чистом лабораторном боксе. Клетки-репортеры ADCC (набор реагентов ADCC Reporter Bi 5, Promega) собирали из культуры и суспендировали в среде RPMI, содержащей 4% FBS с низкой концентрацией IgG, в концентрации 3×106 клеток/мл. В каждую лунку добавляли 25 мкл суспензии клеток-репортеров ADCC и культивировали при 37°С в СО2-инкубаторе в течение 24 часов.
Готовили предварительно замороженный субстрат люциферазы, размораживая его на горячей водяной бане. Планшет оставляли на 15 минут при комнатной температуре. После добавления в каждую лунку 75 мкл субстрата люциферазы реакцию проводили в течение 30 минут в темном помещении и измеряли интенсивность люминесценции с помощью люминометра.
На Фиг. 30 показан результат определения антителозависимого цитотоксического действия гуманизированного антитела DNP004 в линии клеток рака молочной железы, на Фиг. 31 показан результат определения антителозависимого цитотоксического эффекта гуманизированного антитела DNP004 в линии клеток рака легкого А549, на Фиг. 32 показан антителозависимый цитотоксический эффект гуманизированного антитела DNP004 в линиях клеток Huh7 и НЕР3В и на Фиг. 33 показаны результаты определения антителозависимого цитотоксического действия гуманизированного антитела DNP004 в линиях клеток рака желудка КАТО III, SNU719 и MKN-45.
Таким образом, было доказано, что гуманизированное антитело DNP004 по настоящему изобретению характеризуется апоптическим механизмом действия на клетки посредством антителозависимого цитотоксического эффекта на различные типы клеток солидных опухолей, экспрессирующих антиген DNP004 (СА-XII, карбоангидраза XII).
Пример 19. Оценка терапевтического эффекта гуманизированного антитела с использованием мышиной экспериментальной модели
19-1: Модель рака молочной железы у животных/группа, получавшая антитело в одной концентрации
Модели рака молочной железы человека у животных были установлены с использованием линии клеток MDA-MB-453 трижды негативного рака молочной железы. Сначала 1,5×107 клеток MDA-MB-453 инокулировали подкожно в правый бок мыши, наблюдали образование и рост опухолей и рассчитывали размер опухоли по следующему уравнению.
(Объем = (а×b)/2, а представляет собой короткий диаметр, a b представляет собой длинный диаметр)
После достижения размера опухоли 100±20 мм3 мышей случайным образом распределяли в контрольную группу (5 мышей) и экспериментальную группу (5 мышей) и вводили гуманизированное антитело DNP004 мышам в хвостовую вену в дозе 10 мг/кг. Затем опухоли измеряли два раза в неделю с интервалом 3-4 суток в течение всего периода эксперимента, строили кривые роста от начала введения антитела до окончания эксперимента, и результаты определения средней величины представлены на Фиг. 34а. Таким образом, в группе, которой вводили гуманизированное антитело, было показано ингибирующее действие на рост большинства опухолей (Фиг. 34).
19-2: Модель рака молочной железы у животных/группа, получавшая антитело в нескольких концентрациях
Используя ту же модель рака молочной железы у животных, как в Примере 19-1, проводили эксперименты по введению гуманизированного антитела DNP004 в различных концентрациях.
В частности, мышей делили на четыре группы (4 мг/кг, 8 мг/кг, 16 мг/кг и 32 мг/кг), в каждую из которых распределяли по 5 мышей. В группе, получавшей антитело в дозе 16 мг/кг, показано частичное подавление роста опухоли, но не выявлено какой-либо зависимости эффекта подавления роста опухоли от дозы, но результат полной ремиссии, при котором рост опухоли был полностью подавлен, был склонен к возрастанию по мере увеличения концентрации (Фиг. 35, таблица 20).
19-3: Модель рака почки у животных/группа, получавшая антитело в одной концентрации
Для подтверждения мышиных животных моделей и противоопухолевых эффектов использовали клетки линии 786-O, представляющей собой линию клеток рака почки с высокой экспрессией антигена-мишени (СА-XII) гуманизированного антитела (DNP004) (Фиг. 36).
Конкретно, бестимусным мышам подкожно инъецировали линию клеток 786-O в количестве 1,5×107 клеток. Однако в данных экспериментальных условиях образование опухоли происходило очень медленно в отличие от линии клеток рака молочной железы, и образование опухоли было подтверждено приблизительно через 70 дней. Гуманизированное антитело DNP004 вводили мышам в хвостовую вену в дозе 32 мг/кг в экспериментальных группах, в которых было подтверждено образование опухоли. Опухоли измеряли два раза в неделю через интервалы 3-4 суток в течение всего эксперимента. Строили кривые роста опухоли от начала введения антитела до окончания эксперимента, и общую кривую роста опухоли для 8 мышей в группе, получавшей гуманизированное антитело DNP004, сравнивали с кривой для 3 мышей контрольной группы, как показано на Фиг. 36.
Таким образом, противораковый эффект гуманизированного антитела DNP004 был подтвержден не только для рака молочной железы, но и для рака почки.
Claims (39)
1. Антитело к CA-XII (карбоангидраза 12) или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично связывающееся с CA-XII, содержащее
(а) VH-CDR (определяющие комплементарность области вариабельной области тяжелой цепи), содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6–8, и VL-CDR (определяющие комплементарность области вариабельной области легкой цепи), содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9–11;
(б) VH-CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:14–16, и VL-CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 17–19; или
(в) VH-CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 28, и VL-CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 29, 30 и 31.
2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где связываемый антителом или антигенсвязывающим фрагментом эпитоп включен в аминокислоты с 25-й по 57-ю аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.
3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где связываемый антителом или антигенсвязывающим фрагментом эпитоп представляет собой пептид, содержащий от 7 до 19 последовательных аминокислот, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.
4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, где антитело содержит VH-CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6–8, и VL-CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9–11.
5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело содержит VH-CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:14–16, и VL-CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 17–19.
7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 6, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
8. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело содержит VH-CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 28, и VL-CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 29, 30 и 31.
9. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, где VL-CDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32 или 33, или VL-CDR2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34–42.
10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, где антитело содержит каркасную последовательность VH (вариабельной области тяжелой цепи), содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 43–46.
11. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, где антитело содержит каркасную последовательность VL (вариабельной области легкой цепи), содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 47, 48, 51 и 52.
12. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 11, где антитело содержит каркасные последовательности VL, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 или 50.
13. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, где антитело содержит аминокислотную последовательность области VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, и аминокислотную последовательность области VL, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 54–63.
14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, полученное из гибридомы, депонированной в KCLRF (Научно-исследовательский фонд клеточных линий Кореи) под номером по каталогу KCLRF-BP-00279 или KCLRF-BP-00280.
15. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1–14, где антитело к CA-XII представляет собой антитело животного, химерное антитело или гуманизированное антитело.
16. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1–14, где антитело обладает агонистической активностью в отношении CA-XII.
17. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1–14, где антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv, (scFv)2, Fab, Fab' или F(ab')2 антитела к CA-XII.
18. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как они определены в любом из пп. 1–14, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент сшиты с маркирующим агентом, токсином или противоопухолевым агентом.
19. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 18, где маркирующий агент выбран из группы, состоящей из радиоизотопа, гаптена, флуоресцентного вещества, хромогена и красителя.
20. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 18, где токсин представляет собой радиоизотоп, малую молекулу, пептид или белок.
21. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 18, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент сшит с токсином с образованием гибридного белка.
22. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 18, где фукозы, связанные с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, частично или полностью удалены.
23. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающиеся с некаталитическим доменом карбоангидразы, в соответствии с любым из пп. 1–14.
24. Вектор экспрессии, в который введена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающиеся с некаталитическим доменом карбоангидразы, в соответствии с любым из пп. 1–14.
25. Клетка-хозяин, экспрессирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающиеся с некаталитическим доменом карбоангидразы, в соответствии с любым из пп. 1–14, где указанная клетка-хозяин включает молекулу нуклеиновой кислоты по п. 23 или вектор по п. 24.
26. Клетка-хозяин по п. 25, представляющая собой клетку гибридомы.
27. Клетка-хозяин по п. 25, представляющая собой клетку гибридомы, депонированной в KCLRF (Научно-исследовательский фонд клеточных линий Кореи) под номером по каталогу KCLRF-BP-00280 или KCLRF-BP-00279, и клетка гибридомы продуцирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с некаталитическим доменом карбоангидразы.
28. Фармацевтическая композиция для профилактики, облегчения или лечения солидного злокачественного новообразования, экспрессирующего CA-XII (карбоангидраза 12), содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающиеся с некаталитическим доменом карбоангидразы, в соответствии с любым из пп. 1–14 или антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 18, сшитые с токсином.
29. Фармацевтическая композиция по п. 28, где солидное злокачественное новообразование представляет собой рак молочной железы, рак легкого, рак ободочной кишки, рак желудка, рак предстательной железы или рак печени.
30. Фармацевтическая композиция по п. 29, где солидное злокачественное новообразование представляет собой трижды негативный рак молочной железы.
31. Фармацевтическая композиция по п. 28, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 18, сшитые с токсином.
32. Фармацевтическая композиция по п. 31, дополнительно содержащая противораковое химическое лекарственное средство или другое противораковое антитело.
33. Фармацевтическая композиция по п. 32, которую вводят с радиотерапией.
34. Способ выявления солидного злокачественного новообразования, экспрессирующего CA-XII (карбоангидраза 12), включающий (а) взаимодействие антитела или антигенсвязывающего фрагмента по п. 18, сшитого с маркирующим агентом, с образцом, и (б) определение образца как солидное злокачественное новообразование, экспрессирующее CA-XII, если образец демонстрирует связывание с антителом или антигенсвязывающим фрагментом.
35. Способ по п. 34, где солидное злокачественное новообразование представляет собой рак молочной железы, рак легкого, рак ободочной кишки, рак желудка, рак предстательной железы или рак печени.
36. Способ по п. 35, где связывание определяют на основании обнаружения ферментативной реакции, флуоресценции, люминесценции или радиоактивного излучения.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20160151382 | 2016-11-14 | ||
KR10-2016-0151382 | 2016-11-14 | ||
PCT/KR2017/012892 WO2018088878A2 (ko) | 2016-11-14 | 2017-11-14 | 탄산탈수소 효소에 결합하는 항체 및 이의 용도 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2727682C1 true RU2727682C1 (ru) | 2020-07-22 |
Family
ID=62109235
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019113853A RU2727682C1 (ru) | 2016-11-14 | 2017-11-14 | Антитело, связывающееся с карбоангидразой, и его применение |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11192959B2 (ru) |
EP (1) | EP3543259A4 (ru) |
JP (2) | JP6947435B2 (ru) |
KR (1) | KR102107963B1 (ru) |
CN (1) | CN109996816B (ru) |
AU (1) | AU2017358360B2 (ru) |
BR (1) | BR112019009765A8 (ru) |
CA (1) | CA3043692C (ru) |
IL (1) | IL266460B (ru) |
MX (1) | MX2019005492A (ru) |
NZ (1) | NZ753061A (ru) |
RU (1) | RU2727682C1 (ru) |
WO (1) | WO2018088878A2 (ru) |
ZA (1) | ZA201903805B (ru) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018088878A2 (ko) * | 2016-11-14 | 2018-05-17 | 주식회사 에이프로젠케이아이씨 | 탄산탈수소 효소에 결합하는 항체 및 이의 용도 |
CN112552408B (zh) * | 2019-09-10 | 2022-09-20 | 普米斯生物技术(珠海)有限公司 | 靶向caix抗原的纳米抗体及其应用 |
US11988671B2 (en) | 2020-08-04 | 2024-05-21 | Abbott Rapid Diagnostics International Unlimited Company | Assays for detecting SARS-CoV-2 |
US20230340141A1 (en) * | 2020-08-21 | 2023-10-26 | City Of Hope | Anti-cd5 antibody compositions and uses thereof |
KR20240095029A (ko) | 2022-12-16 | 2024-06-25 | 순천향대학교 산학협력단 | 미토콘드리아 탄산무수화효소 5a 및 5b 저해제 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996002552A1 (en) * | 1994-07-19 | 1996-02-01 | Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. | Lung cancer marker |
US20130231465A1 (en) * | 2010-05-03 | 2013-09-05 | Reinhard Zeidler | Novel antibody to a carbonic anhydrase |
RU2536290C2 (ru) * | 2009-09-15 | 2014-12-20 | Вилекс Аг | Избирательное выявление костных метастазов при светлоклеточной почечно-клеточной карциноме |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11077212B2 (en) | 2010-08-24 | 2021-08-03 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Molecular imaging of cancer cells in vivo |
LT6331B (lt) * | 2014-12-12 | 2016-11-10 | Vilniaus Universitetas | Naujas rekombinantinis antikūnas prieš žmogaus karboanhidrazę xii |
WO2017209318A1 (ko) | 2016-05-30 | 2017-12-07 | 다이노나(주) | 탄산탈수소화 효소에 결합하는 항체 및 이의 용도 |
WO2018088878A2 (ko) * | 2016-11-14 | 2018-05-17 | 주식회사 에이프로젠케이아이씨 | 탄산탈수소 효소에 결합하는 항체 및 이의 용도 |
-
2017
- 2017-11-14 WO PCT/KR2017/012892 patent/WO2018088878A2/ko active Application Filing
- 2017-11-14 MX MX2019005492A patent/MX2019005492A/es unknown
- 2017-11-14 KR KR1020170151802A patent/KR102107963B1/ko active IP Right Grant
- 2017-11-14 RU RU2019113853A patent/RU2727682C1/ru active
- 2017-11-14 BR BR112019009765A patent/BR112019009765A8/pt unknown
- 2017-11-14 US US16/347,254 patent/US11192959B2/en active Active
- 2017-11-14 CA CA3043692A patent/CA3043692C/en active Active
- 2017-11-14 AU AU2017358360A patent/AU2017358360B2/en active Active
- 2017-11-14 JP JP2019525786A patent/JP6947435B2/ja active Active
- 2017-11-14 NZ NZ753061A patent/NZ753061A/en unknown
- 2017-11-14 CN CN201780070252.3A patent/CN109996816B/zh active Active
- 2017-11-14 EP EP17870532.3A patent/EP3543259A4/en active Pending
-
2019
- 2019-05-05 IL IL266460A patent/IL266460B/en unknown
- 2019-06-12 ZA ZA2019/03805A patent/ZA201903805B/en unknown
-
2021
- 2021-05-25 JP JP2021087868A patent/JP2021129585A/ja not_active Withdrawn
- 2021-09-30 US US17/489,885 patent/US11820831B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996002552A1 (en) * | 1994-07-19 | 1996-02-01 | Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. | Lung cancer marker |
RU2536290C2 (ru) * | 2009-09-15 | 2014-12-20 | Вилекс Аг | Избирательное выявление костных метастазов при светлоклеточной почечно-клеточной карциноме |
US20130231465A1 (en) * | 2010-05-03 | 2013-09-05 | Reinhard Zeidler | Novel antibody to a carbonic anhydrase |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
DOUGLAS A. WHITTINGTON et al., Crystal structure of the dimeric extracellular domain of human carbonic anhydrase XII, a bitopic membrane protein overexpressed in certain cancer tumor cells, PNAS, 2001, vol. 98, N.17, pp.9545-9550. * |
DOUGLAS A. WHITTINGTON et al., Crystal structure of the dimeric extracellular domain of human carbonic anhydrase XII, a bitopic membrane protein overexpressed in certain cancer tumor cells, PNAS, 2001, vol. 98, N.17, pp.9545-9550. OZLEM TURECI et al., Human carbonic anhydrase XII: cDNA cloning, expression, and chromosomal localization of a carbonic anhydrase gene thatis overexpressed in some renal cell cancers, Proc. Natl. Acad. Sci., 1998, Vol.95, pp.7608-7613. * |
OZLEM TURECI et al., Human carbonic anhydrase XII: cDNA cloning, expression, and chromosomal localization of a carbonic anhydrase gene thatis overexpressed in some renal cell cancers, Proc. Natl. Acad. Sci., 1998, Vol.95, pp.7608-7613. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA3043692A1 (en) | 2018-05-17 |
CN109996816B (zh) | 2023-05-26 |
ZA201903805B (en) | 2020-12-23 |
JP6947435B2 (ja) | 2021-10-13 |
BR112019009765A8 (pt) | 2023-02-07 |
JP2020511111A (ja) | 2020-04-16 |
WO2018088878A2 (ko) | 2018-05-17 |
KR20180054496A (ko) | 2018-05-24 |
BR112019009765A2 (pt) | 2019-10-01 |
EP3543259A4 (en) | 2020-07-22 |
NZ753061A (en) | 2021-12-24 |
WO2018088878A3 (ko) | 2018-10-04 |
MX2019005492A (es) | 2019-08-26 |
WO2018088878A9 (ko) | 2018-11-08 |
US20190276557A1 (en) | 2019-09-12 |
AU2017358360A1 (en) | 2019-05-23 |
JP2021129585A (ja) | 2021-09-09 |
US11820831B2 (en) | 2023-11-21 |
US20220033523A1 (en) | 2022-02-03 |
IL266460A (en) | 2019-06-30 |
CA3043692C (en) | 2023-08-22 |
AU2017358360B2 (en) | 2021-01-14 |
CN109996816A (zh) | 2019-07-09 |
IL266460B (en) | 2022-02-01 |
US11192959B2 (en) | 2021-12-07 |
KR102107963B1 (ko) | 2020-05-28 |
EP3543259A2 (en) | 2019-09-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2727682C1 (ru) | Антитело, связывающееся с карбоангидразой, и его применение | |
CA2855699C (en) | Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo | |
JP5570218B2 (ja) | Fgfr4抗体 | |
BR112019014694A2 (pt) | anticorpos anti-cd47 e usos dos mesmos | |
WO2021254481A9 (zh) | 抗Claudin18.2抗体以及其用途 | |
US10975160B2 (en) | Antibody binding to carbonic anhydrase and use thereof | |
WO2024104431A1 (zh) | 一种靶向FRα的抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
WO2023190465A1 (ja) | 抗ヒトsema7a抗体 | |
RU2816856C2 (ru) | Антитела, нацеленные на epn1 | |
TW202417516A (zh) | Ptk7結合蛋白及其用途 | |
KR20240099470A (ko) | 항-cldn18.2 단일클론 항체 및 이의 응용 | |
NZ716839B2 (en) | Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo | |
NZ716839A (en) | Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo | |
NZ623464B2 (en) | Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner |