CN109996816B - 与碳酸酐酶结合的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及识别并结合碳酸酐酶的抗体、编码抗体或抗原结合片段的核酸分子、包含该核酸分子的载体和宿主细胞，以及该抗体或其抗原结合片段用于缓解、预防、治疗或诊断实体癌的用途。

Description

与碳酸酐酶结合的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及识别并结合碳酸酐酶的抗体、编码抗体或抗原结合片段的核酸分子、携带核酸分子的载体、包括核酸分子或载体的宿主细胞，以及抗体或其抗原结合片段在缓解、预防、治疗或诊断与酸脱氢酶相关的疾病(例如，实体瘤)中的用途。
背景技术
碳酸酐酶(CA)形成一种酶家族，其可逆地催化二氧化碳和水与碳酸氢盐和质子的快速相互转化，以维持体内pH稳态。大多数碳酸酐酶的活性部位含有锌离子；因此它们被归类为金属酶。
碳酸酐酶家族有几个成员。存在至少五个不同的CA族(α、β、γ、δ和ε)。α-CA存在于哺乳动物中。α-CA分为四个广泛的亚组，其又由几种亚型组成：细胞溶质CA(CA-I、CA-II、CA-III、CA-VII和CA-XIII)、线粒体CA(CA-VA和CA-VB)、分泌的CA(CA-VI)和膜相关的CA(CA-IV、CA-IX、CA-XII、CA-XIV和CA-XV)。
CA同工酶II、IX和XII与肿瘤过程相关，并且它们是某些肿瘤的潜在组织学和预后生物标志物[Nordfors et al.(2010),BMC cancer；10:148]。CA-II是α-CA基因家族中表达最广泛的成员，几乎存在于每个人体组织和器官中。跨膜酶CA-IX首先被认为是在几种类型的人类癌症以及正常胃肠组织中表达的新型肿瘤相关抗原。CA-IX在功能上与细胞粘附、分化、增殖和致癌过程相关，并且其酶活性与CA II相当。另一种跨膜CA同工酶CA-XII首先在正常肾组织和肾细胞癌中发现。进一步的研究表明它在其他几种肿瘤中表达(ΜLmasov etal.(2000))，但也在一些正常器官诸如结肠和子宫中表达。CA-II、CA-IX和CA-XII在肿瘤中的高表达，特别是在低氧条件下，进一步表明这些酶可以在功能上参与侵袭过程，这是通过细胞外空间的酸化促进的。
发明内容
[技术问题]
根据一个实施方案，本发明提供结合碳酸酐酶的抗体及其抗原结合片段。
本发明的另一个实施方案提供了编码抗体或抗原结合片段的核酸分子、携带核酸分子的载体和包含核酸分子的宿主细胞。
本发明的进一步实施方案提供了用于检测或诊断碳酸酐酶相关疾病的方法或试剂盒，其包含抗体、核酸分子、载体和/或宿主细胞。
本发明的又进一步实施方案提供用于预防、治疗或缓解碳酸酐酶相关疾病的组合物，其包含抗体、核酸分子、载体和/或宿主细胞，或抗体、核酸分子、载体和/或宿主细胞在预防、治疗或缓解碳酸酐酶相关疾病中的用途。
本发明的又进一步实施方案提供预防、治疗或缓解碳酸酐酶相关疾病的方法，包括将包含抗体、核酸分子、载体和/或宿主细胞的组合物施用于患有碳酸酐酶相关疾病的受试者。
本发明的还进一步实施方案提供用于减小实体瘤或实体瘤细胞大小或用于诱导或促进肿瘤消退的组合物或方法。
技术方案
本发明涉及识别和结合碳酸酐酶的抗体、编码抗体或抗原结合片段的核酸分子、携带核酸分子的载体、包含核酸分子或载体的宿主细胞，以及抗体或其抗原结合片段在缓解、预防、治疗或诊断CA-XII阳性实体瘤中的用途。
在本发明中有用的是特异性识别并结合碳酸酐酶的抗体。详细地说，本发明的抗体与CA-XII结合。抗原决定簇，即本发明的抗体结合的表位是位于CA-XII的N末端的非催化区域。优选地，CA-XII是源自人的酶。特别地，人源CA-XII具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
术语“催化结构域”在本领域中是公知的，并且在本发明中是指CA-XII中发生碳酸催化碳酸氢盐和质子的部分。相反，术语“非催化结构域”是指除发生碳酸催化碳酸氢盐和质子的催化结构域之外的部分。在本发明中，CA-XII的非催化结构域是N-末端非催化结构域，并且可以指由在人源CA-XII的SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的N-末端第1位至第93位的93个氨基酸残基组成的肽，或其片段。
本发明的抗体结合的抗原区域可以是非催化区域或其片段。也就是说，抗原区域可以是由SEQ ID NO:5的氨基酸序列的N末端的第1位至第93位氨基酸，或其片段，或人源CA-XII同种型I(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列中的第25位至第93位氨基酸，或第25位至第57位氨基酸，或其片段组成的肽。
作为具体实施方案，待由本发明的抗体识别的抗原结合区或表位是具有7至93个连续氨基酸、7至69个连续氨基酸、7至33个连续氨基酸、14至93个连续氨基酸、14至69个连续氨基酸、14至33个连续氨基酸、19至93个连续氨基酸、19至69个连续氨基酸、或19至33个连续氨基酸的肽，其包括SEQ ID NO:1、2、3或4的氨基酸序列。
更具体地，待由本发明的抗体识别的抗原结合区或表位是基本上包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的具有7至93个连续氨基酸或7至69个连续氨基酸的肽，优选基本上包括SEQID NO:2的氨基酸序列的具有14个至93个连续氨基酸或14至69个连续氨基酸的肽，更优选基本上包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的具有7至14个连续氨基酸的肽，或最优选由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2组成的肽。
在SEQ ID NO:5的人源CA-XII的氨基酸序列中，SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以是由32至38个连续氨基酸组成的肽，而SEQ ID NO:2的氨基酸序列可以是25至38个连续氨基酸。
或者，待由本发明的抗体识别的抗原结合区或表位是基本上包括氨基酸中SEQ IDNO:5的氨基酸序列中的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的具有14至93个连续氨基酸或14至69个连续氨基酸的肽，优选基本上包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的具有19至93个连续氨基酸或19至69个连续氨基酸的肽，更优选基本上包括在SEQ IDNO:4的氨基酸序列中的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的具有14至19个连续氨基酸，或最优选由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4组成的肽。
在SEQ ID NO:5的人源CA-XII的氨基酸序列中，SEQ ID NO:3的氨基酸序列可以是由39至52个连续氨基酸组成的肽，而SEQ ID NO:4的氨基酸序列可以是39至57个连续氨基酸。
SEQ ID NO:5的氨基酸序列(其为人源CA-XII的氨基酸序列)和SEQ ID NO:1至4的表位总结于表1中。
[表1]
Figure GDA0003742741010000031
Figure GDA0003742741010000041
本发明的抗体是特异性识别并结合碳酸酐酶的非催化区域的抗体，包括小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。碳酸酐酶的非催化区域是由人源CA-XII同种型I(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列中的N-末端1-93位氨基酸组成的肽或其片段，由N-末端25-93位氨基酸组成的肽或其片段，或由N-末端25-57位氨基酸组成的肽或其片段。
抗体的实例可以结合由人源CA-XII同种型I(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列中的N-末端1-93位氨基酸组成的肽，或基本上包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的SEQ ID NO:1，或优选SEQ ID NO:2的肽。
在本发明的一个实施方案中，抗体结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽，其中，所述抗体是重链可变区的CDR1至CDR3和轻链可变区的CDR1至CDR3由具有登录号KCLRF-BP-00280的杂交瘤细胞产生的抗体。该杂交瘤细胞系于2012年2月14日保藏于韩国细胞系研究基金会，其位于韩国首尔Chongno-gu，Yongon-Dong 28，首尔国立大学癌症研究基金会，并于2012年2月20日接收到KCLRF-BP-00280的保藏号。保藏号为KCLRF-BP-00280的杂交瘤产生的抗体命名为27B6，其包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变区以及含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链可变区。
具体地，根据本发明的一个实施方案，抗体可以包含选自由VH区的CDR以及VL区的CDR组成的组中至少一种，其中VH区的CDR包括SEQ ID NO:6至8的氨基酸序列以及VL区的CDR包括SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，本发明的抗体可包含作为VH区的CDR的SEQ ID NO:6(CDR1)、SEQ ID NO:7(CDR2)和SEQ ID NO:8(CDR3)的氨基酸序列，和/或作为VL区的CDR的SEQ ID NO:9(CDR1)、SEQ ID NO:10(CDR2)和SEQ ID NO:11(CDR3)的氨基酸序列。本发明另一实施方案的抗体可包含包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH区和包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL区。
抗体的实例是由人源CA-XII同种型I(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列中的N-末端1-93位氨基酸组成的肽，或基本上包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的SEQ ID NO:3的氨基酸序列或优选SEQ ID NO:4的肽。
根据本发明的一个实施方案，结合包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的肽的抗体和抗体的实例可包括由保藏号为KCLRF-BP-00279的杂交瘤细胞产生的重链可变区的CDR1-3和轻链可变区的CDR1-3。该杂交瘤细胞系于2012年2月14日保藏于韩国细胞系研究基金会，韩国首尔Chongno-gu，Yongon-Dong 28，首尔国立大学癌症研究基金会，并于2012年2月20日接收到KCLRF-BP-00279的保藏号。由保藏号为KCLRF-BP-00279的杂交瘤产生的抗体命名为4B4，并包括含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区。
特别地，本发明的实施方案的抗体可包含选自由包括SEQ ID NO:14至16的氨基酸序列的CDR和包括SEQ ID NO:17至19的氨基酸序列的CDR组成的组中至少一种，或优选包含作为确定VH区CDR的氨基酸序列的SEQ ID NO:14(CDR1)、SEQ ID NO:15(CDR2)和SEQ IDNO:16(CDR3)的氨基酸序列，和/或作为确定VL区的CDR氨基酸序列的SEQ ID NO:17(CDR1)、SEQ ID NO:18(CDR2)和SEQ ID NO:19(CDR3)的氨基酸序列。本发明另一实施方案的抗体可包含含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL区。
根据小鼠抗体或嵌合抗体的实例的CDR序列和可变区序列总结于下表中。
[表2]
Figure GDA0003742741010000051
Figure GDA0003742741010000061
根据本发明的一个实施方案，与包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的表位结合的抗体和与包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的表位结合的抗体可以一起结合至相同的抗原。因此，这两种抗体可用于CA-XII抗原的夹心ELISA测定。在夹心ELISA中，特别地，与包含SEQID NO:1的氨基酸序列的表位结合的抗体(诸如27B6抗体)可用作捕获抗体，而与包含SEQID NO:3的氨基酸序列的表位结合的抗体(诸如4B4抗体)可用作检测抗体。
根据本发明，通过使用特异性结合CA-XII的小鼠单克隆抗体4B4(登录号KCLRF-BP-00279)的轻链可变区基因和重链可变区基因作为模板制备了结合CA-XII抗原的人源化抗体(下文称为DNP004)。例如，人源化抗体可包括选自由包含SEQ ID NO:14、15和28的氨基酸序列的VH区的CDR和包含SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列的VL区的CDR组成的组中至少一个CDR。
SEQ ID NO:29：
Figure GDA0003742741010000062
(X1＝P或S)
SEQ ID NO:30：
Figure GDA0003742741010000063
(/>
Figure GDA0003742741010000064
G或R；/>
Figure GDA0003742741010000065
R、H、Q、D、E或M；/>
Figure GDA0003742741010000066
V、I或M；/>
Figure GDA0003742741010000067
或S)
抗体中VL区的CDR1由通式SEQ ID NO:29表示，并且可以包括作为具体实例的SEQID NO:32或33的氨基酸序列。VL区的CDR2由通式SEQ ID NO:30表示，并且可以包括作为具体实例的选自由SEQ ID NO:33至42组成的组的氨基酸序列。
根据人源化抗体(DNP004)的实例的CDR序列和可变区序列总结于下表中。在表3中的SEQ ID NO:32至42中，粗体字符代表经修饰的氨基酸。
[表3]
Figure GDA0003742741010000068
Figure GDA0003742741010000071
/>
包含在根据本发明的人源化抗体(DNP004)的实例中的框架序列总结于下表4中，其中，所述抗体包含选自由重链可变区框架1至4和轻链可变区框架1至4组成的组中的至少一种。重链可变区框架1至4的氨基酸序列可分别包含SEQ ID NO:43至46，而轻链可变区框架1至4的氨基酸序列可分别包括SEQ ID NO:47、48、51和52。轻链可变区的框架2由通式SEQID NO:48表示，并且可以包括作为具体实例的SEQ ID NO:49或50的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48：MHWYX6QKPGKAPX7PWIY(X6＝Q或H；H7＝R或K)
根据人源化抗体(DNP004)的实例的框架序列总结于下表中。
[表4]
Figure GDA0003742741010000072
Figure GDA0003742741010000081
例如，根据本发明的人源化抗体(DNP004)可包含含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链可变区和含有选自由SEQ ID NO:54至63组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。
如图31所示，根据本发明的人源化抗体(DNP004)选自具有比嵌合4B4抗体更高的抗原结合亲和力的候选抗体组(实施例16)，其表明人源化抗体(DNP004)对各种细胞系具有更高的结合亲和力(实施例18)。人源化抗体显著降低了小鼠抗体或嵌合抗体中固有的免疫原性潜力，并且优于嵌合4B4抗体。
根据本发明的一个实施方案的抗体或其抗原结合片段表现出肿瘤消退活性和对肿瘤细胞系的直接抑制作用。如本文所用，术语“肿瘤消退”旨在包括诱导或促进肿瘤大小的减少，和/或肿瘤细胞生长的抑制、中断或减少。肿瘤大小的减小意味着，当施用根据本发明的抗体或其片段时，肿瘤大小降低至施用前肿瘤大小的例如97％或更低、95％或更低、90％或更低、85％或更低、80％或更低，或75％或更低。
根据本发明的抗体表现出抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
根据本发明，结合了糖残基的抗体可以部分或完全地被去岩藻糖基化(defucosylated)。根据本发明的去岩藻糖基化抗体保留了抑制实体瘤生长和促进肿瘤消退的活性。例如，27B6抗体和4B4抗体在其去岩藻糖基化时比其岩藻糖基化时对乳腺癌表现出更高的抑制作用(图14和17)。
根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以不存在于体内或可以是非天然存在的物质，例如重组或合成的物质。可以使用本领域熟知的技术产生重组或合成的抗体或其抗原结合片段。
另外，本发明提供识别CA-XII的抗原决定区的物质。该物质可选自由抗体、抗体片段和配体组成的组。抗体可以是多克隆或单克隆的，并且可以源自人或动物。例如，抗体可以是单克隆的。可以使用本领域已知的方法(例如噬菌体展示技术)制备单克隆抗体。小鼠抗体和嵌合抗体落入根据本发明的抗体的范围。
术语“CDR(互补决定区)”是指重链的高变区和免疫球蛋白的轻链的氨基酸序列。重链和轻链可各自包含三个CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL1、CDRL2、CDRL3)。抗体的CDR可以提供与抗原或表位结合的必需接触残基。
在整个说明书中，术语“特异性结合”或“特异性识别”具有相同的含义，如本领域普通技术人员通常已知的，表明抗原和抗体特异性地相互作用并引起免疫反应。
术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白的完整结构的片段，其是包含抗原可结合的结构域的部分多肽。例如，它可以是scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab'或F(ab')2，但不限于此。
抗CA-XII抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可通过本领域熟知的方法制备。例如，它可以使用噬菌体展示技术产生。或者，可以使用来自小鼠的单克隆抗体通过常规方法产生抗CA-XII抗体。
另一方面，可以使用典型的ELISA(酶联免疫吸附测定)形式，基于它们结合CA-XII的能力筛选单个单克隆抗体。为了测定偶联物的分子相互作用，使用诸如竞争性ELISA(竞争性ELISA(competitively ELISA))的功能试验或基于细胞的试验来测试抑制活性。然后，测定基于强抑制活性选择的单克隆抗体成员的CA-XII的各自抗体亲和力(Kd值)。
最终选择的抗体可以用作人源化抗体以及除了抗原结合部分之外用人免疫球蛋白抗体取代的抗体。制备人源化抗体的方法是本领域熟知的(Almagro,J.C.and Fransson,J.,\"Humanization of antibodies,\"Frontiers in Bioscience,13(2008),1619-1633)。
另一个实施方案提供产生所述抗CA-XII抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，杂交瘤可以是具有登录号KCLRF-BP-00279或KCLRF-BP-00280的杂交瘤。
进一步的实施方案提供了由所述杂交瘤产生的抗CA-XII抗体或其抗原结合片段。
其他实施方案包括由杂交瘤产生的抗CA-XII抗体的重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3或其组合)、轻链互补决定区(CDR-L2、CDR-L3、或其组合)，或其组合，或者，抗CA-XII抗体或其抗原结合片段包含由所述杂交瘤产生的抗CA-XII抗体的重链可变区、轻链可变区或其组合。此时，互补确定区域可以通过任何常规方法确定，例如，IMGT定义(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/)或Cabat定义(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/).bioinf.org.uk/abs/)，但不限于此。
抗CA-XII抗体或其片段可以与各种标记试剂、毒素或抗肿瘤药物偶联。对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的抗体可以通过本领域熟知的方法与标记试剂、毒素或抗肿瘤药物偶联。这种偶联可以在抗体或抗原表达后在连接位点上化学地进行。或者，可以在DNA水平将偶联产物工程化到本发明的抗体或抗原中。随后，然后在如下文所述的合适宿主系统中表达DNA，并收集表达的蛋白质，并且如果需要，使其复性。偶联可以通过本领域已知的接头实现。特别地，在该技术中可以使用在酸性或碱性条件下或在暴露于特定蛋白酶时释放毒素或抗肿瘤药物的不同接头。在一些实施方案中，可能需要将标记试剂、毒素或抗肿瘤药物以各种长度连接到间臂上以减少潜在的空间位阻。
标记试剂可选自由放射性同位素、半抗原、荧光、色原(chromogen)和染料组成的组。特别地，标记试剂可选自FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、樱桃、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、DNP、AMCA、生物素、地高辛、Tamra、德克萨斯红、罗丹明、Alexa荧光、FITC和TRITC。或者，标记试剂可以是放射性同位素，例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I，或131I。合适的标记试剂的进一步实例包括由第二报告分子识别的酶基团(例如，辣根过氧化物酶、辣根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或预定的多肽表位。
只要它对细胞或生物体有毒，任何毒素都可用于本发明。例如，放射性同位素、小分子、肽或蛋白质可用作毒素。抗体或其片段可以与毒素偶联以形成融合蛋白。作为毒素蛋白质，可以使用蓖麻毒蛋白、皂草素、白树毒素、苦瓜蛋白、白喉毒素或假单胞菌毒素。至于放射性同位素，其实例包括131I、188Rh和90Y，但不限于此。
如本文所用，术语“抗肿瘤剂”是指能够阻止或减缓组织异常生长的药物。因此，抗肿瘤剂特别适用于治疗癌症。抗肿瘤剂可以是血管生成抑制剂、DNA嵌入剂或DNA交联剂、DNA合成抑制剂、DNA-RNA转录调节剂、酶抑制剂、基因调节剂、微管抑制剂或其他抗肿瘤剂。
本发明进一步涉及编码本发明抗体的核酸分子。编码本发明抗体的本发明核酸分子可以是单独或组合的例如，DNA、cDNA、RNA、合成产生的DNA或RNA，或包含任何这些核酸的重组产生的嵌合核酸分子。核酸分子也可以是对应于整个基因或其实质部分的基因组DNA，或其片段或衍生物。核酸分子的核苷酸序列可以是经修饰的核苷酸序列，其中在一个或更多个核苷酸残基上发生取代、缺失或添加，并引起抗体氨基酸序列的至少一个氨基酸残基的取代或突变。在本发明的一个具体实施方案中，核酸分子是cDNA分子。
本发明的一个实施方案还涉及包含可表达形式的核酸分子的载体。本发明的载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒载体或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是复制型或复制缺陷型。在后一种情况下，病毒繁殖通常发生在互补宿主/细胞中。
可以将上述核酸分子插入载体中，使得发生与另一多核苷酸的平移性融合。通常，载体可以含有用于克隆或表达的一个或更多个复制起点(ori)和遗传系统，一个或更多个用于在宿主中选择的标记(例如，抗生素抗性)和一个或更多个表达盒。合适的复制起点(ori)的实例包括Col E1、SV40病毒和M13复制起点。
在本发明中，核酸分子可以设计用于直接或通过脂质体、噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒载体、逆转录病毒载体等)导入宿主。另外，杆状病毒系统或基于牛痘病毒或塞姆利基森林病毒的系统可用作本发明核酸分子的真核表达系统。
本发明的另一个实施方案涉及包含本发明的载体的非人宿主。宿主可以是原核的或真核的。存在于宿主细胞中的本发明的多核苷酸或载体可以整合到宿主细胞的基因组中，或者可以在染色体外维持。
此外，本发明涉及可用于产生本发明抗体的转基因非人动物，其包含一种或更多种本发明的核酸分子。抗体可以从山羊、牛、马、猪、大鼠、小鼠、兔、仓鼠或其他哺乳动物的组织或体液(例如乳汁、血液或尿液)中产生和回收。
此外，本发明提供了用于产生选择性识别CA-XII的抗原决定区的物质的方法，以及产生选择性识别CA-XII的抗原决定区的抗体的细胞系。CA-XII的抗原决定区的抗体或其片段可以使用CA-XII蛋白、CA-XII的抗原决定区、含有CA-XII的抗原决定区的CA-XII的一部分，或表达作为抗原的CA-XII的抗原决定区的细胞的典型方法来制备。例如，通过产生抗CA-XII抗体的细胞系的制备方法，可以实现制备抗CA-XII抗体的方法，该方法包括(a)用CA-XII蛋白、CA-XII的抗原决定区、含有CA-XII的抗原决定区的CA-XII的一部分，或表达CA-XII的抗原决定区的细胞注射和免疫动物，(b)获得产生特异性针对CA-XII的抗体的脾细胞，和(c)将脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞并选择产生针对CA-XII的抗体的杂交瘤细胞。可以通过体外培养细胞系或通过体内引入细胞系来分离抗体。例如，可以将细胞系腹膜内注射到小鼠中，然后从腹水中分离和纯化抗体。单克隆抗体的分离和纯化可以通过使用抗免疫球蛋白柱或蛋白A柱对培养物上清液和腹水进行离子交换层析(DEAE或DE52)或亲和层析来实现。
本发明的抗体结合的抗原决定区表现出实体瘤特异性表达。因此，抗CA-XII抗体不仅可以有效地用于检测肿瘤细胞，而且当它携带有毒物质时也可以仅对肿瘤细胞发挥细胞毒性。
本发明的进一步实施方案提供CA-XII，特别是位于CA-XII的非催化结构域的抗原决定区在检测实体瘤中的用途。此外，提供了用于检测实体瘤的癌症干细胞的组合物，其包含与抗原决定区相互作用的物质。相互作用物质可以是能够与CA-XII，特别是位于其非催化结构域的CD-XII的抗原决定区相互作用的任何物质。特别地，相互作用物质可选自由小分子化学物质、抗体、抗体的抗原结合片段、适体或其组合组成的组。
在另一个实施方案中，本发明涉及诊断组合物，其包含本发明的抗体、本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的宿主。如本文所用，术语“诊断组合物”是指包含本发明的抗体、核酸分子、载体和/或宿主中的至少一种的组合物。
通过使样品与本发明的抗体接触，本发明的诊断组合物可用于检测CA，特别是CA-XII在各种细胞、组织或其他合适的样品中的不希望的表达或过表达，并确定样品中CA，特别是CA-XII的存在。因此，本发明的诊断组合物可用于评估疾病的发作或状态，如下文所定义。特别地，可以用本发明的抗体或其片段或衍生物靶向能够表达CA，特别是CA-XII的恶性细胞(诸如癌细胞)。结合本发明抗体的细胞可能被免疫系统功能(诸如补体系统或细胞介导的细胞毒性)攻击，从而减少细胞的数量或完全根除细胞，该细胞表现出CA，特别是CA-XII的不希望的表达或过表达。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段或衍生物与标记试剂偶联。此类抗体特别适用于诊断应用。
本发明的诊断组合物可以单独或与其他试剂组合作为活性剂施用。
本发明的又一个实施方案涉及检测肿瘤细胞的方法，其包括(a)使抗CA-XII抗体与包含肿瘤细胞的样品反应，和(b)如果样品对抗体呈阳性，确定样品是肿瘤。样品可包括但不限于淋巴液、骨髓、血液和血细胞。肿瘤细胞可以优选为乳腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌、胃癌细胞、前列腺癌细胞或肝癌细胞。
当用于筛选肿瘤细胞时，抗CA-XII抗体可以与能够指示抗原-抗体反应性的标记偶联。用于此目的的标记可包括放射性同位素、荧光、发光(luminescence)、色原和染料。
而且，可以提供本发明的抗CA-XII抗体用于诊断实体瘤的试剂盒。
除了抗CA-XII抗体之外，诊断试剂盒可以包括用于检测抗原-抗体反应的手段。检测手段可以是用于进行选自由流式细胞术、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)和发光免疫测定(LIA)的组成的组的技术的试剂。在这种情况下，标记可以是诸如HRP(辣根过氧化物酶)的酶、诸如FITC(荧光星氨基甲酰基乙二胺)的荧光、诸如鲁米诺、异鲁米诺和光泽精的发光物，或诸如125I、3H、14C和131I的放射性同位素，但不限于此。可以使用用于测量与底物、荧光、发光或辐射的酶促反应的手段来确定与标记的偶联。例如，可以制备抗CA-XII抗体用于ELISA试剂盒或条带试剂盒。
根据本发明的一些实施方案的抗体27B6和4B4可以一起结合相同的抗原，因为它们的表位不重叠。因此，这两种抗体可用于CA-XII抗原的夹心ELISA测定。在夹心ELISA中，特别地，27B6抗体可以用作捕获抗体，而4B4抗体可以用作检测抗体。
根据本发明的一个实施方案，本发明涉及包含本发明的抗体、核酸分子、载体或宿主的药物组合物。本发明的抗体、核酸分子、载体或宿主用于治疗或消退实体癌。实体瘤的治疗或消退可以通过以有效剂量向有需要的受试者施用本发明的核酸分子、载体或宿主来实现。
如本文所用，术语“实体瘤”定义了通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的(不是癌症)或恶性的(本领域通常称为癌症)。可应用根据本发明的抗体的实体瘤的实例包括肉瘤、神经胶质瘤、恶性肿瘤、间皮瘤、淋巴瘤、肾癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌和头颈癌、优选乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌或肝癌。乳腺癌可能是三阴性乳腺癌(TNBC)，其可以通过使用HER2、雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)的三个诊断标志物检测为阴性，因此很难被检测到。肺癌可以是小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌或肺鳞状细胞癌。
根据本发明的实体瘤的治疗效果包括对癌细胞(特别是癌症干细胞)或包括癌细胞的组织的迁移、侵袭和转移的抑制效果，并因此缓解癌症的恶性，以及它们的生长抑制(定量减少)和细胞凋亡。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指患有或者有可能患有实体瘤或症状，因此需要缓解、预防和/或治疗实体瘤的哺乳动物，包括灵长类动物(诸如人、猴等)，以及啮齿动物(诸如小鼠、大鼠等)。
根据本发明的抗体或其片段的施用可以以任何可接受的方式进行。例如，将包含抗CA-XII抗体作为活性成分的治疗剂口服或肠胃外施用，优选肠胃外施用于受试者，例如有肿瘤细胞的人或动物。治疗剂可以包括药学上可接受的赋形剂，并且治疗剂的剂量可以根据患者的状况而变化，并且可以为例如每天3mg至6000mg。治疗剂可以采取诸如液体、粉末、乳液、悬浮液或注射剂的形式，但不限于此。
进一步地，本发明提供一种治疗急性或慢性髓性或淋巴细胞白血病的方法，使用选自CA-XII抗原决定区抗体、抗体片段(F(ab')2、Fab、Fv等)和CA-XII的抗原决定区的配体中的至少一种。
抗体或其片段可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以源自人或动物。抗CA-XII抗体或其片段可以进一步包含上述毒素。可以使用众所周知的技术将毒素融合、偶联(coupled)、缀合(conjugated)或连接至抗体。
本发明的药物组合物可以作为单一活性剂施用，或与任何其他优选用于治疗感兴趣的疾病的试剂(agent)联合施用。此外，本发明的抗体可以与其他抗癌疗法(诸如化学疗法、放射疗法、细胞疗法等)联合使用。可以在化学疗法或细胞疗法中使用各种众所周知的抗癌剂。
本发明的另一个实施方案提供筛选实体瘤的治疗剂或抑制剂的方法，包括使候选化合物与CA-XII，特别是位于CA-XII的非催化结构域的抗原决定区接触，并且如果确定候选化合物与抗原决定区结合，则分类候选化合物作为实体瘤的潜在治疗剂。本发明的进一步实施方案提供用于治疗实体瘤的药物组合物，其包含经筛选的实体瘤治疗剂作为活性成分。
候选化合物可以是选自由下组成的组中至少一种：各种合成或天然存在的化合物、多肽、寡肽、肽或蛋白质构建体(例如，抗体、抗原结合片段、肽体、纳米抗体等)、多核苷酸、寡核苷酸、反义RNA、shRNA(短发夹RNA)、siRNA(小干扰RNA)、适体和天然产物提取物。
候选化合物和抗原决定区之间的结合可以通过检测复合物的形成来确定，其可以使用本领域已知的各种方法进行。举例来说，可以检测典型的酶反应、荧光、发光和/或辐射以确认候选化合物与抗原结合区的结合。详细地，可用于检测复合物的技术包括但不限于免疫层析、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、发光免疫测定(LIA)和Western印迹。
[有益效果]
本发明提供识别并结合碳酸酐酶的抗体、编码抗体或抗体的抗原结合片段的核酸分子、携带核酸分子的载体、含有载体或核酸分子的宿主细胞，以及抗体或其抗原结合片段在缓解、预防或诊断与碳酸酐酶相关的疾病(诸如实体瘤)中的用途。
附图说明
图1显示了根据实施例1测量的外周血中的实体瘤特异性小鼠单克隆抗体27B6的滴度；
图2显示了根据实施例2测量的27B6嵌合抗体的抗原特异性和亲和力；
图3说明了根据实施例3测量的筛选外周血中4B4单克隆抗体滴度的步骤；
图4显示了根据实施例4测量的4B4嵌合抗体的抗原特异性和亲和力；
图5a、5b和5c显示了根据实施例5测量的各种乳腺癌细胞中碳酸酐酶12抗原上的小鼠嵌合抗体4B4的表达模式；
图6显示了通过用嵌合抗体4B4和嵌合抗体27B6制备的柱从肺腺癌A549细胞系分离和纯化的抗原的电泳图；
图7显示了通过ELISA测定分析的碳酸酐酶12作为4B4和27B6单克隆抗体的抗原的鉴定；
图8显示了通过实施例6中的Western印迹分析的碳酸酐酶12作为4B4和27B6单克隆抗体的抗原的鉴定；
图9显示了27B6和4B4单克隆抗体的表位作图过程和结果；
图10显示了根据实施例8分析的嵌合抗体27B6的补体依赖性细胞毒性作用；
图11显示了根据实施例9-1分析的27B6嵌合抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用；
图12显示了根据实施例9-2分析的27B6嵌合抗体对三阴性乳腺癌细胞系的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用；
图13显示了根据实施例10-1分析的去岩藻糖基化27B6嵌合抗体在各种实体瘤中的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用；
图14显示了通过实施例10-2中的荧光素酶测定法分析的去岩藻糖基化的4B4和27B6嵌合抗体在乳腺癌细胞系中的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用；
图15显示了根据实施例11分析的CA12抗原在三阴性乳腺癌细胞系上的表达水平和27B6和4B4嵌合抗体与细胞系的细胞表面的结合；
图16显示了27B6和4B4嵌合抗体对三阴性乳腺癌动物模型中肿瘤生长的抑制活性；
图17显示了根据实施例11分析的4B4抗体对三阴性乳腺癌的抑制活性；
图18和19显示根据实施例12，单独的4B4抗体与肿瘤细胞的结合不影响肿瘤细胞的生长；
图20显示了根据实施例13分析的27B6抗体和放射疗法的组合的效果；
图21显示了根据实施例14选择的所选克隆(噬菌体展示的scFv)与CA-XII的亲和结合的ELISA测试结果；
图22显示了根据实施例14选择的10个克隆(克隆编号#1、2、8、11、15、19、22、25、26和30)的轻链可变区(VL)的序列和CDR1和CDR2序列和CDR1和CDR2阵列的序列；
图23和图24是显示根据实施例14选择的10个克隆(克隆编号#1、2、8、11、15、19、22、25、26和30)的全长IgG的亲和力测试结果的图；
图25显示了根据实施例15的人源化抗体DNP004在CA-XII阳性和三阴性乳腺癌细胞系MDAMB-231中的结合；
图26是显示根据实施例16使用SDS-PAGE分析候选抗体组的物理性质的结果的图；
图27显示了根据实施例16的候选抗体组与CA XII阳性细胞系的结合力的评估；
图28和图29显示了根据实施例17的各种乳腺癌细胞中DNP004人源化抗体对碳酸酐酶XII抗原的结合特征的结果；
图30显示了根据实施例18的DNP004人源化抗体在乳腺癌细胞系中的抗体依赖性细胞毒性作用的结果；
图31显示了根据实施例18的DNP004人源化抗体在肺癌细胞系中的抗体依赖性细胞毒性作用的结果；
图32显示了根据实施例18的DNP004人源化抗体在肝癌细胞系中的抗体依赖性细胞毒性作用的结果；
图33显示了根据实施例18的DNP004人源化抗体在胃癌细胞系中的抗体依赖性细胞毒性作用的结果；
图34至35显示了根据实施例19的DNP004人源化抗体在三阴性乳腺癌小鼠模型中的抗肿瘤作用的结果；
图36显示了根据实施例19的DNP004人源化抗体在肾癌细胞系动物模型中的抗肿瘤作用的结果。
具体实施方式
通过以下实施例可以更好地理解本发明，这些实施例仅用于说明，而不应解释为限制本发明。
实施例1：CA-XII(27B6)单克隆抗体的产生
在以下实验中实现了对CA12特异性的新抗体的开发。观察到所开发的抗体对实体瘤(诸如肺腺癌，乳腺癌，结肠直肠癌和前列腺癌)具有特异性，因为它们与肿瘤中特异性表达的抗原反应。它们分别被命名为27B6和4B4。
1-1：用于构建27B6单克隆抗体的靶位点的设计
制备了对实体瘤细胞特异的抗体。为此，用实体瘤细胞直接免疫小鼠，并使用细胞融合技术建立单克隆抗体。此后，分析和识别结合有实体瘤细胞特异性单克隆抗体的抗原。
1-2：小鼠免疫
免疫A549细胞，其是腺癌人肺泡-基底上皮细胞，并且在使用流式细胞术的杂交瘤选择过程中选择对A549细胞系而不是L132呈阳性的抗体。阳性细胞与单克隆抗体的百分比计算为在测试受试者的5000个细胞中与DNP004抗体结合的细胞数，以％表示，-(阴性)是指阳性细胞数是小于10％，+(阳性)指的是阳性细胞数在10％至30％范围内的情况。++表示阳性细胞的数量在30％至70％的范围内，而+++表示阳性细胞的数量为70％至100％。
最后，6周龄的Balb/c雌性小鼠每个IP(腹膜腔)按三周按固定间隔注射A549细胞系(ATCC CCL-185)三次，剂量为1x107个细胞，然后移除静脉中的血清。将稀释的血清加入A549细胞中。在4℃下放置30分钟以进行反应后，将稀释液与3ml PBS混合并以1500rpm离心3分钟。洗去未结合的抗体。使用200倍稀释的二抗山羊抗小鼠Ig-FITC(DINONA INC，韩国)来检测结合的抗体。在4℃下反应15分钟后，以相同的方式用3ml PBS洗涤反应混合物。通过流式细胞术测量血清对A549细胞的抗体滴度。观察到用A549细胞免疫的血清对A549细胞高度阳性(结果未显示)。简而言之，在细胞融合实验前三天，加入50μg抗CD40激动剂mAb以增强免疫反应，并以1x107个细胞的剂量注射A549(ATCC CCL-185)以诱导A549的表面抗原的抗体扩增。
1-3：杂交瘤细胞的制备
从经免疫的小鼠切下脾脏，并得到单个脾细胞的悬浮液，用RPMI(GIBCO)洗涤两次。使用0.4％台盼蓝(Sigma)的1:1(v/v)混合物计数活细胞，其仅染色死细胞。使用X63小鼠骨髓瘤细胞系(ATCC CRL-1580)作为细胞融合伴侣，并以与脾细胞相同的方式洗涤和计数。
将骨髓瘤细胞以1:5的比例与脾细胞混合并离心。用1ml预热至37℃的50％PEG(聚乙二醇)1500在1分钟内缓慢加入而因此获得沉淀物。孵育约1分钟后，用RPMI培养基缓慢稀释细胞混合物并离心。将得到的细胞沉淀重悬于含有1xHAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)的RPMI(20％FBS)中，以150μl/孔的体积铺板到96孔板中，并在37℃CO2培养箱中生长。在融合后的预定时间内饲养(fed)HAT。当在孔中观察到群落时，向每个孔中加入150μlHT培养基，然后在37℃，5％CO2培养箱中孵育48小时。然后，在流式细胞术之前进行三色免疫荧光染色。简言之，用两种不同的染料对肺腺癌细胞系A549和正常肺细胞系L132进行免疫染色，并以1:1的比例混合。将该细胞混合物与100μl杂交瘤细胞培养物的上清液在4℃孵育30分钟，并与3ml PBS一起以1500rpm离心3分钟以除去未结合的抗体。通过用200倍稀释的二抗山羊抗小鼠Ig-APC(DINONA INC，韩国)在4℃孵育15分钟，然后用3ml PBS以相同方式洗涤来检测结合的抗体。此后，通过流式细胞术测量杂交瘤细胞。
进行检查以确定抗体是否与外周血结合。为此，将PBMC(来自韩国红十字会血液服务的外周血单核细胞)与100μl杂交瘤上清液在4℃孵育30分钟，并与3ml PBS一起以1500rpm离心3分钟洗去未结合的抗体。使用200倍稀释的二抗山羊抗小鼠Ig-FITC(DINONAINC，韩国)来检测结合的抗体。在4℃下反应15分钟后，以相同的方式用3ml PBS洗涤反应混合物。使用流式细胞术测量抗体滴度，并显示结果(图1)。图1显示了通过流式细胞术测量的外周血中肺腺癌特异性27B6单克隆抗体的滴度。
以这种方式，选择对肺癌细胞系A549呈阳性且对正常肺细胞系L132和外周血的所有粒细胞，淋巴细胞和单核细胞呈阴性的抗体，并命名为“27B6”。最后，在有限稀释过程中，稀释27B6杂交瘤细胞并选择其进行单群落生长。
27B6杂交瘤细胞系于2012年2月14日保藏于位于韩国首尔Chongno-gu，Yongon-Dong28，韩国细胞系库，并于2012年2月20日接收到保藏号KCLRF-BP-00280。
1-4：27B6单克隆抗体的同种型的确定
使用小鼠免疫球蛋白同种型ELISA试剂盒(BD Biosciences，USA)分析实施例1-3中制备的27B6单克隆抗体的同种型。简而言之，用抗鼠同种型特异性抗血清(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、Kappa、λ)进行同种型分型，而过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG用作第二抗体。用邻苯二胺(OPD)和过氧化氢底物诱导显色。读取450nm处的吸光度。
结果，27B6单克隆抗体被识别为小鼠IgG1/κ轻链(结果未显示)。
1-5：27B6抗体的CDR序列
抗体克隆步骤如图1所示。具体地，使用小鼠Ig-引物组(Millipore，Cat.#：69831)克隆27B6抗体基因。使用小鼠Ig-引物组从分离自27B6杂交瘤的RNA进行PCR，插入pGem-T载体(Promega，Cat.#：A3600)，并测序以确认DNA序列。通过IMGT位点(www.imgt.org)识别小鼠抗体基因。包括27B6 Ab的CDR序列的重链和轻链序列分别由SEQ ID NO:12和13表示。重链可变区的CDR1至CDR3分别显示于SEQ ID NO:6至8，轻链可变区的CDR1至CDR3分别显示于SEQ ID NO:9至11(参见表2)。
实施例2：27B6嵌合抗体的产生
当将小鼠来源的单克隆抗体施用于人体时，人免疫系统将单克隆抗体识别为外来抗原，从而产生人抗小鼠抗体(HAMA)以从血液中消除小鼠抗体。另外，小鼠抗体的Fc结构域不能在人体内发挥其有效的生物学功能。因此，不仅治疗效果急剧下降，而且还可以诱发诸如严重过敏反应和肾功能障碍的副作用。为了在施用于人体时降低27B6抗体的免疫原性，构建了嵌合抗体，其中除可变区外的小鼠抗体被人抗体的Fc取代。观察到嵌合抗体的抗原特异性和亲和力与原始小鼠27B6抗体的相似。
为了构建嵌合抗体，将以上述方式制备的27B6-HuIgFc DNA转染到源自CHO细胞的DHFR DG44细胞系中，然后在选择性培养基中进行选择性培养以建立产生27B6重组抗体的稳定细胞系。细节描述如下。
首先，在转染前3小时，将DG44细胞系(Invitrogen，Cat No.A1100001)以1×106个细胞/ml的密度接种到6孔板中，并与1ml GIBCO CD DG44培养基(Invitrogen，USA)在5％CO2气氛中37℃一起孵育3小时。然后，使用Effectene转染试剂试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)将27B6-HuIgFc DNA转染到感受态DG44细胞中。
在转染后三天，取上清液并加入A549细胞中，然后在4℃下孵育30分钟。通过与3mlPBS一起以1500rpm离心3分钟除去未结合的抗体。通过用150倍稀释的二抗山羊抗小鼠Ig-FITC(DINONA INC，韩国)在4℃孵育15分钟，然后用3ml PBS以相同方式洗涤来检测结合的抗体。此后，使用流式细胞术测量针对A549细胞的抗体滴度。随后，建立稳定的细胞系。为此，在克隆选择开始之后，将培养基更换为补充有30nM MTX(Sigma，USA)和200μg/ml G418(Invitrogen，USA)的Power CHO培养基(LONZA，瑞士)。随着克隆选择轮次的重复，选择培养基中MTX和G418的浓度增加。每轮都是三周。最后一轮克隆选择在补充有1000nM MTX和400μg/ml G418的PowerCHO培养基中进行。此后，通过有限稀释将最终细胞系建立为单个群落。
发现以这种方式建立的27B6嵌合抗体具有抗原特异性和对原始小鼠27B6抗体的亲和力，如通过流式细胞术测量的(图2)。图2显示了27B6嵌合抗体的抗原特异性和亲和力。
实施例3：CA XII的单克隆抗体(4B4)的产生
3-1：27B6配对抗体
为了开发另一种识别相同抗原但与不同表位结合的抗体，开发了27B6配对抗体。
首先探讨了开发27B6配对抗体的可能性，建立了使用嵌合27B6和小鼠血清的夹心ELISA。以与实施例1-2相同的方式，将6周龄的balb/c雌性小鼠各自IP(腹膜腔)用A549细胞系(1×107个细胞)以3周的规律间隔注射，然后从静脉中取血清。
具体地，将嵌合的27B6纯化的抗体以100ng/mL的浓度添加到微板中，并在37℃下包被1小时。将封闭缓冲液(Sigma)加入到200μl/孔的27B6包被的微量培养板中并在37℃下封闭1小时。使用1％NP40裂解缓冲液以1×107个细胞/ml裂解A549细胞。将制备的A549裂解物以50μL/孔加入微板中，在37℃反应1小时，然后用PBS洗涤三次。以100μl/孔将A549免疫的小鼠血清1000倍稀释液加入到微量培养板中并在37℃下孵育1小时，然后用PBS洗涤三次。最后，以100μL/孔加入二抗山羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson)2000倍稀释液，并在37℃下孵育30分钟，然后用PBS洗涤3次。以50μL/孔加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，然后在室温下反应10分钟以诱导显色，并加入相同量的2NH2SO4(Sigma)。然后在450nm的波长下测量吸光度。
如所预期的，使用嵌合27B6和小鼠血清在夹心ELISA中观察到阳性反应(数据未显示)。
3-2：单克隆抗体的产生
以与实施例1-3中相同的方式从免疫小鼠的脾细胞制备杂交瘤细胞。
结果，选择对肺癌细胞系A549呈阳性且对正常肺细胞系L132和对外周血中的所有粒细胞，淋巴细胞和单核细胞呈阴性的抗体，如27B6，并命名为“4B4”。最后，在有限稀释过程中，将4B4杂交瘤细胞稀释并选择用于单群落生长(图3)。图3显示了通过流式细胞术测量的外周血中4B4单克隆抗体的滴度。4B4杂交瘤细胞系于2012年2月14日保藏于位于韩国首尔Chongno-gu，Yongon-Dong 28的韩国细胞系库，并于2012年2月20日接收到保藏号KCLRF-BP-00279。
3-3：4B4抗体的分析
根据与实施例1-5基本相同的方法分析抗体的氨基酸序列。包括实施例3-2中获得的4B4Ab的CDR序列的重链序列和轻链序列分别由SEQ ID NO:20和21表示，重链的CDR1至3在SEQ ID NO:14至16中显示，以及轻链的CDR1至3在SEQ ID NO:17至19中显示(参见表2)。
实施例4：4B4嵌合抗体的产生
为了在施用于人体时降低4B4抗体的免疫原性，根据实施例2构建嵌合抗体，其中除可变区外的小鼠抗体被人抗体的Fc取代。观察到抗体的抗原特异性和亲和力与原始小鼠4B4抗体相似。
根据<实施例2>的相同方法进行4B4嵌合抗体的制备方法。结果，通过流式细胞术测量，发现制备的抗体具有与原始小鼠4B4抗体相似的抗原特异性和亲和力(图5)。图5显示了4B4嵌合抗体的抗原特异性和亲和力。
实施例5：各种细胞系中抗体表达的分析
5-1：各种细胞系中的抗体表达
使用流式细胞术分析实施例2中获得的27B6嵌合抗体和实施例4中获得的嵌合抗体与KCLB(韩国细胞系库)和SNU(首尔国立大学)获得的各种细胞系的结合。
具体地，从KCLB(韩国细胞系库)和SNU(首尔国立大学)获得各种细胞系。在37℃，5％CO2气氛下，L-132、SW-900、DU145、LNCap、MCF-7、Huh7和Hs-578T在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS；GIBCO，Invitrogen)的Dulbecco's MEM(GIBCO，Invitrogen)中培养并且A549、NCI-H460、NCI-H417、DLD-1、HCT116、HT-29、SW-480、SW-620、LS174T、PC-3、SNU1、SNU638、SNU719、MKN1、MKN28、MKN45、MKN74、NCI-N87、SK-BR3、MDA-MB231和MDA-MB453在补充有10％热灭活的FBS的RPMI 1640(GIBCO，Invitrogen)中培养。此外，补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS；GIBCO，Invitrogen)的Eagle's MEM(GIBCO，Invitrogen)用于Calu-3、Hep3B、SK-HEP-1、C3A、Hep G2，PLC/PRF/5和BT-20，补充有20％热灭活的胎牛血清(FBS；GIBCO，Invitrogen)的IMDM(GIBCO，Invitrogen)用于KATO III，并且补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS；GIBCO，Invitrogen)的Leibovitz的L-15培养基用于SW480和MDA-MB468，在37℃，5％CO2气氛下进行孵育。
将经培养的癌细胞系与本发明的27B6或4B4单克隆抗体在4℃下孵育30分钟，用PBS洗涤，并用FITC偶联的山羊抗小鼠IgG(DINONA INC，韩国)在4℃处理15分钟。用PBS再次洗涤细胞系，然后用FACScaliber(Becton Dickinson，USA)分析。结果总结在下表5中。此外，在各种实体瘤细胞系中测量了27B6和4B4抗体的滴度。
下表5显示了各种实体瘤细胞系中碳酸酐酶12抗原的表达模式。在表16中，通过FACS分析分析了待测试的5000个细胞中27B6和4B4单克隆抗体的阳性细胞百分比，并且-表示阳性细胞数量为10％或更少，+表示阳性细胞数的范围为10～30％，++表示阳性细胞数为30～70％，且+++表示阳性细胞数为70～100％。当阳性细胞数小于10％时，认为是阴性，当阳性细胞数为10％或更高时，认为是阳性细胞。
[表5]
Figure GDA0003742741010000211
Figure GDA0003742741010000221
通过流式细胞术进行4B4嵌合抗体的细胞结合分析。
-：阳性细胞数少于10％
+：10～30％
++：30～70％
+++：高于70％。
如表5所示，尽管在各种类型的肺癌、结肠直肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌细胞系中结合亲和力的程度不同，但本发明的27B6和4B4单克隆抗体显示出阳性反应。相反，外周血淋巴细胞、单核细胞和粒细胞均显示为阴性结果。这表明本发明的27B6和4B4抗体可用作抗表达CA XII抗原的实体瘤的治疗剂。
5-2：乳腺癌细胞中的表达模式
观察到27B6和4B4对ER-、PR-和HER2-阳性乳腺癌细胞具有阳性反应。因此，两种抗体均可用作各种乳腺癌亚型的治疗剂，包括三阴性乳腺癌。
通过流式细胞术检查27B6和4B4单克隆抗体与三种不同表型乳腺癌细胞系的结合。细胞培养在37℃，5％CO2气氛下进行，补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS；GIBCOInvitrogen))的Dulbecco's MEM(GIBCO，Invitrogen)用于MCF-7细胞(乳腺癌细胞，ER阳性)，和补充有10％热灭活的FBS的RPMI 1640(GIBCO，Invitrogen)用于MDMI-MB231(源自恶性乳腺癌的细胞系)和SK-BR-3细胞(过量表达Her2(Neu/ErbB-2)基因产物的人乳腺癌细胞系)。
将经培养的癌细胞系在4℃下与本发明的27B6或4B4单克隆抗体一起孵育30分钟，用PBS洗涤，并用FITC偶联的山羊抗小鼠IgG(DINONA INC，韩国)在4℃处理15分钟。用PBS再次洗涤细胞系，然后通过FACS caliber(Becton Dickinson，USA)分析。结果总结在表6中。
[表6]
Figure GDA0003742741010000231
因此，根据本发明的抗体27B6和4B4不仅可以用于三阴性乳腺癌，还可以用于各种类型的乳腺癌，因为它们在ER和PR以及HER2阳性乳腺癌细胞中都显示出阳性反应。
5-3：IHC(免疫组织化学)
通过免疫组织化学(IHC)分析27B6和4B4单克隆抗体结合的抗原在人体正常组织中的分布。人体的正常胸腺和扁桃体组织来自忠北大学医院，并在忠北大学医院的病理科准备冷冻切片。
如下用本发明的27B6和4B4单克隆抗体对制备的冷冻切片进行免疫组织化学染色。将储存在-20℃或更低温度下的胸腺和扁桃体冷冻切片在室温下干燥30-60分钟，并浸入1xPBS中60分钟。然后，将组织在室温下用3％H2O2处理10分钟以抑制内源性过氧化物酶的活性，用流动的水洗涤，并用含有山羊免疫球蛋白的血清在室温下封闭30分钟以排除小鼠抗体的非特异性染色。然后，将组织与一抗(27B6、4B4)在室温下孵育60分钟。每种抗体以10μg/ml的浓度使用。此后，用1xPBS将组织洗涤三次，持续5分钟，在室温下用HRP偶联的山羊抗小鼠抗体(Dako，Denmark)孵育30分钟，然后用1xPBST(0.05％Tween20)洗涤三次。每次5分钟。用二氨基联苯胺(DAB)显色，然后用流动的水洗涤5分钟。将组织用苏木精复染色，然后用流动的水洗涤7分钟。染色后，将载玻片脱水并密封。通过显微镜分析染色结果如下。
[表7]
Figure GDA0003742741010000232
Figure GDA0003742741010000241
如表7所示，本发明的27B6和4B4单克隆抗体识别的抗原既不分布在正常胸腺也不分布在正常扁桃体组织中。特别地，抗原不在正常成熟或未成熟T细胞或B细胞中表达。27B6抗体在扁桃体的基底层中被弱染色，然而，这似乎是由非特异性结合引起的。
实施例6：单克隆抗体的抗原分析
6-1：4B4和27B6单克隆抗体的分离和纯化
培养已用于开发4B4和27B6单克隆抗体的肺腺癌细胞系A549。然后，将1×108个细胞悬浮于50ml裂解缓冲液(1％Nonidet P-40；NP-40在50mM Tris-HCl中，pH 7.4，50mMEDTA和1mM苯基-甲基-磺酰氟；PMSF)中并裂解15分钟。离心后，除去细胞碎片，得到细胞裂解物作为上清液。细胞裂解物用于分离被4B4或27B6抗体识别的抗原。
将5mg每种经纯化的4B4和27B6单克隆抗体针对结合缓冲液(0.2M碳酸氢钠，0.5M氯化钠，pH8.3)透析，得到两种不同的抗体溶液。将装有2ml NHS活化的琼脂糖凝胶4FastFlow树脂(GE Healthcare)的5ml柱用20ml 1mM HCl洗涤，然后用20ml结合缓冲液(20mM碳酸氢钠，0.5M氯化钠，pH8.3)洗涤，以使制备的抗体与柱结合。将柱在其出口处封闭，加入两种不同抗体溶液中的任一种，并在其入口处封闭。在室温下进行孵育4小时。然后，使20ml洗涤缓冲液(20mM乙酸钠，0.5M氯化钠，pH5.4)流过柱，以除去未与树脂结合的过量抗体。再次，用50ml封闭缓冲液(0.1M乙醇胺，0.5M氯化钠，pH8.3)洗涤柱子以除去剩余的反应基团。用20ml储备缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.02％叠氮化钠，pH8.0)洗涤两个柱，并冷藏直至使用。
将制备的柱应用于FPLC(Acta FPLC)，使得与树脂结合的抗体可以识别抗原，从而使得能够分离抗原。将肺腺癌A549细胞系裂解物上样到与FPLC偶联的柱上，并用作4B4和27B6单克隆抗体识别的抗原来源。抗原分离在四步过程中进行：平衡；样品上样；洗涤和第二次洗涤；洗脱。平衡缓冲液和洗涤缓冲液具有相同的组成：0.5％吐温-80、20mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH7.4。用于平衡的缓冲液的用量为10ml，用于洗涤用量为20ml。洗脱缓冲液含有0.3M甘氨酸、0.1M蔗糖、0.1M甘露醇、1.0M尿素和0.5％吐温-80，pH为3.0，并以20ml的量用于洗涤。对于第二次洗涤，使用其中洗脱缓冲液以25％的比例与洗涤缓冲液混合的混合物。将5ml TCA加入到20ml在抗原分离过程中获得的洗脱溶液中，并在冰箱中储存30分钟。离心后，将沉淀用丙酮进一步洗涤两次。将最终得到的沉淀物悬浮在1xSDS-PAGE样品缓冲液中，进行电泳，并用考马斯蓝染色。如上所述，通过分别用4B4和27B6抗体制备的柱分离和纯化的抗原显示在图6中。图6显示了通过用4B4和27B6单克隆抗体制备的柱从肺腺癌A549细胞系分离和纯化的抗原的电泳图。
6-2：4B4和27B6单克隆抗体的抗原识别
如图7所示，从与4B4和27B6单克隆抗体偶联的树脂中分离和纯化的抗原可见。在Seoul Pharma Laboratories中分析了箭头指示的约58kDa的两个主要蛋白质条带。为了识别，通过凝胶内消化制备肽，并使用LC-MS/MS分析，然后用PLGS(Waters)和MASCOT(MatrixScience)处理MS/MS谱。如下进行一系列分析。
使用100％CAN(乙腈)将含有蛋白质的凝胶块脱水，并在Speed-vac中完全干燥。用胰蛋白酶消化经干燥的凝胶块中的蛋白质15分钟。用60％CAN和0.1％TFA提取胰蛋白酶肽。将收集的提取物在Speed-vac中干燥。在LC-MS/MS分析之前，将样品溶解在20％的5％CAN、0.2％TFA(三氟乙酸)中。从LC柱nanoACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，
Figure GDA0003742741010000252
2.1mm×150mmI.D.)洗脱肽，在LC-MS/MS分析中，梯度为流动相缓冲液A(100％DW中0.1％TFA)至流动相缓冲液B(100％ACN中0.1％TFA)。在nana-ESI-Q-TOF仪器上以阳性测量扫描模式在线分析经分离的肽。随后，用PLGS和MASCOT处理光谱数据。
作为上述一系列分析的结果，如下表所示获得最终识别结果，并且它们显示在下表8中。
[表8]
Figure GDA0003742741010000251
/>
Figure GDA0003742741010000261
如所预期的，分析结果的碳酸酐酶12由通过4B4和27B6单克隆抗体纯化的抗原共同识别，并且发现存在于细胞表面上。其他蛋白质不能是4B4和27B6单克隆抗体的抗原，因为它们是细胞内蛋白质。因此，由于不完美的分离和纯化，它们似乎包含杂质。
通过27B6分离四种肽：QFLLTNNGHSVK(SEQ ID NO:22)、WTYFGPDGENSWSK(SEQ IDNO:23)、GQEAFVPGFNIEELLPER(SEQ ID NO:24)和YKGQEAFVPGFNIEELLPER(SEQ ID NO:25)。通过4B4分离三种肽：QFLLTNNGHSVK(SEQ ID NO:22)、EMINNFR(SEQ ID NO:26)和GVIYKPATK(SEQ ID NO:27)。其中，分析了4B4和27B6中共有的序列QFLLTNNGHSVK。图8显示碳酸酐酶12前体同型1的氨基酸序列，分析的肽序列以粗体表示。图8列出了通过LC-MS/MS分析从经纯化的抗原识别的蛋白质。表9显示了通过LC-MS/MS检测的根据实施例6的碳酸酐酶12同型1的氨基酸序列和27B6和4B4抗体识别的抗原的抗原肽片段。这些结果表明27B6和4B4抗体识别的抗原的抗原性肽片段是碳酸酐酶12同型1。
[表9]
Figure GDA0003742741010000262
6-3：4B4和27B6单克隆抗体的抗原测定(ELISA)
为了评估通过LC-MS/MS获得的抗原识别结果，通过ELISA和Western印迹分析检查4B4和27B6单克隆抗体对重组蛋白碳酸酐酶12(R&D Systems)的反应性。
将重组蛋白CA12以100ng/孔的密度接种到Maxisrop ELISA板中，并在37℃下孵育1小时。向每个抗原包被的孔中加入200μl的1x封闭缓冲液(Sigma)，然后在37℃下孵育1小时以进行封闭。将4B4、27B6和抗CA12单克隆抗体(R&D Systems)与100μl的PBS一起接种到板中。在37℃孵育1小时后，用PBS洗涤平板以除去未结合的抗体。随后，将稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson)加入孔中，反应30分钟，并用PBS洗涤。在每个孔中用50μl的TMB显色10分钟，并用50μl硫酸终止。读取450nm处的吸光度。尽管27B6单克隆抗体对重组碳酸酐酶12的反应性低，但4B4、27B6和抗CA12单克隆抗体(R&DSystems)对重组抗原的反应性信号如图7所示。图7显示了通过ELISA测定分析识别碳酸酐酶12作为4B4和27B6单克隆抗体的抗原。
6-4：4B4和27B6单克隆抗体的抗原测定(Western印迹)
通过Western印迹证实了在先前实验中证实的4B4和27B6单克隆抗体对碳酸酐酶12作为抗原的识别。将重组碳酸酐酶12煮沸3分钟，上样到8％分离的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中，并通过电泳进行。将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后用5％脱脂乳(Sigma)封闭，并用4B4、27B6或抗CA12单克隆抗体(R&D Systems)处理(27B6：泳道1和2，4B4：泳道3和4，抗CA12单克隆抗体：泳道5和6)。用洗涤缓冲液(PBS中的0.1％Tween-20)洗涤三轮后，将抗体与过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(Sigma，Saint Louis，USA)偶联。在用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜后，使用增强的化学发光检测系统(ECL，Amersham，Sweden)使条带可视化。结果显示在图8中。图8显示了通过Western印迹试验分析的碳酸酐酶12作为4B4和27B6单克隆抗体的抗原的识别。通过所有4B4、27B6和抗CA12单克隆抗体(R&D Systems)在40kDa检测到重组CA12。
6-5：4B4和27B6单克隆抗体的抗原测定(夹心ELISA)
ELISA和WB测定证明4B4和27B6单克隆抗体识别碳酸酐酶12作为抗原，但27B6单克隆抗体的检测信号相对较低。为了补偿相对低的信号，如下进行夹心ELISA。将嵌合的4B4或27B6单克隆抗体以100ng/孔的浓度接种到Maxisrop ELISA板中，并在37℃下孵育1小时。向每个抗原包被的孔中加入200μl的1x封闭缓冲液(Sigma)，然后在37℃下孵育1小时以进行封闭。将从100ng/ml开始的重组碳酸酐酶12的两倍系列稀释液加入孔中，在37℃下孵育1小时，并用PBS洗涤以除去未结合的抗原。随后，将4B4单克隆抗体和27B6单克隆抗体以100ng/孔的浓度分别加入到嵌合27B6包被的孔和嵌合4B4包被的孔中。在37℃孵育1小时后，用PBS洗涤孔以除去未结合的抗体。另外，将结合的抗体与稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson)一起孵育30分钟并用PBS洗涤。在每个孔中用50μl的TMB显色10分钟，并用50μl硫酸终止。检测450nm处的吸光度。当嵌合27B6和4B4分别用作捕获抗体和检测抗体时，读取高反应信号，如表10所示。因此证明4B4和27B6单克隆抗体均识别作为抗原的碳酸酐酶12。
表10显示27B6和4B4单克隆抗体同时识别碳酸酐酶12，如使用27B6和4B4单克隆抗体作为捕获/检测抗体通过夹心ELISA测定法测量的。
[表10]
捕获抗体 嵌合27B6 嵌合4B4
检测抗体 4B4 mAb 27B6 mAb
CA12 100ng/ml 1.653 0.021
CA12 50ng/ml 1.349 0.016
CA12 25ng/ml 0.954 0.016
CA12 12.5ng/ml 0.634 0.011
CA12 6.25ng/ml 0.351 0.009
CA12 3.13ng/ml 0.193 0.008
空白 0.064 0.007
空白 0.055 0.008
实施例7：表位映射
为了分析表位，如图13所示，构建具有或不具有表位的重组抗原，并分析实施例1和3中27B6和4B4的小鼠单克隆抗体的免疫反应。
7-1：CA12突变重组基因的构建和表达
用BamHI和HindIII消化重组载体pSec-Tag-CA12全-hFc以制备CA12突变体重组基因。将CA12抗原的完整碱基序列与hFc融合的重组基因插入pSec-Tag，然后使其能够表达含有全长CA12加hFc的重组融合蛋白。如图13所示，制备了具有在从N末端300个氨基酸的范围内的各种长度的缺失突变体-hFc构建体。
携带CA12全-hFc和五种不同缺失突变体-hFc构建体的各自的pSec-Tag载体借助于ViaFect(Promega)导入CHO细胞。
简言之，在转染前一天，将CHO细胞接种并孵育。在用新鲜培养基更换培养基后，将载体和ViaFect的复合物应用于CHO细胞并孵育48小时。转染后两天，收集培养物上清液，通过夹心ELISA检测人Fc(hFc)分析基因的表达。
7-2：单克隆抗体表位的测定
为了检查由本发明的单克隆抗体识别的CA12表位，向每个孔中加入50ng抗人Ig抗体(Jackson Laboratory)并在37℃下孵育1小时。通过在每个孔中与200μl的1x封闭缓冲液(Sigma)在37℃下孵育1小时来封闭固定至孔的抗体，其将用作捕获抗体。将含有CA12全hFc和五种不同缺失突变体-hFc构建体的各培养物中的每一种以100μl/孔的浓度添加至平板。在37℃孵育1小时后，用PBS洗涤孔以除去未结合的抗体。随后，将稀释的抗小鼠Ig，Fc特异性-HRP(Jackson Laboratory)加入孔中，反应30分钟，并用PBS洗涤。在每个孔中用50μl的TMB显色10分钟，并用50μl硫酸终止。读取450nm处的吸光度。使用捕获和检测夹心ELISA检测培养物上清液中CA12突变体-hFc蛋白的存在，其中抗人Ig抗体用作对照。结果如图9所示。
从图9中可以看出，表位位于氨基酸25到57的部位，它是非催化结构域。因此，本发明的抗体不与CA-XII的催化结构域结合，因此它们不抑制CA-XII的酶活性。
详细地，通过缺失方法分析，发现27B6抗体特异性表位具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列
Figure GDA0003742741010000291
(SEQ ID NO:5的第25个氨基酸至第38个氨基酸的跨度)。CA12的三维晶体结构将表位限制在SEQ ID NO:2的氨基酸序列上的SEQ ID NO:1的7个连续氨基酸WTYFGPD(对应于SEQ ID NO:5的32至38)。进一步地，发现4B4抗体特异性表位具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列/>
Figure GDA0003742741010000292
(SEQ ID NO:5中第39至57位氨基酸的跨度)，而CA12的三维晶体结构将表位限制在SEQ ID NO:4的氨基酸序列上的SEQ ID NO:3的14个连续氨基酸序列GENSWSKKYPSCGG(对应于SEQ ID NO:5的第39位至第52位氨基酸)。
实施例8：嵌合抗体对实体瘤的治疗作用(CDC)
8-1：肺腺癌细胞系中的CDC效果
将肺腺癌细胞系A549细胞以5×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并在37℃CO2培养箱中培养20-24小时。从每个孔中除去培养基后，将不含胎牛血清的RPMI培养基与10％人血清混合，并将嵌合27B6抗体以10μg/ml的终浓度加入混合物中。将该溶液以100μl/孔的浓度铺板到板中。
还以相同方式处理4B4嵌合抗体。在37℃CO2培养箱中孵育3小时后，向每个孔中加入10μl的Ez-CyTox试剂(DOGEN，韩国)。在37℃，CO2培养箱中孵育3.5小时，然后在平板读数器上测量450nm处的吸光度。结果在图10中给出。图10显示27B6抗体的补体依赖性细胞毒性作用。
从图10中可以看出，实施例2和4中获得的27B6和4B4嵌合抗体显示出补体依赖性细胞毒性。
8-2：三阴性乳腺癌中的CDC效果
根据<实施例8-1>的相同方法，评价治疗效果，除了使用三阴性乳腺癌细胞系的MDAMB-231代替A549细胞系作为靶细胞，并且测量在450nm处的吸光度，并在表11中显示。表11显示了证实根据实施例8的4B4嵌合抗体在三阴性乳腺癌中表现出补体依赖性细胞毒性的结果。
[表11]
样品 细胞毒性(％)
未处理 0.0
5％HS (12.7)
5％NHS+4B4 1ng/ml 76.5
5％NHS+4B4 10ng/ml 86.3
5％NHS+4B4 100ng/ml 83.4
5％NHS+4B4 1000ng/ml 75.7
5％NHS+4B4 10000ng/ml 83.7
4B4+5％NHS+CVF 50μg 83.9
4B4+5％NHS+CVF 100μg 80.7
如表11所示，本发明的27B6单克隆抗体显示出对肺腺癌肿瘤的补体依赖性细胞毒性。
实施例9：嵌合抗体在实体瘤中的治疗效果(ADCC)
9-1：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的测定(ADCC-LDH测定)
为了制备效应细胞，将Ficoll加入人血样(血液:Ficoll＝1:2)，然后以2000rpm离心20分钟以获得PBMC(外周血单核细胞)。将PBMC在37℃下储存在5％FBS补充的RPMI培养基中。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定与LDH测定或荧光素酶测定一起进行。
作为靶标，各种实体瘤细胞系-HT29(结肠直肠癌)、A549(肺腺癌)、NCI-H460(肺腺癌)和MCF7(乳腺癌)-各自以1×104细胞/孔的密度接种到将96孔板在37℃，CO2培养箱中培养18-20小时。从每个孔中取出培养基后，将27B6嵌合抗体以0μg/mL、0.1μg/mL或3μg/mL的浓度添加到补充有5％FBS的培养基中，然后以100μl/孔的浓度加入板中，然后在37℃CO2培养箱中孵育30分钟。此后，将上面制备的效应细胞以5×105个细胞/孔的密度(靶细胞的50倍)铺板，并在37℃CO2培养箱中培养24小时。对于阳性对照，加入裂解缓冲液，然后在37℃孵育24小时。孵育24小时后，将细胞培养物以2500rpm离心5分钟。测量由此获得的上清液的LDH(乳酸脱氢酶)活性以计算细胞裂解(Promega测定试剂盒)。如图11所示，本发明的27B6单克隆抗体在各种实体瘤中表现出抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(图11)。图11显示了27B6抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。
9-2：三阴性乳腺癌中的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定(ADCC-LDH测定)
以与实施例9-1相同的方式制备效应细胞，并测试抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
此外，发现27B6抗体在尚无治疗剂已经开发出来的三阴性乳腺癌细胞系(MDAMB-231、MDAMB-468、MDAMB-453、BT-20)中表现出高抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(图12)。图12显示了27B6抗体对三阴性乳腺癌细胞系的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。
实施例10：去岩藻糖基化抗体在实体瘤中的治疗效果(ADCC)
10-1：去岩藻糖基化的嵌合27B6抗体-结肠癌、肺癌、乳腺癌的ADCC的测定
为了诱导抗体蛋白的去岩藻糖基化，将实施例2的27B6抗体细胞系和实施例4的4B4嵌合抗体细胞系与100ng/ml的几夫碱(kifunensine)一起孵育，其诱导抗体的去岩藻糖基化，并且分离出去岩藻糖基化的抗体，并且与相应的岩藻糖基化抗体相比。用于几夫碱处理，ADCC增强的嵌合27B6抗体的ADCC的测定显示去岩藻糖基化抗体在结肠癌、肺癌和乳腺癌中的ADCC效果。
从图13中可以看出，通过几夫碱的去岩藻糖基化的抗体增加了针对各种实体瘤细胞系的抗体依赖性细胞介导细胞毒性。图13显示了去岩藻糖基化的27B6嵌合抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
10-2：对去岩藻糖基化嵌合27B6抗体-三阴性乳腺癌的ADCC的测定
通过使用荧光素酶ADCC测定，分析针对三阴性乳腺癌细胞系MDAMB231和HER2受体阳性乳腺癌细胞系SK-BR3的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。通过用几夫碱处理的去岩藻糖基化后的抗体对MDAMB231和SK-BR-3的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性比相应的岩藻糖基化抗体更高(图14)。
图14显示了通过荧光素酶测定法测量的去岩藻糖基化的4B4和27B6嵌合抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
具体地，作为靶细胞，将乳腺癌细胞系MDAMB231和SK-BR3各自以1.25×104个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并在37℃CO2培养箱中培养20-24小时。从每个孔中除去培养基后，向每个细胞被接种的孔中加入25μl含有4％低IgG FBS的RPMI培养基。将27B6和4B4抗体在含有4％低IgG FBS的RPMI培养基中连续3倍稀释从10μg/ml至1.2ng/ml。连续抗体稀释液各自以25μl/孔的量加入，并将板用各自的盖子覆盖并留在超净台上。从细胞培养物中收获ADCC报告细胞(ADCC Reporter Bioassay，Promega)，并以3×106个细胞/ml的浓度悬浮于含有4％低IgG FBS的RPMI培养基中。向每个孔中加入25μlADCC报告细胞悬浮液，然后在37℃CO2培养箱中孵育24小时。在取出平板之前，将冷冻的荧光素酶底物在水浴中解冻。将板从超净台上取下并在室温下放置15分钟。将荧光素酶底物以75μl/孔的浓度加入板中并在黑暗条件下反应30分钟，然后用光度计测量发光。使用荧光素酶测定的去岩藻糖基化的27B6和4B4嵌合抗体的抗体依赖性细胞毒性试验的结果显示于图14中。
如图14所示，27B6和4B4抗体在通过用几夫碱处理进行去岩藻糖基化后，对MDAMB231和SK-BR-3的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性比相应的岩藻糖基化抗体更强。
实施例11：27B6和4B4抗体在小鼠模型中的治疗效果
11-1：细胞系建立
使用三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-453建立具有人乳腺癌的动物模型。首先，将MDA-MB-231或MDA-MB-453以1.5×108个细胞(在RPMI:基质胶混合物中)的剂量皮下注射到小鼠的右侧腹中。将经注射的小鼠随机分为试验组和对照组。
图15进一步显示实施例2中的27B6嵌合抗体和实施例4中的4B4嵌合抗体与动物实验中使用的MDA-MB231细胞表面的结合，图16显示使用抗体的动物实验的结果，证明抗体抑制MDA-MB231诱导的肿瘤的生长和大小。
作为测试材料，将27B6岩藻糖基化的嵌合抗体、27B6去岩藻糖基化的嵌合抗体、4B4岩藻糖基化的嵌合抗体和4B4去岩藻糖基化的嵌合抗体接种到乳腺癌细胞中。三天后，以12mg/kg的剂量向每只小鼠腹膜内注射细胞。每周注射两次，持续三周。在注射前测量肿瘤大小。抗CA12抗体对乳腺癌的抑制活性表示为根据下式计算的肿瘤体积：(a×b2)/2(a是短直径，b是长直径)。体积计算式与实施例20-1的体积计算式相同。
[计算式]
体积计算式(体积＝(a×b)/2，其中，a是短直径，b是长直径)
11-2：抗CA12抗体对三阴性乳腺癌的抑制活性
靶向在三阴性乳腺癌上特异性表达的CA12表位，测定抗CA12嵌合抗体4B4对三阴性乳腺癌的抑制活性(图17)。
通过4B4减少了乳腺肿瘤的体积，并且去岩藻糖基化的抗体对肿瘤生长的抑制活性优于相应的岩藻糖基化抗体。在MDA-MB-231和MDA-MB-453中均发现4B4岩藻糖基化抗体对乳腺癌肿瘤生长的抑制活性。
特别地，在MDA-MB-453模型中观察到完全缓解，因为肿瘤在第21天后没有进一步生长(图17)。图17显示了4B4抗体对三阴性乳腺癌的抑制活性。
实施例12：抗体对细胞存活的影响
证实了实施例4的嵌合4B4抗体对细胞活力的影响。当抗体应用于CA12阳性癌细胞时，检查抗体对细胞生长和存活的影响。为此，在施用前一天(10％RPMI)将细胞以3×104个细胞/孔的密度接种到96孔平底板中。24小时后，除去RPMI，向每个孔中加入100μl的含有抗体的新鲜5％RPMI。
24小时后，以50μl/孔的浓度接种
Figure GDA0003742741010000331
非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega，Cat.#G1780)，并在室温下孵育30分钟。使用分光光度计测量细胞活力。将抗体应用于MDA-MB231细胞后24小时，测量细胞活力。
测量结果显示在图18中。抗体的施用既不促进也不降低细胞活力。该抗体不抑制CA12酶活性，对肿瘤细胞生长没有影响。因此，发现根据本发明的抗体通过免疫系统的ADCC和CDC表现出抗肿瘤活性。
在向A549施用抗体后24小时、48小时和72小时测量细胞活力。与未施用抗体的细胞相比，未观察到细胞活力的显著变化。图19和20显示单独的4B4抗体与肿瘤细胞的结合不影响肿瘤细胞的生长。
作为抗CA12抗体的4B4抗体仅在抗体与细胞结合时对细胞生长没有影响。这似乎可归因于4B4抗体不影响CA12的酶活性的事实，因为它结合CA12抗原的N-末端非酶区域。
实施例13：通过抗体疗法和放射疗法的组合评价治疗效果
进行检查以确定本发明的抗体和放射疗法的组合是否可以带来增加的抗癌效果。
简而言之，将实施例2的27B6嵌合抗体与5μg/ml顺铂、2Gy辐射或4Gy辐射组合使用，并通过流式细胞术分析A549细胞的CA12表达。结果，发现顺铂和放射均增加细胞表面CA12的表达，且4Gy辐射诱导最大表达水平。这表明本发明的抗CA12抗体与放射疗法的组合能够影响肿瘤细胞的生长(图20中的上图)。
为了测定联合治疗对肿瘤细胞生长的影响，如图20的下图所示，在用27B6的组合处理后，通过MTT测定法测量用抗体和放射疗法的组合处理的癌细胞系A549的存活力。在图20中，下图显示了27B6抗体和放射疗法的组合对细胞活力的影响。从图20中可以看出，与单独的抗体或同种型对照抗体和放射疗法的组合相比，27B6和放射疗法的组合以更高的速率诱导细胞死亡。
实施例14：抗CA-XII嵌合抗体的人源化
14-1：人源化可变结构域的构建(DNP004 scFv形式选择)
通过使用D.H.lap所具有的噬菌体展示技术，将实施例4中获得的完整IgG形式的4B4嵌合抗体转化为scFv形式用于抗体筛选。为此，将嵌合4B4抗体的可变区改变为大肠杆菌密码子，并通过PCR将VL和VH连接来构建scFv基因。将VL序列和VH序列和接头长度的依次序组合以构建各种构建体并连接到噬菌粒载体。通过与抗原CA XII的结合测定分析连接的质粒载体，并选择VH-长接头-VL形式的DNP004 scFv并用作诱变模板。
14-2：子库构建和筛选
通过D.H.Lab的专门技能，为全部或部分可变区制备11个随机突变亚文库或位置特异性突变亚文库。生成的子库类型如下：
(1)随机突变子库：1种VL、1种VH、2种VH和VL，以及
(2)位置特异性突变子库：三种LCDR、三种HCDR、以及一种VH和VL。
在十一(11)个子文库上进行CA XII的生物筛选。从第一次筛选中，选择在VL区域具有高信号的552个克隆。进行二次筛选以选择78个克隆以具有高于母克隆的信号。在确认多核苷酸序列后，选择总共32个具有不同多核苷酸序列的克隆。
选择的32个克隆通过ELISA重新确认其对CA XII的结合亲和力，并且10个克隆(克隆ID：1、2、4、5、8、15、24、25、26、28)，ELISA信号大于所选择的4B4嵌合抗体1.5倍。作为其CDR的序列分析的结果，证实在LCDR1和LCDR2区域中存在突变(图22)。
然后，LCDR1和LCDR2部分被判断为热点，选择10个克隆(克隆ID：1、2、4、5、8、15、24、25、26、28)和另外4个在LCDR2中具有突变的克隆(克隆ID：11、22、19、30)，然后转为完全IgG[LK sun,P Curtis,Chimeric antibody with human constant regions and mousevariable regions directed against carcinoma-associated antigen 17-1A,ProcNatl Acad Sci US A.1987Jan；84(1):214-8](图21和22)。然而，14个克隆中的克隆ID：4、5、4和28由于其低表达被排除在进一步的材料测试之外，所选择的十个克隆的突变位点总结在下表12中。
[表12]
Figure GDA0003742741010000351
14-3：人源化文库和培养物的转染以及IgG的测量
将CHO细胞接种到96孔板中，并用人源化克隆的小制备DNA转染。详细的实验方法如下。
首先，在转染12小时之前，将CHO细胞系以1×105个细胞/ml的浓度接种到6孔板中，并添加3ml含有5％胎牛血清的DMEM并在37℃，5％CO2培养12小时。使用ViaFect试剂盒(Promega，USA)将10种完整IgG DNA转化到制备的CHO细胞中。转染后48小时收集细胞培养物上清液，通过ELISA确认每种人源化克隆和对照IgG抗体的反应性。
将每孔100ng重组蛋白CA XII加入Maxisrop ELISA板中并在37℃反应1小时以包被抗原。然后，将1x封闭溶液(Sigma)加入到每孔200μl中并在37℃下封闭反应1小时。将4B4、27B6、抗CA XII单克隆抗体(R&D Systems)和PBS 100μL加入到制备的板中，在37℃下孵育1小时并用PBS洗涤以除去未结合的抗体。然后，用稀释的山羊抗人IgG-HRP(Jackson)加入反应物，孵育30分钟，用PBS洗涤，与TMB溶液以50μl/孔反应10分钟，并加入50μl硫酸猝灭反应。在450nm下测量产物的吸光度。
14-4：使用ELISA对候选人源化抗体进行抗原亲和力测试
通过使用D.H Lab中提供的方案和抗原，进行人源化克隆与抗原CA-XII结合的平行测试。计算每个克隆的活性(亲和力)，并与同一平板上阳性对照(嵌合克隆4B4)的活性进行比较。10种变体(克隆ID：1、2、4、5、8、15、24、25、26、28)的抗原结合亲和力没有显著高于母体克隆(4B4嵌合体)的抗原结合亲和力。通过ELISA分析的母克隆的预期亲和力是大约KD10-10M，这是非常高的。因此，认为即使候选克隆的抗原结合亲和力未到达母克隆，10种候选抗体的结合力也不低(图23和24)。
实施例15：人源化抗体的CDR序列/抗体序列
15-1：抗DNP004人源化抗体的基因序列的选择
通过使用小鼠单克隆抗体4B4(以保藏号：KCLRF-BP-00279保存的杂交瘤)的轻链可变区基因和重链可变区基因特异性结合CA-XII作为模板来制备DNP004人源化抗体基因而制备人源化抗体，通过DH Lab的计算机专有技能，为全部或部分可变区制备10个随机突变亚文库或位置特异性突变亚文库
使用构建的文库通过噬菌体展示技术筛选552个克隆，筛选显示比母体克隆信号更高的78个克隆。根据核苷酸序列分析筛选32个不同的克隆。作为分析32个克隆对CA XII的结合亲和力的结果，当ELISA信号超过母克隆的1.5倍时，选择了10个克隆，并且突变位点主要在LCDR1和LCDR2区域。因此，选择LCDR1和2作为热点，选择在LCDR2区域具有突变的4种(克隆ID：11、22、19、30)进行全IgG1转换。在制备的14种IgG中，因为低表达排除克隆ID4、5、24和28，并且表达并纯化剩余的10个克隆，并且最后进行ELISA以选择最终的10种。
最后，选择与小鼠单克隆抗体4B4大部分相似的人源化抗体#8候选物。通过测序识别每种候选抗体的人源化抗体基因。经分析的DNP004抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列如下(表13和14)。如下表13中所示，重链可变区的CDR序列可以相同或部分不同，但轻链可变区的CDR序列可以不同。以下SEQ ID NO:15、16、28和32至42中以粗体表示的氨基酸被修饰。
[表13]
Figure GDA0003742741010000361
/>
Figure GDA0003742741010000371
[表14]
Figure GDA0003742741010000372
在下表15中，显示了所选克隆的重链可变区序列和轻链可变区序列，所有重链可变区是相同的(SEQ ID NO:53)，但轻链可变区是不同的(SEQ ID NO:54至63)。序列的下划线部分对应于CDR序列。
[表15]
Figure GDA0003742741010000373
/>
Figure GDA0003742741010000381
15-2：人源化抗体的制备
基于制备的抗CA-XII人源化抗体DNP004的氨基酸序列，制备人源化抗体。
为了表达抗CA-XII人源化抗体，分别制备用于表达重链的质粒和用于轻链表达的质粒。PcDNA3.4(Invitrogen)载体用作重链表达质粒，pOptiVEC(Invitrogen)载体用作轻链表达质粒。
为了表达每个抗体的可变区编码cDNA和恒定区编码cDNA作为连续氨基酸序列而不插入额外的氨基酸，合成克隆的可变区的编码序列和已知的人IgG1恒定区(重链)和κ恒定区(轻链)编码序列(Bioneer)。用限制酶Xho I和Sal I消化所合成的重链基因和轻链基因，将重链基因片段连接到pcDNA3.4载体上，将轻链基因片段连接到pOptiVec载体上构建完整的抗体表达质粒(pcDNA3.4-4B4重链表达质粒和pOptiVEC-4B4轻链表达质粒)。
将制备的pcDNA3.4-4B4重链表达质粒和pOptiVEC-4B4轻链表达质粒转染到CHO细胞衍生的DG44细胞(Invitrogen)中进行转化。
转染前3天，将悬浮的DG44细胞适应于含有5％FBS的MEMa培养基，将其转化为贴壁细胞并提高转染效率。使用ViaFect转染试剂(Promega，Cat.#：E4981)在6孔板上进行转染。在转染前一天，通过以1×105个细胞/孔的浓度进行传代培养来制备适合于贴壁状态的DG44细胞。通过使用3μg pOptiVEC-4B4轻链表达质粒和1μg p3DNA3.4-4B4重链表达质粒以3:1的混合比确定用于转染的DNA的量。转染进行48小时。流式细胞术用于分析转染的细胞群。
图25显示人源化抗体DNP004在CA-XII阳性三阴性乳腺癌细胞系MDAMB-231中的结合。
实施例16：抗体候选组的物理性质的评估
为了比较人源化抗体变体的表达和物理性质，评估和比较了SDS-PAGE分析、尺寸排阻色谱、熔解温度、ANS反应性等。
16-1：抗体候选组-表达水平分析
为了通过蛋白A纯化确认表达水平和沉淀的发生，通过将8种突变体的组合载体导入HEK293F来诱导瞬时转染。
将300mL每种培养物注入到蛋白A(GE Helthcare，目录号11-0034-93)中，并使用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸缓冲液，pH3.0)纯化。将获得的抗体用磷酸盐缓冲盐水透析，并在透析之前和之后定量以确认损失。表达水平在1.0～10.0μg/mL的范围内变化，并且在变体号25和26中观察到高表达率(表16)。
[表16]
Figure GDA0003742741010000401
16-2：抗体候选物的SDS-PAGE分析
进行SDS-PAGE分析以评估人源化抗体变体的重链/轻链结合的完整性，重链和轻链的统一性。
在非还原测定中，减少5μg抗体，将10μg抗体在2×Laemmli样品缓冲液(Bioread，目录号161-0737)中混合，在100℃下煮沸5分钟并且ini-PROTEAN TGX gel Bio-Rad，CatNo.456-1083)。电泳在150V下进行1小时，并用SimplyBlue Safestain(Invitrogen，Cat.No:LC6060)染色2小时，并用蒸馏水脱盐。在八种人源化抗体变体中，对于克隆#15变体，轻链染色不清楚，但其他7种变体均未发现异常(图26)。
图26是显示使用SDS-PAGE分析候选抗体组的物理性质的结果的图片。在人源化抗体变体的15种变体中，对于克隆#15变体，轻链染色不清楚，但在其他7种变体中没有(图26)。
16-3：抗体候选物的SE-HPLC分析
进行尺寸排阻-色谱分析以进行纯度评估。
用磷酸盐缓冲盐水稀释每种抗体以制备1.0mg/mL抗体，并将20μL注射到用平衡缓冲液(0.1M磷酸钠，0.1M氯化钠pH7.0)平衡的TSKgel G3000SWXL(TOSOH)中。使平衡缓冲液以0.5mL/min的流速流动40分钟，并在280nm的波长下检测经洗脱的蛋白质。通过自动分析对检测到的峰进行积分，以计算每个峰的面积，并将主峰的面积比描述为百分比。
大多数变体的主峰面积比是纯度的95％或更高，但变体#11和#26分别为94.3％和94.1％，其略低(表17)。
[表17]
抗体编号 保留时间(min) 主峰面积比(％)
嵌合抗体(4B4) 15.99 98.3402
人源化抗体变体#1 16.366 95.325
人源化抗体变体#2 16.326 95.0894
人源化抗体变体#8 16.332 95.1814
人源化抗体变体#11 16.409 94.3005
人源化抗体变体#15 16.307 96.8589
人源化抗体变体#19 16.263 97.4621
人源化抗体变体#22 16.158 96.7872
人源化抗体变体#25 16.329 95.3279
人源化抗体变体#26 16.361 94.1417
人源化抗体变体#30 16.326 95.735
16-4：抗体候选组-熔解温度(Tm)分析
为了比较评估稳健性，测量人源化抗体变体的熔解温度。
根据制造商的手册将蛋白质热转移染料和缓冲液(Invitrogen，Cat.No.4462263)加入到0.44μg抗体变体中以制备20μL混合溶液，将其注入配备Protein Thermal ShiftTM软件v1.0的实时PCR中。检测通过蛋白质热位移染料和抗体之间的结合检测的荧光值，同时以0.05℃/秒的速率将温度从25℃连续升高至95℃。在完成测试后，用ViiA TM 7软件实施Boltzmann拟合，并计算每种抗体的熔解温度(Tm)。对于突变体8，是最稳健的抗体，Tm为71.41℃。为了确认Tm和纯度之间的相关性，使各突变体在62℃下在高温下放置3小时，然后进行尺寸排阻色谱分析以计算主峰的面积比。
变体8在62℃的高温下显示出最高的峰-峰比，并且是具有相同Tm分析的最稳健的变体(表18)。
[表18]
Figure GDA0003742741010000411
Figure GDA0003742741010000421
16-5：评估CA XII阳性细胞系的结合强度
将表达CA XII抗原的MDAMB231乳腺癌细胞系在补充有10％热灭活的FBS的RPMI1640(GIBCO，Invitrogen)中培养，用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)解吸，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并以2x106个细胞/管倒入管中。
将人源化抗体变体添加至每个管中至1.0μg/mL的浓度，并在冷藏下反应30分钟。加入FITC标记的第二抗体山羊抗小鼠IgG(HL)-FITC(DINONA INC，Korea)，并使细胞在冰箱中反应20分钟。用磷酸盐缓冲盐水将细胞再离心一次，将细胞悬浮在含有1％甲醛的磷酸盐缓冲盐水中，用流式细胞仪(Stratedigm，S1000EXi)分析荧光。
基于与MDAMB231细胞系结合的4B4嵌合抗体的平均荧光强度(MFI)的突变体的结合强度以百分比示于图28中。所有变体显示相对结合强度为90％或更高，变体8、11、15和26显示99％的相对结合强度，其与嵌合抗体没有太大差异(图27)。
实施例17：各种细胞系中人源化抗体表达的分析
17-1：各种细胞系中的抗体表达
通过流式细胞术证实人源化抗体(DNP004)在从KCLB(韩国细胞系库)和SNU(首尔国立大学)获得的各种癌细胞系中的结合。在37℃，5％CO2培养箱中，LNCap、MCF-7、Huh7和Hs-578T在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS；GIBCO，Invitrogen)的Dulbecco'sMEM(GIBCO，Invitrogen)中培养，以及A549、NCI-H460、DLD-1、HT-29、LS174T、PC-3、SNU638、SNU719、MKN45、NCI-H87、SK-BR3、MDA-MB231、MDA-MB453在补充有10％热灭活的FBS的RPMI1640(GIBCO，Invitrogen)培养基中培养。另外，在37℃，5％CO2培养箱中，Hep3B.1-7和PLC/PRF/5在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS；GIBCO，Invitrogen)的Eagle's MEM(GIBCO，Invitrogen)培养基中培养，以及KATO III在补充有20％热灭活的胎牛血清(GIBCO，Invitrogen)的IMDM(GIBCO，Invitrogen)培养基中培养。
在与DNP004在4℃孵育30分钟后，用PBS洗涤癌细胞，并将FITC偶联的山羊抗人IgG(DINONA INC，韩国)加入到培养的癌细胞中。用PBS洗涤后，用FACS器量(BectonDickinson，USA)分析细胞，结果如下所示(表19)。下表19显示了各种实体癌细胞系中碳酸酐酶12抗原的表达模式。在表19中，通过FACS分析，分析了DNP004阳性细胞的百分比。在5000个待测细胞中，与DNP004抗体结合的细胞数以％计算；-指阳性细胞数少于10％，+指10％至30％的阳性细胞数，++指30％至70％的阳性细胞数，+++指70至100％的阳性细胞数。
[表19]
Figure GDA0003742741010000431
如表19所示，即使在细胞系构建中具有相同来源的细胞使用不同组织来源，阳性反应的程度可以根据细胞的类型而变化。然而，本发明的人源化抗体DNP004显示出对肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌细胞系的多种类型的腺癌的阳性反应，即使阳性反应的程度有些不同，但在前列腺癌中表现出阴性反应。另一方面，发现外周血淋巴细胞、单核细胞和粒细胞是阴性的。这些结果表明，本发明的人源化抗体DNP004可用作治疗剂，用于表现出阳性反应的实体瘤的适应症。
17-2：各种类型的乳腺癌细胞中的表达模式
DNP004抗体在ER和PR以及HER2阳性乳腺癌细胞中均为阳性。因此，本发明的抗体可用于三阴性乳腺癌，以及各种类型的乳腺癌治疗。通过流式细胞术证实DNP004人源化抗体在三种不同的表型乳腺癌细胞系中的结合，并比较了与嵌合4B4的结合程度的差异。
具体地，以与实施例5-2相同的方式培养MDAMB-231和MDAMB453，MCF-7和SK-BR-3细胞系。将DNP004人源化抗体加入每种培养的癌细胞系中。将细胞在4℃孵育30分钟，用PBS洗涤，并用FITC-偶联的山羊抗人IgG(DINONA INC，Korea)在4℃孵育15分钟。用PBS再次洗涤细胞，并用FACS器量(Becton Dickinson，USA)分析，结果显示在图28和29中。
图28和29显示了各种类型的乳腺癌细胞中DNP004人源化抗体对碳酸酐酶12抗原的结合试验结果。因此，根据本发明的DNP004人源化抗体不仅可以用于三阴性乳腺癌，而且可以用于各种类型的乳腺癌，因为它在ER和PR以及HER2阳性乳腺癌细胞中都是阳性的。
实施例18：针对各种实体瘤的人源化抗体的治疗效果(ADCC)
通过荧光素酶测定法在各种实体瘤中评估抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。MDAMB-231和MDAMB-453、MCF7、SK-BR3、肺癌细胞系A549、肝癌细胞系Huh7和HEP3B以及胃癌细胞系KATO III、SNU719和MKN-45以1.25×104个细胞/孔接种，并在37℃下在CO2培养箱中孵育20-24小时。从每个孔中取出培养基后，将25μl含有4％低IgG FBS的RPMI加入到平板孔中。将实施例15的DNP004人源化抗体用含有4％低IgG FBS的RPMI稀释3倍至最大浓度10μg/ml至1.2ng/ml。将各制备的抗体样品以各自的浓度加入相应的孔中，盖上盖子并保持在洁净的工作台中。收获经培养的ADCC报告细胞(ADCC报告Bi 5测定，Promega)并以3×106个细胞/ml悬浮于含有4％低IgG FBS的RPMI中。向每个孔中加入25μlADCC报告细胞悬浮液，并在37℃下在CO2培养箱中培养24小时。
预先冷冻的荧光素酶底物通过在热水浴中熔化来制备。将板在室温下放置15分钟。向每个孔中加入75μl荧光素酶底物后，在暗室中发生反应30分钟，并使用光度计测量发光强度。
图30显示了DNP004人源化抗体在乳腺癌细胞系中的抗体依赖性细胞毒性作用的结果。图31显示DNP004人源化抗体在肺癌细胞系A549中的抗体依赖性细胞毒性作用的结果。图32显示Huh7和HEP3B中DNP004人源化抗体依赖性细胞毒性作用。图33显示了证实DNP004人源化抗体在胃癌细胞系KATO III、SNU719和MKN-45中的抗体依赖性细胞毒性作用的结果。
因此，证明本发明的DNP004人源化抗体在表达DNP004的抗原(CA XII，碳酸酐酶XII)的各种类型的实体癌细胞中具有通过抗体依赖性细胞毒性作用的细胞凋亡机制。
实施例19使用小鼠实验模型评估人源化抗体的治疗效果
19-1：单一浓度的乳腺癌动物模型/抗体施用组
用三阴性乳腺癌细胞系的MDA-MB-453细胞系建立人乳腺癌动物模型。首先，将1.5×107个MDA-MB-453细胞皮下接种到小鼠的右侧腹，观察肿瘤形成和生长，并通过下式计算肿瘤大小。
(体积＝(a×b)/2，a是短直径，b是长直径)
当肿瘤大小达到100mm3±20时，将小鼠随机分为对照组(5只大鼠)和处理组(5只大鼠)，以10mg/kg的剂量给予小鼠尾静脉DNP004人源化抗体。然后，在实验期间以3-4天的间隔每周测量肿瘤两次，并且从抗体施用开始到实验结束获取肿瘤生长曲线，并且结果的平均值显示在图34。因此，用人源化抗体处理的组显示出对肿瘤生长的大部分的抑制作用(图34)。
19-2：多种浓度的乳腺癌动物模型/抗体施用组
使用与实施例19-1中相同的乳腺癌动物模型进行实验以施用各种浓度的DNP004人源化抗体。
具体地，将小鼠分成四组(4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg和32mg/kg)，其中每组分配5只小鼠。具有16mg/kg剂量的抗体处理组显示部分肿瘤抑制并且不以剂量依赖性方式显示任何肿瘤抑制效果，但肿瘤生长被完全抑制的完全缓解的结果，具有随着浓度的增加而增加的趋势(图35、表20)。
[表20]
Figure GDA0003742741010000451
Figure GDA0003742741010000461
/>
19-3：单一浓度的肾癌动物模型/抗体施用组
高度表达人源化抗体(DNP004)的靶抗原(CA-XII)的肾细胞癌细胞系786-O细胞用于确认小鼠动物模型和抗肿瘤效果(图36)。
具体地，裸鼠皮下注射1.5×107个细胞的786-O细胞系。然而，与乳腺癌细胞系不同，在该实验组中肿瘤形成非常晚，并且在约70天后确认肿瘤形成。将DNP004人源化抗体以32mg/kg的剂量在小鼠尾静脉中施用给确认肿瘤形成的处理组。在实验期间以3-4天的间隔一周测量肿瘤两次。从抗体施用开始到实验结束获得肿瘤生长曲线，获得与对照组的3只小鼠相比的DNP004人源化抗体施用组中8只小鼠的平均肿瘤生长曲线，并显示在图36中。
因此，DNP004人源化抗体的抗癌作用不仅在乳腺癌中而且在肾癌中得到证实。
Figure GDA0003742741010000471
/>
Figure GDA0003742741010000481
/>
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<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化27B6的表位
<400> 1
Trp Thr Tyr Phe Gly Pro Asp
1 5
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化27B6的表位
<400> 2
Ala Pro Val Asn Gly Ser Lys Trp Thr Tyr Phe Gly Pro Asp
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化4B4的表位
<400> 3
Gly Glu Asn Ser Trp Ser Lys Lys Tyr Pro Ser Cys Gly Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化4B4的表位
<400> 4
Gly Glu Asn Ser Trp Ser Lys Lys Tyr Pro Ser Cys Gly Gly Leu Leu
1 5 10 15
Gln Ser Pro
<210> 5
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人的CA XII的氨基酸序列
<400> 5
Met Pro Arg Arg Ser Leu His Ala Ala Ala Val Leu Leu Leu Val Ile
1 5 10 15
Leu Lys Glu Gln Pro Ser Ser Pro Ala Pro Val Asn Gly Ser Lys Trp
20 25 30
Thr Tyr Phe Gly Pro Asp Gly Glu Asn Ser Trp Ser Lys Lys Tyr Pro
35 40 45
Ser Cys Gly Gly Leu Leu Gln Ser Pro Ile Asp Leu His Ser Asp Ile
50 55 60
Leu Gln Tyr Asp Ala Ser Leu Thr Pro Leu Glu Phe Gln Gly Tyr Asn
65 70 75 80
Leu Ser Ala Asn Lys Gln Phe Leu Leu Thr Asn Asn Gly His Ser Val
85 90 95
Lys Leu Asn Leu Pro Ser Asp Met His Ile Gln Gly Leu Gln Ser Arg
100 105 110
Tyr Ser Ala Thr Gln Leu His Leu His Trp Gly Asn Pro Asn Asp Pro
115 120 125
His Gly Ser Glu His Thr Val Ser Gly Gln His Phe Ala Ala Glu Leu
130 135 140
His Ile Val His Tyr Asn Ser Asp Leu Tyr Pro Asp Ala Ser Thr Ala
145 150 155 160
Ser Asn Lys Ser Glu Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Leu Ile Glu Met
165 170 175
Gly Ser Phe Asn Pro Ser Tyr Asp Lys Ile Phe Ser His Leu Gln His
180 185 190
Val Lys Tyr Lys Gly Gln Glu Ala Phe Val Pro Gly Phe Asn Ile Glu
195 200 205
Glu Leu Leu Pro Glu Arg Thr Ala Glu Tyr Tyr Arg Tyr Arg Gly Ser
210 215 220
Leu Thr Thr Pro Pro Cys Asn Pro Thr Val Leu Trp Thr Val Phe Arg
225 230 235 240
Asn Pro Val Gln Ile Ser Gln Glu Gln Leu Leu Ala Leu Glu Thr Ala
245 250 255
Leu Tyr Cys Thr His Met Asp Asp Pro Ser Pro Arg Glu Met Ile Asn
260 265 270
Asn Phe Arg Gln Val Gln Lys Phe Asp Glu Arg Leu Val Tyr Thr Ser
275 280 285
Phe Ser Gln Val Gln Val Cys Thr Ala Ala Gly Leu Ser Leu Gly Ile
290 295 300
Ile Leu Ser Leu Ala Leu Ala Gly Ile Leu Gly Ile Cys Ile Val Val
305 310 315 320
Val Val Ser Ile Trp Leu Phe Arg Arg Lys Ser Ile Lys Lys Gly Asp
325 330 335
Asn Lys Gly Val Ile Tyr Lys Pro Ala Thr Lys Met Glu Thr Glu Ala
340 345 350
His Ala
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 27B6抗体的VH-CDR1
<400> 6
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 27B6抗体的VH-CDR2
<400> 7
Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr
1 5
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 27B6抗体的VH-CDR3
<400> 8
Thr Arg Gly Ile Arg Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 27B6抗体的VL-CDR1
<400> 9
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 27B6抗体的VH-CDR2
<400> 10
Tyr Thr Ser
1
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 27B6抗体的VH-CDR3
<400> 11
Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Arg Thr
1 5
<210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 27B6抗体的重链可变区
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Trp Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Asn Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Val Ser Ser Ser Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Ile Arg Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 27B6抗体的轻链可变区
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100 105
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4抗体的VH-CDR1
<400> 14
Gly Tyr Ser Tyr Thr Asp Tyr Asn
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4抗体的VH-CDR2
<400> 15
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr
1 5
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4抗体的VH-CDR3
<400> 16
Ala Arg Pro Ile Tyr Tyr Gly Val Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4抗体的VL-CDR1
<400> 17
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4抗体的VL-CDR2
<400> 18
Arg Met Ser
1
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4抗体的VL-CDR3
<400> 19
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4抗体的重链可变区
<400> 20
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ser Gln Gly Lys Ser Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Gly Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Ile Tyr Tyr Gly Val Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4抗体的轻链可变区
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自27B6抗体的肽
<400> 22
Gln Phe Leu Leu Thr Asn Asn Gly His Ser Val Lys
1 5 10
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自27B6抗体的肽
<400> 23
Trp Thr Tyr Phe Gly Pro Asp Gly Glu Asn Ser Trp Ser Lys
1 5 10
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自27B6抗体的肽
<400> 24
Gly Gln Glu Ala Phe Val Pro Gly Phe Asn Ile Glu Glu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Glu Arg
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自27B6抗体的肽
<400> 25
Tyr Lys Gly Gln Glu Ala Phe Val Pro Gly Phe Asn Ile Glu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Glu Arg
20
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自4B4抗体的肽
<400> 26
Glu Met Ile Asn Asn Phe Arg
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自4B4抗体的肽
<400> 27
Gly Val Ile Tyr Lys Pro Ala Thr Lys
1 5
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VH-CDR3
<400> 28
Ser Arg Pro Ile Tyr Tyr Gly Ala Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)
<223> X是P或S
<400> 29
Ala Ser Ser Xaa Val Thr Tyr
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> X是A、G或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)
<223> X是S、R、H、Q、D、E或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)
<223> X是A、V、I或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)
<223> X是P或S
<400> 30
Xaa Thr Ser Xaa Leu Xaa Xaa
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR3
<400> 31
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR1
<400> 32
Ala Ser Ser Pro Val Thr Tyr
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR1
<400> 33
Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr
1 5
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR2
<400> 34
Ala Thr Ser Ser Leu Ala Pro
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR2
<400> 35
Ala Thr Ser Ser Leu Val Ser
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR2
<400> 36
Gly Thr Ser Arg Leu Val Ser
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR2
<400> 37
Ala Thr Ser His Leu Val Ser
1 5
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR2
<400> 38
Gly Thr Ser Gln Leu Val Ser
1 5
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR2
<400> 39
Arg Thr Ser Asp Leu Ile Ser
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR2
<400> 40
Ala Thr Ser Glu Leu Met Ser
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR2
<400> 41
Gly Thr Ser Met Leu Ala Ser
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的VL-CDR2
<400> 42
Ala Thr Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 43
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH-人源化的框架 #1
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH-人源化的框架 #2
<400> 44
Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 45
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH-人源化的框架 #3
<400> 45
Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH-人源化的框架 #4
<400> 46
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 47
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL-人源化的框架 #1
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
20
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL-人源化的框架 #2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)
<223> X是Q或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)
<223> X是R或K
<400> 48
Met His Trp Tyr Xaa Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Xaa Pro Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL-人源化的框架 #2
<400> 49
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Pro Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL-人源化的框架 #2
<400> 50
Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 51
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL-人源化的框架 #3
<400> 51
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL-人源化的框架 #4
<400> 52
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 53
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的重链可变区
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Pro Ile Tyr Tyr Gly Ala Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的 #1 轻链可变区
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Pro Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Ser Leu Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 55
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的#2轻链可变区
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Ser Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 56
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的#8轻链可变区
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的#11轻链可变区
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser His Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 58
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的#15轻链可变区
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Gly Thr Ser Gln Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的#19轻链可变区
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Arg Thr Ser Asp Leu Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的#22轻链可变区
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Glu Leu Met Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 61
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的#25轻链可变区
<400> 61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Gly Thr Ser Met Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 62
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的#26轻链可变区
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Pro Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 63
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DNP004抗体的#30轻链可变区
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Ser Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (30)

1.抗CAXII抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包含VH-CDR 1、2、3和VL-CDR 1、2、3，并且所述抗体或抗体的抗原结合片段结合至氨基酸序列为SEQ ID NO:1或3的表位上，
所述VH-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列组成，所述VL-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:9、10和11的氨基酸序列组成；
所述VH-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:14、15和16的氨基酸序列组成，所述VL-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:17、18和19的氨基酸序列组成；
所述VH-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:14、15和28的氨基酸序列组成，所述VL-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:32、34和31的氨基酸序列组成；
所述VH-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:14、15和28的氨基酸序列组成，所述VL-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:33、35和31的氨基酸序列组成；
所述VH-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:14、15和28的氨基酸序列组成，所述VL-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:33、36和31的氨基酸序列组成；
所述VH-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:14、15和28的氨基酸序列组成，所述VL-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:33、37和31的氨基酸序列组成；
所述VH-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:14、15和28的氨基酸序列组成，所述VL-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:33、38和31的氨基酸序列组成；
所述VH-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:14、15和28的氨基酸序列组成，所述VL-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:33、39和31的氨基酸序列组成；
所述VH-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:14、15和28的氨基酸序列组成，所述VL-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:33、40和31的氨基酸序列组成；
所述VH-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:14、15和28的氨基酸序列组成，所述VL-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:33、41和31的氨基酸序列组成；或
所述VH-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:14、15和28的氨基酸序列组成，所述VL-CDR 1、2、3分别为由SEQ ID NO:32、42和31的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体进一步包含VH-框架序列，所述VH-框架序列包含SEQ ID NO:43至46的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体进一步包含VL-框架序列，所述VL-框架序列包含SEQ ID NO:47、48、51和52的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体进一步包含含有SEQ IDNO:48的氨基酸序列的VL-框架序列，所述VL-框架序列包含SEQ ID NO:49或50的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体包含VH-区氨基酸序列和VL-区氨基酸序列，所述VH-区氨基酸序列含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列，所述VL-区氨基酸序列含有选自由SEQ ID NO:54至63的序列组成的组的氨基酸序列。
8.抗CAXII抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CAXII抗体的每个CDR序列对应于以保藏号KCLRF-BP-00279或KCLRF-BP-00280保藏的杂交瘤产生的抗CA XII抗体的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
9.根据权利要求8所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体包含由以保藏号KCLRF-BP-00279或KCLRF-BP-00280保藏的杂交瘤产生的抗CAXII抗体的重链可变区和轻链可变区。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗CA XII抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段是所述抗CAXII抗体的scFv、(scFv)2、Fab、Fab'或F(ab')2。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或所述抗原结合片段与标记试剂、毒素或抗肿瘤剂偶联。
13.根据权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述标记试剂选自放射性同位素、半抗原、荧光材料和染料。
14.根据权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述标记试剂选自色原。
15.根据权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述毒素是放射性同位素。
16.根据权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中，部分或完全地除去与所述抗体或抗原结合片段结合的岩藻糖。
17.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗原结合片段结合至碳酸酐酶的非催化结构域。
18.一种载体，所述载体引入编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段的核酸分子，所述抗体或抗体的抗原结合片段结合碳酸酐酶的非催化结构域。
19.一种宿主，所述宿主表达根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗原结合片段结合碳酸酐酶的非催化结构域。
20.根据权利要求19所述的宿主，其中，所述宿主是杂交瘤细胞。
21.根据权利要求19所述的宿主，其中，所述宿主是以保藏号KCLRF-BP-00280或KCLRF-BP-00279保藏的杂交瘤细胞，并且所述杂交瘤细胞产生与碳酸酐酶的非催化结构域结合的抗体或其抗原结合片段。
22.一种用于缓解或治疗实体癌的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗原结合片段结合至碳酸酐酶的非催化结构域，
其中，所述实体癌是肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌或肾癌。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中，所述实体癌是三阴性乳腺癌。
24.根据权利要求22所述的药物组合物，其中，所述抗体或抗原结合片段进一步与毒素偶联。
25.根据权利要求24的药物组合物，所述药物组合物进一步包含抗癌化学药物或其他抗癌抗体。
26.根据权利要求25的药物组合物，其中，所述药物组合物与放射疗法一起施用。
27.一种用于检测实体癌的组合物，所述组合物包含权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗原结合片段结合至碳酸酐酶的非催化结构域，其中，如果样品显示对所述抗体或抗原结合片段的阳性反应，则所述样品被确定为实体癌，其中，所述实体癌是肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌或肾癌。
28.根据权利要求27所述的用于检测实体癌的组合物，其中，所述抗体或所述抗原结合片段与标记试剂偶联。
29.根据权利要求27的用于检测实体癌的组合物，其中，通过检测酶反应、发光或辐射来确定阳性反应。
30.根据权利要求27的用于检测实体癌的组合物，其中，通过检测荧光来确定阳性反应。
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