KR101130181B1 - 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 및 검출에 유용한 핵산분자, 폴리펩티드, 항체 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관여하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드, 및 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기한 핵산 분자, 폴리펩티드 및 항체를 사용하여 인플루엔자 바이러스 감염을 진단, 치료 및 예방하는 방법을 제공한다.

Description

인플루엔자 바이러스 감염의 치료 및 검출에 유용한 핵산 분자, 폴리펩티드, 항체 및 이를 포함하는 조성물{Nucleic acid molecules, polypeptides, antibodies and compositions containing same useful for treating and detecting influenza virus infection}

본 발명은 조류, 돼지 및 인간과 같은 척추동물에서 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 및 검출하는데 사용될 수 있는 핵산 분자, 폴리펩티드, 항체, 및 이들을 함유하는 약학조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 유사이래 인간의 사망과 이환의 주된 원인이 되어 왔다. 중증도는 크게 다르지만 고령자들에게서 더 높은 심각한 사망률 및 이환률을 노상 야기하는 인플루엔자 대유행은 일정한 간격으로 발생한다. 이 인플루엔자 감염은 두통, 기침, 열 및 전신권태를 비롯한 일련의 급성 증상을 초래한다. 선재(pre-existing) 폐 또는 심장 질환을 앓고 있는 심각한 상태 또는 상황인 경우에는 입원이 필요하다. 직접적인 바이러스성 감염에 의하거나 이차적인 세균 또는 바이러스 침입에 의한 폐렴이 가장 빈번하게 발생하는 합병증이다. 인플루엔자 바이러스 감염의 임상적 일면에 대한 재고에 관해서는 문헌[Douglas (1990) New England Journal of Medicine, 322: 443-450]을 참조하기 바란다.

인플루엔자 바이러스는 현재 체내 항원 단백질의 차이에 따라 세 가지 A형, B형 및 C형로 나뉘어지는데, A형과 B형은 밀접한 관련이 있고 대부분의 감염이 이들 A형과 B형에 의해 야기되는 반면, C형 인플루엔자 바이러스는 질병-유발 잠재성에서는 격원한 제 3 인자이고 아마도 공중보건과는 관련이 거의 없을 것이다. 비록 A형과 B형 사이의 전면적인 유전자 상동성은 30% 미만이지만, 이들 바이러스는 공통의 선조(ancestor)를 공유하며 음성 극성의 8 개 RNA를 포함한다. 헤마글루티딘(HA) 및 뉴라미니다제(NA)는 바이러스 입자를 함유하는 지질의 표면에서 발현하며, 인플루엔자 바이러스에서 관찰되는 항원 변화의 일차적 원인이 된다.

항원소변이에 의해 야기된 새로운 균주의 인플루엔자는 일정한 주기, 통상은 일년에 한번 출현하며, 전 세계로 이동하는 한 사이클의 감염을 시작한다. 개개의 대유행이 어떻게 개시되는 지에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 주요 신규 아형의 인플루엔자는 덜 빈번하게 나타나지만, 주로 범유행병을 초래할 수 있다.

인구의 20% 이하가 특정 해에 인플루엔자 감염에 걸릴 수 있고, 인플루엔자 대유행으로 인해 미국에서 매년 20,000명이 사망하는 것을 알 수 있을 것이다[Palese (2002) J. Clin. Invest. 110: 9-13]. 지난 100 년동안 인플루엔자의 가장 파국적인 영향은 단연 미국에 사는 50,000명 이상을 희생시켜 거의 10년까지 평균 수명을 낮춘 1918년의 범유행병이었다[Heilman (1990) Clin. North Am. 37: 669-688].

개인과 사회에 미친 인플루엔자의 영향때문에, 어린 아이들과 노령자와 같은 감염될 위험이 상당히 높은 대상에서 인플루엔자 감염을 예방하는데 사용될 수 있 는 매우 강력한 예방 수단을 생성하고자 하는 시도가 현재 이루어지고 있다.

신규한 항인플루엔자 제제를 밝혀내기 위해 여러 가지 시도가 착수되었다.

비활성화 인플루엔자 바이러스 백신 - 여러 가지 합병증의 위험이 있는 개체군에 대해 인플루엔자 바이러스를 처리하는 가장 효과적인 방법은 예방하는 것이다. 효과적이기 위해서, 현존하는 백신은 A형, B형 및 바람직하게는 C형 바이러스 성분을 함유해야 한다. 백신을 제조하기 위해, 바이러스 균주를 발육란에서 성장시킨 다음, 바이러스를 정제하고 화학적 비활성화에 의해 비감염성화시킨다. 입수가능한 인플루엔자 백신을 사용하면 개체군의 사망률을 낮추는데는 효과적이지만, 바이러스의 끊임없이 변화하는 성질때문에, 현재 순환하는 바이러스 균주를 방어하기 위한 조성물로서 백신을 개발하는 것은 복잡하고 비용이 많이 든다. 또한, 백신을 투여받는 환자의 순응력은 일반적으로 매우 낮다. 따라서, 인플루엔자 바이러스로부터 심각한 합병증의 위험이 있는 대다수의 환자를 보호할 수 없다.

저온적응 인플루엔자 바이러스 백신 - 동물 및 포유동물에서의 병원성이 백신을 크게 감독(減毒)화 하기 때문에, 온도에 민감한 인플루엔자 바이러스를 생백신으로서 제조하는 것이 시도되었다[Wareing (2001) Vaccine 19: 3320-3330; Maasab (1990) Adv. Biotechnol. Processes 14: 203-242]. 전형적으로, 저온적응 바이러스를 제조하기 위해서는 인플루엔자 바이러스를 치킨(chicken)의 콩팥 세포 및 발육란에 접종하여 25℃에서 성장시킨다. 따라서, 매년 적용된 백신 제제는 현 균주에서 발견된 항원을 반영하여(reflecting) 바이러스 표면 항원을 주로 코딩하는 2 개의 유전자(즉, HA와 NA)를 포함하도록 유전자공학에 의해 합성될 수 있는 반면, 나머지 6 개의 유전자는 저온적응 마스터 균주로부터 유도될 수 있다. 이러한 생바이러스 백신은, 화학적으로 비활성화된 바이러스 제제에 의해 도출되는 것보다 더 지속적이고 교차반응적 면역성을 가질 수 있는 국소 중화 면역 및 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러나, 생백신을 사용하기 위해서는 병독성 복귀 돌연 변이체의 확산으로부터 유발될 수 있는 예상치 못했던 합병증을 철저히 모니터하여야 하며, 이는 본질적으로 미국에서 이러한 요법을 허가하지 않는 이유를 설명하는 것이다.

유전자조작 인플루엔자 바이러스 생백신 - RNA 바이러스의 게놈에서 부위-특이성 변화를 설계하기 위한 기술의 출현으로 인해 신규한 백신 접근법을 개발하는 것이 가능하게 되었다[Enami (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3802-3805; Garcia-Sastre (1998) Trends. Biotechnol. 16: 230- 235]. 즉, 단지 단일 사이클의 복제를 거치는 바이러스 입자의 제조는 와탄베(Watanbe)와 동료들에 의해 입증되었다[(2002), J. Virol. 76: 767-773]. NEP 발현 유전자(NS2)를 결손시키는 바이러스 입자의 제제에 의한 세포의 감염은 바이러스 단백질을 생성하지만 감염성 입자를 생성하지는 않는다. 즉, 이들 제제는 방어 항체 반응을 유도하고 감염성 바이러스를 복제시키지 않으면서 강한 세포-매개 면역 반응을 촉진한다. 바이러스 감독화를 위한 다른 시도는 M2 유전자가 제거된 복제 결손주를 생성하는 것이다. 이러한 결손형 돌연변이주는 단지 마우스에서만 불량할 뿐 조직 배양에서 효과적으로 성장하므로, 따라서 강력한 생바이러스 백신 후보가 된다[Watanbe (2001) J. Virol. 75: 5656- 5662]. 그러나, 매번 이러한 조작된 바이러스의 감염가 (infectious titer)는 너무 낮아서 임상적으로 적용하기에는 유용하지 않다.

DNA 백신 - 이 접근법은 국소 투여 또는 하나 이상의 인플루엔자 단백질을 코딩하는 플라스미드 DNA의 주사(injection)를 통한 투여를 포함한다. 그러나, 지금까지 인플루엔자의 DNA 백신화에 대한 보고에는 동물 모델에서의 연구로 제한되었고, 인간 대상에서의 치료적 효능도 전혀 입증되지 않았다[Donnelly (1995) Nat. Med. 1: 583-587; Ljungberg (2000) 268: 244-25; Kodihalli (2000) Vaccine 18: 2592-2599].

항바이러스제 - 미국에서는 현재 4 가지의 항바이러스제가 허가되었다; 아만티딘(amantidine)과 리만티딘(rimantidine)은 바이러스 탈각(viral uncoating)에 관여하는 이온 채널 M2 단백질의 화학적 관련 억제제이고[Hay (1985) EMBO J 4: 3021-3024], 자나미비르(zanamivir)와 오셀타미비르(oseltamivir)는 세포막으로부터의 인플루엔자 바이러스 입자의 적정 방출을 억제하는 NA 억제제이다[Palese (1976) J. Gen. Virol. 33: 159-63]. 이들 항바이러스 약물은 인플루엔자에 대한 특정 의학적 중재를 위해 중요한 보조제이며, 바이러스의 방어에 사용될 수 있다(아직 승인되지 않은 자나미비르는 제외). 또한, 이들 제제는 새로운 범유행성 균주가 백신이 개발되지 않았을 때를 대비하여 나온 경우 상당히 가치가 있을 수 있다.

모든 이점에도 불구하고, 현재 이용가능한 항바이러스제의 폭넓은 사용은 부작용, 환자의 순응 및 약물-내성 변이체의 문제에 의해 제한되고 있다.

안티센스(antisense) - 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인플루엔자 바이러스를 억제하는 시도가 보고되었다. 라이터(Leiter)와 그의 동료는 인플루엔 자 A와 인플루엔자 C에 포스포디에스테르와 포스포로티오에이트를 표적시켰다[Leiter, J. , Agrawal, S. , Palese, P. & Zamecnik, P. C. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3430-3434 (1990)]. 이 연구에서, 폴리메라제 PB1 유전자와 mRNA는 각각 vRNA 3' 영역과 mRNA 5' 영역에서 표적되었다. 인플루엔자 C의 일부 특이적 억제는 언급된 바가 있지만, 인플루엔자 A의 서열-특이적 억제는 관찰되지 않았다. 그외의 어느 인플루엔자 바이러스 세그먼트 또는 mRNA도 표적되지 않았다.

따라서, 상기와 같은 제한점이 없이 인플루엔자 바이러스 감염을 진단 및 치료하는데 사용될 수 있는 조성물에 대한 필요성이 폭넓게 인식되고 있으며, 이러한 조성물을 가지는 것이 매우 유리할 것이다.

본 발명의 한 일면에 따라, 세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관여하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다.

이하에 기술된 본 발명의 바람직한 구체예에서의 추가의 특징에 따라, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 11 및 12로 구성된 그룹중에 선택된다.

기술된 바람직한 구체예에서의 다른 추가의 특징에 따라, 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드이다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 1의 아미노산 코디네이트 91-261에 의해 정의된 헤마글루티닌의 영역에 결합할 수 있다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리펩티드는 숙주 세포 폴리펩티드이다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 숙주 세포 폴리펩티드는 시알산(sialic acid) 수용체이다.

본 발명의 다른 일면에 따라, 인플루엔자 바이러스 감염을 억제할 수 있는 분자를 생성하는 방법이 제공되며; 이 방법은 (a) 다수의 핵산 분자를 세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관여하는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; (b) 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 핵산 분자로부터 적어도 하나의 핵산 분자를 확인하는 단계; 및 (c) 폴리펩티드에 결합할 수 있는 적어도 하나의 핵산 분자를 분리하여 인플루엔자 바이러스 감염을 억제할 수 있는 분자를 생성하는 단계를 포함한다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 본 방법은 (a) 단계 이전에 조합 합성법(combinatorial synthesis approach)을 사용하여 다수의 핵산 분자를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 본 방법은 (a) 단계 이전 또는 (c) 단계 이후에 다수의 핵산 분자를 변형시키는 단계를 추가로 포함한다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 본 방법은 (a) 내지 (c) 단계를 반복하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 일면에 따라, 세포의 인플루엔자 감염에 관여하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일면에 따라, 포장재(packaging material)와, 세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관여하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 활성성분으로서 가지며 상기 포장재내에 담겨지는 약학 조성물을 포함하는 제품이 제공된다.

본 발명의 추가적인 일면에 따라, 세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관여하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료학적 유효량의 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하여 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 것을 포함하여, 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.

기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따라, (i) 핵산 분자의 투여; 및/또는 (ii) 핵산 분자를 발현하는 폴리뉴클레오티드의 투여에 의해 대상에게의 제공된다.

본 발명에 따른 또 다른 추가적인 일면의 따라, 생체 시료에서 인플루엔자 바이러스를 확인하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 생체 시료를 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계; 및 (b) 생체 시료에서 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드에 결합한 핵산 분자를 검출하여 인플루엔자 감염을 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 추가적인 일면에 따라, 인플루엔자 바이러스로 감염된 조직에 항바이러스제를 표적시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자에 컨쥬게이트된(conjugated) 치료학적 유효량의 항바이러스제를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하여 인플루엔자로 감염된 조직에 항바이러스제를 표적시키는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 일면에 따라, 세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관여하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자에 컨쥬게이트된 항바이러스제를 포함하는 것의 조성물이 제공된다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드이다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리펩티드는 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, RNA-지향(RNA-directed) RNA 폴리메라제 핵심 단백질, M1 기질 단백질(matrix protein), M2 기질 단백질 및 NS 단백질로 구성된 그룹중에서 선택된다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 1의 아미노산 코디네이트 9-261에 의해 정의된 헤마글루티닌의 영역을 결합할 수 있다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리펩티드는 숙주 세포 폴리펩티드이다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 숙주 세포 폴리펩티드는 시알산 수용체이다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리뉴클레오티드 서열은 싱글 스트랜드이다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA이다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA이다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 핵산 분자는 검출가능한 표지(detectable label)를 추가로 포함한다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리뉴클레오티드 서열은 2'-플루오로 변성 뉴클레오티드를 포함한다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리뉴클레오티드는 길이가 10 내지 35 개의 뉴클레오티드인 것으로부터 선택된다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 약학조성물은 제제를 추가로 포함한다.

기술된 바람직한 구체예에서의 또 다른 추가의 특징에 따라, 상기 제제는 면역조절제, 항생제, 항바이러스제, 안티센스 분자 및 리보자임(rybosyme)으로 구성된 그룹중에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 인플루엔자 바이러스에 대한 백신화에 유용한 폴리펩티드를 제공하며, 이 폴리펩티드는 갭 생성 패널티(gap creation penalty)가 8이고 갭 확장 패널티(gap extension penalty)가 2인 스미스 앤드 워터맨 알고리즘(Smith and Waterman algorithm)을 이용하고, 위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin sequence analysis package)의 베스트피트 소프트웨어(BestFit software)를 사용하여 측정된 바, 서열번호: 13에 대해 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 인플루엔자 바이러스의 HA2 도메인을 포함하지 않는다.

본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 갭 생성 패널티가 8이고 갭 확장 패널티가 2인 스미스 앤드 워터맨 알고리즘을 이용하고, 위스콘신 서열 분석 패키지인 베스트피트 소프트웨어를 사용하여 측정된 바, 서열번호: 13에 대해 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함하며, 인플루엔자 바이러스의 HA2 도메인을 포함하지 않는 폴리펩티드, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 갭 생성 패널티가 8이고 갭 확장 패널티가 2인 스미스 앤드 워터맨 알고리즘을 이용하고, 위스콘신 서열 분석 패키지인 베스트피트 소프트웨어를 사용하여 측정된 바, 서열번호: 13에 대해 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 인플루엔자 바이러스의 HA2 도메인을 포함하지 않는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편이 제공된다.

본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 갭 생성 패널티가 8이고 갭 확장 패널티가 2인 스미스 앤드 워터맨 알고리즘을 이용하고, 위스콘신 서열 분석 패키지인 베스트피트 소프트웨어를 사용하여 측정된 바, 서열번호: 13에 대해 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 인플루엔자 바이러스의 HA2 도메인을 포함하지 않는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 갭 생성 패널티가 8이고 갭 확장 패널티가 2인 스미스 앤드 워터맨 알고리즘을 이용하고, 위스콘신 서열 분석 패키지인 베스트피트 소프트웨어를 사용하여 측정된 바, 서열번호: 13에 대해 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함하며, 인플루엔자 바이러스의 HA2 도메인을 포함하지 않는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물(construct)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.

본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 갭 생성 패널티가 8이고 갭 확장 패널티가 2인 스미스 앤드 워터맨 알고리즘을 이용하고, 위스콘신 서열 분석 패키지인 베스트피트 소프트웨어를 사용하여 측정된 바, 서열번호: 13에 대해 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 인플루엔자 바이러스의 HA2 도메인을 포함하지 않는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 갭 생성 패널티가 8이고 갭 확장 패널티가 2인 스미스 앤드 워터맨 알고리즘을 이용하고, 위스콘신 서열 분석 패키지인 베스트피트 소프트웨어를 사용하여 측정된 바, 서열번호: 13에 대해 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 인플루엔자 바이러스의 HA2 도메인을 포함하지 않는 치료학적 유효량의 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하는 것을 포함하여, 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 갭 생성 패널티가 8이고 갭 확장 패널티가 2인 스미스 앤드 워터맨 알고리즘을 이용하고, 위스콘신 서열 분석 패키지인 베스트피트 소프트웨어를 사용하여 측정된 바, 서열번호: 13에 대해 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 인플루엔자 바이러스의 HA2 도메인을 포함하지 않는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항원 결합 부위를 가진 치료학적 유효량의 항체 또는 항체 단편을 이를 필요로 하는 대상에게 제공하는 것을 포함하여, 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 생체 시료에서 인플루엔자 바이러스를 확인하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 갭 생성 패널티가 8이고 갭 확장 패널티가 2인 스미스 앤드 워터맨 알고리즘을 이용하고, 위스콘신 서열 분석 패키지인 베스트피트 소프트웨어를 사용하여 측정된 바, 서열번호: 13에 대해 적어도 60% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 인플루엔자 바이러스의 HA2 도메인을 포함하지 않는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항원 결합 부위를 가진 항체 또는 항체 단편과 생체 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 생체 시료에서 항체 또는 항체 단편을 가진 면역복합체(immunocomplex)를 검출하여 생체 시료에서 인플루엔자 바이러스를 확인하는 단계를 포함한다.

기술된 바람직한 구체예에서 또 다른 추가의 특징에 따라, 폴리펩티드는 서열번호: 13-15에 나타낸 바와 같다.

기술된 바람직한 구체예에서 또 다른 추가의 특징에 따라, 아미노산 서열은 서열번호: 13-15에 나타낸 바와 같다.

기술된 바람직한 구체예에서 또 다른 추가의 특징에 따라, 아미노산 서열은 서열번호: 1의 아미노산 코디네이트 91-261에 의해 정의된다.

기술된 바람직한 구체예에서 또 다른 추가의 특징에 따라, 아미노산 서열은 서열번호: 1의 아미노산 코디네이트 116-261에 의해 정의된다.

기술된 바람직한 구체예에서 또 다른 추가의 특징에 따라, 아미노산 서열은 서열번호: 1의 아미노산 코디네이트 116-245에 의해 정의된다.

기술된 바람직한 구체예에서 또 다른 추가의 특징에 따라, 항체 또는 항체 단편은 표지를 추가로 포함한다.

기술된 바람직한 구체예에서 또 다른 추가의 특징에 따라, (b) 단계 이후 표지 세기(intensity)의 정량화에 의해 면역복합체가 검출된다.

본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 서열번호: 11 또는 12에 나타낸 바와 같은 핵산 분자가 제공된다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염을 진단 및 치료하는데 사용될 수 있는 핵산 분자, 폴리펩티드, 이에 대해 제조된 항체 및 이를 함유하는 조성물을 제공함으로써, 현재 공지된 구조(configuration)의 단점을 성공적으로 해결한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에 있는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기술된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 아래 기술된다. 불일치한 경우에, 정의를 비롯한 특허 명세서는 콘트롤할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 설명을 위한 것일 뿐, 제한하고자 의도된 것이 아니다.

본 발명은 첨부된 도면과 관련하여 단지 일례로서 여기에 기술된다. 도면과 관련하여 상세하게는 도시한 도면은 일례로서, 단지 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 원리 및 개념적 양상을 가장 유용하고 쉽게 이해할 수 있게 설명하도록 하기 위해 나타낸다. 이 점에서, 본 발명을 근본적으로 이해하는데 필요한 설명 보다 더 상세하게 본 발명을 구조적으로 설명하고자 하는 시도는 이루어지지 않았지만, 도면에 의한 설명은 본 발명의 일부 형태가 실제로 어떻게 구체화될 수 있는지를 당업자들에게 명백하게 한다.

도면에서,

도 1a-c는 본 발명의 핵산 분자에 혼입될(incorporated) 수 있는 핵산 변형(modification)을 설명하는 문헌[Eaton (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 10-16]으로부터 개작한 개략도이다. 도 1a는 5번 위치가 변형된 우리딘 및 2'-데옥시우리딘이다. 도 1b는 8번 위치가 변형된 구아노신, 아데닌 및 2'-데옥시아데닌이다. 도 1c는 2'-변형된 우리딘이다.

도 2a-b는 ELISA에 의해 측정된 인플루엔자 완전(intact) 바이러스 또는 HA_91-261 펩티드에 대한 본 발명의 교시에 따라 생성된 인플루엔자 특이 압타머(압타 머)(A21 및 A22) 및 대조군 싱글 스트랜드 압타머의 결합 레벨(binding level)을 나타내는 히스토그램이다. 대조군 핵산에 비해 바이러스 펩티드에 대한 A21 및 A22의 상당히 강한 결합이 주목할 만하며(p=0. 042 및 p=0. 0008), 완전 바이러스에 대한 A21의 결합은 A22 압타머에 비해 상당히 감소하였음(p=0. 017)을 주목하기 바란다.

도 2c-e는 A22 압타머(도 2c), A21 압타머(도 2d) 및 NP 147-158을 코딩하는 대조군 올리고뉴클레오티드(도 2e)의 DNAdraw 소프트웨어(18)에 의해 생성된 이차 구조물의 개략도이다.

도 3a는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 (MTT) 에세이를 사용하여 측정된 인플루엔자 바이러스 처리 MDCK 세포의 생육성에 대한 본 발명의 A22 압타머의 영향을 나타내는 용량 반응 곡선이다. 최고의 방어 효과는 50 내지 100 pmole의 농도 범위에서 A22를 사용하는 경우 달성되었음을 주목하기 바란다.

도 3b는 H3N2 및 H2N2로 감염된 MDCK 세포에 대한 본 발명의 A21 및 A22 압타머(각각 50 pmole에서)의 방어 효과를 나타내는 히스토그램이다.

도 3c는 MTT 에세이에 의해 측정된 숙주 세포 단백질과는 독립적인 A22의 세포 방어 효과를 도시한 히스토그램이다. MDCK 세포는 지정된 시간동안 50 pmole의 A22로 처리하고 60분후에 인플루엔자 바이러스와 인큐베이션시켰다. 처리군과 대조군 사이의 차이는 근소하였다(30 분동안 p=0. 237 및 60 분동안 p=0. 09). 마찬가지로, 두 인큐베이션 시간 사이의 세포 생육성(cell viability)의 유의차는 뚜렷하 지 않았다(p>0. 05).

도 3d는 MTT 에세이에 의해 측정된 감염 MDCK 세포에 대한 A22의 방어 효과를 나타낸 히스토그램이다. MDCK 세포는 50 pmole A22로 60분간 처리하기 전에 30분 또는 60분간 인플루엔자 바이러스와 인큐베이션시켰다. 60분 바이러스 처리 MDCK 세포에 대한 A22의 효과는 미미하였지만, 30분 바이러스 처리 MDCK 세포에 대한 A22의 방어 효과는 비-감염 세포에 비해 두드러졌다.

도 4a-f는 인플루엔자에 의한 세포 감염에 대한 A22의 효과를 나타낸 현미경사진이다. 도 4a-c는 인플루엔자 감염후의 MDCK 세포(도 4a), A22로 전처리한 후의 MDCK 세포(도 4b) 또는 감염되지 않은 MDCK 세포의 광학현미경 사진이다. 도 4d-f는 인플루엔자 바이러스와 인큐베이션시킨 2일후(도 4d), 인플루엔자 바이러스와 A22와 인큐베이션시킨 2일후(도 4e), 또는 A22 단독 인큐베이션시킨 2일후(도 4f)의 MDCK 세포의 면역형광 사진이다.

도 5a-f는 A22의 존재 또는 부재하에 인플루엔자 바이러스로 감염된 BALB/c 마우스의 폐 부분을 나타내는 현미경사진이다. 다양한 처리 그룹의 마우스를 인플루엔자 바이러스로 비강내 접종한 후 6일째에 희생시키고, 그것의 폐를 소량 제거하여, 조직검사를 위해 10% 중화 포르말린 완충액에 넣었다. 해마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 도 5a는 감염되지 않은 마우스의 폐 부분이고; 도 5b는 인플루엔자 바이러스로 감염된 마우스의 폐 부분이며; 도 5c는 바이러스 감염 하루 전 A22 압타머로 처리한 '-1일' 그룹 마우스의 폐 부분이고; 도 5d는 바이러스 감염과 동시에 A22로 처리한 '0일' 그룹 마우스의 폐 부분이며; 도 5e-f는 감염후 2일째 A22 로 처리한 '+2일' 그룹 폐의 다른 두 부분이다. 도 5f의 패턴에 상응하는 마우스 폐의 약 60%는 감염되지 않은 대조군의 조직과 유사한 반면, 폐의 40%는 단핵세포가 크게 확장된 것으로 평가된다(도 5e).

도 6a-b는 체중(도 6a) 및 바이러스 양(도 6b)으로 측정한 인플루엔자 바이러스로 감염된 마우스에 대한 A22의 방어 효과를 나타낸 그래프이다. 마우스를 비강내 접종에 의해 100 HAU A/Poart Chalmers/1/73로 감염시켰다. -1일 그룹은 바이러스 접종 1일 전 2. 5 nmole A22로 처리한 마우스이다. +2일 그룹은 바이러스 접종하고 2일후 2. 5 nmole A22로 처리한 마우스이다. '0일 그룹'은 바이러스 접종과 동시에 A22로 처리한 마우스이다. 감염되었지만 처리하지 않은 마우스의 체중을 시간 간격동안 A22으로 처리한 마우스의 체중과 비교하였다(도 6a). 또한, A22의 방어능을 폐의 바이러스 양을 측정함으로써 조사하였다(도 6b).

도 7a는 A22 압타머를 사용하여 여러 개의 인플루엔자 균주(각각 10 HAU에서)에 의한 마우스 감염의 억제를 나타내는 그래프이다.

도 7b는 본 발명의 A21와 A22 압타머, 및 대조군 올리고뉴클레오티드와 항-인플루엔자 약물 오셀타미비르를 사용하여 A/Texas/1/77 인플루엔자 균주에 의한 마우스 감염의 억제를 나타내는 그래프이다.

도 8a-e는 ELISA에 의해 측정한, 다양한 인플루엔자 바이러스 균주를 가진 재조합 HA_91-261 단편에 대한 항체의 교차-반응 효과를 나타내는 그래프이다. IgG 레벨을 면역화(●) 및 비면역화(○) 마우스의 혈청 시료에서 ELISA에 의해 측정하였 다. 도 8a는 Port Chalmeras/1/73로 감염된 마우스이고; 도 8b는 PR/8/34로 감염된 마우스이며; 도 8c는 Texas/1/77로 감염된 마우스이고; 도 8d는 Japanese/57로 감염된 마우스이며; 도 8e는 완전 A/Texas/1/77(◇), A/Port Chalmers/1/73(△), A/PR/8/34(○) 및 A/Japanese/57(×) 바이러스에 의해 유도된 주특이성 면역 반응을 나타낸다.

도 9a는 Ni-NTA 칼럼으로 정제한 HA_91-108의 SDS-PAGE 분석을 나타내는 현미경사진이다. 여기서, M은 분자량 마커(marker)이고; 1은 10㎍의 HA_91-108 펩티드이며; 2는 20㎍의 HA_91-108 펩티드이다.

도 9b는 ELISA 에세이에 의해 측정한 HA_91-108 펩티드의 항원성을 나타내는 그래프이다. HA_91-261 펩티드를 ELISA 플레이트에 코팅시키고, HA_91-108 펩티드(■) 또는 완전 A/Texas/77 인플루엔자 바이러스(○)에 대해 래빗 항혈청과 반응시켰다. 항혈청이 없는 대조군은 *으로 표시하였다.

도 10a-b는 ELISA 에세이에 의해 측정된 본 발명에 따른 HA_91-261 펩티드의 면역원성을 나타내는 그래프이다. 비강내로(▲) 또는 발바닥으로(foot pad)(◆) 또는 상기 펩티드에 상응하는 DNA 백신(●)에 의해 HA_91-261 펩티드로 면역화시킨 마우스의 혈청 희석액을 HA_91-261 펩티드(도 10a) 또는 완전 바이러스(도 10b)로 코팅한 마이크로티터 플레이트와 접촉시키고, ELISA 에세이를 실시하였다. DNA 초회감작(priming)-단백질 추가접종(boosting)에 의해 면역화된 마우스의 혈청을 ■으로 표 시하였고, 면역화되지 않은 마우스의 혈청은 *으로 표시하였다. 공 벡터(empty vector) pCDNA3. 1로 면역화된 마우스의 혈청은 ○으로 표시하였다.

도 10c는 다중 인플루엔자 바이러스 균주와 항 HA_91-261 펩티드의 교차 반응성을 나타내는 히스토그램이다.

도 11a-b는 폐 균질물의 ELISA 에세이에 의해 측정된, HA_91-261 펩티드(▲) 또는 DNA 백신(■)에 의한 마우스의 비강내 면역화후, 본 발명의 HA_91-261 펩티드(도 11a) 또는 A/Texas/77 바이러스(도 11b)와 반응하는 IgA 항체의 생성률을 나타내는 그래프이다. 조합 DNA 초회감작-단백질 단편 추가접종한 것은 ■으로 표시하였고, 면역화되지 않은 대조군 마우스는 *으로 표시하였다. 벡터 pCDNA3. 1로 면역화된 대조군은 □으로 표시하였다.

도 12a-b는 HA_91-261 펩티드(도 12a) 또는 바이러스 입자(도 12b)에 의한 시험관내 자극에 대한 반응으로 HA_91-261 DNA 및/또는 펩티드로 초회감작시킨 마우스의 지라 세포의 증식을 나타내는 히스토그램이다. 증식은 티미딘 섭취율에 의해 모니터하였고, 대조군 배지에 대한 자극 지수(Stimulation Index)로서 나타내었다.

도 13a-b는 인플루엔자 바이러스 자극에 대한 반응으로 지라 세포에 의한 시토카인 분비를 나타낸다. 마우스는 3주 간격으로 3회 면역화킨 다음, 마우스의 지라 세포를 회수하여 비활성화 인플루엔자 바이러스로 시험관내에서 자극하였다. 정제된 시토카인의 표준 곡선 비교에 의해 정량화된 평균 시토카인 농도를 나타내었 다.

도 14a-b는 본 발명의 펩티드 및/또는 DNA 백신으로 면역화시킨 마우스의 CTL 반응을 나타내는 히스토그램이다. BALB/c 마우스를 pHA_91-261 DNA 또는 펩티드로 면역화시키고, 바이러스-특이 CTL 활성에 대해 비세포(splenocyte)를 에세이하였다. 각 그룹에 대한 데이터는 작동체(effector) 대 표적의 비 20:1(도 14a) 및 50:1(도 14b)에서 ⁵¹Cr 표지된 표적 세포의 분해율에 의해 표시하였다.

도 15a-b는 본 발명의 pHA_91-261 DNA 또는 펩티드 작제물로 면역화시킨 아치사 인플루엔자 바이러스 시험감염 마우스에 대한 방어를 나타내는 히스토그램이다. 마우스를 최종 면역화하고 4주후에 시험감염시키고 5일후에 희생시켰다. 바이러스 존재에 대하여 각 그룹으로부터 폐 균질물의 10^-8 희석액을 적혈구응집 에세이(haemagglutination assay)에 의해 분석하였다. 결과를 10^-8 균질물 희석액(도 15a) 및 LogEID₅₀(도 15b)에서 각 그룹의 바이러스 양성 폐(%)로서 나타내었다. *는 통계학상의 유의차를 나타낸다(p<0. 05).

본 발명은 조류, 돼지 및 인간과 같은 척추동물에서 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 및 검출하는데 사용될 수 있는 핵산 분자, 폴리펩티드, 항체, 및 이들을 함유하는 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명의 원리 및 조작은 도면 및 첨부되는 발명의 상세한 설명에 의해 더 욱 이해될 수 있다.

본 발명의 적어도 하나의 구체예를 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명은 이후의 발명의 설명에 나타내었거나 실시예로서 예시된 항목으로 그의 적용이 제한되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 발명은 그 외에도 구체화할 수 있거나 다양한 방법으로 실행 또는 수행될 수 있다. 또한, 여기에 사용하는 표현 및 용어는 설명을 위한 것이지 제한하는 것으로서 간주되어서는 안되는 것으로 이해하여야 한다.

인플루엔자는 임상적 질환, 이환, 및 매년 유행병으로 인한 많은 경제적 손실을 초래하는 주된 공중 보건상의 문제이다. 지금까지, 인플루엔자 제어를 토대로 만든 백신화 전략은 고위험군 그룹의 사망률 및 이환률의 억제화쪽으로 향하고 있다. 그러나, 새로운 바이러스 균주를 출현시키는 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질(즉, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제)의 신속하고 예측불가능한 변화로 인해, 효과적인 백신의 개발이 복잡하고 비용이 많이 든다.

현재 입수가능한 항바이러스 약물은 바이러스 M2 이온 채널 차단제(blocker)인 아만티딘과 리만타딘 및 뉴라미니다제 차단제인 자나미비르(Relenza^TM)와 오셀타미비르(Tamiflu^TM)를 포함하며, 바이러스 입자의 방출(release) 및 출아(budding)를 억제한다. M2 이온 채널 차단제는 M2 단백질을 코딩하지 않는 B형 인플루엔자 바이러스에 대해 효과적이지 않으며 몇 가지 부작용 및 획득내성에 의해 제한되는 한편, 자나미비르의 사용은 기도저항과 연관되며, 오셀타미비르의 사용은 비용이 너무 든다.

상술된 바와 같이, 인플루엔자 바이러스는 2개의 표면 항원[뉴라미니다제와 헤마글루티닌(HA)]을 코딩하며, 이들은 점진적인 변화(즉, 항원대변이 및 항원소변이)를 거쳐 인플루엔자에서 높은 항원 변이를 일으킨다. HA 분자(75-80 kD, GenBank Accession No. AF092062, 서열번호: 1)는, 일부는 상이한 균주에서 서열 변화를 거치는 영역에 있고(즉, 주특이 결정기), 나머지는 많은 HA 분자들에 공통적인 영역에 있는(공통 결정기) 다수의 항원 결정기(determinant)를 가진 상이한 바이러스 균주의 혈청학적 특이성을 정의하는데 가장 중요한 항원이다.

본 발명의 실제 적용에서, 본 발명자들은 HA 폴리펩티드에서 보존 서열을 결합하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드(예, 압타머)가, 바이러스를 숙주 세포에 결합하는 것을 억제하는데 사용될 수 있음을 밝혀내었다. 이후 및 다음에 오는 실시부에서 설명되는 바와 같이, 본 발명은 어려운 실험을 거쳐 최초로 인플루엔자 바이러스 감염을 진단 및 치료하는데 사용될 수 있는 압타머 핵산 분자를 제공하였다. 이러한 압타머 분자는 바이러스 교차-반응성을 나타내며, 그 자체로 인플루엔자 바이러스의 만능(universal) 백신으로서 사용될 수 있다.

압타머는 관심대상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하도록 선택되고 특정 기능을 억제하는 3차 구조의 핵산 서열이다. 압타머 및 그의 작용 메카니즘에 대한 추가적인 설명이 문헌[Osborne, et al. , Curr. Opin. Chem. Biol. 1997, 1 (1) : 5-9; and Patel, D. J. , Curr. Opin. Chem. Biol. Jun. 1997; 1 (1): 32-46)]에 의해 제공된다.

즉, 본 발명의 하나의 일면에 따라, 세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관 여하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자가 제공된다.

세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관여하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 본 발명의 핵산 분자의 능력은 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 및 진단에 이를 사용하는 것을 가능케한다.

본원에 사용된 "세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관여하는 폴리펩티드"란 A-C형 인플루엔자 바이러스 균주를 비롯한 오르토믹소바이러스(orthomyxoviridea)에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 숙주 세포 폴리펩티드 또는 그의 펩티드 단편을 의미한다.

세포의 바이러스 감염에 관여하는 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드의 예로는 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, PB1, PB2 및 PBA를 비롯한 RNA-지향 RNA 폴리메라제 핵심 단백질, M1 및 M2 기질 단백질, 및 NS 단백질이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

인플루엔자 바이러스 감염에 관여하는 숙주 세포 폴리펩티드의 예로는 말단 N-아세틸 뉴라민산(NANA=시알산) 그룹을 가진 점액단백질, HLA 단백질 및 점막 당단백질 및 글리칸을 함유하는 세포내 단백질이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 핵산 분자의 특이성을 최대하고 그의 세포독성을 낮추기 위해, 이러한 일면의 본 발명의 폴리펩티드 표적은 바람직하게는 바이러스임이 이해될 것이다. 따라서, 바람직한 폴리펩티드 표적 서열은 A-C형 인플루엔자 바이러스에 의해 공유되는 보존 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 서열을 결합하도록 생성 된 핵산 분자는 만능 백신으로서 사용될 수 있다.

보존 바이러스 펩티드 표적의 예가 아래 표 1에 제공된다.

표 1 - 바이러스 펩티드 표적

인플루엔자 바이러스 단백질(아미노산 코디네이트)	펩티드 서열	서열번호	참고문헌
HA (91-108)	Ser-Lys-Ala-Phe-Ser-Asn-Cys-Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Leu	2	미국특허 제 4,474,757호
HA (306-318)	Pro-lys-tyr-val-lys-gln-asn-thr-leu-lys-leu-ala-thr	3	Rothbard (1998) Cell (306-318) 52 (4): 515-23
HA (305-323)	Cys-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-Met-Arg-Asn-Val	4	Rothbard (1998) Cell (305-323) 52 (4): 515-23
NP (335-350)	Ser-Ala-Ala-Phe-Glu-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Phe-Ile-Arg-Gly-Tyr	5	Dyer and Middleton (335-350) Histocompatability testing, a practical approach Ed. Rickwood and Hames IRL Press Oxford (1993); Gulukota (1996) Biomolecular Engineering 13:81
NP (380-393)	Glu-Leu-Arg-Ser-Arg-Tyr-Trp-Ala-Ile-Arg-Thr-Arg-Ser-Gly	6	Dyer and Middleton (380-393) Histocompatability testing, a practical approach Ed. Rickwood and Hames IRL Press Oxford (1993); Gulukota (1996) Biomolecular Engineering 13:81
M1 (220-236)	Gly-Thr-His-Pro-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Leu-Lys-Asn-Asp-Leu-Leu-Glu-Asn	7	미국특허 제5,243,030호
M1 (79-104)	Phe-Val-Gln-Asn-Ala-Leu-Asn-Gly-Asn-Gly-Asp-Pro-Asn-Asn-Met-Asp-Arg-Ala-Val-Lys-Leu-Tyr-Arg-Lys-Leu-Lys	8	미국특허 제 5,243,030호
M1 (64-80)	Phe-Thr-Leu-Thr-Val-Pro-Ser-Glu-Arg-Gly-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Phe-Val	9	미국특허 제 5,243,030호
M1 (149-169)	Ala-Thr-Cys-Glu-Gln-Ile-ala-Asp-Ser-Gln-His-Arg-Ser-His-Arg-Gln-Met-Val-ala-Thr-Thr	10	미국특허 제 5,243,030호

이러한 일면의 본 발명에 따른 핵산 분자는 상술한 폴리펩티드-표적에 특이적으로 결합할 수 있는 싱글 스트랜드 또는 더블 스트랜드 DNA 또는 RNA 분자, 또는 그의 임의의 변형을 의미한다. 이러한 일면의 본 발명에 따른 핵산 분자는 "압타머"로서 서로 혼용가능하다.

전형적으로, 이러한 일면의 본 발명에 따른 핵산 분자는 그 길이가 다양하다(예컨대 10-100개 염기). 경제, 제조 및 치료 문제, 예컨대 생체이용률(즉, 내성 감소 및 세포 흡수율 증가)을 위해, 짧은 길이의 핵산 분자(예, 10-35개 염기)가 바람직하게 사용되는 것이 이해될 것이다.

이러한 일면의 본 발명에 따른 현재 공지된 구체예에 따라, 핵산은 서열번호: 11 및 12에 나타낸 것들(즉, A21 및 A22)이 바람직하다.

상기 언급한 바와 같이, 이러한 일면의 본 발명에 따른 핵산 분자는 바람직하게는 표적 펩티드에 대한 효능을 개선시키고 생체이용률을 향상시키도록 변형된다. 변형물은 핵산 염기 또는 전체 분자에 추가의 전하, 분극률, 수소결합, 정전상호작용 및 유동성을 연계시키는 화학 그룹을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 첨가 또는 변형된 화학 그룹은 폴리펩티드 표적의 토폴로지(topology)에 순응하는 배좌 유동 결합(conformationally flexible linkage)을 포함하도록 선택된다. 또한, 이러한 일면의 본 발명에 따른 핵산 분자의 변형에 대한 화학적 성질이 트리포스페이트(NTP) 또는 포스포르아미다이트 합성의 원인이 된다는 것을 평가하였다.

즉, 예를 들어 이러한 일면의 본 발명에 따른 핵산 분자는 표적 폴리펩티드에 특이적 가교결합(cross-linking)을 가능케하여 고친화력의 화합물을 형성하는 변형물을 포함한다.

부가된 가교결합 그룹은 소수성, 친수성 또는 하전 기능을 가질 수 있다. 가교결합은 α,β-불포화 카보닐 링커에 대한 공역 부가에 의해서 뿐만 아니라 이민, 아세탈, 에스테르 및 디설파이드 결합의 형성에 의해 수행될 수 있다. 비닐과 같은 작은 소수성 작용 그룹(그룹 1, 도 1a), 피레닐과 같은 큰 소수성 작용 그룹(그룹 13-14, 도 1a) 및 다양한 등급의 측쇄 소수성을 가진 카보닐 화합물(그룹 3, 6-11, 도 1a)을 포함하는, 포스포르아미다이트 합성에 적합한 2'-데옥시우리딘 뉴클레오시드의 예를 도 1a에 도시하였다.

피리미딘 염기 변형물, 예컨대 5 위치 RNA 우리딘 뉴클레오시드 변형물은 DNA 또는 RNA 핵산 분자에 결합될 수 있는, 케톤[그룹 17, 18, 도 1a, Crouch (1994) Nucleosides Nucleotides 13: 939-944], 아미드[그룹 24, 27, 도 la, Dewey (1995) J. Am. Chem. Soc. 117: 8474-8475] 등의 형태로 컨쥬게이트될 수 있다. 아미드가 압타머에 대한 수소 결합능을 제공할 수 있는 것이 인지될 것이다. 어떤 경우에, 상술한 바와 같이 가교결합 카보닐 그룹은 우리딘의 5-위치(그룹 15-18, 도 1a)에 결합될 수 있다. 카보닐 링커의 예상 반응성은 표적 폴리펩티드의 계면에 따라 크게 다를 수 있음이 인지될 것이다.

퓨린 변형물의 예를 도 1b에 도시하였다. 예를 들어, 소수성 치환체는 RNA 또는 DNA 퓨린 뉴클레오시드의 8-위치에 부착될 수 있다(그룹 28-30, 도 1b). 입체장해의 정도는 아미딘 결합에 따라 변할 수 있다(그룹 31, 33, 34, 37 및 38, 도 1b). 친수성(그룹 35, 도 1b) 및 하전(그룹 36 및 39, 도 1b) 그룹은 퓨린 뉴클레 오시드의 8-위치에 부가될 수 있다. 표적 폴리펩티드에 대한 친화력이 공지된 작용 그룹은 퓨린 염기의 8-위치, 예컨대 비오틴화 뉴클레오시드(그룹 40, 도 1b)에 부착될 수 있음이 이해될 것이다.

변형물에 대한 추가 부위로는 RNA의 2'-위치, 및 RNA와 DNA의 포스포디에스테르가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 문헌[Sebesta (1996) Tetrahedron 52: 14385-14402; McGee (1996) Tetrahedron Lett. 37: 1995-1998; McGee (1996) J. Org. Chem. 61: 781-785]에 따르면, 2'-위치 피리미딘 뉴클레오시드 변형이 효과적일 수 있다. 본래, 아민 링커, 예컨대 하이드록실 아민 링커는 토폴리지가 다른 소수성 그룹(그룹 41-43도 1c), 친수성 그룹(그룹 45 및 47, 도 1c) 및 표적 폴리펩티드에 대해 특이적 친화력을 나타내는 그룹(그룹 45, 도 1c)을 부착하는데 사용될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 이러한 일면의 본 발명에 따른 핵산 분자는 또한 그의 생체이용률을 증가시키도록 변형될 수 있다. 이후의 설명은 이러한 변형에 대한 비한정적인 예이다.

이러한 일면의 본 발명에 따른 핵산 분자는 3' 내지 5' 포스포디에스테르 결합으로 결합된 피리미딘 염기 및 퓨린으로 구성된 헤테로사이클릭 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.

바람직하게 사용되는 핵산 분자는 이후 폭넓게 설명되는 백본(backbone), 인터뉴클레오시드(internucleoside) 결합 또는 염기가 변형된 것들이다. 이러한 변형물은 종종 세포내 조건에 대한 내성 및 올리고뉴클레오티드 섭취율을 높힌다.

합성 화학의 어레이는 NTP 또는 포스포르아미다이트 시약으로 전환될 수 있는 뉴클레오시드의 변형에 이용가능하다. 추가의 상세한 설명은 문헌[Eaton and Pieken (1995) Annu. Rev. Biochem. 64: 837-863]을 참조하기 바란다.

이러한 일면의 본 발명에 따른 유용한 핵산 분자의 구체적인 예로는 변형된 백본 또는 비자연적 인터뉴클레오시드 결합을 가진 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 변형된 백본을 가진 올리고뉴클레오티드는 미국특허 제 4,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361 및 5,625,050호에 개시된 바와 같이 백본에 인원자를 보유하는 것들이 포함된다.

바람직한 변형 핵산 백본으로는 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬 포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 그외의 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 노멀 3'-5' 결합을 가진 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 결합 유사체, 및 인접쌍의 뉴클레오시드 단위가 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2' 결합되는 반전 극성(inverted polarity)을 가진 것들이 포함된다.

또한, 인 원자를 포함하지 않는 변형 핵산 백본은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 결합, 복합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 인터뉴클레오시드 결합에 의해 형성된 백본을 가진다. 이들로는 미국특허 제 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 및 5,677,439호에 개시된 바와 같이, 모르폴리노 결합(뉴클레오시드의 당 부분에 부분적으로 형성됨); 실록산 백본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알킨 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 N, O, S 및 CH₂ 성분이 혼합된 그 외의 것들이 포함된다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 그 외의 핵산 분자는 당과 인터뉴클레오시드 결합 모두가 변형된, 즉, 뉴클레오티드 단위의 주쇄가 신규한 그룹으로 대체된 것들이다. 염기 단위는 적절한 폴리뉴클레오티드 표적과의 상보성을 위해 유지된다. 이러한 핵산 서열 유사물질의 예로는 펩티드 핵산(PNA)이 포함된다. PNA 올리고뉴클레오티드는 당-백본이 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 염기는 그대로 남아 백본의 아미드 부분의 아 자 질소원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 미국특허로는 미국특허 제 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262호가 포함되나 이에 한정되지 않으며, 이들 특허문헌은 각각 본원에 참고로서 포함된다. 본 발명에 사용될 수 있는 다른 백본 변형물이 미국특허 제 6,303,374호에 개시되어 있다.

본 발명의 핵산 분자는 또한 염기 변형물 또는 치환체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "변형되지 않은" 또는 "천연" 염기로는 퓨린 염기인 아데닌(A)와 구아닌(G), 및 피리미딘 염기인 티미딘(T), 시토신(C)과 우라실(U)이 포함된다. 변형 염기로는 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 그외의 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 그외의 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로 우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신, 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 그외의 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 그외의 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 합성 및 천연 염기가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 추가의 염기로는 미국 특허 제 3,687,808호에 개시된 것들, 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I. , ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 문헌[ Englisch et al. , Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것들 및 문헌[Sanghvi, Y. S. , Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B. , ed. , CRC Press, 1993]에 개시된 것들이 포함된다. 이러한 염기는 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화력을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들로는 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 비롯한 N-2, N-6 및 0-6 치환 퓨린이 포함된다. 5-메틸시토신 치환체는 0. 6-1. 2C까지 핵산의 안정성을 2배로 증가시키는 것으로 나타났고[Sanghvi YS et al. (1993) Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton 276-278], 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형물과 결합된 경우 현재 더욱더 바람직한 염기 치환체이다.

본 발명의 핵산 분자의 다른 변형물은 활성, 세포 분포율 또는 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수율을 향상시키는 하나 이상의 부분 또는 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 결합시킨다. 이러한 부분으로는 미국특허 제 6,303,374호에 개시된 바와 같이, 지질 부분, 이를테면 콜레스테롤 부분, 콜산, 티오에스테르, 예, 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족쇄, 예, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예, 디-헥사데실-rac-글리콜 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥시데실-rac-글리세로-3-H-포스페이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 부분, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 부분이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

올리고뉴클레오티드 분자의 모든 위치가 불균일하게 변형될 필요는 없고, 사실 상기 언급된 변형물중 하나 이상은 단일 화합물 또는 심지어 올리고뉴클레오티 드내의 단일 뉴클레오시드에 혼입될 수 있다.

뒤에 오는 실시부에서 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 핵산 분자가 결정적으로 시험관내 및 생체내에서 세포의 인플루엔자 바이러스 감염을 억제할 수 있음을 나타내었다. 또한, 바이러스 시험감염후 바이러스 확산을 억제하는 본 발명에 따른 핵산 분자의 능력에 의해 항-인플루엔자 예방 및 치료 적용에 본 발명의 핵산 분자를 사용하는 것이 가능해졌다.

즉, 본 발명의 다른 일면에 따라, 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 방법이 제공된다.

본원에 사용된 용어 "치료하는"것은 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하거나 인플루엔자 바이러스 감염과 연관된 증상을 실질적으로 감소(즉, 경감 또는 약화)시키는 것을 의미한다.

이 방법은 치료학적 유효량의 상술된 본 발명의 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 달성된다.

본원에 사용된 "이를 필요로 하는 대상"은 인플루엔자-바이러스 연관 증상으로부터 고통받고 있거나 인플루엔자에 걸릴 위험이 있는 대상을 의미한다. 이러한 대상의 예로는 65세 이상의 사람; 요양시설 및 다른 만성질환 치료 시설의 거주하는 몇 가지 형태의 빈혈, 면역억제, 당뇨병, 심장, 폐 또는 신장의 만성 질환을 가진 사람, 아스피린 치료를 받고 있고 인플루엔자 감염후 라이증후군으로 발전될 위험이 있는 어린이나 10대, 및 고위험군과 가깝거나 자주 접촉하는 사람이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

바람직하게도, 본 발명의 핵산 분자는 0. 1-150 ㎍/㎏ 체중, 바람직하게는 1-100 ㎍/㎏ 체중, 더욱 바람직하게는 1-50 ㎍/㎏ 체중, 더욱더 바람직하게는 1-15 ㎍/㎏ 체중의 농도로 제공된다.

본 발명의 핵산 분자(즉, 활성성분)는 그 자체로, 또는 이것을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합한 약학조성물의 일부로서 대상에 제공될 수 있다.

본원에 사용된 "약학조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분과 본원에 기술된 하나 이상의 활성성분의 제제를 의미한다. 약학조성물의 목적은 유기체에 화합물의 투여를 촉진하는 것이다.

본원에 사용된 "활성성분"은 생물학적 효과가 있는 제제를 의미한다.

이후에서, 서로 혼용되게 사용될 수 있는 어구 "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않으며 투여된 화합물의 성질 및 생물활성을 파괴하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 애주번트가 이들 어구에 포함될 수 있다.

압타머의 활성은 그의 분자량과 직접적으로 서로 관련이 있기 때문에, 본 발명의 핵산 분자를 고분자량 담체에 컨쥬게이트하는 방법이 취해진다. 이러한 고분자량 담체로는 유기 및 수성 매질 모두에 대해 광범위한 용해도를 가진 생체적합성 폴리머인 폴리알킬렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)가 포함되나 이에 한정되지 않는다(Mutter 등 (1979)).

또한, 마이크로캡슐 또는 양이온성 지질과 같은 미립자가 본 발명의 이러한 일면의 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다.

본원에 사용된 "미립자"로는 합성 및/또는 천연 폴리머로부터 형성된 마이크로캡슐, 미세구, 비로솜 및 리포솜이 포함된다. 마이크로캡슐 및 미세구의 제조방법은 당업계에 공지되어 있으며, 용매 증발, 용매 캐스팅(casting), 분무 건조 및 용매 확장(extension)을 포함한다.

리포솜은 문헌[Kim et al. , Biochim. Biophys. Acta, 728: 339-348 (1983); Liu et al. , Biochim. Biophys. Acta, 1104: 95-101 (1992); and Lee et al. , Biochim. Biophys. Acta, 1103: 185-197 (1992); Wang et al. , Biochem. , 28: 9508-9514 (1989)]에 보고된 것과 같이 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 또한, 본 발명의 이러한 일면의 핵산 분자는 미립자내에 혼입될 수 있거나, 미립자 외면에 이온적으로 또는 공유적으로 결합될 수 있다.

양이온성 리포솜 또는 마이크로캡슐은 본 발명의 이러한 일면의 핵산 분자와 같이 양으로 하전된 이들 리포솜의 외부 표면에 이온적으로 결합할 수 있는 음전하 화합물을 전달하는데 특히 유용한 미립자이다. 다양한 양이온성 리포솜은 문헌[Felgner et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987); Felgner, Advanced Drug Delivery Reviews, 5: 163-187 (1990); Clarenc et al. , Anti-Cancer Drug Design, 8: 81-94 (1993)]에 보고된 바와 같이 핵산 또는 핵산-단백질 복합체를 세포에 시험관내 또는 생체내로 전달시 매우 효과적인 것으로 알려져 있다. 혼합물로부터 형성된 마이크로캡슐 또는 리포솜이 네트(net) 음으로 하전된 화합물을 이온적으로 결합하게 될 네트 양전하를 가지도록 충분한 양으로 양이온 사이드(side) 그룹을 갖는 하나 이상의 지질을 포함하는 혼합물을 사용하여, 양이온 성 리포솜 또는 마이크로캡슐을 제조할 수 있다. 양이온성 리포솜을 생성하는데 사용될 수 있는 양으로 하전된 지질의 예로는 양으로 하전된 일차 아미노 두부기(head group)을 가진 아미노리피드 디올레오일 포스파티딜 에탄올아민(PE); 일차 아민이 아닌 양으로 하전된 두부기를 가진 포스파티딜콜린(PC); 및 N[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리에틸암모늄이 포함된다["DOTMA", 문헌[Felgner et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84: 7413-7417 (1987); Felgner et al. , Nature, 337: 387-388 (1989); Felgner, Advanced Drug Delivery Reviews, 5: 163-187 (1990)]을 참조하기 바란다]).

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 이러한 일면의 약학조성물은 추가로 부형제를 포함할 수 있다. 용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 더욱 촉진하기 위해 약학조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당, 및 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 야채유 및 폴리에틸렌 글리콜의 형태가 포함되나 이에 한정되지 않는다.

약물의 제조 및 투여 기술은 본원에 참고로서 포함되는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences, "Mack Publishing Co. , Easton, PA, 최종판]에서 찾아볼 수 있다.

적합한 투여 경로는 예를 들어 경막내, 직접 내실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사 뿐만 아니라 근육내, 피하 및 골수 주사를 포함하여 경구, 직장, 경점막, 특히 경비, 장 또는 비경구 전달을 포함할 수 있다.

또한, 예를 들어 환자 몸의 특정 영역내로 직접 제제의 주사를 통해 전신적 이 아닌 국소적으로 제제를 투여할 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정화, 분말화, 유화, 캡슐화, 인트래핑(entrapping) 또는 동결건조 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 약학조성물은 약제학적으로 사용될 수 있는 제제내로 활성성분의 진행을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상의 방식으로 제형화될 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여경로에 따라 잘라진다.

주사용의 경우, 본 발명의 활성성분은 수성 용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액, 이를테면 핸크 용액(Hank's solution), 링거액, 또는 생리학적 염 완충액으로 제형화될 수 있다. 경점막 투여의 경우, 침투할 장벽에 적합한 침투제가 제형화에 사용될 수 있다. 이러한 침투제는 당업계에 널리 알려져 있다.

경구 투여의 경우, 화합물은 활성 화합물을 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용되는 염과 배합함으로써 쉽게 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 환자의 경구 섭취를 위해 본 발명의 화합물을 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔, 시럽제, 슬러리, 현탁제 등으로서 제형화할 수 있게 한다. 경구 사용을 위한 약리학적 제제는 고형 부형제를 사용하고 생성된 혼합물을 임의로 분쇄하고, 필요에 따라 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물을 처리하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 특히 충진제(filler), 예컨대 락토스, 슈크로스, 만니톨 또는 솔비톨을 비롯한 당; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전 분, 감자 전분, 젤라틴, 트리가칸트 검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 소듐 카보메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리학적으로 허용되는 폴리머이다. 필요에 따라, 붕괴제, 이를테면 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 소듐 알기네이트와 같은 그의 염이 첨가될 수 있다.

적합한 코팅에 의해 당의정 코어가 제공된다. 이를 위해, 임의로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티탄, 래커(lacquer) 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축 당 용액이 사용될 수 있다. 식별을 위해 또는 활성 화합물 용량이 상이한 배합물임을 특징화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 염료 또는 안료가 첨가될 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 약학조성물로는 젤라틴과 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제로 제조된 연성 밀봉 캡슐 뿐만 아니라 젤라틴으로 제조된 압입형 캡슐제(push-fit capsule)가 포함된다. 압입형 캡슐제는 락토스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 임의로 안정화제와의 혼합물로 활성성분을 포함할 수 있다. 연성 캡슐제의 경우, 활성성분은 적합한 액체, 예컨대 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 선택되는 투여 경로에 적합한 용량이어야 한다.

구강 투여의 경우, 조성물은 통상의 방식으로 제형화된 정제 또는 트로치이 형태를 취할 수 있다.

비강내 흡인에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 활성성분은 적합한 분사제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용함으로써 가압팩 또는 분무기로부터 통상 에어로졸 분무제의 형태로 전달된다. 가압형 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하도록 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 디스펜서로 사용하기 위해 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기재와 화합물의 분말 혼합물을 함유하는 예를 들어 젤라틴의 캡슐제 및 카트리지로 제형화될 수 있다.

본원에 기술된 제제는 비경구 투여를 위해 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 임의로 첨가되는 방부제와 함께 단위 투여형, 예를 들어 앰풀(ampoule) 또는 다중투여(multidose) 용기로 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클의 현탁제, 용액제 또는 에멀젼일 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 제제(formulatory agent)를 함유할 수 있다.

비경구 투여용 약학조성물은 활성 제제의 수용액을 수-가용성 형태로 포함한다. 또한, 활성성분의 현탁제는 적합한 오일 또는 수 기재 주사 현탁제로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 참깨유와 같은 지방유, 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세리드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르가 포함된다. 수성 주사 현탁제는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 솔비톨 또는 덱스트린을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁제는 또한 적합한 안정화제 또는 활성성분의 용해도를 증가시켜 고농도의 용액제를 제조가능 케 하는 제제를 함유할 수 있다.

또한, 활성성분은 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어 발열원이 없는 수 기재 멸균 용액과 함께 구성하기 위해 분말 형태일 수 있다.

본 발명의 제제는 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상의 좌제 기재를 사용하여 좌제 또는 정체관장제와 같은 직장형 조성물로 제형화될 수 있다.

본 발명과 관련하여 사용하기에 적합한 약학조성물은 의도하는 목적을 달성하는데 유효한 양으로 활성성분이 함유된 조성물을 포함한다. 더욱 구체적으로, 치료학적 유효량은 치료할 대상의 생명을 연장하거나 질병의 증상을 예방, 경감 또는 약화시키는데 효과적인 활성성분의 양을 의미한다.

치료학적 유효량은 당업자들에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 임의의 제제의 경우, 치료학적 유효량 또는 용량은 시험관내 에세이로부터 먼저 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 동물 모델에서 정해질 수 있고, 이러한 정보는 사람에 있어서의 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다.

본원에 기술된 활성성분의 치료 효능 및 독성은 시험관내, 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 방법에 의해 결정될 수 있다. 이들 시험관내, 세포 배양액 에세이 및 동물 연구에 의해 수득된 데이터는 사람에게 사용하기 위한 용량 범위를 정하는데 사용될 수 있다. 투여량은 사용되는 투여 경로 및 사용하는 투여형태에 따라 변할 수 있다. 적합한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자 상태를 고려 하여 의사 개인에 의해 선택될 수 있다. (참조예. Fingl, et al. , 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p. l).

치료할 상태의 중증도 및 반응도에 따라, 수일 내지 수주 내내 또는 병을 고치거나 증상이 감퇴될 때까지 치료하는 과정으로서 단일 또는 복수 투여될 수 있다.

투여되는 조성물의 양은 물론 치료할 대상, 고통의 정도, 투여 방식, 처방하는 의사의 판단 등에 따라 달라질 것이다.

적합한 약제학적 담체로 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 또한 제조하여 적절한 용기에 넣고 처방된 상태를 써넣은 라벨을 붙일 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 필요에 따라 활성성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 담을 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치, 이를테면 FDA에 의해 승인된 키트(kit)로 제시될 수 있다. 발포(blister) 팩과 같은 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 포일(foil)을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투약 설명서가 첨부될 수 있다. 팩 또는 디스펜서에는 또한 약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 행정기관에 의해 규정된 형태의 용기와 연관된 통지서를 첨부될 수 있으며, 이 통지서는 조성물의 형태 또는 인간 또는 가축 투여에 대한 기관의 승인을 반영한다. 이러한 통지서는 예를 들어 처방약에 대한 미국 식품의약청의 승인 라벨이거나 승인된 제품 전단일 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 또한 상술된 투여에 적합한 방법을 사용하여 대상 개개에게 투여되는 핵산 작제물로부터 발현될 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 핵산 작제물은 적합한 전달 비히클/방법(형질전환, 형질도입 등) 및 필요에 따라 발현계를 통해 적합한 세포내로 도입된 다음, 변형 세포가 배양액에서 확장되어 개체로 되돌려진다.

본 발명의 RNA 핵산 분자의 세포발현을 가능하게 하기 위해서, 본 발명의 핵산 작제물은 적어도 하나의 시스 작용부위 조절요소(cis acting regulatory element)를 포함한다. 본원에 사용된 어구 "시스 작용부위 조절요소"란 트랜스 작용부위 조절자를 결합하여 하향 위치의 코드 서열의 전사를 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 프로모터(promoter)를 의미한다.

이용가능한 프로모터는 본 방법에 의해 사용될 수 있다. 압타머 발현 벡터에 사용하는데 바람직한 프로모터는 인간 소핵 U6 유전자 프로모터 및 tRNA 유전자 프로모터와 같은 pol III 프로모터를 포함한다. 생체내에서 짧은 RNA 분자를 생성하기 위해 U6 유전자 전사 시그널을 사용하는 것이 문헌[Noonberg et al. , Nucleic Acids Res. 22: 2830-2836 (1994)]에 개시되어 있으며, 전사 시그널을 사용하는 것이 문헌[Thompson et al. , Nucleic Acids Res. , 23: 2259- 2268 (1995)]에 개시되어 있다.

다수의 pol III 프로모터가 체내에 존재하며, pol III 전사가 프로모터 서열을 포함하도록 전사 단위내에 위치하는 것이 인지될 것이다. 압타머 분자의 발현을 유용하게 하기 위해서는, 이들 프로모터 서열이 압터머의 구조 또는 기능을 저해해서는 안된다. 따라서, 바람직한 RNA pol III RNA 프로모터는 체내에 없는 U6 유전자 프로모터이다[Kunkel and Pederson, Nucleic Acids Res, 17: 7371-7379 (1989); Kunkel et al. , Proc. Natl. Acad Sci. USA 83: 8575-8579 (1986); Reddy et al. , J. Biol. Chem. 262: 75-81 (1987)]. 압타머 분자의 발현에 유용한 적합한 pol III 프로모터 시스템이 문헌[Hall et al. , Cell 29: 3-5 (1982), Nielsen et al. , Nucleic Acids Res. 21: 3631-3636 (1993), Fowlkes and Shenk, Cell 22: 405-413 (1980), Gupta and Reddy, Nucleic Acids Res. 19: 2073-2075 (1991), Kickhoefer et al. , J. Biol. Chem. 268: 7868-7873 (1993), and Romero and Blackburn, Cell 67: 343-353 (1991)]에 개시되어 있다. RNA 분자의 발현을 위해 pol III 프로모터를 사용하는 것이 또한 Rybozyme Pharmaceuticals, Inc. 사에 의해 WO95/23225에 개시되어 있다.

본 발명의 압타머를 발현하는데 유용한 다른 프로모터로는 예를 들어 바이러스의 게놈; 폴리오마(polyoma), 시만 바이러스(Simian Virus) 40(SV40), 아데노바이러스(adenovirus), 레트로바이러스(retrovirus), B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 거대세포바이러스(cytomegalovirus), 또는 이종유래 포유류 프로모터, 예를 들어 베타 액틴(beta actin) 프로모터가 포함된다. SV40 바이러스의 조기(early) 및 후기(late) 프로모터는 SV40 바이러스의 복제 기점을 또한 가질 수 있는 SV40 제한단편(restriction fragment)으로서 수득될 수 있다[Fiers et al. , Nature, 273: 113 (1978)]. 사람의 거대세포바이러스의 전초기(immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한단편으로서 수득될 수 있다[Greenway, P. J. et al. , Gene 18: 355-360 (1982)]. 숙주 세포 또는 관련 종으로부터의 프로모터가 또한 사용될 수 있음이 인지될 것이다.

본 방법의 작제물은 바람직하게는 적합한 선택가능 마커(maker) 및/또는 복제 기점을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게도, 사용되는 작제물은 E. coli(여기서, 작제물은 적합한 선택가능 마커 및 복제 기점을 포함한다)에서 모두 증식할 수 있고, 세포의 증식 또는 선택 조직의 통합(integration)에 적합한 셔틀 벡터(shuttle vector)이다. 본 발명에 따른 작제물은 예를 들어 플라스미드, 백미드(bacmid), 파지미드(phagemid), 코스미드(cosmid), 파지(phage), 바이러스 또는 인공 염색체일 수 있다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전이 기술은 바이러스 또는 비바이러스 작제물, 이를테면 아데노바이러스, 렌티바이러스(lentivirus), 단순 헤르페스 I 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스(AAV) 및 지질-기재 시스템과의 형질전환을 포함한다. 지질-매개 전이에 유용한 지질이 문헌[Lasic D. , Liposomes: From Physics to Applications, Elsevier: Amsterdam, 1993]에 개시되어 있다.

바람직하게도, 양이온성 지질은 상술한 바와 같이 등몰량의 중성 지방과 배합하여 사용된다. 형질전환 복합체에 사용하는 중성 지방으로는 예를 들어 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)이 포함된다[Hui et al. , Biophys. J. (71) 590-599 (1996); cholesterol, Liu et al. , Nat. Biotech. 15: 167-173 (1997)].

전형적으로, 지질 혼합물은 클로로포름중에서 제조되고, 건조된 다음 예를 들어 수중 5% 덱스트로즈 또는 생리적 완충액중에서 재수화되어 리포솜을 형성한다. 생성된 리포솜을 일정하게 교반하면서 핵산 용액과 혼합하여 양이온성 지질-핵산 형질전환 복합체를 형성한다. 정맥내 투여에 바람직한 형질전환 복합체의 크기 는 50 내지 5000 ㎚, 가장 바람직하게는 100 내지 400 ㎚이다.

DNA/지질 복합체가 약 0. 625 ㎎/㎖의 DNA 농도에서 바람직하게 제조되는 것이 인지될 것이다. 전달되는 용량은 체중 1 그램당 약 10 mu. g 내지 2 ㎎이다. 약 2일 내지 약 2 달의 간격의 반복 투여로 전달될 수 있다.

현재 공지된 구체예에 따라 생체내 사용하는데 가장 바람직한 작제물은 바이러스, 가장 바람직하게는 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스, 또는 레트로바이러스이다. 레트로바이러스 작제물과 같은 바이러스 작제물은 적어도 하나의 전사 프로모터/인핸서(enhancer) 또는 유전자좌-정의(locus-defining) 요소(들), 또는 교대 스플라이싱(alternate splicing), 핵 RNA 외수송, 또는 전령(messenger)의 번역후(post-translation) 변형과 같은 다른 수단에 의해 유전자 발현을 억제하는 그외의 요소들을 포함한다. 이러한 벡터 작제물은 또한 바이러스 작제물에 이미 존재하지 않는 한, 꾸리기 시그널(packaging signal), 말단의 긴 반복서열(long terminal repeats, LTRs) 또는 그의 부분, 및 사용된 바이러스에 대해 적합한 부위를 결합하는 양성 및 음성 스트랜드 프라이머를 포함한다. 또한, 이러한 작제물은 전형적으로 그것이 위치하는 숙주 세포로부터 항체 또는 펩티드의 분비를 위한 시그널 서열을 포함한다. 바람직하게도, 이러한 목적을 위한 시그널 서열은 포유동물의 시그널 서열이다. 임의로, 작제물은 또한 아데닐중합체형성을 지시하는 시그널 및 하나 이상의 제한 부위 및 번역 말단 서열(translation termination sequence)을 포함한다. 예로서, 이러한 작제물은 전형적으로 5' LTR, tRNA 결합 부위, 꾸리기 시그널, 제 2 스트랜드 DNA 합성의 기점, 및 3' LTR 또는 그의 부분을 포함할 것이다.

생체내 핵산 전달 프로토콜에 바람직한 모드(mode)가 문헌[Somia and Verma (2000) Nature Reviews 1: 91-99, Isner (2002) Myocardial gene therapy Nature 415: 234-239 ; High (2001) Gene therapy: a 2001 perspective. Haemophilia 7: 23-27; and Hammond and McKirnan (2001) Angiogenic gene therapy for heart disease: a review of animal studies and clinical trials. 49: 561-567]에 제공되어 있다.

본 발명의 핵산 분자를 제공하기 전, 그와 동시 또는 그후, 제제가 대상에게 제공될 수 있다.

제제는 인플루엔자 감염 또는 폐렴과 같은 인플루엔자 감염과 연관된 병태의 예방 또는 치료를 촉진하는 분자일 수 있다. 본 발명의 이러한 일면에 따른 제제의 예로는 면역조절제(예, 항체), 항생제, 항바이러스제(예, 아만티딘), 안티센스 분자, 리보자임 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 핵산 분자의 항체와 유사한 성질(즉, 폴리펩티드 표적에 대한 특이 결합)은 상술된 제제가 투여된 핵산 분자에 또는 이를 함유하는 지질 담체에 부착시, 감염 조직을 특이적으로 표적할 수 있게 한다.

예를 들어, 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드에 연결된 안티센스 분자(발명의 배경 부분에서 추가로 설명됨)는 본 발명의 압타머 서열을 사용하여 표적시킬 수 있다. "키메라 안티센스 분자"는 화학적으로 상이한 2개 이상의 영역을 가지며, 각각 적어도 하나의 뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드이다. 이들 올리고뉴클레오티드는, 전형적으로 올리고뉴클레오티드에 뉴클레아제 분해에 대한 내성 증가, 세포 흡수율 증가 및/또는 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 결합 친화력 증가를 제공하도록 올리고뉴클레오티드가 변형되는 적어도 하나의 영역을 가진다. 올리고뉴클레오티드의 추가 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서의 역할을 가진다. 이것의 예로는 RNA:DNA 이중나선 RNA 스트랜드를 절단하는 세포 엔도뉴클레아제(endonuclease)인 RNase H가 포함된다. 따라서, RNase H의 활성화에 의해 RNA 표적이 절단되고, 이로써 유전자 발현에 대한 올리고뉴클레오티드의 억제 효능이 크게 향상된다. 그 결과, 동일한 표적 부위에 혼성화하는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드에 비해, 키메라 올리고뉴클레오티드가 사용되는 경우, 더 짧은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이와 유사한 결과를 종종 수득할 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동에 의해 기계적으로 검출할 수 있고, 필요에 따라 당업계에 공지된 핵산 혼성화 기술을 결합할 수 있다.

본 발명의 키메라 안티센스 분자는 상술한 바와 같이 2개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드의 복합 구조체로 형성될 수 있다. 이러한 혼성화 구조의 제조법을 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 및 5,700,922호가 포함되나 이에 한정되지 않으며, 이들은 각각 본원에 참고로서 모두 포함된다.

또한, 리보자임 서열은 본 발명의 핵산 분자를 사용하여 표적화시킬 수 있다. 리보자임은 mRNA의 절단에 의한 유전자 발현의 서열-특이적 억제에 더 많이 사 용되고 있다. 몇몇 리보자임 서열이 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 융합될 수 있다. 이들 서열로는 혈관생성 경로에서 중요한 성분인 VEGF-R(혈관내피성장인자 수용체)의 형성을 특이적으로 억제하는 ANGIOZYME, 및 C형 간염 바이러스(HCV) RNA를 선택적으로 파괴하도록 설계된 리보자임인 HEPTAZYME가 포함되나 이들에 한정되지 않는다(Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated-WEB 홈페이지).

임의로, "DNAzymes"을 본 발명의 방법을 사용하여 표적화시킬 수 있다[Breaker, R. R. and Joyce, G. Chemistry and Biology (1995); 2: 655; Santoro, S. W. & Joyce, G. F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997 ; 943: 4262]. DNAzyme은 싱글-스트랜드로서 RNA 모두를 절단한다. DNAzyme의 일반적인 모델("10-23" 모델)이 제안되어 있다. "10-23" DNAzyme은 2개의 기질-각각 7 내지 9개의 데옥시리보뉴클레오티드의 인지 도메인이 측면에 위치하는 15개 데옥시리보뉴클레오티드의 촉매 도메인(domain)을 가진다. 이러한 형태의 DNAzyme은 퓨린:피리미딘 연결부에서 기질 RNA을 효과적으로 절단할 수 있다(Santoro, S. W. & Joyce, G. F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199; for rev of DNAzymes see Khachigian, LM Curr Opin Mol Ther 2002 ; 4: 119-21).

싱글 및 더블-스트랜드 표적 절단 사이트를 인식하는 유전공학 처리된 합성 DNAzymes의 작제 및 증폭 방법의 예는 조이스(Joyce) 등의 미국특허 제 6,326,174호에 기술되었다. 최근, 인간 우로키나제 수용체에 대한 유사한 디자인의 DNAzymes이 우로키나제 수용체 발현을 저해하고, 생체내에서 결장 암 세포의 전이를 성공적으로 저해하는 것으로 관찰되었다(Itoh et al, 20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www. asat. org). 또 다른 출원에서, bcr-abl 온코진(oncogene)에 상보적인 DNAzymes은 백혈구 세포에서 온코진 발현을 저해하고 CML 및 ALL의 경우 골수의 자가 이식에 있어 재발율을 감소시키는데 성공하였다.

핵산-지질 커플링 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있고, 미국특허 제 5,756,291호에 기술되어 있다.

예를 들면, 아셀린 유. (Asseline, U. ) 등[Proc Natl Acad Sci 81, 3297-3301(1984)]은 3'-포스페이트 그룹을 통해 폴리메틸렌 링커를 매개로 하는 중격제(intercalating agent)의 공유 결합을 기술하였다. 모리, 케이(Mori, K. ) 등(FEBS Letters 249:213-218 (1989))은 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 메틸렌 링커를 매개로 하는 그룹의 공유 결합을 기술하였다. 1989년 6월 29일에 공개된 PCT 출원공개 W089/05853(그의 전체 내용이 본원에 참고문헌으로서 포함됨)에는 뉴클레오티드 서열과 킬레이트제 사이에 컨쥬게이트를 형성하는 다양한 방법이 기술되어 있다(여기에서, 킬레이트제는 공유 결합에 의해 또는 다원자가 작용 그룹으로부터 유도된 링커 단위에 의해 뉴클레오티드 서열에 연결된다).

따라서, 본 발명의 압타머 또는 변형된 압타머를 치료적 적용에 단독 사용할 수 있거나, 원하는 표적으로 약물 또는 독성 물질을 전달하기 위한 표적제로서 사용할 수 있다.

인플루엔자 바이러스의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 본 발명의 핵산 분자의 능력을 통해 이를 진단용으로 사용할 수 있다.

현재까지 인플루엔자 A 및 B를 진단하기 위하여 다수의 시험을 이용하여 왔 다. 생체 시료내 인플루엔자 바이러스를 확인하는 통상의 접근법은 세포를 배양하여 바이러스 감염을 고도로 민감하고 특이적으로 검출할 수 있도록 하는 것을 포함한다. 그러나 이러한 접근법은 세포 배양에 필요한 시간에 의해 상당 수준으로 제한되고, 인플루엔자 바이러스의 확인은 2 내지 10일 범위로 소요될 수 있기 때문에 의사가 적절한 요법으로 관리하는데는 효과가 없다. 인플루엔자 바이러스 감염은 일반적으로 자가-치유(self-limited)되기 때문에 요법이 효능이 있다면 신속하게 진단하여야 한다. 따라서, 세포 배양 방법은 후향 역학적 정보(retrospective epidemiological information)를 제공할 경우에만 사용된다.

다른 인플루엔자 진단 방법은 모노클로날 면역형광 에세이[Spada, B. et al. , J. Virol. Methods, (1991) 33: 305] 및 효소면역측정법[EIA, Ryan-Poirier, K. A. et al. , J. Clin. Microbiol. , (1992) 30: 1072]의 사용을 포함한다. 그러나, 이들 방법은 A형 인플루엔자 바이러스 감염을 확인하는 것으로 제한하는 것은 아니지만, 이는 상당한 기술적 수준을 요하는 바, 고 수준의 위양성(false-positive)을 초래한다.

따라서, 본 발명의 또다른 일면에 따라 생체 시료중 인플루엔자 바이러스를 확인하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 "생체 시료"는 체내 샘플, 예로서, 혈액, 척수액, 가슴막액, 호흡액(respiratory fluid) 및 비강내 흡인물을 말한다. 척추 동물로부터 체액을 수득하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Henrickson, J. Viol. Methods, 46: 189-206, 1994 또는 Hall 및 Douglas, J. Infect. Dis. , 131: 1-5, 1975]에 기술된 바와 같이 비강내 세척액을 수득할 수 있다.

상기 기술된 바와 같이, 생체 시료를 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 접촉시켜 본 방법을 수행한다.

이하 기술하는 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자를 고체 기질(solid substrate)에 부착시킬 수 있다.

폴리펩티드-핵산 분자 이중 나선이 형성되는 조건하에서 접촉시킨다.

바람직하게 이중 나선을 세척하여 비특이적으로 결합한 폴리펩티드를 제거하여 복합체내 특이적으로 결합한 핵산 분자만이 검출되도록 한다.

생체 시료중 폴리펩티드-결합 핵산 분자를 검출하여 인플루엔자 감염을 확인한다.

일반적으로 폴리펩티드-핵산 분자 복합체를 모니터하는 것은 본 분야에 잘 공지되어 있고 이는 상기 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 이러한 접근법은 통상 이하 기술되는 것과 같은 표지 또는 마커의 검출에 기초한다.

바람직하게, 인플루엔자 바이러스로 감염되지 않은 정상적인 샘플과 비교하여 감염된 샘플을 검출한다.

본 발명의 핵산 분자를 제조하기 위하여 로버스트(robust) 선택 방법이 바람직하게 사용된다.

따라서, 본 발명의 추가의 일면에 따라 세포의 인플루엔자 바이러스 감염을 저해할 수 있는 핵산 분자를 제조하는 방법이 제공한다.

본 방법은 하기와 같이 수행된다.

먼저, 다수의 핵산 분자를 상기 기술된 바와 같이, 세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관여하는 폴리펩티드 표적과 접촉시킨다.

이중 나선 형성 후(즉, 폴리펩티드 표적 및 핵산 분자 사이의 비-왓슨-크릭 상보성), 폴리펩티드와 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 핵산 분자중 적어도 하나의 핵산 분자를 확인한다.

마지막으로 폴리펩티드 결합 핵산 분자를 분리하여 인플루엔자 바이러스 감염을 저해할 수 있는 분자를 제조한다.

더블 스트랜드 DNA 분자는, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 프라이머 결합을 위해 사용할 수 있는 두개의 정의된 뉴클레오티드 서열 측면에 위치하는 랜덤화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열의 라이브러리로부터 제조될 수 있다. 라이브러리를 증폭시켜 더블-스트랜드 PCR 산물을 수득한다[Bielinska (1990) Science 250 (4983): 997-1000]. 랜덤화된 서열을 완전하게 랜덤화시키거나(즉, 어느 위치에서 염기를 발견할 수 있는 확률 = 1: 4) 부분적으로 랜덤화시킬 수 있다(즉, 어느 위치에서 염기를 발견할 수 있는 확률는 0-100% 수준으로 선택된다).

싱글 스트랜드 압타머를 제조하기 위하여, 하류 프라이머의 5' 말단을 바이오틴화하고 PCR 산물을 아비딘 아가로스 칼럼에 적용시킨다. 약 염기성 완충액으로 용출시켜 싱글 스트랜드 DNA 서열을 회수한다. 3

싱글 스트랜드 RNA 분자를 올리고뉴클레오티드 서열 라이브러리로부터 제조할 수 있고, 이를 증폭시켜 T7 박테리오파지 폴리메라제 프로모터 사이트를 포함하는 더블-스트랜드 PCR 산물을 수득한다. 이어서, T7 RNA 폴리메라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 RNA 분자를 제조할 수 있다.

본 발명의 이러한 일면의 핵산 분자를 자연발생된 핵산 또는 그의 단편, 화학적으로 합성된 핵산, 효소적으로 합성된 핵산 또는 상기 기술의 조합으로 제조된 핵산 분자로부터 제조할 수 있다.

상기 기술된 바와 같은 선택된 핵산 변형을 구조적 및 화학적으로 모두 포함할 수 있도록 본 발명의 이러한 일면의 라이브러리를 충분히 크게 제조한다.

통상, 본 발명의 이러한 일면에 따라 랜덤화된 핵산 서열 라이브러리는 적어도10¹⁴개의 서열 변이체를 포함한다.

표적 폴리펩티드와 함께 인큐베이션하기 전 핵산을 변형시킬 수 있다. 이 경우, 최종적으로 변형된 압타머에 대하여 스크리닝하지만, 변형은 스크리닝하는 동안 발생하는 효소적 프로세스(예: 전사)와 같은 프로세스로 방해되지 않는 것으로 제한한다.

다르게는, 선택(즉, 폴리펩티드 결합 핵산 분자의 분리)한 후 핵산 분자를 변형시킬 수 있다. 따라서, 광범위한 범위의 작용 그룹을 동시에 사용할 수 있다. 이 경우, 전자분사 이온화 질량분석기(ESI-MS)를 사용하여 적절한 작용 그룹을 확인할 수 있다[Pomerantz (1996) Anal. Chem. 68: 1989-1999].

어느 경우에든 일단 핵산 분자를 수득한 후에는 상기 언급한 바와 같이 폴리펩티드 표적과 접촉시킨다.

바람직하게 생리학적 조건하에서 본 발명의 이러한 일면의 표적 폴리펩티드와 핵산 분자를 인큐베이션시킨다. 본 명세서에서 사용되는 어구 "생리학적 조건"은 생리학적 완충액 또는 생리학적 염수로도 언급되는, 인플루엔자 바이러스로 감염될 수 있는 척추 동물 대상의 대사에서 발견되는 체액을 특징으로 하는 수용액에서의 염 농도 및 이온 세기를 언급한다. 예를 들면, 인간 대상의 생리학적 체액 세포내의 pH는 7. 1이고 나트륨의 염 농도(mM) 3-15; 칼륨의 염 농도(mM) 140; 마그네슘의 염 농도(mM) 6. 3; 칼슘의 염 농도(mM) 10-4; 염화물의 염 농도(mM) 3-15이고, 세포외의 pH는 7. 4이고, 나트륨의 염 농도(mM) 145; 칼륨의 염 농도(mM) 3; 마그네슘의 염 농도(mM) 1-2; 칼슘의 염 농도(mM) 1-2; 염화물의 염 농도(mM) 110이다.

용액중 또는 고체 기질에 결합하였을 때 핵산 분자를 표적 폴립펩티드와 인큐베이션시킬 수 있다.

핵산 분자를 고체 기질에 부착시키기 위한 중간 물질로서 몇몇의 상기-기술된 바와 같이 변형된 염기를 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 도 1c의 그룹 48에 나타낸 변형된 우리딘은 고체상 합성에서 사용되는 포스포르아미다이트 시약으로서 활성화되기 전에, 매우 다양한 소수성, 친수성, 하전 및 가교 결합된 그룹으로 이미다졸을 치환하여 추가로 변형될 수 있는 공통된 중간 물질로서 사용될 수 있다.

핵산 분자를 고체 기질에 부착시키는 방법은 본 분야에 공지되어 있고, 제한하는 것은 아니지만, 유리-프린팅[Schena et al. , 1995, Science 270: 467-47에 기술됨], 사진 평판 기술[Fodor et al. (1991) Science 251: 767-773], 잉크젯 프린팅, 마스크 등을 포함한다.

통상, 고체 지지체 및/또는 비표적 에피토프와 같은 비표적 물질에 결합한 핵산 분자를 선택하기 위하여 대조군 샘플을 포함한다.

본 분야에 잘 공지되어 있는 방법을 사용하여 비결합 핵산 서열을 분리하고 결합 핵산 서열을 확인할 수 있다. 제한하는 것은 아니지만 예를 들면, 선택 용출, 여과, 전기 영동을 포함한다(미국특허 제 5,756,291 참조).

다르게는, 결합 압타머 분자를 영상화하여 확인할 수 있다. 예를 들면, 명시야를 이용하는 광학 현미경법, 에피-형광(fluorescence) 또는 공-초점 방법, 또는 스캐닝 프로브 현미경법을 사용하여 폴리펩티드 결합 핵산 분자를 확인할 수 있다(미국특허 제 6,287,765호 참조). 용이하게 볼 수 있도록 하기 위하여, 본 분야에서 표준 용도로 사용되는 방사성, 형광성, 생물학적 또는 효소적 태그(tag) 또는 표지를 사용하여 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 바람직하게 표지화한다.

이하 본 발명에서 사용하기 적절한 다수의 표지 방법을 설명한다. 예를 들면, 본 발명의 핵산 분자를 합성한 후 바이오틴화된 dNTPs 또는 rNTP, 또는 몇몇 유사한 수단(예: 바이오틴의 소랄렌(psoralen) 유도체와 RNAs의 광-교차-결합)을 혼입한 후 표지된 스트렙타비딘(예: 피코에리트린-컨쥬게이트된 스트렙타비딘) 또는 동등물을 가하여 표지화할 수 있다, 다르게는, 형광 부위, 제한하는 것은 아니 지만, 형광물질, 리사민(lissamine), 피코에리트린, 로다민(Perkin Elmer Cetus), Cy2, Cy3, Cy3. 5, Cy5, Cy5. 5, Cy7, FluorX (Amersham) 및 그외의 것[예: Kricka et al. (1992), Academic Press San Diego, Calif]를 사용한다. 다르게는 방사능 표지를 사용한다[Zhao et al. (1995) Gene 156: 207]. 그러나, 방사능 입자는 산란되고, 그 결과 광범위한 결합 부위를 요하기 때문에 방사성동위원소보다 형광단을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 기술된 바와 같은 검출 방법에서 생성된 시그널의 세기를 수동적으로 또는 상기 목적을 위해 적합화된 하드웨어 및 소프트웨어 애플리케이션을 사용하여 분석할 수 있다.

압타머 서열(즉, 폴리펩티드-결합 핵산)의 분리는 통상 PCR과 같은 서열 증폭을 포함한다. 표적 폴리펩티트로부터 분리하기 전, 그와 동시에 또는 그후 증폭시킬 수 있다. PCR 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 미국특허 제 4,683,195호, 제 4,683,202호 및 제 4,800,159호 및 문헌[Methods in Enzymology (1987) 155: 335-350]에 기술되어 있다. RNA 분자를 사용할 경우 증폭된 DNA 서열은 RNA로 전사된다는 것을 이해할 것이다.

다른 증폭 방법, 예로서 표준 클로닝, 리가제 연쇄 반응 등(미국특허 제 4,957,858호 참조)을 사용할 수 있다. 예를 들면, 일단 압타머를 확인하면 링커를 각 사이트에 부착시켜 표준 벡터로 용이하게 클로닝시킬 수 있다. 싱글 스트랜드 또는 더블 스트랜드 압타머를 클로닝하고 회수할 수 있다.

그후, 선택 및 증폭의 반복적을 순환(즉, 표적 폴리펩티드 결합)을 위해 사 용하기 위하여 본래의 싱글-스트랜드 또는 이중 나선 형태로 회수한 핵산 분자를 사용할 수 있다. 통상, 3 내지 6회 선택/증폭을 반복한 후 nM 내지 M 범위의 바람직한 친화력으로 결합하는 핵산 분자를 수득할 수 있다.

폴리펩티드 표적과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 분자를 확인하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있음을 이해할 것이다[미국특허 제 5,270,163호, Ellington and Szostak (1990) Nature 346: 818-822, Bock et al. (1992) Nature 255: 564-566, Wang et al. (1993) Biochemistry 32: 1899-1904, and Bielinska et al. (1990) Science 250:997-1000 참조]. 예를 들면, 미국특허 제 5,270,163호는 하기와 같이 핵산 리간드를 확인하기 위하여 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)로 언급되는 방법을 기술하고 있다. 랜덤화된 서열 부위를 갖는 싱글-스트랜드 핵산의 후보 물질 혼합물을 표적 화합물과 접촉시키고 표적과의 친화력이 증가된 핵산을 남은 후보 물질 혼합물로부터 분리한다. 분리된 핵산을 증폭시켜 리간드가 풍부한 혼합물을 수득한다. 복(Bock) 및 동료들은 랜덤 서열 및 PCR용 프라이머로서 사용할 수 있는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 혼합물과 지지체-결합 표적 분자의 복합체 형성을 포함하는, 표적 생체분자와 특이적으로 결합하는 올리고머 서열을 확인하는 방법을 기술하였다[Bock et al. (1992) Nature 255: 564-566]. 이어서, 표적-올리고뉴클레오티드 복합체를 지지체로부터 분리하고, 복합체를 형성하지 못한 올리고뉴클레오티드 및 복합체를 형성한 올리고뉴클레오티드를 회수한 후 PCR을 사용하여 증폭시켰다. 회수한 올리고뉴클레오티드를 서열화하고, 복합체형성, 분리, 증폭 및 회수를 사용하여 연속적으로 반복하여 선택하였다.

다르게는, 추론적 약물 디자인(Rational drug design)에 의해 본 발명의 핵산 서열을 제조할 수 있다.

추론적 약물 디자인은 예를 들면 특히 HIV 프로테아제를 확인하기 위하여 사용될 수 있는 효소 저해제(Lam et al. , 1994. Science 263, 380; Wlodawer et al. , 1993. Ann Rev Biochem. 62,543; Appelt, 1993. Perspectives in Drug Discovery and Design 1, 23; Erickson, 1993. Perspectives in Drug Discovery and Design 1, 109), 및 인간 면역 결핍증 바이러스(HIV)에 의해 유발되는 인간의 후천성 면역결핍증 증후군(AIDS), 및 인간 암(만성 골수성 백혈병) 각각에 대하여 제 1의 효능이 있는 약물학적 치료를 제공하기 위하여 사용되는 bcr-abl 티로신 키나제 저해제(Mauro MJ. et al. , 2002. J Clin Oncol. 20, 325-34)를 확인하기 위한 유력한 수단이다.

핵산 서열 구조 데이타베이스("3D 데이타베이스")를 스크리닝하여 추론적 약물 디자인을 통해 추정의 압타머 서열을 확인하기 위하여, "스캐너" 타입 알고리즘을 사용하는 소프트웨어는, 인플루엔자 헤마글루틴 폴리펩티드의 시알산 수용체 결합 포켓과 같은 분자의 결합 포켓의 3차원 구조를 정의한 원자 코디네이트(GenBank Accession No. AF092062의 아미노산 코디네이트 116-261), 스크린된 압타머 구조와 결합 포켓과의 "도킹(docking)"을 컴퓨터로 모델링하기 위하여, 데이타베이스에 저장된 핵산 서열을 사용하여 결합 포켓과 압타머 구조의 결합을 검정하였다. 데이타베이스에 저장된 다수의 추정의 압타머 구조를 각각 사용하여 본 프로세스를 반복 하여 다수의 컴퓨터 스크리닝을 통해 결합 포켓과 바람직하게 잠재적으로 결합 상호작용을 가질 수 있는 화학적 구조를 확인하고, 이로써, 추정의 저해제를 확인할 수 있도록 하였다.

본 발명의 핵산 분자를 확인하기 위한 핵산 구조 데이타베이스의 예로는 RNA 구조 데이타베이스(www. RNABase. org) 및 NDB 데이타베이스(http://www. imb-jena. de/RNA. html#Databases)가 포함된다.

다르게는, 결합 포켓의 3차원 구조 및 기본 압타머(예: A22)의 3차원 구조를 정의하는 원자 코디네이트 세트를 사용하여 정확한(refined) 압타머를 컴퓨터로 어셈플리하는 "빌더" 타입 알고리즘을 포함하는 소프트웨어를 사용하여 공지된 압타머 구조(예: A22, 서열번호: 12)를 변형시킴으로써 정확한 압타머 서열을 확인할 수 있다. "스캐너" 및 "빌더" 타입 알고리즘을 사용하는 소프트웨어를 통해 추론적 약물 디자인을 수행하는 광범위한 가이던스를 본 분야의 문헌에서 이용할 수 있고(참고예. Halperin I. et al. , 2002. Proteins 47, 409-43; Gohlke H. and Klebe G. , 2001. Curr Opin Struct Biol. 11, 231-5; Zeng J. , 2000. Comb Chem High Throughput Screen. 3, 355-62; and RACHEL: Theory of drug design, http://www. newdrugdesign. com/Rachel_Theory. htm#Sofrware), 이하 추가로 상세히 기술한다.

스크린된 압타머 구조와 결합 포켓의 결합을 검정하기 위하여 추론적 약물 디자인에서 사용되는 소프트웨어 프로그램에서 사용하는 기준으로서 갭 간격(gap space), 수소 결합, 정전기 상호작용, 반데르 발스 힘, 친수성/소수성 등을 포함한다. 일반적으로 스크린된 분자와 폴리펩티드 결합 부위의 접촉 면적이 넓을수록, 입체장해가 적을수록, "갭 간격"도 좁을수록, 수소 결합의 수가 많을수록, 스크린된 분자와 폴리펩티드 결합 부위 사이의 반데르 발스 힘이 클수록, 표적 폴리펩티드에 대한 스크린된 분자의 결합능은 증가할 것이다. "갭 간격"이란 결합 포켓내 위치하는 스크린된 분자의 반데르 발스 표면과 결합 포켓내 아미노산 잔기에 의해 정의되는 결합 포켓의 표면 사이의 빈 공간을 말한다. 예를 들면, 도킹된 분자를 둘러싸는 직렬의 입방 격자에 기초하는 알고리즘을 사용하여, 사용자가 정의한 격자 간격으로 갭 간격을 확인할 수 있고, 이는 폴리펩티드 표적의 결합 부위내 위치하는 도킹된 압타머를 변형시켜 유리하게 채워질 수 있는 볼륨을 나타낸다.

화합물 사이의 접촉 면적은 MS 프로그램(Connolly ML. , 1983. Science 221, 709-713)을 사용하여 도킹된 입체형태의 화합물의 코디네이트로부터 직접 산출할 수 있다.

"스캐너" 타입의 알고리즘을 사용하는 적절한 소프트웨어로는 예를 들어 도킹 소프트웨어, 예컨대 GRAM, DOCK, 또는 AUTODOCK(Dunbrack et al. , 1997. Folding and Design 2, 27에 검토됨), INSIGHTII 패키지의 AFFINITY 소프트웨어(Molecular Simulations Inc. , 1996, San Diego, Calif. ), GRID(Goodford PJ. , 1985. "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromoleocules", J. Med. Chem. 28,849-857; GRID는 Oxford University(Oxford, UK))로부터 이용가능), 및 MCSS (Miranker A. and Karplus M. , 1991. "Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method", Proteins: Structure Function and Genetics 11,29-34; MCSS는 Molecular Simulations(Burlington, Mass. )로부터 이용가능)이 포함된다.

AUTODOCK 프로그램(Goodsell DS. and Olson AJ. , 1990. Proteins: Struct Funct Genet. 8, 195-202; Scripps Research Institute, La Jolla, Calif. 로부터 이용가능)은 몬테카를로(Monte Carlo) 모의(simulated) 어닐링 접근법을 사용하여 탄력적인 방식으로 스크린된 분자가 결합 포켓과 도킹하는 것을 돕는다. 이 방법을 통해 연구자의 편견없이 조사할 수 있다. 이러한 편견은 표적된 결합 포켓에서 스크린된 분자의 배향 및 입체형태에 영향을 줄 수 있다.

DOCK 프로그램(Kuntz ID. et al. 1982. J Mol Biol. 161, 269-288; University of California(San Francisco)로부터 이용할 수 있음)은 결합 포켓의 공간을 채우는 표시로 음성 이미지로 기술하는 것에 기초하며, 이는 에너지 평가에서의 소수성 고려, 배좌 유연성의 제한 및 에너지 평가를 위한 역장(force field)을 포함한다.

모델링 또는 도킹 후 CHARMM (Brooks BR. et al. , 1983. J Comp Chem. 4, 187-217) 또는 AMBER(Weiner SJ. et al. , 1984. J Am Chem Soc. 106, 765-784)과 같은 프로그램을 사용하여 표준 분자의 역학적 역장 또는 동력으로 에너지를 최소화하였다.

본 명세서에서 사용되는 "에너지 최소화"는 화학 구조의 원자 배열을 계통적으로 변형시켜, 원자 배열상의 추가적인 최소한의 교란(perturbation)에 의해 분자 역학적 역장에 의해 측정되는 시스템의 전체 에너지가 증가될 수 있도록 하는 것을 의미한다. 최소화 및 분자 역학적 역장은 계산화학(computational chemistry)에서 잘 이해된다(참고예. Burkert U. and Allinger NL. , "Molecular Mechanics", ACS Monograph 177, pp. 59-78, American Chemical Society, Washington, D. C. (1982)).

"빌더" 타입 알고리즘을 사용하는 프로그램은 LEGEND(Nishibata Y. and Itai A. , 1991. Tetrahedron 47, 8985; Molecular Simulations, Burlington, Mass. 로부터 이용가능), LEAPFROG(Tripos Associates, St. Louis, Mo. ), CAVEAT(Bartlett, PA. et al. , 1989. Special Pub Royal Chem Soc. 78, 182-196; University of California, Berkeley로부터 이용가능), HOOK(Molecular Simulations, Burlington, Mass. ) 및 LUDI(Bohm HJ. , 1992. J. Comp Aid Molec Design 6, 61-78; Biosym Technologies, San Diego, Calif. 로부터 이용가능)을 포함한다.

CAVEAT 프로그램은 바람직한 결합 벡터에 기초하는 결합 분자를 제안한다. HOOK 프로그램은 모의 연구에서 여러 개의 작용 그룹을 사용하여 도킹 부위를 제안한다. LUDI는 디스크립터(descriptor)보다는 단편에 기초하는 프로그램으로서, 결합 포켓과 일치하는 약간 더 큰 단편을 제시하고, 캠브리즈 스트럭츄럴(Cambridge Structural) 데이타베이스 (CSD), 단백질 데이터 뱅크(Data Bank)(PDB)로부터 얻은 기학학적 기준, 및 결합 데이타에 기초한 기준에 기초하여 그의 히트(hit)를 스코어한다. LUDI를 사용하여 도킹된 화학적 구조의 저해 상수(inhibition constant)를 유리하게 산출할 수 있다. 최종 도킹 위치에서 화합물의 저해 상수(Ki 값)는 LUDI 소프트웨어를 사용하여 평가할 수 있다.

추론적 약물 디자인하는 동안, 또는 그 후, 중간체 화학적 구조 또는 결합 포켓을 포함하는 추정의 압타머의 도킹을 컴퓨터 스크린에 디스플레이된 3차원 모델과 같은 구조적 모델을 통해 가시화하여 추론적 약물 디자인하는 동안 사용자가 개입하여 화학적 구조를 유리하게 최적화시킬 수 있다.

3차원 구조를 디스플레이하는데 유용한 소프트웨어 프로그램으로는 RIBBONS (Carson, M. , 1997. Methods in Enzymology 277, 25), O(Jones, TA. et al. , 1991. Acta Crystallogr. A47, 110), DINO(DINO: Visualizing Structural Biology (2001) http://www. dino3d. org); 및 QUANTA, INSIGHT, SYBYL, MACROMODE, ICM, MOLMOL, RASMOL 및 GRASP(Kraulis, J. , 1991. Appl Crystallogr. 24, 946에 검토됨)이 포함된다.

다른 분자 모델링 기술 또한 본 발명에 따라 사용할 수 있다(참고예: Cohen NC. et al, 1990. "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem. 33,: 883-894; Navia M. A. and Murcko M. A. , 1992. "The Use of Structural Information in Drug Design", Current Opinions in Structural Biology 2, 202-210). 예를 들면, 시험 화합물의 구조가 공지되어 있는 경우 시험 화합물의 모델을 본 발명의 구조 모델위에 올려놓을 수 있다. 본 단계를 수행하는 다수의 방법 및 기술이 본 분야에 공지되어 있고, 모두 사용할 수 있다(참고예: Farmer P. S. , "Drug Design", Ariens EJ. (ed. ), Vol. 10, pp 119-143 (Academic Press, New York, 1980); 미국특허 제 5,331,573호; 미국특허 제 5,500,807호; Verlinde C. , 1994. Structure 2, 577-587; and Kuntz ID. , 1992. Science 257, 1078-108).

일단 추정의 압터머 서열을 확인하면 표적 폴리펩티드와의 특이적 결합에 대하여 조사하고, 이는 밴드 쉬프트(band shift) 에세이 (미국특허 제 5,756,291호) 및 친화크로마토그래피[Schott, H. , Affinity Chromatography, (Marcel Dekker, Inc. , New York, 1984)]와 같이 본 분야에 공지되어 있는 다수의 생화학적 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

다르거나 추가적으로는, 다음의 실시부의 실시예 2(시험관내) 및 실시예 3(생체내)에서 추가로 기술된 바와 같이, 생체내에서 또는 MDCK 배양된 세포주에서와 같은 시험관내에서 인플루엔자 바이러스 감염 저해에 대해 본 발명의 핵산 서열을 시험하였다.

상기 기술한 바와 같이 압타머 디자인에서 중요한 요소는 폴리펩티드 표적을 선택하는 것이다. 본 발명의 압타머 분자를 선택하기 위하여 사용되는 펩티드를 인플루엔자와 관련된 치료 및 진단용 적용에서 효능이 있는 도구로서 사용할 수 있다(13).

따라서, 본 발명의 추가의 일면에 따라 인플루엔자 바이러스(즉, 오르토미옥시바이러스)에 대한 백신화에 유용한 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 이러한 일면의 폴리펩티드는 다양한 인플루엔자 균주 사이의 폴리펩티드 보존을 반영하고, 갭 생성 패널티가 8이고 갭 확장 패널티가 2인 스미스 앤드 워터맨 알고리즘을 이용하고, 위스콘신 서열 분석 패키지의 베스트피트 소프트 웨어를 사용하여 측정된 바, 서열번호: 13에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94% 이상, 즉 95%-100% 상동성인 아미노산 서열 및 기능적 상동물(homologue)도 포함한다.

본 발명의 이러한 일면의 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스의 HA2 영역은 포함하지 않는다.

바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 시알산 수용체와 같은 숙주 세포 결정기에 결합하는 것을 매개하는 인플루엔자 HA의 구상(globular) 영역을 포함하는 서열번호: 14의 아미노산 코디네이트 116-261로 정의된 아미노산 서열을 포함한다.

더욱 바람직하게 본 발명의 폴리펩티드는 인플루엔자 HA의 추가의 최소 구상 영역을 포함하는 서열번호: 15의 아미노산 코디네이트 116-245로 정의된 아미노산 서열을 포함한다.

인플루엔자 HA 폴리펩티드의 수용체 결합 포켓은 배좌 제한에 기인하여 대체로 면역계에 노출되지 않기 때문에, 본 발명의 이러한 일면의 폴리펩티드는 바람직하게 서열번호: 1의 아미노산 코디네이트 _91-261로 정의된 것과 같은 추가의 항원성 에피토프를 추가로 포함한다[McEwen (1992) Vaccine 10:405-411; Muller (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:569-573; Shapira (1985) J. Immunopharmacol. 7: 719-723].

상기 표 1에 제공된 것과 같이, 바람직하게 보존되는 다른 항원성 에피토프도 본 발명의 폴리펩티드에 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

바람직하게, 본 발명의 이러한 일면의 폴리펩티드를 서열번호: 13-15에 나타낸다.

다르게는, 본 발명의 이러한 일면의 폴리펩티드는 서열번호: 13-15에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 자연(native) 펩티드 (또는 분해 산물, 합성적으로 합성된 펩티드 또는 재조합 펩티드) 및 펩티도미메틱(peptidomimetic) (통상, 합성적으로 합성된 펩티드), 및 펩티드 유사체인 펩토이드 및 세미펩토이드를 포함하고, 이는 예를 들면 체내에서 펩티드를 더욱 안정적으로 하는 변형, 또는 세포내로 더 잘 침투될 수 있도록 하는 변형을 가질 수 있다. 상기 변형으로는 CH₂-NH, CH₂-S, CH₂-S=O, O=C-NH, CH₂-O, CH₂-CH₂, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH을 포함하나 이에 한정되지 않는 펩티드 결합 변형, C 말단 변형, N 말단 변형, 백본 변형 및 잔기 변형이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 펩티도미메틱 화합물을 제조하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Quantitative Drug Design, C. A. Ramsden Gd. , Chapter 17. 2, F. Choplin Pergamon Press (1992)](본 명세서에 전체적으로 참고 문헌으로서 인용된다)에 기술되어 있다. 추가로 이와 관련하여 하기에 상세히 설명한다.

펩티드내 펩티드 결합(-CO-NH-)은 예를 들면 N-메틸화 결합(-N(CH₃)-CO-), 에스테르 결합(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), 케토메틸렌 결합(-CO-CH₂-), α-아자 결합 (-NH-N(R)-CO-)(여기에서, R은 알킬, 예를 들어 메틸이다), 카바 결합(-CH₂-NH-), 하이드록시에틸렌 결합(-CH(OH)-CH₂-), 티오아미드 결합(-CS-NH-), 올레핀 이중 결합(-CH=CH-), 레트로 아미드 결합(-NH-CO-), 펩티드 유도체(-N(R)-CH₂-CO-)(여기에서, R은 탄소 원자상에 자연발생적으로 존재하는 "일반(normal)" 측쇄이다)에 의해 치환될 수 있다.

이들 변형은 펩티드 쇄에 따라 특정 결합에서, 및 동시에 여러 부분(2-3)에서 발생할 수 있다.

자연발생된 방향족 아미노산, Trp, Tyr 및 Phe는 TIC, 나프틸레라닌 (Nol), Phe의 환-메틸화 유도체, Phe의 할로겐화 유도체 또는 o-메틸-Tyr과 같은 비자연발생된 합성 산에 의해 치환될 수 있다.

상기외에도 본 발명의 펩티드는 또한 하나 이상의 변형된 아미노산 또는 하나 이상의 비-아미노산 모노머(예: 지방산, 복합 카보하이드레이트 등)을 포함할 수 있다.

본 명세서 및 이하 청구 범위에서 사용되는 용어 "아미노산" 또는 아미노산들"은 자연발생된 20개의 아미노산; 생체내에서 주로 해독후 변형된 아미노산(예를 들어 하이드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌 포함); 및 2-아미노아디프산, 하이드록시리신, 이소데스모신, 노르-발린, 노르-류신 및 오르니틴을 포함하나 이에 한정되지 않는 그외의 비통상의 아미노산을 포함하는 것으로 이해된다. 추가로, 용어 "아미노산"은 D- 및 L-아미노산을 포함한다.

이하, 표 2 및 3에 본 발명에서 사용될 수 있는 자연발생된 아미노산(표 2) 및 특수(non-conventional) 또는 변형된 아미노산 (표 3)을 열거한다.

표 2

아미노산	3문자 약어	1문자 기호
알라닌 아르기닌 아스파라긴 아스파르트산 시스테인 글루타민 글루탐산 글리신 히스티딘 이소류신 류신 리신 메티오닌 페닐알라닌 프롤린 세린 트레오닌 트립토판 티로신 발린 상기한 임의의 아미노산	Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His lie Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Xaa	A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V X

표 3

표 3 (계속)

표 3 (계속)

본 발명의 펩티드는 바람직하게 선형 형태로 사용되지만, 폐환화가 펩티드의 특성을 심각하게 간섭하지 않는 경우에는 폐환 형태의 펩티드 또한 사용할 수 있다.

본 발명자들은 본 발명의 교시에 따라 제조된 폴리펩티드가 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도시킬 수 있다고 결론지었다(실시부의 실시예 7-8 참조).

펩티드 면역화와 비교하여 DNA 면역화가 다수의 바이러스 병인에 대하여 더욱 우수한 세포 면역 반응을 일으킨다는 것을 이해할 것이다.

따라서, 본 발명의 추가의 일면에 따라 상기 기술된 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 게놈, 상보적 또는 구성(composite) 폴리뉴클레오티드를 구성할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 어구 "상보적 폴리뉴클레오티드 서열"은 본래 역전사 효소 또는 다른 RNA 의존 DNA 폴리메라제를 사용하여 메신저 RNA의 역전사로부터 제조된 서열을 포함한다. 이어서, 상기 서열은 DNA 의존 DNA 폴리메라제를 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 증폭될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 어구 "게놈 폴리뉴클레오티드 서열"은 본래 염색체로부터 유래하고, 염색체 인접(contiguous) 부분을 반영하는 서열이다.

본 명세서에서 사용되는 어구 "구성 폴리뉴클레오티드 서열"은 적어도 부분적으로 상보적이고 적어도 부분적으로 게놈성인 서열을 포함한다. 구성 서열은 HA 구상 영역을 코딩하기 위하여 요구되는 몇몇 엑손 서열, 글리코실화 공통(consensus) 사이트, 및 그들 사이에 위치하는 몇몇 인트론 서열을 포함할 수 있다. 인트론 서열은 다른 유전자들 포함하여, 어느 공급원일 수 있고, 전형적으로 보존되는 스플라이싱(conserved splicing) 시그널 서열을 포함할 것이다. 상기 인트론 서열은 추가로 시스 작용부위 조절요소를 포함할 수 있다. 인트론 서열은 또한 해독되는 단백질에 도움이 될 수 있다.

이하 실시부의 실시예 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 대하여 제조된 항체는 다중 인플루엔자 균주 종과 교차 반응을 하고 그 자체로서 다양한 임상적 적용에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가의 일면에 따라, 상기 기술된 본 발명의 폴리펩티드 를 특이적으로 인식하는 항원 결합 사이트를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 완전한 항체 분자를 말하며, 어구 "항체 단편"은 대식세포에 결합할 수 있는 Fab, F(ab')₂ 및 Fv와 같은 그의 작용성 단편을 말한다. 이들 작용성 항체 단편은 하기와 같이 정의된다: (i) Fab는 항체 분자의 1가 항원-결합 단편을 포함하는 단편이고 전체 항체를 효소 파페인(papain)으로 분해하여 완전한 경쇄 및 하나의 중쇄 일부를 수득함으로써 제조될 수 있고; (ii) Fab'는 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원시켜 완전한 경쇄 및 중쇄 일부를 수득함으로써 얻을 수 있는 항체 분자 단편이고; 항체 분자 1개당 두개의 Fab' 단편이 수득되고; (iii) (Fab')₂는 전체 항체를 효소 펩신으로 처리하고, 이후 환원시키지 않고 수득할 수 있는 항체 단편이고; F(ab')₂는 2개의 디설파이드 결합에 의해 결합된 2개의 Fab' 단편 다이머이고; (iv) Fv는 2개의 쇄로서 발현된 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전공학적으로 처리된 단편으로서 정의되고; (v) 단쇄 항체 ("SCA")는 유전자적으로 융합된 단쇄 분자로서 적절한 폴리펩티드 링커에 의해 연결된, 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전공학적으로 처리된 분자이고; (vi) 상보적-결정 영역(CDR)을 코딩하는 펩티드.

항체(즉, 모노클로날 및 폴리클로날)를 제조하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 항체는 본 분야의 공지된 수개의 방법중 어느 하나를 통해 제조될 수 있고, 상기 방법은 항체 분자, 문헌[Orlandi D. R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837, Winter G. et al. (1991) Nature 349:293-299]에 기술된 바와 같은 고특이성 결합 시약 패널 또는 스크리닝 면역글로불린 라이브러리의 생체내 생산 유도, 또는 배양액중 연속 세포주에 의한 모노클로날 항체 분자의 제조를 사용할 수 있다. 이들로는 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 및 Epstein-Bar-바이러스(EBV)-하이브리도마 기술이 포함되나 이에 한정되지 않는다[Kohler G. , et al. (1975) Nature 256:495-497, KozborD. , et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42, Cote R. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030, Cole S. P. et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 62:109-120].

본 분야에 잘 공지되어 있는 방법을 사용하여 항체 단편을 수득할 수 있다(참고예: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1988(참조 문헌으로서 인용됨)). 예를 들면, 본 발명에 따른 항체 단편은 항체의 단백질 가수 분해에 의해 또는 단편을 코딩하는 DNA를 E. coli 또는 포유동물 세포(예: 차이니즈 햄스터 난소 세포 배양액 또는 다른 단백질 발현 시스템)에서 발현시켜 제조될 수 있다.

다르게는, 통상의 방법으로 전체 항체를 펩신 또는 파페인으로 분해하여 항체 단편을 수득할 수 있다. 예를 들면, 항체를 펩신을 사용하여 효소적으로 절단하여 F(ab')₂로 표시한 5S 단편을 제공하므로써 항체 단편을 제조할 수 있다. 티올 환원제, 및 임의로 디설파이드 결합을 절단하여 형성된 설프하이드릴 그룹에 대한 차단 그룹(blocking group)을 사용하여 이 단편을 추가로 절단시켜 3. 5S Fab' 1가 단편을 생산할 수 있다. 다르게는, 펩신을 사용하여 효소적으로 절단하여 2개의 1가 Fab' 단편 및 Fc 단편을 직접 생산한다. 이 방법은 예를 들어 골든버그(Goldenberg)의 미국특허 제 4,036,945호 및 제 4,331,647호, 및 이들 명세서에 포함된 참고 문헌에 기술되어 있다(상기 특허는 본 명세서에 전체적으로 참고 문헌으로서 인용됨). 문헌[Porter, R. R. , Biochem. J. , 73: 119-126, 1959]도 참조하기 바란다. 단편이 완전한 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한, 항체를 절단하는 다른 방법, 이를테면 1가의 경-중쇄 단편을 형성하기 위한 중쇄 분리법, 추가의 단편 절단, 또는 다른 효소적, 화학적, 또는 유전자 기술 또한 사용할 수 있다.

Fv 단편은 V_H 및 V_L 쇄의 회합(association)을 포함할 수 있다. 이 회합은 문헌[Inbar et al. , Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62, 1972]에 기술된 바와 같이 비공유결합일 수 있다. 다르게는, 가변 쇄는 분자간(intermolecular) 디설파이드 결합에 의해 연결되거나 글루타르알데히드와 같은 화학물질에 의해 가교결합될 수 있다. 바람직하게, Fv 단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 V_H 및 V_L 쇄를 포함한다. 이들 단쇄 항원 결합 단백질(sFv)은 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 V_H 및 V_L 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자(sturctural gene)를 작제하여 제조한다. 구조 유전자를 발현 벡터내로 삽입한 후, E. coli와 같은 숙주 세포내로 도입시킨다. 재조합 숙주 세포는 2개의 V 도메인을 연결시키는 링커 펩티드를 사용하여 단일 폴리펩티드 쇄를 합성한다. sFvs 생산 방법은 예를 들어 문헌[Whitlow 및 Filpula, Methods, 2: 97-105, 1991; Bird et al. , Science 242:423- 426,1988; Pack et al. , Bio/Technology 11:1271-77, 1993; 및 라드너(Ladner) 등의 미국특허 제 4,946,778호]에 기술되어 있다.

CDR 펩티드("최소 인식 단위(minimal recognition units)")는 관심의 대상이 되는 항체의 CDR을 코딩하는 유전자를 작제하여 수득할 수 있다. 이 유전자는 예를 들어, 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하기 위한 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 제조된다. (참조예, Larrick and Fry, Methods, 2:106-10, 1991).

인간의 치료법 또는 진단을 위해 바람직하게 인간화된 항체를 사용한다는 것을 이해할 것이다. 비인간형(예: 뮤린) 항체의 인간화된 형태는 비인간형 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(예: Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 서브시퀀스)의 키메라 분자이다. 인간화된 항체는 수혜자의 상보적 결정 영역(CDR)로부터의 잔기가 예를 들어 원하는 특이성, 친화력 및 수용능을 갖는 마우스, 래트 또는 래빗과 같은 비인간형 종(기증자 항체)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린 (수혜자 항체)이다. 일례로, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비인간형 잔기로 대체된다. 인간화된 항체는 또한 수혜자 항체 및 들여오는(imported) CDR에서도 발견되지 않는 잔기 또는 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 및 전형적으로 두개의 가변 도메인 모두를 포함하고, 모두 또는 실질적으로 CDR 영역 모두는 비인간형 면역글로불린 것에 상응하고, 모두 또는 실질적으로 FR 영역 모두는 인간 면역글로불 린 공통 서열의 영역이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)중 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다[Jones et al. , Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. , Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. , 2: 593-596 (1992)].

비인간형 항체를 인간화시키는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 일반적으로 인간화된 항체는 인간이 아닌 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 비인간형 아미노산 잔기를 주로 임포트(import) 잔기로서 언급하고, 이는 통상 임포트 가변 도메인으로부터 제공받는다. 윈터(Winter) 및 동료의 방법[Jones et al. , Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al. , Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. , Science, 239:1534-1536 (1988)]에 따라 로덴츠(Rodents)의 CDRs 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환하여 실질적으로 인간화를 수행할 수 있다. 따라서, 상기 인간화된 항체는 키메라성 항체이다(미국특허 제 4,816,567호)(여기에서, 실질적으로 소수의 완전한 인간 가변 도메인은 비인간형 종으로부터의 상응하는 서열로 치환되었다). 실제로 인간화된 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 몇몇 FR 잔기가 로덴츠 항체내 유사한 사이트의 잔기에 의해 치환된 통상의 인간 항체이다.

인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는, 본 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. , 227:381 (1991); Marks et al. , J. Mol. Biol. , 222:581 (1991)]. 콜(Cole) 등 및 베너(Boerner) 등의 기술 또한 인간 모노클로날 항체 제조에 이용할 수 있다 [(Cole et al. , monoclonal antibody and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al. , J. Immunol. , 147(1):86-95 (1991)]. 유사하게, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 전체적으로 불활성화된 마우스와 같은 트랜스제닉(transgenic) 동물내로 인간 면역글로불린 유전자 좌(locus)를 도입하여 인간형을 제조할 수 있다. 면역성 시험감염(challenge)시, 인간 항체의 생산이 관찰되었고, 이는 유전자 재배열, 어셈블리, 및 항체 레파토리를 포함하여 모든 측면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하였다. 이러한 접근법은 예를 들면, 미국특허 제 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016호 및 하기 과학 문헌[Marks et al. , Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al. , Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al. , Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)]에 기술되어 있다.

상기 언급한 바와 같이, 인플루엔자 감염을 치료하기 위하여 본 발명의 폴리펩티드 및 핵산 서열을 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가의 일면에 따라 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다.

본 방법은 상기 기술된 바와 같이, 치료학적 유효량의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및/또는 항체를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하여 수행한다.

바람직한 투여 경로 및 약학조성물이 하기 기술되어 있다.

본 발명의 교시에 따라 제조된 항체를 생체 시료에서 인플루엔자 바이러스를 확인하는데 사용할 수 있음을 이해할 것이다.

본 방법은 상기 기술된 바와 같은 생체 시료를 본 발명의 항체 또는 항체 단편과 접촉시켜 수행할 수 있다.

이하, 생체 시료중 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역복합체를 검출하여 생체 시료내 인플루엔자 바이러스를 확인한다.

바람직하게는, 검출하기 전에 면역복합체를 세척하여 비특이적으로 결합한 항체를 제거함으로써 1차 면역복합체내 특이적으로 결합된 항체만이 검출될 수 있도록 한다.

일반적으로 면역복합체 형성을 검출하는 것은 본 분야에 잘 공지되어 있고 이는 수개의 접근법중 하나에 의해 수행될 수 있다. 이 접근법은 상기 기술된 바와 같은 표지 또는 마커의 검출에 기초한다.

본 발명의 교시에 따라 제조된 핵산 분자, 그의 컨쥬게이트, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 항체는 진단용 또는 치료용 키트에 포함될 수 있다. 이 시약을 적절한 완충액 및 보존제와 함께 하나 이상의 용기에 패킹하여, 진단 또는 치료적 요법을 위해 사용할 수 있다.

따라서, 핵산 분자 및 그의 컨쥬게이트를 단일 용기에서 각각 혼합할 수 있거나 개별 용기에 위치시킬 수 있다. 바람직하게, 용기는 표지를 포함한다. 적절한 용기로는 예를 들어 병, 바이얼, 시린지 및 테스트 튜브가 포함된다. 용기는 다양한 재료, 이를테면 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다.

추가로, 안정화제, 완충액, 차단제 등과 같은 그밖의 첨가물을 또한 가할 수 있다. 기술되는 바와 같이 키트의 핵산 분자 및 그의 컨쥬게이트를 고체 지지체에 부착시켜 진단 목적을 위해 사용할 수 있다. 키트에는 또한 시험 대상이 인플루엔자에 감염되었는지 또는 인플루엔자에 감염될 위험이 있는지를 측정하는 사용설명서가 포함된다.

이로써 본 발명의 추가의 목적, 장점 및 신규한 특징은 비한정적인 하기 실시예의 실험을 통해 당업자들에게 자명할 것이다. 또한 상기 설명되고 이하 청구 범위에서 청구하는 본 발명의 다양한 일례 및 일면은 하기 실시예를 통해 실험적으로 입증될 것이다.

[실시예]

상기한 설명과 함께 하기 실시예를 참고하여 본 발명을 비한정적으로 설명한다.

일반적으로 본 명세서에서 사용되는 명칭 및 본 발명에서 사용되는 실험실 방법은 분자, 생화학, 분자생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 상기 기술은 전체적으로 문헌에 설명되어 있다. 문헌["Molecular Cloning: A laboratory Manual"Sambrook et al. , (1989); "Current Protocols in Molecular Biology "Volumes I-III Ausubel, R. M. , ed. (1994); Ausubel et al. , "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al. , "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U. S. Pat. Nos. 4,666, 828; 4,683, 202; 4,801, 531; 5,192, 659 and 5,272, 057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E. , ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E. , ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co. , New York (1980)]을 참조하기 바라며 이용가능한 면역에세이는 전체적으로 특허 및 과학 문헌에 기술되어 있다[참조예, 미국특허 제 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521호; "oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J. , ed. (1984); "Nucleic aicd Hybridization" Hames, B. D. , and Higgins S. J. , eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D. , and Higgins S. J. , Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I. , ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B. , (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al. , "Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)](상기한 문헌은 모두 본 명세서에서 전체적으로 참고 문헌으로서 인용된다). 이 문서 전체를 통해 다른 일반 문헌이 제공된다. 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있고 독자의 용이를 위해 제공된다. 이에 포함된 모든 정보는 본 명세서에서 참고적으로 인용된다.

실시예 1

헤마글루티닌-특이 압타머-원리 및 디자인

인플루엔자 헤마글루티닌(HA)에 결합하는 압타머 올리고뉴클레오티드를 확인하기 위하여 셀렉스(SELEX, Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)를 수행하였다.

재료 및 실험 방법

라이브러리 제작 - 공통 5'서열-AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG (서열번호: 16, T3으로 표시, Stratagene, La사) 및 공통 3' 서열-5'-TAT GGT CGA ATA AGT TAA-3' (서열번호: 17) 측면에 위치하는 뉴클레오티드 30개의 중심 랜덤화 서열을 포함하는 압타머 라이브러리는 380B DNA 합성기(Applied Biosystems사)에서 합성하였다. 라이브러리는 총 분자수 10¹⁶개 이상의 30개의 뉴클레오티드 랜덤 세그먼트를 포함하고, 제조업자의 사용설명서에 따라 제작하였다(Applied Biosystems사).

셀렉스(SELEX) - ssDNA 압타머를 80℃에서 10분동안 변성시킨 후 10분동안 얼음상에서 냉각시켰다. 압타머 30nmole을 30분동안 37℃에서 500㎕ 선별 완충액 (50mM Tris-HCl; pH 7. 4, 5mM KCl, 100mM NaCl, 1mM MgCl₂, tRNA, 0. 2% BSA)중 25㎍의 HA_91-261 펩티드(추가로 이하에 기술함)와 혼합하였다. 25㎕ Ni-NTA 슈퍼플로(superflow)(Qiagen사, 독일 힐덴 소재)를 가하여 압타머-펩티드 복합체를 정제하고 압타머 라이브러리에서 공통 서열을 지향(direct)하는 프라이머[즉, 5'-AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG-3', 서열번호: 18 (T3) 및 3' 프라이머 5' TTA ACT TAT TCG ACC ATA-3', 서열번호: 19]를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이와 같은 SELEX를 3회 반복한 후 증폭된 뉴클레오티드를 E. coli내로 형질전환시켰다. SELEX를 위한 PCR 조건은 5 분 95℃/ 1분 95 ℃/ 1분 55℃/ 1분 72℃/ 10분 72℃ 및 100 pmole의 각 프라이머를 포함한다.

압타머의 역 스크리닝 - 각각의 각개 클론으로부터 선택된 ssDNAs 분자를 5' 프라이머(T3 프라이머)와 동일한 서열인 B-T3(Stratagene사, 캘리포니아 라졸라 소재), 및 클레노우(klenow) 단편(2 유니트/㎖)를 사용하여 바이오틴화하였다. 역 스크리닝을 위한 싱글 스트랜드 바이오틴 컨쥬게이트된 A22 압타머를 제조하기 위하여 T3 프라이머(서열번호: 18)를 Biotin 표시하였다(stratagene사, 캘리포니아 라졸라 소재).

0. 1M NaHC0₃로 희석된 100㎍의 스트렙타비딘(100㎍/㎖)을 사용하여 각 웰을 코팅한 후 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켜 96-웰 평평한 바닥 ELISA 플레이트(Immunoplate사, 덴마크 눈크 소재)를 제조하였다. PBS로 수회 세척한 후, 실온에서 2시간동안 1% BSA를 포함하는 200㎕의 PBS로 웰을 차단한 후 PBS-T(0,05% (v/v) Tween-20를 포함하는 10mM PBS)로 3회 세척하였다. 이후, 100㎕의 2. 5pmole/100㎕ 바이오틴화된 -ssDNA를 웰에 가하고 37℃에서 2시간동안 인큐베이션시킨 후 PBS-T를 사용하여 4회에 걸쳐 세척하였다. T3 프라이머를 음성 대조군으로 사용하였다(서열번호: 18). 세척한 후 100㎕의 10 헤마글루티닌 유니트(HAU)의 인플루엔자 바이러스 또는 2㎍의 히스티딘 표지된 HA _91-261 펩티드를 지정된 웰에 가하고 37℃에서 2시간동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 PBS-T를 사용하여 4회에 걸쳐 세척하고, 항-히스티딘 항체(Qiagen사, 독일 힐덴 소재) 및 항-바이러스 항체 (재조합 HA_91-261로 면역화된 마우스로부터의 혈청 샘플)를 상응하는 웰에 가하였다. ELISA에 의해 역 스크리닝을 완료하였다.

효소면역측정법(ELISA) - 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켜 인산 완충 처리된 염수(PBS)에 희석된 100 HAU/㎖의 다양한 인플루엔자를 포함하는 요막액 100㎕으로 고 결합능 ELISA 플레이트(Immunoplate사, 덴마크 눈크 소재를 코팅하였다. PBS로 수회 세척한 후, 1% 소혈청알부민(BSA)를 포함하는 200㎕의 PBS로 웰을 차단하고, 실온에서 90분동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 0. 05% (v/v) Tween-20를 포함하는 PBS(PBS-T)로 플레이트를 3회 세척하였다. 이어서, 각 웰을 일련의 희석된 혈청 샘플 100㎕으로 보충하고 37℃에서 2시간동안 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 기간 후, PBS-T에서 플레이트를 5회 세척하고 결합된 항체는 허스래디시페록시다제(horseradish peroxidase) 표지된 고트(goat) 항-마우스 IgG 컨쥬게이트(HRP; Jackson Laboratories사)를 사용하여 검출하였다. 실온에서 30분동안 3,3',5,5'-테 트라메틸 벤지딘 용액(TMB, Zymed사)과 함께 인큐베이션시켜 면역복합체를 가시화하였다. 50㎕의 2M H₂SO₄로 반응을 종결시키고 450nm에서 다채널 분광 광도계(Titertek, Multiskan MCC/340 MK II, Lab system사, 핀랜드)를 사용하여 플레이트를 판독하였다.

결과

HA 분자의 아미노산_91-261에 결합하는 올리고뉴클레오티드를 확인하기 위하여 보존 링커 사이에 랜덤한 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 라이브러리를 합성하였다. 라이브러리는 10¹⁸ 타입의 상이한 ssDNA를 포함하였고, 이를 HA_91-261 펩티드와 혼성화시키고 Ni-NTA 수지에 의해 정제하였다. 정제한 후, 링커 서열을 사용하여 PCR에 의해 ssDNAs를 증폭시켰다. 본 프로세스를 4회 반복하고 ELISA에 의해 HA_91-261-결합을 재스크리닝하였다.

본 역-스크리닝 프로세스를 통해 'A21' 및 'A22' (각각, 서열번호: 11 및 12)로 표시하는 두개의 올리고뉴클레오티드 압타머를 수득하였다. A21 및 A22는 HA_91-261에 대하여 동일한 결합능을 나타내었지만, 완전한 바이러스와의 결합에 있어서는 현저한 차이를 나타내었다(도 2a-b). 따라서, 추가로 A22 올리고뉴클레오티드만을 구조적 및 기능적으로 분석하였다. DNAdraw 프로그램(18)을 사용하여 A22, A21 및 대조군 올리고뉴클레오티드에 대한 제안된 2차 구조를 도 2c-e에 나타내었다.

실시예 2

압타머의 인플루엔자 감염으로부터의 시험관내 방어

인플루엔자 감염(H3N2 Port Chalmers 균주)에 대한 A22 압타머의 방어 효과를 MDCK 세포(19)를 사용하여 시험관내에서 조사하였다.

재료 및 실험 방법

바이러스 - 인플루엔자 균주 A/Port Chalmers/1/73(H3N2), A/Texas/1/77 (H3N2), PR/8/34 (H1N1) 및 Japanese/57 (H2N2)를 11일된 암탉 발육란의 요막공간(Bar On Hatchery, Hod Hasharon사, 이스라엘)에서 배양하였다. Barret 및 Inglis (23)에 기술된 표준 방법에 따라 바이러스 증식 및 정제를 수행하였다. 헤마글루틴화 에세이에 의해 요막액중 바이러스를 적정하였다.

세포 - 열 불활성화된 10% 우태아혈청(FCS)로 보충된 둘베코스 변형 이글스 배지(DMEM, Dulbecco's modified Eagle's medium)에 Madin-Darby Canine Kidney 세포(MDCK, ATCC #CCL 34)를 유지시켰다.

MTT 에세이 - 에세이하기 1일전에 MDCK 세포를 96웰 플레이트(7x10⁴/웰)에 플레이팅하였다. 세포를 둘베코스 인산 완충 처리된 염수(DPBS)로 2회 세척한 후 지정된 농도의 압타머의 존재 또는 부재하에, 10 HAU의 Port Chalmers/1/73 (H3N2) 또는 10 HAU의 Japan (H2N2)를 함유하는 25mM HEPES 및 4mM 중탄산나트륨(pH 7. 3)으로 보충된 핸크 밸런스 염 용액(HBSS)와 함께 1시간동안 인큐베이션시켰다. 감염 후 세포를 성장 배지에서 72시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. PBS에 용해시킨 4 mg/㎖ MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드, (Sigma, St. Louis사, 미국)를 세포 배양액에 가하고 3시간동안 37℃에서 인큐베이션시켜 MTT 에세이를 수행하였다. 이어서, 플레이트를 10분동안 800 x g에서 원심분리하였다. 상등액을 흡인시키고 포르마잔 염료를 150㎕/웰의 이소프로필 알코올(Merck사, 독일 다름스타트 소재)에 용해시키고, 540nm에서 ELISA 판독기를 사용하여 O. D. 값을 측정하였다.

바이러스 감염 전 바이러스로부터의 시험관내 방어 - 본 실험하기 24시간 전에 MDCK 세포를 96웰 플레이트(7x10⁴/웰)에 플레이팅하였다. 각 웰을 DPBS로 2회 세척하고 지정된 시점에 37℃에서 세포를 50 pmole A22로 처리하였다. 이어서, 세포를 DPBS로 2회 세척하고 보강(enriched) HBSS중에서 1시간동안 10 HAU H3N2로 감염시켰다. 인큐베이션시킨 후 세포를 성장 배지로 이동시키고 72시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이후, 기술한 바와 같이 MTT 에세이를 수행하였다.

바이러스 감염 후 바이러스로부터의 시험관내 방어 - 바이러스로 감염하기 24시간 전에 MDCK 세포를 96웰 플레이트(7x10⁴/웰)에 플레이팅하였다. 상기 기술한 바와 같이 바이러스 감염시켰다. 감염된 세포를 3회에 걸쳐 DPBS로 서서히 세척하였다. 이어서, 세포를 1시간동안 37℃에서 50 pmole A22로 처리하였다. 인큐베이션시킨 후 세포를 성장 배지로 이동시키고 72시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이후, 기술한 바와 같이 MTT 에세이를 수행하였다.

면역염색법(Immunostaining) - 5x1O⁵ MDCK 세포를 유리 커버 슬립상에 놓았다. 24시간 후, 1시간동안 A22와 함께 프리인큐베이션시키거나 시키지 않고 인플루엔자 바이러스 (Port Chalmers/1/73, H3N2)를 가하였다. 추가의 48시간 후, 0. 5% Triton X-100를 포함하는 3% 파라포름알데히드로 세포를 투과할 수 있도록 한 후 새로 제조된 3% 포름알데히드로 고정시켰다. 인플루엔자 헤마글루티닌에 특이적인 마우스 모노클로날 항체(1:100으로 희석, Santa Cruz Biotechnology Inc사)를 배양액과 함께 인큐베이션시켜 인플루엔자 표면 항원 헤마글루티닌을 검출하였다. 습윤 챔버내에서 1시간동안 실온에서 모든 항체를 인큐베이션시킨 후 PBS로 3회 세척하였다. 1차 항체를 Cy3 컨쥬게이트된 고트 항-마우스 면역글로불린(Jackson Immunoresearch Laboratories사, 미국) 2차 항체로 검출하였다. 2㎍/㎖ 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; Sigma사, 이스라엘)로 염색하여 핵을 가시화하였다. Nikon Eclipse E600 현미경을 사용하여 면역형광현미경검사법을 수행하였다. Spot 소프트웨어 프로그램을 사용하여 사진을 찍었다. 이미지를 Adobe Photoshop(Adobe Systems사, 캘리포니아 마운틴뷰 소재)으로 프로세싱하였다.

결과

시험관내에서 세포를 인플루엔자 바이러스 감염로부터 방어하는 압타머 능력을 시험하였다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 바이러스 감염(H2N2) 전 압타머 A22로 처리된 세포는 바이러스와 관련된 세포 사멸에 있어 현저히 감소된 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 비감염 세포에 대한 방어 효과는 아마도 고농도에 기인하여 50 내 지 100pmole의 A22의 농도에서 피크점에 도달하였다(도 3b). 따라서, 추가의 바이러스 균주 H3N2 감염에 대한 50 pmole A22 효과를 연구하였다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 비감염된 MDCK 세포와 비교할 때 A22는 H2N2 및 H3N2에 대한 세포의 감염에 대하여 각각 대략적으로 60% 및 70% 방어하였다. 또한 흥미롭게도, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 세포 사망율을 전혀 저하시키지 못하는 무관한 올리고뉴클레오티드 대조군과 비교할 때 A21 압타머도 바이러스의 시험관내 감염성을 저하시킬 수 있었다.

이어서, 숙주 단백질에 결합하는 A22 압타머의 능력을 측정하였다. 바이러스 감염에 앞서 MDCK 세포를 A22 (50 pmole)와 함께 30분 또는 60분동안 인큐베이션시킨 후 반복하여 세척하였다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, 처리군 및 비처리군 세포의 생존율에 있어서 뚜렷한 차이는 관찰되지 않았고, A22에 대한 세포 노출에 있어서도 양 세포간의 차이(즉, 바이러스 감염 전 및 감염 후)를 검출할 수 없었다. 이 결과는 A22의 저해 활성은 숙주 세포상의 시알산 포함 수용체의 직접적인 차단에 기인한 것이 아니라는 것을 제시한다.

바이러스와 숙수 세포 수용체가 결합한 후 첨가한 경우에도 A22는 여전히 방어성을 갖고 있는지를 조사하기 위하여, MDCK 세포를 50 pmole A22로 처리하기 전에 30분 또는 60분동안 10 HAU H3N2 바이러스와 인큐베이션시켰다. 도 3d에 나타낸 바와 같이, 60분동안 바이러스와 인큐베이션시킨 후의 A22의 효과는 현저하지 않았다. 대조적으로, 감염되지 않은 세포와 60분동안 바이러스와 인큐베이션시킨 세포간의 차는 현저하였다(p=0. 0028). 특히, A22로 처리하기 전에 오직 30분동안만 바 이러스와 인큐베이션 시킨 것과 감염되지 않은 세포간의 차는 매우 큰 것으로 관찰되었다. 따라서, 이 결과로부터, 일단 바이러스-숙수 세포 수용체의 상호작용이 그의 최적 조건에 도달하게 되면, A22는 세포-사멸을 막을 수 없는 것이 제시하였다.

바이러스 결합 및 세포내로의 진입을 막는 A22의 효과 또한 현미경 분석을 통해 입증되었다. 도 4a-c에 나타낸 바와 같이, 광학 현미경을 사용한 바, 모든 형태의 MDCK 세포가 바이러스 감염에 의해 손상되었다(도 4a). 대조적으로 A22의 존재하에서는 파괴는 저해되고 세포 형가 대체로 보존되었다(도 4b). 추가로, A22의 단순(mere) 처리는 세포의 형태에 어떠한 영향도 미치지 않아(도 4c), 손상은 단지 바이러스에 의해서만 유발되는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 추가로 Cy3 표지된 특이 항-HA 모노클로날 항체를 사용하여 바이러스의 존재를 조사하는 면역형광법에 의해 입증되었다. 나타낸 바와 같이, 감염된 세포에서 바이러스의 존재가 확실하게 입증되었지만(도 4d), A22의 첨가에 의해 거의 대부분 억제되었다(도 4e). 비처리 세포는 A22로 처리된 세포와 일치하는 것으로 나타났다(도 4f).

실시예 3

압타머의 인플루엔자 감염으로부터 생체내 방어

인플루엔자 감염(H3N2 Port Chalmers 균주)에 대한 A22 압타머의 방어 효과를 감염된 마우스에서 조사하였다.

재료 및 실험 방법

마우스 - 10-12주령된 BALB/c 마우스를 Harlan Laboratories사(이스라엘 레 호보트 소재)로부터 구입하였다.

동물 감염 - 2. 5 nmole A22 압타머와 함께 100 HAU Port Chalmers/1/73 (H3N2) 바이러스를 포함하거나, 2. 5 nmole A22 압타머없이 100 HAU Port Chalmers/1/73 (H3N2) 바이러스만을 포함하는 준치사 감염성 요막액을 상이한 시간 간격으로 마우스에 비강내로 접종하였다. 2주동안 마우스의 체중을 조사하였다. 충란 적정법(egg titration)(19)에 의해 폐내 바이러스 역가를 측정하였다. 간단히, 바이러스 접종 후 6일째 마우스를 희생시키고 폐를 적출하고 PBS 0. 1% BSA (10% w/v)에서 균질화하였다. 균질화한 후 샘플을 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하고 -70℃에서 저장하였다. 실험 당일 해동시킨 폐 균질물(100㎕의 일련의 10배 희석액)을 9-11일된 발육란의 요막 공간내로 주사하였다. 37℃에서 48시간 및 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후 요막액을 제거하고 혈구응집측정 에세이에 의해 바이러스 존재를 측정하였다. 이 에세이 결과를 logEID₅₀ (26)으로 나타내었다.

혈구응집측정 에세이 - 최종 농도가 0. 5%가 될 때까지 치킨 적혈구 세포(CRBCs)를 Alsevier 용액에서 희석하였다. 50㎕의 샘플 및 50㎕의 0. 5% CRBCs를 포함하는 마이크로-티터 플레이트에서 에세이를 수행하였다. 90분간의 인큐베이션을 마치고 이 에세이 결과를 logEID₅₀ 로 나타내었다.

조직학 - 폐의 조직학적 분석을 위해, 7일째 마우스를 희생시키고 폐를 10%의 중성 완충처리된 포르말린(pH 7. 0)내로 적출시켰다. 이어서, 폐를 절편화하고 헤모톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 이에 대한 지식이 없는 관찰자에게 슬라이 드를 보여주었다.

통계학적 분석 - p < 0. 05의 통계학적 유의 수준으로 스튜던트 t-테스트를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다.

결과 - 바이러스 감염 전 및 후 생체내에서 A22의 항바이러스 성질을 측정하였다. 간단하게, 마우스를 '비처리', '0일', '-1일' 및 '+2일'로 지정된 4개의 그룹으로 분류하였다. 각 마우스를 100 HAU의 인플루엔자 A/Texas/1/77 바이러스로 시험감염시켰다. 바이러스 및 2. 5nmole/㎖ A22의 혼합물을 사용하여 비강내로(i. n) '0일' 그룹의 마우스에 접종하였다. 각각 바이러스 감염 1일전, 또는 바이러스 감염 후 2일째 2. 5 nmole/㎖ A22를 사용하여 i. n으로 '-1일' 및 '+2일' 그룹의 마우스에 접종하였다. 3개의 파라미터: (i) 바이러스 처리 후 16일동안의 체중 감소; (ii) 폐 바이러스 역가; (iii) 바이러스 접종 후 7일째의 폐-절편의 조직학적 조사에 의해 인플루엔자 감염을 조사하였다

감염되지 않은 마우스(도 5a)와 대조적으로, 감염된 마우스는 모노클로날 세포 및 허탈(collapsed) 환부의 용적 확장(bulk expansion)을 포함하는 전형적인 병상(pathology)을 나타내었다(도 5b). 대조적으로, 특히 '0일' 및 '-1일' 그룹의 A22 처리 마우스의 폐에서(각각, 도 5c 및 도 5d) 모노클로날 세포 침윤이 다소 덜 관찰되었고 꽈리 대부분은 열려있는 상태였다. 흥미롭게도, '+2 일' 그룹에서는 손상부 및 비손상부 모두를 관찰할 수 있었다(도 5e-f). 이러한 발견으로부터 A22 투여가 폐에서 염증 부위를 감소시키는 것이 제시된다. 추가로, 대조군과 비교하여, 처리군(+2일, 0일 및 - 1일)는 체중 감소도 현저히 낮고 회복도 현저히 빠른 것으 로 나타났다(도 6a).

마우스 폐내 바이러스 적재량(virus load)을 측정하는 전체 충란 적정법 (20)을 사용하여 A22의 방어 능력 또한 조사하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 상이한 시간 간격으로 2. 5nmole/㎖ A22 (125 pmole/mice)으로 처리된 마우스는 비처리군 마우스와 비교하여 바이러스 시험감염에 대하여 방어 효과를 나타내었다. '0일 그룹'에서 방어 효과가 가장 현저하였고, 비처리군 그룹과 비교해 폐 바이러스 역가에서 2를 초과하는 log 차이(이는 99% 초과의 방어와 동등한 값이다)를 나타내었다. A22 방어 효과에 있어 '+2일' 및 '-1일' 그룹 사이에는 현저한 차이가 관찰되지 않았다.

이러한 결과로부터 A22는 감염 전 및 감염 후 수 일간 효과가 있음이 제시된다. 방어 실험에 있어 단지 저농도의 A22만을 사용하였기 때문에(nmole/㎖ 농도), A22의 방어 효과는 증가될 수 있음을 이해할 것이다.

실시예 4

압타머 처리는 다양한 인플루엔자 균주에 의한 감염을 방어한다

HA의 수용체 결합 영역은 고도 보존 영역이기 때문에, A22의 방어 효과가 다른 인플루엔자 균주에 의한 감염에 대해서도 입증되는지를 시험하는 것이 관심의 대상이 되었다. 또한 압타머의 효과를 현재 이용가능한 항-인플루엔자 요법, 뉴라미다아제 저해제인 오셀트아미비르(Oseltamivir)의 것과 비교하는 것 또한 관심의 대상이 되었다.

재료 및 실험 방법

재료 - 셀트아미비르를 Roche(Basel, Switzerland)로부터 구입하였다.

동물 및 감염 방법 - 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.

결과

결과를 도 7a에 나타낸 바, 감염 당일 A22로 처리한 결과 3개의 인플루엔자 균주로 감염된 마우스에서 폐 바이러스 역가는 감소되었음이 입증되었다. 모든 시험 균주 균주 A/PR/8/34(H1N1), A/Japanese/37 (H2N2) 및 A/Texas/1/77 (H3N2)에 의한 감염을 방지함에 있어 A22가 효능이 있다는 것은 주목할 만하다. 이러한 발견에 의해 도 3b에 제시한 시험관내 에세이 결과가 확실해졌다. A22와 대조적으로 인플루엔자 뉴클레오프로테인(Nucleo단백질) 영역 NP 147-158(서열번호: 22)을 코딩하는, 무관한 대조군 뉴클레오티드는 바이러스 역가를 별로 변화시키지 못했다. A22보다는 효과가 없지만 압타머 A21도 A/Texas/1/77의 폐 바이러스 역가를 감소시킬 수 있다는 점이 주목할 만하다(H3N2, 도 7b 참조).

인플루엔자 감염을 저해하는 A22 압타머의 능력을 현재 이용가능한 항-인플루엔자 약물중 하나인 뉴라미다아제 저해제 오셀트아미비르의 것과 비교하였다. 이 목적을 위해, A22 및 오셀트아미비르 모두를 바이러스와 함께 비강내 경로를 통해 1회 투여하였다. 이하 표 4에 나타낸 바와 같이, 용량 20㎍/마우스의 오셀트아미비르(1mg/kg(체중))는 바이러스 역가를 0. 62 로그 EID₅₀까지 감소시켰고, 이 값은 바이러스 부하량을 4. 17배 감소시켰음을 나타내는 것이다. 대조적으로 이 특정 실험 에서 A22에 의한 영향은 1. 1 로그 EID₅₀까지 감소시켰고, 이 값은 바이러스 부하량을 10 배 이상 감소시켰음을 나타내는 것이다.

표 4

처리	Δ로그 EID50	감소한 배수(Fold reduction)	방어율(%)
A22	1. 11	12. 88	92. 3
오셀트아미비르	0. 62	4. 17	76. 03

이들 결과를 통해, 본 발명의 압타머 서열의 작용 메카니즘은 본질적으로 바이러스 세포 표면상의 HA의 수용체 결합 영역에 직접 결합하고, 이로써 바이러스가 숙주 세포에 부착하지 못하게 하여 결과적으로는 숙주 세포내로 진입하지 못하게 하는 것이라고 제시되었다.

실시예 5

압타머는 다중 인플루엔자 균주와 교차-반응한다

본 발명의 A22 압타머와 다중 인플루엔자 균주의 교차 반응을 ELISA 에세이를 사용하여 측정하였다.

재료 및 실험 방법 - 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다.

결과

본 발명의 DNA 압타머를 HA_91-261의 보존 서열에 기초하여 디자인하였기 때문 에, HA_91-261 및 다양한 인플루엔자 균주 사이의 교차 반응을 ELISA 에세이를 사용하여 측정하였다. 도 8a-e에 나타낸 바와 같이, 조사중 보존 펩티드에 대하여 형성 항체는 모든 인플루엔자 균주와 교차 반응하였고, 이는 펩티드의 보존을 입증하고, 본 발명의 압타머 약물의 전반적인 효능을 확인시켜 주었다.

실시예 6

재조합 HA _91-261 펩티드의 제조 및 특징화

실험 방법

RT-PCR에 의한 HA _91-261 펩티드의 제조 -인플루엔자 균주 A/Port Chalmers/1/73 바이러스의 전체 RNA를 분리하고 HA 단백질의 잔기 91-97 및 255-261에 상응하는 두개의 프라이머; 각각, 5'-GGA TCC AGC AAA GCT TTC AGC AAC TGT-3'(서열번호: 20) 및 5'- GTC GAC GCG CAT TTT GAA GTA ACC CC-3'(서열번호: 21), 및 Taq 폴리메라제(Invitrogen사, 캘리포니아 칼스바드 소재)를 사용하여 역전사 효소 (RT)-PCR을 위해 사용하였다. HA 단백질중 구상 영역의 일부(_91-261 아미노산)를 코딩하는 생성된 PCR 산물은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 이어서, E. coli에서 유전자 산물을 과잉발현시키기 위하여 pQE30 플라스미드(Qiagen사, 독일 힐덴 소재)내로 클로닝하였다. Ni- NTA 칼럼(Qiagen사)을 사용하여 5시간동안 IPTG 유도에 의해 수득한 과잉발현된 펩티드를 정제하였다. 마우스의 근육내로 주사하기 위하여 추가로 PCR 산물을 pCDNA3. 1 HisC 플라스미드(Invitrogen사, 캘리포니아 칼스바드 소재) 내로 클로닝하였다. 면역화 연구를 위해, 엔도프리(Endofree) 플라스미드 기가(Giga) 키트(Qiagen사)를 사용하여 플라스미드 DNA를 증폭시켰다.

결과

인플루엔자 바이러스 RNA의 HA_91-261 영역을 코딩하는 DNA 작제물을 포유 동물 및 박테리아 발현을 위해 작제하였다. 이 목적을 위해, 인플루엔자 HA의 아미노산 잔기 91-97 및 255-261에 상응하는 프라이머(각각 서열번호: 20 및 21)를 사용하여 인플루엔자 A 바이러스(즉, H3N2)로부터 PCR에 의해 HA_91-261 서열을 코딩하는 cDNA 단편을 증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 pQE30 플라스미드내로 클로닝하고 정제를 위해 그의 N-말단 부분을 프레임내 6 His 잔기로 태그하였다. 과잉발현되고 정제된 HA_91-261 단백질 단편을 도 9a에 나타낸 바와 같이 12 % SDS-PAGE에서 25 kDa로 이동하였다.

HA_91-108 펩티드에 대하여 형성된 특이적 래빗 항체 또는 인플루엔자 바이러스에 대한 래빗 항혈청을 사용하는 ELISA 에세이에 의해 HA_91-261의 항원성을 확인하였다(도 9b).

DNA 백신화를 위해, HA_91-261 펩티드를 코딩하는 PCR 산물을 HA_91-261 포유 동물의 발현 벡터내로 클로닝하고 CMV 프로모터하에 마우스의 세포에서 발현시켰다. PCR 산물의 BamHI/SaII 단편은 프레임내 N-말단 6 His 잔기 및 ATG 개시 코돈하에서, pCDNA3. 1 HisC 벡터의 BamHI/XhoI 사이트를 삽입하기 전에 확인하였다.

실시예 7

펩티드 및 DNA 백신화에 의해 형성된 체액성 면역 반응

재료 및 실험 방법

면역화 및 감염 방법 - 근육내로(i. m. ) HA_91-261을 코딩하는 100㎍의 플라스미드 DNA를 사용하여 8-10마리의 마우스 그룹을 면역화시켰다. 초기 면역화를 위해 사용된 것과 동일한 양의 항원을 사용하여 3주 간격으로 2회에 걸쳐 마우스에 추가접종하였다.

HA_91-261 펩티드에 대한 면역화를 위해 동물 1마리당 50㎕의 PBS중 50㎍의 펩티드를 에테르로 경미하게 마취된 마우스의 콧구멍을 통해(i. n. ) 투여하거나 프로인트 완전 애주번트(CFA)중 동일한 펩티드를 사용하여 발바닥에 주사하였다. 펩티드 및 DNA 백신을 병용하여 사용하기 위하여(DNA 초회감작(priming)-단백질 추가 접종의 병용), 플라스미드 pHA_91-261를 사용하여 마우스에 2회 근육내로 주사한 후 HA_91-261 펩티드를 비강내로 추가접종하였다.

마지막 추가접종 후 1개월째 경미한 에테르 마취하에 마우스 1마리당 1 HAU 인플루엔자 바이러스를 포함하는 감염성 요막액을 비강내 접종하여 마우스를 감염시켰다.

혈청 및 폐 균질물 제조 - 면역화된 마우스에서 특이 항-인플루엔자 항체의 생산을 측정하기 위하여, 2차 및 3차 면역화 후 3주째 채취한 혈액으로부터 IgG 에 세이를 위한 혈청을 제조하였다. 폐 균질물로부터의 상등액(PBS중 0. 1%의 BSA에 현탁됨)을 IgG 에세이 및 폐 바이러스 역가를 위해 채취하였다.

통계학적 분석 - Stat-View II 소프트웨어 (Abacus Concepts사, 캘리포니아 버클리 소재)를 사용하여 통계학적으로 분석하였다. Fisher PLSD 테스트를 이용하여 확률(p) 값을 계산하였다. 결과는 적어도 두개의 반복된 독립적 실험의 평균 및 표준 오차로 나타내었다.

결과

상이한 백신화에 의해 유도된 체액성 면역 반응 - 항체를 유도하는 그의 능력을 측정하기 위하여 상기 기술된 바와 같이, HA_91-261 펩티드 및 DNA 제제를 마우스에 투여하였다.

IgA 수준을 측정하기 위하여 마지막으로 면역화시킨 후 2주째 HA_91-261 펩티드 또는 플라스미드 pHA_91-261로 면역화된 마우스(그룹당 2마리)로부터의 폐 균질물을 수거하였다. 면역화된 마우스의 IgG 수준을 측정하기 위하여 IgG 에세이를 수행하였다. 간단하게, 3차 면역화 후 3주째 수거한 혈액으로부터 혈청을 제조하였다. 각 그룹의 샘플을 함께 풀링하고 HA_91-261 펩티드에 반응성인 항체, 및 완전 바이러스를 인식하는 것의 존재에 대하여 ELISA에 의해 분석하였다. 도 10a에 나타낸 바와 같이, 발바닥을 통해 HA_91-261 펩티드로 면역화시킨 것에서만 IgG 항체가 유도되었고, 비강내로 면역화시킨 후에는 HA_91-261 펩티드를 인식하는 검출가능한 IgG 항체는 관찰 되지 않았다. 그러나, 애주번트없이 HA_91-261 펩티드를 사용하여 비강내로 면역화시킨 후에도 완전 바이러스를 인식하는 IgG 항체가 상당한 수준으로 관찰되었다(도 1Ob).

도 10c에 나타낸 바와 같이 HA_91-261 펩티드에 의해 유도된 항체는 HINI (PR/8/34) 및 H2N2 (Japanese/57)를 포함하는 상이한 인플루엔자 바이러스 균주와 교차-반응을 나타내었다.

흥미롭게도, DNA 플라스미드 pHA_91-261에 의한 면역화는 항체 반응을 유도하지 못했다(도1Oa).

도 11a에 나타낸 바와 같이, HA_91-261 펩티드 및 pHA_91-261 플라스미드 어느 것도 펩티드 단편을 인식하는 IgA 항체의 생산을 유도하지 못했다. 그러나, HA_91-261 펩티드로 면역화된 마우스는 완전 바이러스를 인식하는 IgA 항체를 상당 수준으로 생산하였다(도 11b). 대조적으로 pHA_91-261 플라스미드로 면역화된 마우스에서는 IgA 반응이 검출되지 않았다.

이하, 상승되거나 부가적 항체 반응을 일으키는 HA_91-261 펩티드 및 DNA 둘 모두의 능력에 대하여 검토하였다. 이를 위해, DNA 초회감작 후 단백질을 추가접종하는 면역화 용법을 수행하였다. 도 10a-c 및 11a-b에 나타낸 바와 같이, DNA 및 펩티드 백신의 병용 주사를 통해 완전 바이러스에 대한 IgG 및 IgA 항체를 상당 수준으로 유도시켰으나, HA_91-261 단백질 단편만을 주사한 경우와 비교하여 외관상 부가적 인 효과는 없었다.

따라서, 이 결과는 그를 코딩하는 DNA에 비해, 펩티드로 면역화시킬 경우 현저하게 상당히 높은 항체가 생산되는 것으로 확인되었지만, 본 발명의 교시에 따라 제조된 펩티드 및 DNA 백신 둘 모두 체액성 면역 반응을 유도한다는 것을 제시한다.

추가로, 상이한 인플루엔자 균주와 IgG 항체의 교차 반응은 HA 분자의 HA_91-261 구상 영역이 만능 백신화를 일으킬 수 있다는 것을 제시한다.

IgG는 혈청에서 생산되는 반면, IgA 항체는 주로 폐에서 생산되고, 그 곳에서 국소적으로 중요한 항-인플루엔자 효과를 발휘할 수 있기 때문에, IgA 및 IgG 항체를 유도하는 본 발명의 백신의 능력은 특히 중요하다. 기도 질환에서 백신 방어가 기도 분비 IgA의 증가와 관련성을 갖고 있다는 발견에 의해 상기 결과가 추가로 입증된다[Lue (1988) J. Immunol. 140: 3793-3800; Nedrud (1987) J. Immunol. 139:3484-3492].

실시예 8

펩티드 및 DNA 백신화에 의해 형성된 세포성 면역 반응

재료 및 실험 방법

비세포(Splenocyte) 증식 에세이 - 상기 기술된 바와 같이, 3주 간격으로 3회에 걸쳐 PBS중 100㎍의 pHA_91-261 플라스미드(i. m. )와 함께 또는 애쥬번트를 포함 하지 않고(i. n. ) 50㎍/50㎕ HA_91-261 펩티드를 사용하여 BALC/c 마우스를 면역화하였다. 3차 면역후 14일째 지라를 절개하고 HA_91-261 펩티드에 대한 증식 반응을 시험하였다. RPMI-HEPES중 5x10⁵ 세포/웰을 포함하는 0. 2 ㎖의 배양액(Sigma사, 미국, 세인트루이스 소재) 3벌을 사용하여 96-웰 평평한-바닥 플레이트(Immunoplate사, 덴마크 눈크 소재)에서 세포를 배양하였다. 지정 농도의 HA_91-261 펩티드 또는 불활성화시킨 정제된 바이러스로 비세포를 자극시키고 48시간동안 배양하였다. 밤새도록 세포를 1 mCi (37 Bq)의 [³H]티미딘(Amershampharmacia사, 영국)로 펄스시켰다. 티미딘 혼입은 Packard β-카운터에서 측정하였다.

시토카인 에세이 - 항체 및 정제된 시토카인을 Phamingen사(캘리포니아 샌디에고 소재)로부터 입수하였다. 카보네이트 완충액(0. 1 M NaHCO₃, pH 8. 2)중 2㎍/㎖ (래트 항-마우스 IL-4) 또는 4㎍/㎖ (래트 항-마우스 IL-2, IL-10, 및 IFN-γ)로 희석된 정제된 항-시토카인 포획 mAbs를 사용하여 ELISA 플레이트에 코팅하고 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. PBS-Tween(0. 05% Tween-20를 포함하는 1OmM PBS)로 세척한 후, 플레이트를 실온에서 2시간동안 200㎕/웰의, 10 % 우태아 혈청을 포함하는 PBS(Biological Industries사, 이스라엘)로 차단시켰다. 표준 및 희석된 샘플을 웰에 가하고 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, PBS/10% 혈청중 바이오틴화된 항-시토카인 검출 mAb를 1시간동안 각 웰에 가하였다. 퍼옥시다아제-컨쥬게이트된 아비딘을 가하고 ELISA에 대하여 기술된 것과 동일 한 단계를 사용하여 에세이를 진행하였다. 상기 기술된 바와 같이, 포획되고 검출된 정제된 시토카인의 표준 곡선과 비교하여 시토카인을 정량하였다.

세포독성 T 림프구(CTL) 에세이 - CTL 사멸 에세이를 실질적으로 Zweerink 등(1977, Eur. J. Immunol. 7:630-635)에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다. 간단하게, HA_91-261 펩티드 및/또는 pHA_91-261 DNA 로 면역화된 마우스로부터의 지라 세포를 인플루엔자 A/Texas/77 바이러스를 사용하여 시험관내에서 감염시킨 동계의 시험감염된 바 없는 지라 세포로 5일간 자극시켰다. P815 표적 세포(ATCC TIB 64)를 RPMI + HEPES (n-(2-하이드록시에틸)피페라진 n'-(2-에탄설폰산)에서 90분동안 37℃, 5% CO₂에서 방사선 소듐 크로메이트(⁵¹Cr, 5㎕Ci 내지 10⁶ 세포), 및 인플루엔자 바이러스와 함께 인큐베이션시켰다. 작동 지라 세포를 수거하고, 세척하고, 살세포(killer) 대 표적의 비를 다양하게 하여 완전하게 세척된 표적 세포와 함께 37℃, 에서 5시간동안 인큐베이션시켰다. 배지로 방출된 ⁵¹Cr-방출량에 의해 표적 세포 분해물을 조사하고, 자발적 방출에 대한 보정 후 전체 방출(%)(1 % 소듐 도데실 설페이트, SDS에 의한 표적 세포의 분해에 의해 측정)로서 나타내었다.

결과

HA _91-261 에 의한 증식적 비세포 반응 유도 - T 헬퍼 활성을 초회감작시키는 효능을 평가하기 위하여, 면역화된 마우스의 지라에서 티미딘 혼입에 의해 세포성 면역 반응을 시험하였다. 도 12a에 나타낸 바와 같이, 펩티드로 면역화된 마우스로부 터 얻은 비세포는 HA_91-261 펩티드와 공-인큐베인션시켰을 때 고도로 증식되었다. 흥미롭게도, HA_91-261 펩티드에 대한 이러한 세포 반응은 지정된 농도(즉, 5 내지 20㎍/㎖, 및 3. 1/5㎍, 4. 7/10㎍, 및 6. 2/20㎍의 자극)의 HA_91-261 펩티드와 상호작용하여 나타난 바와 같이 투여량에 의존하였다. HA_91-261 펩티드로 면역화된 마우스는 또한 완전한 바이러스에 대하여도 양성의 증식 반응을 나타내었다(도 12b). 대조적으로, DNA 단편으로 면역화된 마우스로부터 얻은 비세포에서 관찰되는 증식 반응은 거의 검출할 수 없었다. DNA 초회감작-단백질 추가 접종의 병용시 양성 반응은 완전한 바이러스에 대해서만 뚜렷하게 나타났고, 이 경우조차 상기 반응은 HA_91-261 펩티드만을 사용한 경우에 수득된 것보다도 그리 높지 않았다(도 12b).

HA_91-261 펩티드로 면역화시킨 후 생산되는 T 세포의 서브타입을 특징화하기 위하여, 시토카인 방출 프로파일을 측정하였다. 도 13a-b에 나타낸 바와 같이, HA_91-261 펩티드로 면역화된 마우스로부터 얻은 지라 세포만이 정제된 펩티드 및 완전한 인플루엔자 바이러스 둘 모두에 대한 반응에서 상당 수준의 IL-2 (도 13a) 및 IFN-γ (도 13b)를 방출하였고, 이는 이들 림프구가 Th1 서브타입에 속한다는 것을 제시한다. 상기 세포 서브타입은 감염된 세포의 제거 및 항체-의존 세포 매개 세포독성와 관련이 있다. 대조적으로, Th2 반응을 제시하는 IL-4 및 IL-10은 검출할 수 없었다(데이터를 나타내지 않음). DNA 또는 그의 펩티드 배합물로 면역화된 마우스로부터 얻은 세포에서 관찰되는 시토카인 분비는 없었다.

pHA _91-261 면역화에 의한 CTL 반응 유도 - CTL 메모리 세포를 활성화시키기 위하여 pHA_91-261 DNA 작제물 또는 HA_91-261 펩티드로 면역화된 마우스로부터 얻은 지라 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염된 항원 제시 세포로 자극하였다. 생성된 작동 세포를 바이러스로 처리되지 않았거나 바이러스로 감염된 ⁵¹Cr 표지된 P815 표적 세포와 함께 작동체 대 표적 세포의 비를 다양하게 하여 시험관내에서 공-인큐베이션시켰다.

도 14a-b에 나타낸 바와 같이, DNA 작제물로 면역화된 마우스에서 바이러스로 자극시킨 후 CTLs가 확인되었고, 이는 바이러스-감염된 표적 세포를 특이적으로 분해시켰다. HA_91-261 펩티드 또는 병용된 DNA 초회감작-단백질 추가접종으로 면역화된 마우스에서는 어떤 반응도 관찰되지 않았다.

DNA 백신화에 의해 유도된 CTL 활성은 DNA 백신화 후의 바이러스 항원에 대한 바람직한 CTL 반응을 입증하는 사전의 발견과 일치한다[Raz (I996) Natl. Acad. Sci. USA 93:5141-5145; Ulmer (1993) Science 259:1745-1749]. 예를 들면, 클래스 I의 제한된 CTL 유도 및 이종 바이러스 시험감염에 대한 마우스 방어는 NP 또는 HA를 코딩하는 플라스미드 DNA로 입증되었다[Johnson (2000) J. Gen. Virol. 81:1737-1745].

모든 이 결과는 HA 분자의 동일한 영역에 상응하는 DNA 및 펩티드에 의해 유도되는 면역 반응 경로의 차이를 제시한다.

실시예 9

HA 펩티드 면역화가 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 방어한다

재료 및 실험 방법

바이러스 시험감염에 대한 방어 에세이 - 면역화한 후 1개월째 1 HAU/마우스를 포함하는 감염성 요막액을 i. n. 접종하여 면역화된 마우스에 투여하였다. 5일 후 마우스를 희생시키고 폐 및 혈액 샘플을 회수하고 -70℃에서 저장하였다(상기 기술된 바와 같이). 에세이 직전에 폐를 해동시키고, PBS 0. 1% BSA(10% w/v)에 균질화하고 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하였다. 전(whole) 충란 적정법 [Fayolle (1991) J. hnmunol. 147: 4069-4073]에 의해 바이러스 역가를 측정하였다. 폐 균질물(일련의 10배 희석액 100㎕)을 9-11일된 발육란의 요막 공간에 주사하였다. 48시간동안 37℃ 및 밤새도록 4℃에서 인큐베이션시킨 후 요막액을 제거하고, 혈구응집에 의해 염수중 50㎕의 요막액 및 50㎕의 0. 5% 치킨 적혈구를 포함하는 마이크로-적정 플레이트에서 바이러스 존재를 측정하였다. 특정 균질물 희석액(10^-8)에서의 양성 폐(%) 및 LogEID₅₀ (20)으로 결과를 나타내었다.

결과

HA_91-261 펩티드 및 상응한 DNA 단편 pHA_91-261 둘 모두에 의해 유도되는 양성 체액성 및 세포성 면역 반응과 관련하여, 바이러스의 시험감염에 대하여 방어면역을 제공하는 이들 제제의 능력에 대하여 검토하였다. 각각, 펩티드 또는 DNA 작제물을 사용하여 비강내 또는 근육내로 면역화한 후(3주 간격으로 3회 투여), 마지막 추가접종 후 1개월째 1 HAU의 인플루엔자 A/Texas/1/77 바이러스로 마우스를 시험감염시켰다. 5일 후 동물을 희생시키고 폐중 감염성 바이러스의 존재를 결정하였다. 도 15a-b에 나타낸 바와 같이, 비면역화된 마우스와 비교하여, DNA 작제물 또는 HA_91-261 펩티드로 면역화된 마우스에서는 바이러스 시험감염에 대한 상당 수준의 방어(대략 80%)가 입증되었다. 그러나, DNA 및 펩티드 병용 백신화는 완전 바이러스에 대해서는 상당 수준의 세포성 면역 반응을 유도하였지만 방어는 유도하지 못했다.

이 결과는 본 발명의 교시에 따라 형성된 펩티드 및 DNA 백신화 둘 모두가 바이러스 감염에 대하여 동물을 방어할 수 있다는 것을 나타낸다.

본 발명은 그의 특정 구체예와 함께 기술되었지만 다양한 대안, 수정 및 변형도 본 분야의 기술자에게 자명할 것이라는 것은 명백하다. 따라서, 첨부되는 청구범위의 정신 및 광범위한 범위내에 포함되는 모든 대안, 수정 및 변형도 포함시키고자 한다. 본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 이들 각각의 공개 문헌, 특허 및 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 이들 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로서 인용되는 것까지도 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로서 포함된다. 추가로, 본 명세서에서 참고 문헌의 인용 또는 확인은 상기 문헌이 본 발명의 선행 기술로서 이용가능하다는 것을 허가하는 것으로 이해되어서는 안된다.

참고 문헌 목록

(추가의 참고 문헌은 본문에서 인용됨)

<110> Yeda Research And Development Co. Ltd. <120> NUCLEIC ACID MOLECULES, POLYPEPTIDES, ANTIBODIES AND COMPOSITIONS CONTAINING SAME USEFUL FOR TREATING AND DETECTING INFLUENZA VIRUS INFECTION <130> 27165 <150> US 60/449,863 <151> 2003-02-27 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 329 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 1 Gln Asp Phe Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 20 25 30 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 35 40 45 Gly Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Arg Ile Leu Asp Gly Ile Asn Cys 50 55 60 Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly Phe Gln 65 70 75 80 Asn Glu Thr Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Phe Ser Asn 85 90 95 Cys Thr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Arg Ser Leu Arg Ser Leu Val 100 105 110 Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu Gly Phe Thr Trp Thr 115 120 125 Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Asn Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asp 130 135 140 Ser Gly Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Tyr Lys Ser Gly Ser Ala 145 150 155 160 Tyr Pro Val Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Asp Asn Phe Asp Lys 165 170 175 Leu Thr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Gln Glu Gln Thr 180 185 190 Asn Leu Tyr Val Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg 195 200 205 Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly 225 230 235 240 Asp Ile Leu Val Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly 245 250 255 Tyr Phe Lys Met Arg Thr Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala 260 265 270 Pro Ile Gly Thr Cys Ile Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile 275 280 285 Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala 290 295 300 Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 305 310 315 320 Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg 325 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Ser Lys Ala Phe Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp 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Ile Asn 20 25 30 Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Asn Ala 35 40 45 Cys Lys Arg Gly Pro Asp Ser Gly Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu 50 55 60 Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr Pro Val Leu Asn Val Thr Met Pro Asn 65 70 75 80 Asn Asp Asn Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser 85 90 95 Thr Asp Gln Glu Gln Thr Asn Leu Tyr Val Gln Ala Ser Gly Arg Val 100 105 110 Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly 115 120 125 Ser Arg Pro Trp Val Arg Gly Leu Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp 130 135 140 Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Val Ile Asn Ser Asn Gly Asn 145 150 155 160 Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Met Arg 165 170 <210> 14 <211> 146 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly Val Thr 1 5 10 15 Gln Asn Gly Gly Ser Asn Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asp Ser Gly Phe 20 25 30 Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr Pro Val 35 40 45 Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Asp Asn Phe Asp Lys Leu Thr Ile 50 55 60 Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Gln Glu Gln Thr Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Val Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln 85 90 95 Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg Gly Leu Ser 100 105 110 Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu 115 120 125 Val Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys 130 135 140 Met Arg 145 <210> 15 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 15 Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly Val Thr 1 5 10 15 Gln Asn Gly Gly Ser Asn Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asp Ser Gly Phe 20 25 30 Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Tyr Lys Ser Gly Ser Ala Tyr Pro Val 35 40 45 Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Asp Asn Phe Asp Lys Leu Tyr Ile 50 55 60 Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Gln Glu Gln Thr Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Val Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln 85 90 95 Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg Gly Leu Ser 100 105 110 Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu 115 120 125 Val Ile 130 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 16 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligouncleotide <400> 17 tatggtcgaa taagttaa 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 18 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 19 ttaacttatt cgaccata 18 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 20 ggatccagca aagctttcag caactgt 27 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 21 gtcgacgcgc attttgaagt aacccc 26 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 22 acttatcagc ggacccgtgc ctttagttcg tactggtgat 40

Claims (157)

1. 세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 관여하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합할 수 있으며, 서열번호: 11 및 12로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열로 표시되는 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 일본쇄 (single strand)인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자가 검출가능한 표지(detectable label)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
5. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 2'-플루오로 (2'-F) 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
6. 활성 성분으로서 제1항 내지 5항 중 어느 한 항의 핵산 분자 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 인플루엔자 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 약학 조성물을 항바이러스제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 항바이러스제는 상기 핵산 분자에 컨쥬게이트되는(conjugated) 것을 특징으로 하는 약학조성물.
9. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항의 핵산분자를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 의약품.
10. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항의 핵산분자를 포함하는 인플루엔자 감염의 검출용 키트.
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