KR20230071864A

KR20230071864A - Cd137에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230071864A
Application number: KR1020210157117A
Authority: KR
Inventors: 이현종; 안상호; 이종호; 이종서
Original assignee: 앱클론(주)
Priority date: 2021-11-15
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2023-05-24

Abstract

본 발명은 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디, 상술한 어피바디 및 암 세포 표면상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체, 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 이용하면, T 세포에 특이적으로 결합하는 동시에 다양한 종류의 암 세포 표면상의 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 복합체를 개발하여, 혈액암 및 고형암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 이의 용도 {Affibody specifically binding to CD137 and uses thereof}

본 발명은 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디, CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 EGFR, HER2 또는 CD19에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 단백질 복합체, 및 이들을 이용한 암의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

최근, 다음과 같은 면역항암제가 유망한 암 치료 방법으로 관심을 받고 있다: CTLA-4를 표적으로 하는 이필리무맙(ipilimumab), PD-1을 표적으로 하는 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 또는 니볼루맙(nivolumab), 및 PD-L1을 표적으로 하는 아테졸리맙(atezolizumab)과 같은 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor); 키메라 항원 수용체 T 세포(chimeric antigen receptor-T, CAR-T)와 같은 면역세포치료제; 암세포의 항원에 결합하는 항체, 및 항체와 약물을 결합한 항체약물접합체(antibody drug conjugate, ADC)와 같은 치료용 항체; T 세포의 CD3 및 B 세포 림프종의 CD19 항원을 이중특이적으로 표적으로 하는 블리나투모맙(Blinatumomab) 및 T 세포의 CD3 항원 및 암세포의 상피세포접착분자(epithelial cell adhesion molecule)를 이중특이적으로 표적으로 하는 카투막소맙(Catumaxomab)과 같은 T-세포 관여 이중특이적 항체(T-cell engaging bispecific antibodies); 및 암세포 특이적 항원을 투여하거나 또는 체내 면역 반응 향상을 위한 항원을 투여하는 항암 백신.

이 중에서, 블리나투모맙 및 카투막소맙과 같은 T-세포 관여 이중특이적 항체는 현재까지 가장 진보된 차세대 면역항암 접근 방법이지만, 블리나투모맙은 혈액암에만 사용되고 있고 안전성 문제도 있으며, 카투막소맙은 악성 복수 치료에만 적용되므로, 다양한 종류의 암 치료에 사용하기에는 제한적이다(Lakins MA, et al. Clin Cancer Res. 2020 Aug 1;26(15):4154-4167.).

따라서, 혈액암뿐만 아니라 고형암(solid tumor)에도 적용할 수 있는 T-세포 관여 이중특이적 항체를 개발한다면, 다양한 종류의 암 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

국내 공개특허 제10-2017-0012754호 (공개일자 2017년 02월 03일) 국내 공개특허 제10-2017-0117330호 (공개일자 2017년 10월 23일)

본 발명자들은 혈액암 및 고형암에 모두 적용할 수 있는 T-세포 관여 이중특이적 항체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 활성화된 T 세포의 표면상에서 발현이 증가하는 공동-자극 분자(co-stimulatory molecule)인 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 개발하고, 이를 이용하여 활성화된 T 세포의 CD137에 결합할 뿐만 아니라 EGFR, HER2 또는 CD19와 같은 암세포 표면상의 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 복합체를 개발함으로써, 혈액암 및 고형암 모두에 적용할 수 있는 T-세포 관여 이중특이적 항체를 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디(affibody)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 어피바디 및 암세포 표면상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 어피바디 또는 단백질 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디(affibody)를 제공한다.

본 발명자들은 혈액암 및 고형암에 모두 적용할 수 있는 T-세포 관여 이중특이적 항체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 활성화된 T 세포의 표면상에서 발현이 증가하는 공동-자극 분자(co-stimulatory molecule)인 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 개발하고, 이를 이용하여 활성화된 T 세포의 CD137에 결합할 뿐만 아니라 EGFR, HER2 또는 CD19와 같은 암세포 표면상의 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 복합체를 개발하였다. 따라서, 본 발명의 어피바디 및 암세포 표면상의 항원에 대한 항체를 포함하는 이중항체, 즉 T-세포 관여 이중특이적 항체는 혈액암 및 고형암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “CD137”은 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor, TNFR) 패밀리 중 하나로, TNFRSF9(tumor necrosis factor receptor superfamily number 9), 4-1BB 및 ILA(induced by lymphocyte activation)이라고 불리기도 하는 공동-자극성 면역 체크포인트 분자(co-stimulatory immune checkpoint molecule)를 의미한다.

CD137 (4-1BB)은 활성화된 CD8⁺ T 세포, CD4⁺ T 세포, 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg), NKT 세포(natural killer T cell), NK 세포(natural killer cell), 수지상세포(dendritic cell, DC), 중성구(neutrophil), 호산구(eosinophil), 비만 세포(mast cell) 및 혈관내피세포(endothelial cell) 상에 발현된다.

CD137은 이의 리간드인 4-1BBL과 결합하면 T 세포의 활성화, 생존 및 효과기 기능(effector function)을 유도한다. CD137의 리간드인 4-1BBL은 TNF 패밀리로, 성숙 DC, 활성화된 B 세포 및 대식세포(macrophage)와 같은 항원 제시 세포(antibody presenting cell, APC)에서 발현된다.

본 명세서에서, 용어 "어피바디(affibody)"는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)의 단백질 A (Protein A) 중 IgG(immunoglobulin G)에 친화성(affinity)이 있는 부위인 Z-도메인(Z domain)을 의미하며, "Z body" 또는 "Zb"로도 지칭된다.

어피바디는 58개의 아미노산 잔기로 이루어진 작은 단백질이다. 이러한 어피바디 분자의 단백질 서열에서 IgG와 결합면을 형성하는 13개의 아미노산은 아미노산 서열에 따라 다양한 타겟 항원에 대한 결합이 가능하며, 무작위적인 배열이 가능하여 라이브러리(library)를 구축할 수 있다. 어피바디 분자는 항체와 유사하게 라이브러리로부터 파지 디스플레이(phage display), 효모단백질 잡종법(yeast two hybrid, Y2H) 등의 스크리닝 방법을 통해서 다양한 타겟 항원에 대하여 결합할 수 있는 어피바디 분자들을 선별할 수 있다.

또한, 어피바디는 분자량이 6 kDa으로 매우 작아, 일반적으로 150 kDa의 분자량을 가진 IgG 형태의 항체와 비교하여 인체 투여시 전신적으로 확산되고, 신장 여과로 빠르게 제거되는 특징이 있다. 어피바디는 일반 IgG와 결합된 이중항체의 형태로도 개발되고 있다(Yu F et al., 2014, MAbs). 게다가, 어피바디는 열과 알칼리 조건에 대한 내성을 가지며, 박테리아를 이용해 대량 생산하기 때문에 제작 비용이 항체 대비 낮다.

제1세대 Z 변이체(Z domain의 변이체)에 기반한 폴리펩타이드 스캐폴드에 관한 발명이 PCT 공개공보 WO95/19374에 개시된 바 있고, 제2세대 Z 변이체에 기반한 폴리펩타이드 스캐폴드에 관한 발명이 PCT 공개공보 WO2009/080811에 개시된 바 있다.

상술하였듯이, 어피바디는 작은 단백질 도메인으로, 상이한 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 포도상구균의 단백질 A로부터 유래된 58개-잔기 면역글로블린 Fc-결합 Z 도메인의 13개 표면 잔기를 무작위화(randomization)하여 설계된다.

상기 무작위화가 표적으로 하는 13개 표면 잔기는 첫 번째 나선(helix)에 위치한 Q9, Q11, N11, F13, Y14, L17 및 H18 잔기와, 두 번째 나선 표면에 위치한 E24, E25, R27, N28, Q32 및 K35 잔기이다. 야생형 Z 도메인의 인간 Fc (IgG)에 대한 친화도는 약 10 nM 내지 60 nM로 알려져 있고, 단백질 A는 면역글로불린 포획을 위한 친화성 리간드로 사용된다(Nord, K., Gunneriusson, E., Ringdahl, J. et al. Nat Biotechnol 15, 772-777, 1997. 참조).

본 명세서에서, 용어 “어피맵(AffiMab)”은 어떤 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합된 어피바디(affibody) 분자로 구성된 이중특이적 항체(bispecific antibody)를 의미한다. 어피맵은 모듈 형식이므로 상이한 표적에 용이하게 적용할 수 있다(Volk, AL., Mebrahtu, A., Ko, BK. et al. Drugs R D 21, 157-168, 2021. 참조). 본 발명에 따른 단백질 복합체, 융합 단백질 및 이중항체는 어피맵의 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CD137은 인간 또는 게잡이 원숭이(cynomolgus monkey) 유래의 CD137이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 어피바디의 CD137 세포외 도메인에 대한 결합 부위는 서열번호 27의 아미노산 서열의 64번째 내지 95번째 아미노산 잔기 사이에 위치한다. 즉, 본 발명의 어피바디는 인간(Homo sapiens) 또는 게잡이 원숭이(Macaca fascicularis)의 CD137 세포외 도메인의 64번째 내지 95번째 아미노산 잔기 사이에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 어피바디는 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체(homodimer)의 형태일 수 있다. 상기 동종이량체는 동일 단백질이 서로 상호작용하여 형성된 하나의 단백질 복합체를 의미한다. 상기 어피바디 동종이량체는 어피바디 단량체가 서로 연결된 다량체 형태일 수 있다. 상기 어피바디 동종이량체는 어피바디 단량체가 서로 아미노산 링커로 연결된 다량체 형태일 수 있다. 상기 어피바디 동종이량체는 융합 단백질 또는 컨쥬게이트의 형태로 구현될 수 있다. 상기 어피바디 동종이량체는 직접적으로, 예컨대 공지의 유기화학적 방법으로, 또는 간접적으로 예컨대 아미노산 링커를 통해 연결될 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디는 금 나노입자와 연결된 복합체의 형태일 수 있다. 이러한 경우 나노입자-기반 면역분석법에 사용되어, CD137을 발현하는 항원제시세포(APC), 예컨대 활성화된 T-세포에 대한 높은 민감도와 특이도를 나타내는 ELISA, immuno-PCR 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디는 형광 단백질과 연결된 복합체의 형태일 수 있다. 본 발명의 어피바디가 형광 단백질과 연결된 복합체의 형태인 경우, CD137을 발현하는 항원제시세포에 대한 특이적 표적과 이미징이 가능하다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열의 64번째 내지 95번째 아미노산 잔기 사이에 특이적으로 결합하는 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 어피바디를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.

이는 뉴클레오타이드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 어피바디를 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다.

상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성(예컨대 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성(예컨대 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성(예컨대 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성(예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성(예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 60% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이에 존재하는 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.

서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 NCBI 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 NCBI 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 CD137에 대한 어피바디를 이루는 폴리펩타이드와 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 첨부된 서열목록에 수록되어 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상술한 핵산 분자를 포함하는 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디 발현을 위한 벡터이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상술한 핵산 분자를 포함하는 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 발현을 위한 벡터이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상술한 핵산 분자를 포함하는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 발현을 위한 벡터이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상술한 핵산 분자를 포함하는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열의 64번째 내지 95번째 아미노산 잔기 사이에 특이적으로 결합하는 어피바디 발현을 위한 벡터이다.

본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 파지미드 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 어피바디를 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.

본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤모글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 어피바디의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 벡터는 인간 또는 게잡이 원숭이의 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 인코딩하는 핵산 분자가 삽입된 벡터로서, 상기 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 숙주 세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터 및 숙주 세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 숙주 세포 발현용 재조합 벡터이다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 이스트(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분리된 숙주 세포는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 것이다.

본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된”은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된”, "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명에서 숙주 세포 내로 주입된 재조합 벡터는 숙주 세포 내에서 재조합된 상기의 어피바디를 발현할 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 어피바디를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 갈락토오스 유도성 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

상기 배양은 통상적으로 진탕 배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10℃ 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5시간 내지 7일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터 또는 락토오스 유도성 프로모터를 함유하는 경우 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.

본 발명의 여전히 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 어피바디 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상술한 어피바디는 CD137을 발현하는 세포, 구체적으로, 활성화된 CD8⁺ T 세포, 수지상세포, NK 세포 등에 특이적으로 결합하기 때문에, 상기 어피바디는 CD137에 작용제(agonist)로 작용하여, T 세포를 활성화하고, NK 세포의 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 T-세포 매개 세포 독성(T-cell mediated cytotoxicity)을 나타내므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 혈액암 또는 고형암이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 고형암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강암, 부비동암, 비부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 직장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 혈액암은 급성골수성백혈병, 만성골수성백혈병, 골수이형성증후군, 골수증식성종양, 진성적혈구증가증, 본태성혈소판증가증, 골수섬유화증, 단핵구성백혈병, 적백혈병, 거대핵모구성백혈병, 호염기성벽혈병, 호산구성백혈병, 급성림프구성백혈병, 만성림프구성백혈병, 다발성골수종, 림프종, B세포림프종, 변연부비세포림프종, 호지킨림프종, 비호지킨림프종, 미만성큰B-세포림프종, 결절외변연부세포림프종, 결절외NK/T-세포림프종, 주변T-포림프종, 버킷림프종, 전구세포종양, 외투막세포림프종, 소포림프종, 면역결핍관련림프구증식성질환, 결절림프구우세호지킨병, 결절경화고전호지킨병, 림프구과다고전호지킨병, 혼합세포충실성고전호지킨병, 림프구고갈고전호지킨병 및 화학요법-저항성 모양세포백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 흉골내 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “예방”은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 단백질 복합체(protein complex)를 제공한다: 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및 암세포 표면상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

본 명세서에서 용어 "단백질 복합체(protein complex)"는 적어도 2개의 연관된 폴리펩타이드 사슬의 일 군을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "암세포 표면상의 단백질"은 세포막 층에 임베딩되거나 걸쳐있는 단백질을 의미한다. 상기 암세포 표면상의 단백질은 암세포 표면에 존재하는/발현하는 내재성 막단백질(integral membrane protein), 막관통 단백질(transmemebrane protein), 지질-고정 막단백질(lipid-anchored membrane protein), 표재성 막단백질(peripheral membrane protein), 항원, 프로테오글리칸, 또는 뮤신일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 암세포 표면상의 단백질은 정상 세포 대비 과발현된 단백질일 수 있다. 상기 암세포 표면상의 단백질은 야생형 단백질에서 돌연변이가 발생된 것일 수 있다. 상기 암세포 표면상의 단백질은 암세포-특이적 단백질 또는 종양 마커일 수 있다. 상기 종양 마커는 암 또는 특정 비암성 양성(noncancerous benign) 상태에 대한 반응의 결과로 암세포 또는 다른 세포에 존재하거나 이들로부터 생성되는 임의의 단백질일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 일 구현예에 따른 어피바디의 단량체 및 암세포 표면상의 단백질에 특이적으로 결합하는 각각의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단량체가 연결된 다량체 형태이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 상기 어피바디 및 각각의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서로 공유결합으로 연결된 다량체 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 상기 어피바디 및 각각의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서로 아미노산 링커로 연결된 다량체 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 융합 단백질(fused protein) 또는 컨쥬게이트(conjugate)의 형태로 구현될 수 있다.

따라서, 상기 어피바디 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 화학적 컨쥬게이션(유기화학 방법으로 알려진) 또는 다른 수단(예를 들어, 복합체를 융합 단백질로서 발현하거나, 직접적으로 또는 링커(예컨대, 아미노산 링커))을 통하여 간접적으로 연결될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단백질 복합체를 이루는 각 단량체는 적어도 하나의 링커로 연결된다. 이 경우 상기 링커는 일반식 (GnSm)p 또는 (SmGn)p로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다:

여기에서 상기 n, m 및 p는 독립적으로,

n은 1 내지 7의 정수이고;

m은 0 내지 7의 정수이며;

n과 m의 합은 8 이하의 정수이고; 및

p는 1 내지 7의 정수이다.

본 발명의 다른 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 링커는 n = 1 내지 5이고, m = 0 내지 5이다. 보다 구체적인 일 구현예의 경우, n = 4이고, m = 1이다. 보다 더 구체적인 일 구현예의 경우, 상기 링커는 (GGGGS)₃ 이다. 또 다른 구현예의 경우, 상기 링커는 GGGGS이다. 또 다른 구체적인 일 구현예의 경우, 상기 링커는 VDGS이다. 또 다른 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 ASGS이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 타겟이 2 이상인, 다중 항체일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 단일클론항체, 다중클론항체, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중항체, 다중특이적 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 케모바디(chemobody), 옵토바디(optobody) 또는 이들의 항원 결합 단편일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 이중특이적 항체(bispecific antibody)이다. 본 명세서에서 용어 이중항체는 이중특이적 항체와 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 구체적인 다른 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 4가항체(tetravalent antibody)이다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 삼중특이적 항체(trispecific antibody)이다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 T-세포 관여 이중특이적 항체(T-cell engaging bispecific antibodies)이다.

본 발명의 구체적인 다른 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 단일클론 이중특이적 항체이다.

본 발명의 구체적인 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 다중클론 이중특이적 항체이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 암 세포 표면상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일클론 항체, 다중클론 항체, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중특이적 항체, 삼중특이적, 다중특이적 항체, 2가 항체, 4가 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 항원 결합 단편일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 어피바디는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄에 융합된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 어피바디는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된다.

본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 상기 어피바디는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 융합된다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 어피바디는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 및 N-말단에 융합된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암세포 표면상의 단백질은 EGFR(epidermal growth factor receptor), HER2(human epidermal growth factor receptor 2), 또는 CD19(cluster of differentiation 19)이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:

(a) 세툭시맙(cetuximab); 또는

(b) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역.

상기 세툭시맙(cetuximab)은 상업적으로 입수 가능한 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체이고, 당업계에 공지된 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이라면, 비-제한적으로 사용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.

본 발명의 구체적인 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 세툭시맙을 포함한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 단백질 복합체는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 세툭시맙을 포함한다.

본 발명의 구체적인 다른 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및

서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 단백질 복합체는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 (b)는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함한다.

본 발명의 구체적인 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:

(c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;

(d) 트라스투주맙(trastuzumab); 또는

(e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역.

상기 트라스투주맙(trastuzumab)은 상업적으로 입수 가능한 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 항체이고, 당업계에 공지된 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이라면, 비-제한적으로 사용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.

본 발명의 구체적인 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및

(c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

(d) HER2에 특이적으로 결합하는 트라스투주맙(trastuzumab)을 포함한다.

(e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 (e)는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함한다.

서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:

(f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는

(g) FMC63.

상기 FMC63은 상업적으로 입수 가능한 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체이고, 당업계에 공지된 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이라면, 비-제한적으로 사용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.

본 발명의 구체적인 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및

(f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

(g) CD19에 특이적으로 결합하는 FMC63을 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 암세포 표면상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 핵산 분자는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 상기 핵산 분자는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 핵산 분자는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 단백질 복합체를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 단백질 복합체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 암세포 표면상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 EGFR, HER2 또는 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 항체의 중쇄가변영역을 인코딩하는 핵산 분자 및 경쇄가변영역을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.

본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 세툭시맙을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및

서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.

본 발명의 여전히 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및

HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.

(d) 트라스투주맙(trastuzumab); 또는

(e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.

서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.

본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및

CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.

(f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는

(g) CD19에 특이적으로 결합하는 FMC63을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.

본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 벡터는 EGFR, HER2, 또는 CD19에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자가 삽입된 벡터로서, 상기 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 숙주 세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터 및 숙주 세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 숙주세포 발현용 재조합 벡터이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주 세포는 게잡이 원숭이(cynomolgus monkey) 유래 섬유아세포(CYNOM-K1, Sigma-Aldrich), 붉은털원숭이(rhesus monkey) 유래 신장 세포(ATCC, LLC-MK2 Original CCL-7^TM 또는 ATCC, FRhK-4, CRL-1688^TM), 또는 붉은털원숭이 유래 림프모세포(ATCC, LCL 8664, CRL-1805^TM)일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 단백질 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 단백질 복합체를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 T 세포의 활성화를 유도한다.

구체적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 암세포 표면상의 단백질에 특이적으로 결합하고, 동시에 T 세포의 CD137에 특이적으로 결합하므로, 상기 단백질 복합체는 T 세포의 작용제로 작용하여 T 세포의 활성화를 유도함으로써, 암세포의 수를 감소시키거나, 암세포 수의 증가를 억제시킬 수 있어, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질 복합체는 암세포 표면상의 단백질에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 암세포 표면상의 EGFR에 특이적으로 결합하고, 동시에 T 세포의 CD137에 특이적으로 결합하므로, 상기 단백질 복합체는 T 세포의 작용제로 작용하여 T 세포의 활성화를 유도함으로써, EGFR을 발현하는 암세포의 수를 감소시키거나, EGFR을 발현하는 암세포 수의 증가를 억제시킬 수 있어, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질 복합체는 EGFR에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다.

상기 암은 EGFR 양성일 수 있다.

상기 암은 EGFR을 과발현하는 것을 특성으로 할 수 있다.

상기 암은 비소세포폐암(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC), 폐암(lung cancer), 대장암(colorectal cancer), 뇌종양(brain tumor), 성상세포종(astrocytoma), 식도암(esophageal cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 또는 활막육종(Synovial Sarcoma)이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 암은 삼중-음성 유방암(triple-negative breast cancer, TNBC)일 수 있다. TNBC는 EGFR을 과발현하는 것으로 공지되어 있다. TNBC는 에스트로겐 수용체(Estrogen Receptor, ER), 프로게스테론 수용체(Progesterone Receptor, PR) 및 인간 표피 수용체 2(Human Epidermal Receptor 2, Her2neu)의 발현이 1% 미만인 유방암을 의미한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 암세포 표면상의 HER2에 특이적으로 결합하고, 동시에 T 세포의 CD137에 특이적으로 결합하므로, 상기 단백질 복합체는 T 세포의 작용제로 작용하여 T 세포의 활성화를 유도함으로써, HER2를 발현하는 암세포의 수를 감소시키거나, HER2를 발현하는 암세포 수의 증가를 억제시킬 수 있어, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 이중항체는 HER2에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다.

상기 암은 HER2 양성일 수 있다.

상기 암은 HER2를 과발현하는 것을 특성으로 할 수 있다.

상기 암은 침윤성 유방암(invasive breast cancer) 또는 전이성 유방암(metastatic breast cancer)일 수 있다. 상기 암은 유방암, 방광암, 췌장암, 난소암 및 위암일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 암세포 표면상의 CD19에 특이적으로 결합하고, 동시에 T 세포의 CD137에 특이적으로 결합하므로, 상기 단백질 복합체는 T 세포의 작용제로 작용하여 T 세포의 활성화를 유도함으로써, CD19를 발현하는 암세포의 수를 감소시키거나, CD19를 발현하는 암세포 수의 증가를 억제시킬 수 있어, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질 복합체는 CD19에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다.

상기 암은 CD19 양성일 수 있다.

상기 암은 CD19를 과발현하는 것을 특성으로 할 수 있다.

상기 암은 림프종일 수 있다. 상기 림프종은 B 세포 림프종일 수 있다. 상기 암은 변연부림프종, 호지킨림프종, 비-호지킨 림프종, 만성림프구성백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 급성림프구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 골수성백혈병, 또는 화학요법-저항성 모양세포백혈병일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 T 세포의 활성화에 의해 인터페론-감마(IFN-γ)가 증가된다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 암세포 표면 단백질에 의존적으로 인터페론 감마를 증가시킨다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 EGFR 단백질에 의존적으로 인터페론 감마를 증가시킨다. 즉, 상기 조성물이 EGFR 양성이거나 EGFR을 과발현하는 암세포에 접촉한 경우 T 세포를 활성화여 인터페론 감마의 농도를 증가시킨다.

본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 HER2 단백질에 의존적으로 인터페론 감마를 증가시킨다. 즉, 상기 조성물이 HER2 양성이거나 HER2를 과발현하는 암세포에 접촉한 경우 T 세포를 활성화여 인터페론 감마의 농도를 증가시킨다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 CD19 단백질에 의존적으로 인터페론 감마를 증가시킨다. 즉, 상기 조성물이 CD19 양성이거나 CD19를 과발현하는 암세포에 접촉한 경우 T 세포를 활성화여 인터페론 감마의 농도를 증가시킨다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 암세포 표면 단백질에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 EGFR 단백질에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다. 즉, 상기 조성물이 EGFR 양성이거나 EGFR를 과발현하는 암세포에 접촉한 경우 T 세포의 활성화를 유도한다.

본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 HER2 단백질에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다. 즉, 상기 조성물이 HER2 양성이거나 HER2를 과발현하는 암세포에 접촉한 경우 T 세포의 활성화를 유도한다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 CD19에 단백질 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다. 즉, 상기 조성물이 CD19 양성이거나 CD19를 과발현하는 암세포에 접촉한 경우 T 세포의 활성화를 유도한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

본 발명은 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 제공한다.

본 발명은 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및 암세포 표면상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 제공한다.

본 발명은 상술한 어피바디, 또는 단백질 복합체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 이용하면, T 세포에 특이적으로 결합하는 동시에 다양한 종류의 암세포 표면상의 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 복합체를 개발하여, 혈액암 및 고형암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 CD137 단백질에 결합하는 어피바디를 주변세포질의 추출물(periplasmic extract) 형태로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 CD137에 결합하는 항체-어피바디의 형태로, CD137 양성 세포인 활성화된 CEMT 세포(Activated CEMT cell)를 이용하여, 세포에 발현된 CD137에 결합하는 어피바디를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3d는 EGFR 결합 항체 2종(CET 또는 15E3)을 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체로 생산한 후, 상기 이중항체가 CD137 단백질과 EGFR 단백질에 결합하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a는 세툭시맙(Cetuximab, CET) 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 EGFR 단백질에 결합함을 확인한 도이다.
도 3b는 세툭시맙(CET) 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 CD137 단백질에 결합함을 확인한 도이다.
도 3c는 15E3 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 EGFR 단백질에 결합함을 확인한 도이다.
도 3d는 15E3 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 CD137 단백질에 결합함을 확인한 도이다.
도 4a는 세툭시맙(CET) 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 CD137을 발현하는 활성화된 CEMT 세포에 결합함을 확인한 도이다.
도 4b는 15E3 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 CD137을 발현하는 활성화된 CEMT 세포에 결합함을 확인한 도이다.
도 5a는 세툭시맙(CET) 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 EGFR을 발현하는 HT29 세포에 결합함을 확인한 도이다.
도 5b는 15E3 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 EGFR을 발현하는 HT29 세포에 결합함을 확인한 도이다.
도 6은 CD137 어피바디의 선별을 위해, IFN-gamma 분비량 분석을 통해 EGFR 의존적인 T 세포 활성화(EGFR dependent T cell activation)를 확인한 도이다.
도 7은 선별된 CD137 어피바디 2종이 CD137의 어떤 세포외 도메인(extracellular domain, ECD)에 결합하는지 확인한 도이다.
도 7a는 신호 펩타이드(signal peptide)와 상이한 ECD 도메인 1 내지 5의 조합으로 구성된 hCD137-ECD, hCD137-ECD-ΔD1, hCD137-ECD-ΔD12, hCD137-ECD-ΔD123p, hCD137-ECD-ΔD123, hCD137-ECD-ΔD3 및 hCD137-ECD-ΔD5의 모식도를 나타낸다. 도메인 1 내지 도메인 5로 구성된 인간 CD137 ECD에 대한 아미노산 서열은 서열번호 27에 나타내었다.
도 7b는 우렐루맙(urelumab)이 CD137 ECD의 도메인 1에 결합함을 확인한 도이다.
도 7c는 유토밀루맙(utomilumab)이 CD137 ECD의 도메인 3에 결합함을 확인한 도이다.
도 7d는 세툭시맙(Negative Ab)이 CD137 ECD의 어느 도메인에도 결합이 일어나지 않음을 확인한 도이다.
도 7e는 어피바디 ZAAD01이 CD137 ECD의 도메인 3에 결합함을 확인한 도이다.
도 7f는 어피바디 ZAAD05가 CD137 ECD의 도메인 3에 결합함을 확인한 도이다.
도 8은 선별된 CD137 어피바디 2종과 TNFR 슈퍼패밀리(superfamily)에 속하는 다른 단백질, CD27, CD30, CD134, CD270, CD357 및 TNF-α와의 교차반응(cross reactivity)을 확인한 도이다.
도 8a는 어피바디 ZAAD01이 CD137에만 특이적으로 결합함을 확인한 도이다.
도 8b는 어피바디 ZAA0D5가 CD137에만 특이적으로 결합함을 확인한 도이다.
도 9는 선별된 CD137 어피바디 2종의 CD137 단백질과의 인간(human), 마우스(mouse) 및 게잡이 원숭이(cynomolgus monkey) 사이의 종간 교차반응을 확인한 도이다.
도 9a는 어피바디 ZAAD01이 인간 및 게잡이 원숭이의 CD137 단백질과 결합함을 확인한 도이다.
도 9b는 어피바디 ZAAD05가 인간 및 게잡이 원숭이의 CD137 단백질과 결합함을 확인한 도이다.
도 10은 항체-어피바디 형태의 이중항체 4종이 CD137 항원과 EGFR 항원의 두 표적에 동시 결합함을 BLI(BioLayer Interferometry)법을 이용하여 확인한 도이다. 도 10a는 CET-ZAAD01 이중항체, 도 10b는 CET-ZAAD05 이중항체, 도 10c는 15E3-ZAAD01 이중항체, 도 10d는 15E3-ZAAD05 이중항체의 BLI 결과를 나타낸다.
도 11은 EGFR 발현 세포의 세포별 발현 정도를 유세포 분석법(Flowcytometry)으로 확인하고, EGFR 발현 정도에 따른 이중항체의 T세포 활성화 정도가 EGFR 발현양과 상관관계가 있음을 확인한 도이다.
도 11a는 EGFR 양성 세포인 A431 세포, HT29 세포 및 SW403 세포와 EGFR 음성 세포인 MOLT4 세포에서 EGFR 발현을 확인한 도이다.
도 11b는 IFN-gamma 분비량 분석을 통해 EGFR 발현 정도에 따른 15E3-ZAAD01 이중항체의 EGFR 의존적 T 세포 활성화를 확인한 도이다.
도 12는 CD137 어피바디와 HER2 항체 또는 CD19 항체를 이용하여 생산된 이중항체가 CD137과 HER2 또는 CD19에 각각 결합함을 확인한 도이다.
도 12a는 트라스투주맙-ZAAD01 이중항체(anti-HER2 Ab1_ZAAD01) 및 hz1E11.10-ZAAD01 이중항체(anti-HER2 Ab2_ZAAD01)가 CD137에 결합함을 확인한 도이다.
도 12b는 트라스투주맙-ZAAD01 이중항체 및 hz1E11.10-ZAAD01 이중항체가 HER2에 결합함을 확인한 도이다.
도 12c는 FMC63-ZAAD01 이중항체(anti-CD19 Ab_ZAAD01)가 CD137에 결합함을 확인한 도이다.
도 12d는 FMC63-ZAAD01 이중항체가 CD19에 결합함을 확인한 도이다.
도 13은 CD137 어피바디와 HER2 항체 또는 CD19 항체를 이용하여 생산된 이중항체가 HER2 또는 CD19에 의존적인 T 세포 활성화를 IFN-gamma 분비량 분석을 통해 확인한 도이다.
도 13a는 IFN-감마 분비량 분석을 통해 유토밀루맙 대비 트라스투주맙-ZAAD01 이중항체 및 hz1E11.10-ZAAD01 이중항체가 HER2에 의존적으로 T 세포를 활성화함을 확인한 도이다.
도 13b는 IFN-감마 분비량 분석을 통해 유토밀루맙 대비 FMC63-ZAAD01 이중항체가 EGFR에 의존적으로 T 세포를 활성화함을 확인한 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1. CD137에 대한 어피바디 개발

1-1: 인간 CD137에 특이적으로 결합하는 10종의 어피바디 클론 스크리닝

CD137 단백질을 이용하여 어피바디(affibody, Zb) 라이브러리에서 패닝(panning)을 통해 CD137에 특이적으로 결합하는 클론(clone)을 선별하였다. 선별된 클론들을 어피맵(AffiMab, 단일클론 항체 기반의 어피바디로 구성된 이중항체) 형태의 이중항체로 동물세포를 이용하여 생산하고 CD137 발현 세포에 결합하는 클론을 선별하였다.

패닝 - 친화도 성숙

어피바디 라이브러리는 VSCM13 헬퍼 파지(VSCM13 helper phage)를 이용하여 파지 형태로 레스큐(rescue)해 패닝에 사용하였다. 처음 항원에 결합시키는 라이브러리 파지의 수는 10¹³개 이상이었고, 4회차의 패닝을 거쳐 진행하였다. 패닝 회차를 늘려감에 따라 항원의 양(10 μg, 5 μg, 2 μg 및 1 μg)은 점차 줄이고, 수세(wash) 횟수(3회, 5회, 7회 및 10회)는 점차 늘리는 방법을 적용하여, 친화성이 높은 파지를 선택적으로 선별하는 전략을 사용하였다. 패닝의 각 회차에서 얻은 바인더 파지(binder phage)를 대장균 ER2537(New England Biolabs^® Inc.)에 감염시켜 얻은 콜로니를 ELISA 방법으로 항원에 대한 결합 여부를 확인하였다.

페리플라즘 추출 - 어피바디 분리

바인더 파지를 감염시켜 얻은 콜로니를 SB 배지(MOPS 10 g/L, Bacto YEAST extract 20 g/L 및 Trypton 30 g/L)에 접종한 다음 OD₆₀₀ (optical density at 600 nm) 값이 0.8이 될 때까지 배앙한 후, 1 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, ㈜엘피에스 솔루션)를 넣고 30℃에서 진탕배양(shaking incubation)하여 어피바디(Zb)가 과발현되도록 하였다. BBS 버퍼(200 mM Boric acid, 150 mM NaCl 및 1 mM EDTA)를 이용하여 어피바디의 페리플라즘 추출(periplasmic extraction, PE)을 진행하였다. 이를 이용하여 ELISA 방법을 통해 바인더를 스크리닝하였다.

ELISA 방법 - 바인더 스크리닝

ELISA는 2 μg/mL의 농도로 hCD137-ECD-Fc (human CD137-extracellular domain-fragment crystallizable region) 단백질이 코팅(coating)된 플레이트에 어피바디 페리플라즘 추출물을 처리하였으며, 2차 항체(anti-HA-HRP, Roche, 12013819001, human influenza hemagglutinin (HA) protein)를 처리한 후 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, BioFX^TM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3, PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD₄₅₀ 값을 측정하고, 그 결과는 도 1에 나타내었다. 대조를 위해, 마우스 CD137 ECD Fc 단백질을 코팅하거나(mouse CD137), 어떤 단백질도 코팅하지 않은 플레이트(Negative protein) 또한 사용하였다. Negative PE는 어피바디 플라스미드가 없는 대장균 ER2537의 추출물이다.

ELISA 결과 - 10종의 어피바디 클론 선별

도 1에 나타낸 바와 같이, negative PE에서는 OD₄₅₀ 값이 거의 측정되지 않았고, 마우스 CD137 단백질에서도 OD₄₅₀ 값이 거의 측정되지 않아 이에 대해 어피바디 10종 모두 결합하지 않은 반면, 높은 OD₄₅₀ 값을 통해 인간 CD137 단백질에 대해서는 어피바디 10종 모두 결합하였음을 확인하였다.

상기 ELISA 결과로부터, 인간 CD137 단백질에 결합하는 10종의 어피바디, ZAAD01 내지 ZAAD10을 선별하였다. 어피바디의 서열을 확인한 결과, 인간 CD137에 결합하는 10종의 고유한 클론(unique clone, 클로닝된 특정 세포주)을 확인하였다.

1-2: 8종의 어피바디 선별

상술한 고유한 클론 10종을 Zb-Fc의 형태로 클로닝하고 동물세포를 이용하여 생산하였다. 이후, CD137 발현 세포를 이용하여 세포 결합(융합)을 확인하였다. Fc는 단편 결정화 가능 영역(Fragment crystallizable region)을 의미한다.

T-세포 활성화

CEMT 세포(ATCC^®, CCL-119^TM, T lymphoblast, 급성 림프구성 백혈병)를 1×10⁷/10 mL을 준비하여, PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate, Sigma-Aldrich^®, P1585) 50 ng/mL 와 이오노마이신(ionomycin, Sigma-Aldrich^®, I9657) 1 μg/mL의 농도로 처리한 후, 16시간 인큐베이션(incubation)하여 활성화(activation)시켰다.

PMA 및 이오노마이신은 T 세포를 활성화하는 것으로 알려져 있다. PMA는 단백질 키나제 C(protein kinase C)를 활성화하고, 이오노마이신은 칼슘 운반체(calcium ionophore)이며, 두 화합물은 T 세포막 수용체 복합체를 통과해 여러 세포 내 신호 전달 경로의 활성화를 유도하고 T 세포 활성화함으로써, 다양한 사이토카인의 생성을 유발한다(Ai, W., et al. (2013). Int J Environ Res Public Health. 2013;10(9):3834-3842. 참조). 이오노마이신은 PMA와 함께 사이토카인, 인터페론, 퍼포린, IL-2 및 IL-4의 세포 내 생산을 자극하는 것으로 알려져 있다. 더욱이, 자극을 받지 않은 나이브(naive) T 세포는 CD137을 발현하지 않지만, 자극을 받은 활성화된 T 세포는 일시적으로 높은 수준으로 CD137을 발현하는 것으로 공지되어 있다.

활성화된 CEMT 세포를 5×10⁵/튜브로 준비한 다음, 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고, PBS 중 5% FBS로 수세한 후, 상기 10종의 Zb-Fc를 5 μg/mL 처리하고 얼음에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세하였다. 대조를 위해, 활성화되지 않은 CEMT 세포(inactivated CEMT cell) 또한 준비하였다.

그 다음, 항-인간-Fc-FITC(anti-human-Fc-FITC, Life Technologies^®, A11013)를 1 μg/mL로 세포에 처리하고 빛을 차단한 채로 얼음에서 45분간 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세한 후, 베크만 쿨터(Beckman Coulter, Inc.)의 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 기기를 이용하여 형광의 세기를 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. FACS 결과 그래프에서 피크가 우측으로 이동할수록 세포에 대한 더 강한 결합을 나타낸다. FITC only는 Zb-Fc binding 시 버퍼(buffer)만 존재하는 경우이고, Negative Ab는 hIgG (human IgG)를 사용한 경우이다.

도 2에 나타낸 바와 같이, FACS 측정 결과, CD137 발현 세포에 특이적으로 결합하는 8종의 어피바디, ZAAD01, ZAAD02, ZAAD03, ZAAD04, ZAAD05, ZAAD07, ZAAD09 및 ZAAD010을 선별하였다.

구체적으로, 상기 8종의 어피바디는 활성화되지 않은 CEMT 세포에서는 FITC에 대한 피크만 나타낸 반면, 활성화된 CEMT 세포에서는 FITC에 대한 피크보다 우측으로 이동한 피크를 나타내었다. 이는 상기 8종의 어피바디가 활성화되지 않은 CEMT 세포에는 결합하지 않고, 활성화된 CEMT 세포와는 결합함을 확인할 수 있었다.

그러나, 어피바디 ZAAD06 및 ZAAD08은 hIgG를 첨가한 대조군(negative Ab)과 활성화되지 않거나 활성화된 CEMT 세포 사이에서도 피크의 차이가 없어, CD137을 발현하는 세포, 즉 활성화된 CEMT 세포와 특이적으로 결합하지 않아, ZAAD06 및 ZAAD08은 선택하지 않았다.

실시예 2. CD137에 대한 어피바디 선별

2-1: 이중항체 16종의 생산

EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)에 특이적으로 결합하는, 세툭시맙(Cetuximab, CET)과 자체적으로 개발한 15E3 항체(국내 공개특허공보 제10-2017-0012754호, 참조) 2종을 기반으로 하여, 상기 실시예 1-2에서 선별된 8종의 CD137 어피바디를 이중항체 형태로 클로닝하고, 동물세포를 이용하여 총 16종의 이중항체를 생산하였다. 상기 8종의 어피바디가 세툭시맙(CET)과 이중항체 형태로 클로닝된 경우에는 각각 CET-ZAAD01, CET-ZAAD02, CET-ZAAD03, CET-ZAAD04, CET-ZAAD05, CET-ZAAD07, CET-ZAAD09 및 CET-ZAAD010으로 지칭하였으며, 15E3 항체와 이중항체 형태로 클로닝된 경우에는 각각 15E3-ZAAD01, 15E3-ZAAD02, 15E3-ZAAD03, 15E3-ZAAD04, 15E3-ZAAD05, 15E3-ZAAD07, 15E3-ZAAD09 및 15E3-ZAAD010으로 지칭하였다.

상기 국내 공개특허공보 제10-2017-0012754호에 공지된 바와 같이, 본 발명자들은 세툭시맙과 15E3 항체 모두 EGFR 도메인 3에 결합하지만, 두 항체가 상이한 에피톱(epitope)에 결합하는 것을 밝힌 바 있다.

2-2: CD137 및 EGFR 단백질 각각에 대한 이중항체의 결합 확인

정제된 이중항체의 형태를 이용하여, 단백질의 결합, 발현 세포의 결합 및 T 세포 활성화 테스트(T cell activation test)를 통해, EGFR 및 CD137 단백질에 모두 결합하는, CD137 어피바디의 선별을 진행하였다.

동물세포에서 생산된 상술한 이중항체 총 16종(8종의 Cetuximab-Zb 및 8종의 15E3-Zb)을 이용하여 각 CD137과 EGFR의 단백질의 결합을 ELISA를 이용하여 확인하였다. ELISA는 2 μg/mL의 농도로 hCD137-ECD-his와 hEGFR-ECD-his 단백질이 각각 코팅된 플레이트에 정제된 이중항체 16종을 60 nM부터 1/5 희석(dilution)하여 7 포인트(point)로 처리하였으며, 2차 항체(Goat anti-human IgG-F(ab')₂-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., JAC-109-035-097)를 처리한 후, TMB(BioFX^TM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3, PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD₄₅₀ 값을 측정하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism)를 통해 EC₅₀(half maximal effective concentration) 값을 구하고, 결과를 도 3a 내지 3d에 나타내었다.

도 3a 및 3b는 세툭시맙(CET) 항체를 기반으로 하는 CD137 어피바디로 구성된 이중항체(이하, CET-기반 CD137 어피바디 이중항체, Cetuximab-Zb, 또는 CET_ZAAD01 내지 CET_ZAAD10으로 지칭)의 결합 테스트 결과이고, 도 3c 및 3d는 15E3 항체를 기반으로 하는 CD137 어피바디로 구성된 이중항체(이하, 15E3-기반 CD137 어피바디 이중항체, 15E3-Zb, 또는 15E3_ZAAD01 내지 15E3_ZAAD10으로 지칭)의 결합 테스트 결과이며, 도 3a 및 3c는 EGFR 단백질에 대한 결합을 확인한 결과이며, 도 3b 및 3d는 CD137 단백질에 대한 결합을 확인한 결과이다.

상기 결과로부터, 본 발명의 이중항체 총 16종, CET-기반 CD137 어피바디 이중항체 및 15E3-기반 CD137 어피바디 이중항체가 EGFR 및 CD137 단백질 모두에 대해 결합하는 것을 확인하였다.

2-3: CD137 발현 세포에서 이중항체 형태의 결합 확인

CD137 발현 세포에서 상기 16종의 이중항체 형태의 결합을 확인하기 위해, CEMT 세포를 1×10⁷/10 mL를 준비하여, 50 ng/mL의 PMA 및 1 μg/mL의 이오노마이신을 처리한 후, 16시간 동안 인큐베이션하여 활성화시켰다. 활성화된 CEMT 세포를 5×10⁵/튜브로 준비한 다음 1,200 rpm으로 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고, PBS 중 5% FBS로 수세한 후, 이중항체를 5 μg/mL로 처리하고 얼음에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세하였다. 그 다음 anti-human-Fc-FITC(Life Technologies^®, A11013)를 1 μg/mL로 세포에 처리하고 빛을 차단한 채로 얼음에서 45분간 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세한 후, 베크만 쿨터 FACS 기기를 이용하여 형광의 세기를 측정하고, 그 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다. 또한, 양성 대조군(Positive Ab)으로서 유토밀루맙(utomilumab)을 사용하였고, 음성 대조군으로 인간 IgG(hIgG)를 사용하였다.

도 4a는 CET-기반 CD137 어피바디 이중항체의 FACS 결과로, 양성 대조군(Positive Ab)의 피크와 같이, 우측으로 이동한 피크를 나타내었으므로, CET-기반 CD137 어피바디 이중항체 8종 모두 CD137을 발현하는 활성화된 CEMT 세포에 결합하였음을 확인할 수 있었다.

도 4b는 15E3-기반 CD137 어피바디 이중항체의 FACS 결과로, 양성 대조군의 피크와 같이, 우측으로 이동한 피크를 나타내었으므로, 15E3-기반 CD137 어피바디 이중항체 8종 모두 CD137을 발현하는 활성화된 CEMT 세포에 결합하였음을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 이중항체 총 16종이 모두 CD137을 발현하는 세포에 특이적으로 결합함을 확인하였다.

2-4: EGFR 발현 세포에서 이중항체 형태의 결합 확인

마찬가지로, EGFR 발현 세포에서 상기 16종의 이중항체 형태의 결합을 확인하기 위해, 높은 EGFR 발현을 나타내는 것으로 공지된 HT29 세포(Korean Cell Line Bank, KCLB, 30038, 인간 대장암 세포주)를 5×10⁵/튜브로 준비한 다음 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. PBS 중 5% FBS로 수세한 후, 상기 16종의 이중항체를 5 μg/mL로 처리하고 얼음에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세하였다. 그 다음 anti-human-Fc-FITC(Life Technologies^®, A11013)를 1 μg/mL로 세포에 처리하고 빛을 차단한 채로 얼음에서 45분간 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세한 후, 베크만 쿨터 FACS 기기를 이용하여 형광의 세기를 측정하고, 결과를 도 5a 및 5b에 나타내었다. 또한, 양성 대조군(Positive Ab)으로 CET-기반 평가시에는 CET-IgG 형태를 사용하였고, 15E3-기반 평가시에는 15E3-IgG 형태를 사용하였고, 음성 대조군으로 hIgG를 사용하였다.

도 5a는 CET-기반 CD137 어피바디 이중항체의 FACS 결과로, 양성 대조군(CET-IgG)의 피크와 같이 우측으로 이동한 피크를 나타내었으므로, CET-기반 CD137 어피바디 이중항체 8종 모두 EGFR을 발현하는 HT29 세포에 결합함을 확인하였다.

도 5b는 15E3-기반 CD137 어피바디 이중항체의 FACS 결과로, 양성 대조군(15E3-IgG)의 피크와 같이 우측으로 이동한 피크를 나타내었으므로, 15E3-기반 CD137 어피바디의 이중항체 8종 모두 EGFR을 발현하는 HT29 세포에 결합함을 확인하였다.

상기 결과로부터, 본 발명의 이중항체 총 16종이 모두 EGFR을 발현하는 세포에 특이적으로 결합함을 확인하였다.

2-5: EGFR 의존적 T 세포 활성화 테스트 - 어피바디 ZAAD01 및 ZAAD05 선정

생산된 총 16종의 이중항체에서 EGFR 의존적 T 세포 활성화 테스트(EGFR dependent T cell activation test)를 통해 어피바디 선별 작업을 진행하였다.

테스트 방법

테스트 하루 전에 3 μg/mL의 농도로 항-CD3 항체(Invitrogen^TM, 16-0037-85)를 96 웰 라운드 플레이트(96 well round plate)에 50 μL씩 코팅하였다. 다음날, 멸균된 PBS 100 μL를 이용하여 세 번 수세하였다. 5 μg/mL 농도의 hEGFR-ECD-Fc를 다시 50 μL씩 코팅하였고, 대조군으로 단백질이 없는 웰에는 PBS만 처리하였으며, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. R10 배지(RPMI1640, 10% FBS 및 10 mM HEPES)를 100 μL 이용하여 세 번 수세하였고, R10 배지 100 μL를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 플레이트에 있는 R10 배지를 완전히 제거하고, 16종(8종의 Cetuximab-Zb 및 8종의 15E3-Zb)의 이중항체를 0.1 nM 또는 1 nM의 농도로 50 μL씩 30분간 처리하였다.

그 사이에, 두 명의 공여자로부터 제공받은 혈액을, PBS로 1/2 희석한 후에, 피콜(Ficoll^®, GE healthcare, 17-1440-12)을 띄운 류코셉 튜브(Leucosep tube, Greiner Bio-One 유한회사, 227290)에 넣은 후, 1,000 g에서 30분간 원심분리를 진행하였다. 피콜 위에 자리한 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)의 층만을 따낸다. PBS 중 2% PBMC를 이용하여 300 g에서 10분간 원심분리를 하는 수세 작업을 2회 반복한 후에, PBMC의 수를 측정하였다. PBMC를 CD8⁺ T 세포 분리 키트(CD8⁺ T cell isolation kit, Miltenyi Biotec Inc., 130-096-495)의 프로토콜을 따라 CD8⁺ T 세포를 준비하였다.

CD8⁺ T 세포의 수를 측정하여 1.4 × 10⁶/mL이 되도록 R10 배지로 풀어준 다음, 상기 16종의 이중항체를 처리한 플레이트에 50 μL씩 처리하였다. 처리 3일 후에 플레이트를 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하고, 이를 이용하여, 인간 인터페론-감마 ELISA 키트(IFN-gamma ELISA set, BD Biosciences, 555142)의 프로토콜을 따라 인터페론-감마(Interferon gamma, IFN-gamma, IFN-γ)를 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

테스트 결과

도 6에 나타낸 바와 같이, T 세포 활성화 분석을 통해 EGFR의 유무에 따른 T 세포 활성화의 정도를 IFN-γ의 측정을 통해 확인하였다. 그 결과, CET-기반 ZAAD01 어피바디 이중항체, CET-기반 ZAAD05 어피바디 이중항체, 15E3-기반 ZAAD01 어피바디 이중항체 및 15E3-기반 ZAAD05 어피바디 이중항체를 1 nM 농도로 처리한 경우 IFN-γ의 농도가 유의하게 증가함을 확인하였다. 따라서, 8종의 어피바디 중 IFN-γ 농도가 증가한 어피바디 ZAAD01 및 ZAAD05를 선별하였다.

구체적으로, EGFR 의존적 T 세포 활성화 테스트에서는, 플레이트에 코팅된 hEGFR-ECD-Fc에 Cetuximab-Zb 또는 15E3-Zb가 결합하고, 플레이트에 코팅된 항-CD3 항체에 CD3을 발현하는 CD8⁺ T 세포가 결합한다. hEGFR-ECD-Fc에 결합해 있는 Cetuximab-Zb 또는 15E3-Zb의 어피바디가 항-CD3 항체에 결합해 있는 CD8⁺ T 세포 표면상의 CD137과 결합함으로써, CD8⁺ T 세포가 활성화되고, 활성화된 CD8⁺ T 세포에 의해 분비된 IFN-γ를 측정할 수 있게 된다. CD137의 작용(agonism)을 통해 T 세포가 활성화되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 따른 어피바디 ZAAD01 및 ZAAD05는 CD8⁺ T 세포 표면의 CD137 ECD에 결합함으로써 CD137을 활성화하였고, CD8⁺ T 세포가 IFN-γ를 분비하게 하였다.

이는, CD137에 대한 단일클론 항체인 우렐루맙(Urelumab, BMS-663513) 및 유토밀루맙(Utomilumab)이 CD137 (4-1BB)에 결합하여 T 세포를 활성화하는 작용제(agonist)로 공지된 선행문헌과 일치하는 결과이다(미국 특허 등록번호 제US7288638 B2호. 2007 Oct 30; 미국 특허 등록번호 제US7288638 B2호; 및 미국 특허 등록번호 제US8821867 B2호, 참조).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 이중항체 Cetuximab-ZAAD01, 15E3- ZAAD01, Cetuximab-ZAAD01 및 15E3-ZAAD01이 EGFR에 의존적으로 T 세포 활성화하는 것을 확인하고, 어피바디 ZAAD01 및 ZAAD05를 최종 선별하였다.

실시예 3. 선별된 어피바디의 특성 분석

3-1: CD137 ECD 도메인 맵핑을 통한 어피바디의 결합 특성 확인

선별된 어피바디 두 종, ZAAD01 및 ZAAD05의 CD137 도메인 맵핑(domain mapping)을 통해 결합 특성을 확인하였다. 15E3-기반 ZAAD01 및 ZAAD05 어피바디 이중항체를 이하에서는 각각 15E3ZAAD01 및 15E3ZAAD05로 지칭하였다. 또한, CD137에 대한 단일클론 항체인 우렐루맙(Urelumab, BMS-663513) 및 유토밀루맙(Utomilumab, PF-05082566)의 결합 도메인도 함께 조사하였다.

선별된 CD137 어피바디 2종이 CD137의 세포외 도메인(extracellular domain, ECD)의 어느 부분에 결합하는지 확인하기 위해, CD137의 ECD를 5개의 도메인으로 구분한 후, 도메인 돌연변이(domain mutant)를 클로닝하였다. 도메인 돌연변이에 대한 모식도를 도 7a에 나타내었다.

도 7a에 나타낸 바와 같이, 클로닝한 도메인 돌연변이는 신호 펩타이드(signal peptide) 및 상이한 조합의 ECD 도메인 1 내지 도메인 5를 포함하며, 구체적으로는 다음과 같다: 신호 펩타이드 및 도메인 1 내지 5를 모두 포함하는 hCD137-ECD; 도메인 1이 결실된 hCD137-ECD-ΔD1; 도메인 1 및 2가 결실된 hCD137-ECD-ΔD12; 도메인 1 및 2의 전부 및 도메인 3의 일부(104번째 아미노산까지 결실됨)가 결실된 hCD137-ECD-ΔD123p; 도메인 1 내지 3이 결실된 hCD137-ECD-ΔD123; 도메인 3이 결실된 hCD137-ECD-ΔD3; 및 도메인 5가 결실된 hCD137-ECD-ΔD5.

도 7a에서는 신호 펩타이드 및 도메인 1 내지 5를 포함하는 hCD137ECD에 대한 모식도를 나타내었고, 서열번호 27에는 신호 펩타이드에 대한 아미노산 서열은 제외하고, 도메인 1 내지 도메인 5에 대한 아미노산 서열을 나타내었다.

클로닝한 도메인 돌연변이를 동물세포를 이용하여 생산하였다. 2 μg/mL 농도의 생산된 도메인 돌연변이로 코팅된 플레이트에 정제된 우렐루맙(Urelumab), 유토밀루맙(Utomilumab), 15E3, 15E3ZAAD01 및 15E3ZAAD05를 10 μg/mL, 2 μg/mL 및 0.4 μg/mL씩 처리하였으며, 2차 항체(anti-hIgG-Fab-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., JAC-109-035-097)를 처리한 후 TMB(BioFX^TM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3, PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD₄₅₀ 값을 측정하고, 그 결과를 도 7b 내지 7f에 나타내었다.

도 7b에 나타낸 바와 같이, 우렐루맙은 도메인 돌연변이 중 hCD137ECD-ΔD1, hCD137ECD-ΔD12, hCD137ECD-ΔD123P 및 hCD137ECD-ΔD123에 결합하지 않았으므로, 우렐루맙은 CD137 ECD의 도메인 1에 결합함을 확인하였다.

도 7c에 나타낸 바와 같이, 유토밀루맙은 도메인 돌연변이 중 hCD137ECD-ΔD123P, hCD137ECD-ΔD123 및 hCD137ECD-ΔD3에 결합하지 않았으므로, 유토밀루맙은 CD137 ECD의 도메인 3에 결합함을 확인하였다.

도 7d에 나타낸 바와 같이, Negative Ab (세툭시맙)은 인간 CD137 ECD 전체와 이의 도메인 돌연변이 모두와 결합하지 않았으므로, CD137 ECD에 결합하지 않음을 확인하였다.

도 7e에 나타낸 바와 같이, 15E3ZAAD01은 도메인 돌연변이 중 hCD137ECD-ΔD123P, hCD137ECD-ΔD123 및 hCD137ECD-ΔD3에 결합하지 않았으므로, 15E3ZAAD01은 CD137 ECD의 도메인3에 결합함을 확인하였다.

도 7f에 나타낸 바와 같이, 15E3ZAAD05는 도메인 돌연변이 중 hCD137ECD-ΔD123P, hCD137ECD-ΔD123 및 hCD137ECD-ΔD3에 결합하지 않았으므로, 15E3ZAAD05는 CD137 ECD의 도메인 3에 결합함을 확인하였다.

상기 결과로부터, 본 발명자들은 선별된 어피바디 두 종, ZAAD01 및 ZAAD05가 CD137 ECD의 도메인 3에 결합하는 것을 확인하였다.

3-2: 선별된 어피바디의 TNFRSF 사이의 교차반응 확인

선별된 어피바디 두 종, ZAAD01 및 ZAAD05의 TNFRSF(TNF-alpha receptor super family)에 대한 교차반응(cross reactivity)을 ELISA를 이용하여 확인하였다.

TNFRSF에 속하는 CD137 (TNFRSF9), CD27 (TNFRSF7), CD30 (TNFRSF8), CD134 (TNFRSF4), CD270 (TNFRSF14), CD357 (TNFRSF18) 및 TNF-alpha 단백질을 2 μg/mL의 농도로 코팅된 플레이트에 15E3ZAAD01 및 15E3ZAAD05를 각각 1 μg/mL로 처리하였으며, 2차 항체(anti-hIgG-Fab-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., JAC-109-035-097)를 처리한 후 TMB(BioFX^TM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3 PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD₄₅₀ 값을 측정하고, 그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다.

도 8a에 나타낸 바와 같이, ZAAD01은 CD137에만 특이적으로 결합하였고, 도 8b에 나타낸 바와 같이, ZAAD05 또한 CD137에만 특이적으로 결합하였다.

상기 결과로부터, 본 발명자들은 선별된 어피바디 두 종, ZAAD01 및 ZAAD05가 TNFRSF(TNF-alpha receptor super family)에 속하는 다른 단백질과 교차반응하지 않음을 확인하였다.

3-3: 선별된 어피바디의 종간 교차반응

선별된 어피바디 두 종, ZAAD01 및 ZAAD05의 CD137에 대한 종(species)간 교차반응을 ELISA를 이용하여 확인하였다.

인간(human) CD137, 마우스(mouse) CD137 및 게잡이 원숭이(cynomolgus monkey) CD137 단백질이 각각 2 μg/mL의 농도로 코팅된 플레이트에 15E3ZAAD01 및 15E3ZAAD05를 5 μg/mL로 처리하였으며, 2차 항체(anti-hIgG-Fab-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., JAC-109-035-097)를 처리한 후 TMB(BioFX^TM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3, PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD₄₅₀ 값을 측정하고, 그 결과를 도 9a 및 9b에 나타내었다.

도 9a에 나타낸 바와 같이, 어피바디 ZAAD01은 인간 및 게잡이 원숭이의 CD137 단백질과 결합하였고, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 어피바디 ZAAD05 또한 인간 및 게잡이 원숭이의 CD137 단백질과 결합하였다.

상기 결과로부터, 선별된 CD137 어피바디 2종 모두 CD137 단백질에 대해 인간 및 게잡이 원숭이에서 종간 교차반응하였음을 확인하였다.

실시예 4. 이중항체의 타겟 단백질 결합 및 EGFR 의존적인 효능 확인

4.1: 이중항체가 두 표적에 동시에 결합하는지 여부 확인

EGFR에 결합하는 항체인 세툭시맙과 15E3, 및 CD137에 결합하는 어피바디인 ZAAD01과 ZAAD05로 구성된, 이중항체 4종인, CET-ZAAD01, CET-ZAAD05, 15E3-ZAAD01, 및 15E3-ZAAD05가 각 타겟 단백질에 동시에 결합하는지 여부를 BLI(BioLayer Interferometry) 법을 이용하여 확인하였다.

AR2G 센서칩(Amine Reactive Second-Generation Biosensor, SATORIUS 주식회사, 18-5092)에 EGFR-ECD-Fc 단백질을 5 μg/mL의 농도로 EDC/NHS를 이용한 아민 커플링 방법으로 고정시켰다. EGFR-ECD-Fc가 고정된 센서칩에 상기 4종의 이중항체를 각 10 μg/mL의 농도로 5분간 결합시키고 5분간 안정화시켰다. 고정된 EGFR 단백질에 이중항체가 결합하고 있는 센서칩에 CD137-ECD-his 단백질을 30 μg/mL의 농도로 첨가하고, 5분간 결합시키고 5분간 안정화시켰다. 결과는 도 10a 내지 10d에 나타내었다. 대조군으로서, CET 또는 15E3을 처리한 경우, 그 결과는 빨간색 선으로 나타내었으며, 본 발명의 4종의 이중항체를 처리한 경우, 그 결과는 파란색 선으로 나타내었다.

도 10a에 나타낸 바와 같이, 대조군으로서 CET를 처리한 후, 센서칩에 CD137-ECD-Fc 단백질을 첨가하였을 때 결합 신호에 변화가 없는 반면(빨간색 선), CET-ZAAD01 이중항체를 처리한 후, 센서칩에 CD137-ECD-Fc 단백질을 첨가하였을 때 결합 신호가 증가하였으며(파란색 선), 이는 CET-ZAAD01 이중항체가 센서칩에 미리 고정된 EGFR 단백질과 나중에 첨가한 CD137-ECD-Fc 단백질에 동시에 결합하는 것을 의미한다.

CET-ZAAD01 이중항체의 결과와 마찬가지로, CET-ZAAD05 이중항체(도 10b), 15E3-ZAAD01 이중항체(도 10c), 및 15E3-ZAAD05 이중항체(도 10d) 또한 센서칩에 CD137-ECD-his 단백질을 첨가하였을 때 결합 신호가 증가하여, 상기 이중항체 또한 EGFR 단백질 및 CD137 단백질에 동시에 결합하는 것을 확인하였다.

4.2: EGFR 발현 수준에 따른 이중항체의 T 세포 활성화

CD137에 대한 어피바디와 EGFR에 대한 항체를 이용한 이중항체가 세포주(cell line)의 EGFR 발현 정도에 따라 T 세포 활성화를 증가시키는지 여부를 조사하였다.

세포주의 EGFR 발현 수준

3종의 EGFR 발현 세포 A431(ATCC, CRL-1555, epidermis, epidermoid carcinoma), HT29(KCLB, 30038, colon, adenocarcinoma) 및 SW403(KCLB, 10230, colon, adenocarcinoma)과 EGFR 음성 세포인 MOLT4(KCLB, 21582, adult T acute lymphoblastic leukemia)를 5×10⁵/튜브로 준비하였다.

그 다음, 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고, PBS 중 5% FBS로 수세한 후, 15E3ZAAD01 이중항체를 5 μg/mL 처리하였다. 얼음에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세하였다. 그 다음, anti-human Fc FITC를 1 μg/mL로 세포에 처리하고 빛을 차단한 채로 얼음에서 45분간 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세한 후, 베크만 쿨터의 FACS 기기를 이용하여 형광의 세기를 측정하고 MFI (Mean Fluorescent Intensity) 값을 얻어, 그 결과를 도 11a에 나타내었다. 세포가 15E3ZAAD01 이중항체와 결합을 많이 할수록 MFI 값은 증가하므로, 세포가 높은 EGFR 발현 수준을 가짐을 나타낸다.

도 11a에 나타낸 바와 같이, EGFR 양성 세포인 A431 세포, HT29 세포 및 SW403 세포와 EGFR 음성 세포인 MOLT4 세포에서 EGFR 발현을 확인한 결과, 세포주 A431, H29, SW403 및 MOLT4 순서대로 101.5, 23.9, 17.1 및 0.9의 MFI 값을 각각 나타내어, 상기 순서로 EGFR의 발현이 많았음을 확인하였다.

이중항체의 EGFR 의존적 T 세포 활성화

위에서 살펴본, EGFR의 발현 정도가 상이한 세포를 이용하여, T 세포 분석(T cell assay)을 진행하였다. 하루 전에 3 μg/mL의 농도로 항-CD3 항체(Invitrogen^TM, 16-0037-85)를 96 웰 라운드 플레이트에 50 μL씩 코팅을 진행하였다. 다음날, 멸균된 PBS를 100 μL 이용하여 수세를 3회 수행하였다. R10 배지를 100 μL 이용하여 수세를 3회 수행하고, R10 배지 100 μL를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 4종류의 세포주, A431, H29, SW403 및 MOLT4를 각 플레이트에 2.4×10⁵/mL이 되도록 50 μL씩 첨가하였다. 15E3ZAAD01 이중항체를 5 μg/mL의 농도로 50 μL로 30분간 처리하였다.

그 사이에, 두 명의 공여자로부터 제공받은 혈액을, PBS로 1/2 희석한 후에, 피콜(Ficoll^®, GE healthcare, 17-1440-12)을 띄운 류코셉 튜브(Leucosep tube, Greiner Bio-One 유한회사, 227290)에 넣고, 1,000 g에서 30분간 원심분리하였다.

피콜 위에 자리한 PBMC의 층만을 따내었다. PBS 중 2% PBMC를 이용하여 300 g에서 10분간 원심분리를 하는 수세 작업을 두 번 반복한 후에, PBMC의 수를 측정하였다. PBMC를 CD8⁺ T 세포 분리 키트(CD8⁺ T cell isolation kit, Miltenyi Biotec Inc., 130-096-495)의 프로토콜에 따라 CD8⁺ T 세포를 준비하였다.

CD8⁺ T 세포의 수를 측정하여 1.4×10⁶/mL이 되도록 R10 배지로 풀어준 후에, 15E3ZAAD01 이중항체가 처리된 플레이트에 50 μL의 양으로 처리하였다. 처리 3일 후에 플레이트를 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하고, 이를 이용하여, IFN-γ 측정 키트(BD Biosciences, 555142)의 프로토콜을 따라 IFN-γ의 농도를 측정하였다. 본 발명의 이중항체가 EGFR 발현 수준에 따라 T 세포를 활성화하는지 여부를 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량을 통해 확인하였고, 그 결과는 도 11b에 나타내었다.

도 11b에 나타낸 바와 같이, T 세포 활성화 분석을 통해 EGFR의 발현이 증가함에 따라 IFN-γ의 농도가 증가하므로, EGFR 발현 증가에 따라 T 세포 활성이 증가함을 확인하였다.

구체적으로, IFN-γ 분비량이 많은 순서는 위에서 살펴본 EGFR 발현량이 많은 순서와 일치하였다. 구체적으로, 세포주 A431, H29, SW403 및 MOLT4 순서대로 5.9, 2.2, 1.9 및 1.0의 IFN-γ 농도 배수(fold) 값을 각각 나타내어, 상기 순서로 IFN-γ의 농도가 높았음을 확인하였다.

본 발명자들은 상기 결과로부터, EGFR 발현 정도에 따른 15E3-ZAAD01 이중항체의 EGFR 의존적 T 세포 활성화를 확인하였고, 이는 EGFR 발현 정도에 따른 이중항체의 T세포 활성화 정도가 EGFR 발현양과 상관관계가 있음을 나타낸다.

본 발명에 따른 EGFR 항체-기반 CD137 어피바디 이중항체를 이용하는 경우, 과도한 EGFR 발현량을 나타내는 암 세포 및 조직에 CD137을 발현하는 T 세포가 가까이 위치하여 결합하고, 활성화될 수 있으므로, EGFR을 과발현하는 다양한 암 유형에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 5. CD137 어피바디 기반 다양한 항원 표적 이중항체의 개발 가능성 - HER2 및 CD19

본 발명자들은 상기 결과로부터 암 특이적 표적 단백질로서 EGFR뿐만 아니라, 다른 암 또는 종양 특이적 표적 단백질에 대한 항체-기반 CD137 어피바디 이중항체를 이용하여, T 세포를 활성화할 수 있는지 여부를 아래와 같이 확인하고자 하였다.

5.1: 표적 단백질, HER2 또는 CD19에 대한 결합 확인

선별된 CD137에 대한 어피바디, ZAAD01을 기반으로, EGFR 이외의 다른 단백질인 HER2 및 CD19와 결합하는 항체를 각각 이용하여 이중항체 형태로 클로닝하였다. HER2 항체 및 CD137 어피바디로 구성된 이중항체는 anti-HER2 Ab1-ZAAD01 및 anti-HER2 Ab2-ZAAD01으로 표기하였고, CD19 항체 및 CD137 어피바디로 구성된 이중항체는 anti-CD19 Ab-ZAAD01으로 표기하였다.

구체적으로, anti-HER2 Ab1-ZAAD01에서, anti-HER2 Ab1은 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 트라스투주맙(trastuzumab)이고, anti-HER2 Ab2-ZAAD01에서 anti-HER2 Ab2은 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 자체적으로 개발한 hz1E11.10 항체(국내 공개특허 제10-2017-0117330호, 참조)이다.

상기 anti-HER2 Ab는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.

구체적으로, anti-CD19 Ab-ZAAD01에서 anti-CD19 Ab는 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 FMC63이다.

상기 anti-CD19 Ab는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.

동물세포를 이용하여 상술한 이중항체를 생산하였다. 정제된 이중항체의 형태로 단백질의 결합 및 T 세포 활성화 테스트를 통해, 본 발명의 CD137 어피바디가 모듈 형식으로 다양한 다른 항원을 표적으로 하는 이중항체로 개발되어 실질적으로 사용될 수 있는지의 가능성을 살펴보았다.

ELISA는 2 μg/mL의 농도로 CD137 단백질과 각 항체의 타겟 단백질에 맞게 hHer2-ECD-Fc 단백질과 hCD19-ECD-Fc 단백질이 코팅된 플레이트에 정제된 상술한 이중항체를 60 nM부터 1/5 희석하여 7포인트로 처리하였으며, 2차 항체(anti-hIgG-Fab-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., JAC-109-035-097)를 처리한 후 TMB(BioFX^TM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3, PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD₄₅₀ 값을 측정하였고, 그 결과는 도 12a 내지 12d에 나타내었다.

도 12a 내지 12d에 나타낸 바와 같이, CD137 어피바디와 HER2 항체 또는 CD19 항체를 이용하여 생산된 이중항체가 CD137과 HER2 또는 CD19에 각각 결합하였다.

구체적으로, 음성 대조군(hIgG) 대비 항-HER2-항체 및 ZAAD01 어피바디로 구성된, anti-HER2 Ab1-ZAAD01 및 anti-HER2 Ab2-ZAAD01 이중항체 모두 표적 단백질인 CD137(도 12a) 및 HER2(도 12b)에 대한 결합이 농도 의존적으로 각각 증가하였다.

또한, 음성 대조군 대비 항-CD19-항체 및 ZAAD01 어피바디로 구성된, anti-CD19 Ab-ZAAD01 이중항체의 표적 단백질인 CD137(도 12c) 및 CD19(도 12d)에 대한 결합이 농도 의존적으로 각각 증가하였다.

상기 결과로부터, 본 발명의 이중항체 anti-HER2 Ab1-ZAAD01 및 anti-HER2 Ab2-ZAAD01은 CD137 및 HER2 단백질에 모두 결합하는 것을 확인하였고, 본 발명의 이중항체 anti-CD19 Ab-ZAAD01은 CD137 및 CD19 단백질에 모두 결합하는 것을 확인하였다.

5.2: 표적 단백질 의존적-T 세포 활성화 테스트

위에서 살펴보았듯이, 각 표적 단백질에 모두 결합하는 것을 확인한, 생산된 이중항체를 이용하여, 확장된 다른 단백질, 즉 HER2 또는 CD19에 의존적인 T 세포 활성화 테스트를 수행하여, 이중항체의 효능을 확인하였다.

테스트 방법

하루 전에 3 μg/mL의 농도로 항-CD3 항체(Invitrogen, 16-0037-85)를 96 웰 라운드 플레이트에 50 μL씩 코팅하였다. 다음날, 멸균된 PBS를 100 μL 이용하여 수세를 3회 수행하였다. 5 μg/mL 농도의 HER2 또는 CD19를 다시 50 μL씩 코팅하고 대조군으로 단백질이 없는(HER2 또는 CD19 처리하지 않음) 웰에는 PBS만 처리한 다음, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. R10 배지를 100 μL 이용하여 수세를 3회 수행하였고, R10 배지 100 μL를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 플레이트에 있는 R10 배지를 완전히 제거하고, 상기 이중항체를 5 μg/mL의 농도로 50 μL로 30분간 처리하였다.

그 사이에, 두 명의 공여자로부터 제공받은 혈액을, PBS로 1/2 희석한 후, 피콜(Ficoll^®, GE healthcare, 17-1440-12)을 띄운 류코셉 튜브(Leucosep tube, Greiner Bio-One 유한회사, 227290)에 넣은 후, 1,000 g에서 30분간 원심분리하였다. 피콜 위에 자리한 PBMC의 층만을 따내었다. PBS 중 2% PBMC를 이용하여 300 g에서 10분간 원심분리를 하는 수세 작업을 2회 반복한 후에, PBMC의 수를 측정하였다.

PBMC를 CD8⁺ T 세포 분리 키트(CD8⁺ T cell isolation kit, Miltenyi Biotec Inc., 130-096-495)의 프로토콜에 따라 CD8⁺ T 세포를 준비하였다. CD8⁺ T 세포의 수를 측정하여 1.4×10⁶/mL이 되도록 R10 배지로 풀어준 후, 상기 이중항체가 처리된 플레이트에 50 μL의 양으로 처리하였다. 처리하고 3일 후에 플레이트를 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하고, 이를 이용하여, IFN-γ 측정 키트(BD Biosciences, 555142)의 프로토콜을 따라 IFN-γ의 농도를 측정하고, 그 결과를 도 13a 및 13b에 나타내었다. 음성 대조군으로서, CD137에 대한 단일클론 항체인 유토밀루맙을 사용하였다.

테스트 결과

도 13a 및 13b에 나타낸 바와 같이, CD137 어피바디와 HER2 항체 또는 CD19 항체를 이용하여 생산된 이중항체(anti-HER2 Ab1-ZADD01, anti-HER2 Ab1-ZADD01 및 anti-CD19 Ab-ZADD01)가 HER2 또는 CD19 단백질에 의존적으로 T 세포를 활성화하였음을 IFN-γ 분비량이 증가하였음을 통해 확인하였다.

구체적으로, 도 13a에서 CD137에 대한 단일클론 항체인 유토밀루맙을 처리한 경우, HER2 유무에 상관없이 IFN-γ가 CD8⁺ T 세포로부터 거의 분비되지 않았다. 이중항체 anti-HER2 Ab1-ZAAD01 (트라스투주맙-ZAAD01) 및 anti-HER2 Ab2-ZAAD01 (hz1E11.10-ZAAD01)를 처리한 경우, HER2를 처리하지 않았을 때(no HER2) 대비 HER2를 처리하였을 때(HER2) CD8⁺ T 세포는 유의하게 증가된 IFN-γ 분비량을 나타내었다.

또한, 도 13b에서 CD137에 대한 단일클론 항체인 유토밀루맙을 처리한 경우, CD19 유무에 따른 CD8⁺ T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량에 유의한 차이가 없었다. 이중항체 anti-CD19 Ab-ZAAD01 (FMC63-ZAAD01)를 처리한 경우, CD19를 처리하지 않았을 때(no CD19) 대비 HER2를 처리하였을 때(CD19) CD8⁺ T 세포는 유의하게 증가된 IFN-γ 분비량을 나타내었다.

본 발명자들은, IFN-감마 분비량 분석을 통해, 항-HER2 항체 또는 항-CD19 항체 및 ZAAD01 어피바디로 구성된, 이중항체가 각각의 표적 항체, HER2 또는 CD19에 의존적으로 T 세포를 활성화하였음을 확인하였다.

특히, 이러한 결과는 확장된 다른 표적 단백질인 HER2 또는 CD19에 따른 T 세포 활성화의 유무를 IFN-γ의 측정을 통해 확인한 것으로, 본 발명에 따른 CD137 어피바디를 모듈 형식으로 이용하는 경우, 본 발명에 개시된 표적 단백질인 EGFR, HER2 및 CD19뿐만 아니라, 상기 표적 단백질과 상이한, 다양한 표적 단백질에 적용 가능함을 제시하는 결과이다.

따라서, 본 발명의 개시사항으로부터 당업자라면, 특정 암세포에 특이적으로 발현하는/존재하는 표적 단백질에 대한 항체와 본 발명의 CD137 어피바디로 구성된, 이중항체를 구성함으로써, CD137의 면역조절적(immunomodulatory) 접근 방법을 통해, 다양한 유형의 암에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 이해할 것이다.

결국, 본 발명의 CD137 어피바디, 또는 CD137 어피바디 및 암세포 특이적 표적 단백질에 대한 항체로 구성된 이중항체를 이용하면, CD137을 발현하는 다양한 항원제시세포(antigen-presenting cell, APC)를 통한, 예를 들어, NK(natural killer) 세포의 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 DC(dendritic cell)의 T 세포 활성화 등을 통한, 다양한 유형의 암에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> AbClon Inc. <120> Affibody specifically binding to CD137 and Uses thereof <130> PN200305 <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD01 <400> 1 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Val Cys Arg Ala Met Glu Glu Ile 1 5 10 15 Gly Met Leu Pro Asn Leu Asn Ala His Gln Leu Ala Ala Phe Ile Trp 20 25 30 Ser Leu Pro Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD02 <400> 2 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Glu Cys Thr Ala Tyr Phe Glu Ile 1 5 10 15 Ala Asn Leu Pro Asn Leu Asn Thr Ala Gln Leu Ala Ala Phe Ile Trp 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD03 <400> 3 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Val Cys Thr Ala Phe Asp Glu Ile 1 5 10 15 Ala His Leu Pro Asn Leu Asn Val His Gln Leu Ala Ala Phe Ile Trp 20 25 30 Ser Leu Thr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 4 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD04 <400> 4 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Tyr Cys Phe Ala Met Asp Glu Ile 1 5 10 15 Ala Ser Leu Pro Asn Leu Asn Pro His Gln Leu Ala Ala Phe Ile Trp 20 25 30 Ser Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 5 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD05 <400> 5 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Glu Cys Ser Ala Met Gln Glu Ile 1 5 10 15 Ser Met Leu Pro Asn Leu Asn Pro His Gln Phe Ala Ala Phe Ile Trp 20 25 30 Ser Leu Met Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 6 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD07 <400> 6 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Cys Trp Ala Ile Ala Glu Ile 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ggaggtttgc cgtgccatgg aagagattgg tatgctgccc 60 aacctgaacg ctcatcagct ggctgccttc atttggtccc tgccggacga cccttcccag 120 tccgccaacc tgctggccga ggccaagaag ctgaacgacg cccaggctcc caag 174 <210> 10 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD02 <400> 10 gtggacaaca agttcaacaa ggaggaatgc actgcctact tcgagattgc taacctgccc 60 aacctgaaca ctgctcagct ggctgccttc atttggtccc tgcgtgacga cccttcccag 120 tccgccaacc tgctggccga ggccaagaag ctgaacgacg cccaggctcc caag 174 <210> 11 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD03 <400> 11 gtggacaaca agttcaacaa ggaggtttgc actgccttcg acgagattgc tcatctgccc 60 aacctgaacg ttcatcagct ggctgccttc atttggtccc tgactgacga cccttcccag 120 tccgccaacc tgctggccga ggccaagaag ctgaacgacg cccaggctcc caag 174 <210> 12 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD04 <400> 12 gtggacaaca agttcaacaa ggagtactgc ttcgccatgg acgagattgc ttctctgccc 60 aacctgaacc cgcatcagct ggctgccttc atttggtccc tggacgacga cccttcccag 120 tccgccaacc tgctggccga ggccaagaag ctgaacgacg cccaggctcc caag 174 <210> 13 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD05 <400> 13 gtggacaaca agttcaacaa ggaggaatgc tctgccatgc aggagatttc tatgctgccc 60 aacctgaacc cgcatcagtt cgctgccttc atttggtccc tgatggacga cccttcccag 120 tccgccaacc tgctggccga ggccaagaag ctgaacgacg cccaggctcc caag 174 <210> 14 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD07 <400> 14 gtggacaaca agttcaacaa ggagcagtgc tgggccatcg ctgagattgc tggtctgccc 60 aacctgaacg ttcatcagct ggctgccttc atttggtccc tgtctgacga cccttcccag 120 tccgccaacc tgctggccga ggccaagaag ctgaacgacg cccaggctcc caag 174 <210> 15 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD09 <400> 15 gtggacaaca agttcaacaa ggagttctgc atggcctcta ctgagattgg tggtctgccc 60 aacctgaacg ttcatcagct ggctgccttc atttggtccc tgtctgacga cccttcccag 120 tccgccaacc tgctggccga ggccaagaag ctgaacgacg cccaggctcc caag 174 <210> 16 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAAD10 <400> 16 gtggacaaca agttcaacaa ggagttctgc ttcgccatcg gtgagattgc tactctgccc 60 aacctgaacg ctcaccagat cgctgccttc atttggtccc tggacgacga cccttcccag 120 tccgccaacc tgctggccga ggccaagaag ctgaacgacg cccaggctcc caag 174 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of 15E3 antibody <400> 17 Thr Arg Tyr Trp Leu His 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of 15E3 antibody <400> 18 Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of 15E3 antibody <400> 19 Trp Asp Tyr Asp Glu Gly Thr Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of 15E3 antibody <400> 20 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of 15E3 antibody <400> 21 Asn Ala Arg Thr Leu Val Glu 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of 15E3 antibody <400> 22 Gln His His Tyr Gly Pro Pro Tyr Thr 1 5 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable of 15E3 antibody <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Tyr Asp Glu Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable of 15E3 antibody <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Pro Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable of 15E3 antibody <400> 25 caggttcagc tcgtgcaatc aggcgctgag gttaaaaagc caggagccag tgtcaaagtg 60 tcttgtaagg cctccgggta taccttcaca aggtactggc tgcactgggt gagacaagca 120 cccggtcagg gccttgagtg gatcggggaa attaatccta gcagtggcag aaccaattat 180 aacgagaagt tcaagtctcg cgccactctg actgtagata aaagcatcag cacggcctac 240 atggagctgt ctagactgag atccgacgat accgctgtct actactgcgc gagatgggac 300 tatgacgaag gtacatggtt tgcatattgg ggccagggaa ccttggtgac agtgtcatcc 360 360 <210> 26 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable of 15E3 antibody <400> 26 gacatccaga tgacccagtc acctagcttc ctgtctgctt ctgtcgggga cagagtgact 60 atcacttgtc gcgcctccga gaacatatac tcctatctcg cttggtacca acagaagccc 120 gggaaggccc caaaacttct ggtatacaat gcccggaccc tggttgaggg cgtgccttca 180 aggttcagtg ggagcggctc cggaaccgaa ttcacgttga caattagtag cctgcaaccg 240 gaggattttg caacatacta ttgccagcac cattacggcc ccccatatac ctttggacag 300 ggtacaaagg tggaaattaa a 321 <210> 27 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln <210> 28 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of Trastuzumab <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 29 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of Trastuzumab <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of hz1E11.10 antibody <400> 30 Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of hz1E11.10 antibody <400> 31 Tyr Ile Ser Ala Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of hz1E11.10 antibody <400> 32 His Leu Gly Gly Thr Ala Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of hz1E11.10 antibody <400> 33 Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of hz1E11.10 antibody <400> 34 Ala Thr Ser Leu Ala Asp 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of hz1E11.10 antibody <400> 35 Gln Gln Asn Ala Tyr Ala Pro Trp Thr 1 5 <210> 36 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hz1E11.10 <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ala Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Leu Gly Gly Thr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 37 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of hz1E11.10 <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala Tyr Ala Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 38 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of FMC63 <400> 38 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 39 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of FMC63 <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디(affibody).
제1항에 있어서, 상기 CD137은 인간 또는 게잡이 원숭이(cynomolgus monkey) 유래의 CD137인 것인, 어피바디.
제1항에 있어서, 상기 어피바디의 CD137 세포외 도메인에 대한 결합 부위는 서열번호 27의 아미노산 서열의 64번째 내지 95번째 아미노산 잔기 사이에 위치하는 것인, 어피바디.
제1항의 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제4항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
제4항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
제6항의 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포.
제1항의 어피바디 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 암은 혈액암 또는 고형암인 것인, 약제학적 조성물
제9항에 있어서, 상기 고형암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강암, 부비동암, 비부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 직장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 혈액암은 급성골수성백혈병, 만성골수성백혈병, 골수이형성증후군, 골수증식성종양, 진성적혈구증가증, 본태성혈소판증가증, 골수섬유화증, 단핵구성백혈병, 적백혈병, 거대핵모구성백혈병, 호염기성벽혈병, 호산구성백혈병, 급성림프구성백혈병, 만성림프구성백혈병, 다발성골수종, 림프종, B세포림프종, 변연부비세포림프종, 호지킨림프종, 비호지킨림프종, 미만성큰B-세포림프종, 결절외변연부세포림프종, 결절외NK/T-세포림프종, 주변T-포림프종, 버킷림프종, 전구세포종양, 외투막세포림프종, 소포림프종, 면역결핍관련림프구증식성질환, 결절림프구우세호지킨병, 결절경화고전호지킨병, 림프구과다고전호지킨병, 혼합세포충실성고전호지킨병, 림프구고갈고전호지킨병 및 화학요법-저항성 모양세포백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약제학적 조성물.
다음을 포함하는 단백질 복합체(protein complex):
제1항에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
암세포 표면상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제12항에 있어서, 상기 암세포 표면상의 단백질은 EGFR(epidermal growth factor receptor), HER2(human epidermal growth factor receptor 2), 또는 CD19(cluster of differentiation 19)인 것인, 단백질 복합체.
제13항에 있어서, 상기 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 것인, 단백질 복합체:
(a) 세툭시맙(cetuximab); 또는
(b) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역.
제14항에 있어서, 상기 (b)는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인, 단백질 복합체.
제13항에 있어서, 상기 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 것인, 단백질 복합체:
(c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(d) 트라스투주맙(trastuzumab); 또는
(e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역.
제16항에 있어서, 상기 (e)는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인, 단백질 복합체.
제13항에 있어서, 상기 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 것인, 단백질 복합체:
(f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는
(g) FMC63.
제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제19항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
제20항의 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포.
제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 단백질 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제22항에 있어서, 상기 암은 혈액암 또는 고형암인 것인, 약제학적 조성물
제23항에 있어서, 상기 고형암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강암, 부비동암, 비부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 직장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약제학적 조성물.
제23항에 있어서, 상기 혈액암은 급성골수성백혈병, 만성골수성백혈병, 골수이형성증후군, 골수증식성종양, 진성적혈구증가증, 본태성혈소판증가증, 골수섬유화증, 단핵구성백혈병, 적백혈병, 거대핵모구성백혈병, 호염기성벽혈병, 호산구성백혈병, 급성림프구성백혈병, 만성림프구성백혈병, 다발성골수종, 림프종, B세포림프종, 변연부비세포림프종, 호지킨림프종, 비호지킨림프종, 미만성큰B-세포림프종, 결절외변연부세포림프종, 결절외NK/T-세포림프종, 주변T-포림프종, 버킷림프종, 전구세포종양, 외투막세포림프종, 소포림프종, 면역결핍관련림프구증식성질환, 결절림프구우세호지킨병, 결절경화고전호지킨병, 림프구과다고전호지킨병, 혼합세포충실성고전호지킨병, 림프구고갈고전호지킨병 및 화학요법-저항성 모양세포백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약제학적 조성물.