KR20220072468A - Tigit에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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박재은
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이현주
송영자
고윤정
이민주
박영우
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Abstract

본 발명은 TIGIT (T cell immunoreceptor with immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain)에 특이적으로 결합하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질 전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (Antibody drug conjugate, ADC) 또는 다중 특이적 항체, 이를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIGIT 뿐만 아니라 비-인간 TIGIT에도 친화력을 가지고 결합하며 완전 인간 항체 서열로 구성되어 있고 T 세포의 억제된 기능을 회복시킬 수 있으므로, 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도{Antibody specifically binding to TIGIT and uses thereof}
본 발명은 TIGIT (T cell immunoreceptor with immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain)에 특이적으로 결합하는 항-TIGIT 항체 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체(Antibody drug conjugate, ADC) 또는 다중 특이적 항체 및 이를 포함하는 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.
우리의 면역시스템은 암에 대항하여 몸을 보호한다. 그러나 악성 암세포들은 다양한 방식으로 면역감시를 회피한다.
최근 밝혀진 종양세포의 강력한 면역회피방법은 면역 관문분자(immune checkpoint)들을 활성화시키는 것이다. 면역관문조절 시스템은 수용체와 리간드의 결합을 통해 이루어진다. 암세포는 세포표면에 리간드 발현을 증가시켜서 T 세포나 자연살해(Natural killer, NK) 세포에 발현되어 있는 수용체에 결합한 후 항암면역기능을 떨어뜨린다.
넥틴(nectin)과 넥틴 유사(nectin-like; NECL) 단백질들에 대한 수용체들이 최근 종양면역치료 분야의 신규 타겟으로 주목받고 있는데, TIGIT [또는, WUCAM (Washington university cell adhesion molecule), Vstm3 (V-set and transmembrane domain-containing protein 3), VSIG9 (V-set and immunoglobulin domain-containing protein 9)], DNAM-1 (DNAX accessory molecule-1, CD226, PTA1), TLISA1 (T lineage-specific activation antigen 1) 및 CD96 [Tactile (T cell activation, increased late expression)] 등이 이 그룹에 속한다. TIGIT, CD96 그리고 DNAM-1은 T 세포와 NK 세포 표면에 발현되어 있고 리간드로 CD155 [polio virus receptors (PVR), NECL-5]를 공유한다. DNAM-1은 공동자극 수용체로서 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell; CTL)를 활성화시켜서 암에 대해 면역력을 높이는 반면, TIGIT은 CD96과 같이 면역억제 조절 수용체로서 CD155와 결합이 이루어지면 T 세포와 NK 세포의 기능을 억제시킨다.
TIGIT의 리간드는 CD155 외에 CD112 [PVR-related 2 (PVRL2), nectin-2]와 CD113 [poliovirus receptor-related 3 (PVRL3), nectin-3]이 알려져 있는데, 모두 넥틴 및 NECL 패밀리에 속해 있는 분자들로서 세포 부착(cell adhesion), 세포 분극화(cell polarization) 및/또는 조직 구성(tissue organization)에 관여한다. CD155는 주로 수지상 세포(dendritic cells; DCs), T 세포, B 세포 그리고 대식세포(macrophages)에 발현되어 있으나, 신장, 신경계, 또는 장과 같은 비-조혈 조직(non-haematopoietic tissues)에서도 발견된다. CD112는 폭넓게 발현되어 있는 반면 CD113은 태반, 고환, 신장, 간, 폐 등에 제한적으로 발현되어 있다. CD155와 CD112는 여러 악성 종양세포에서 높게 발현되어 있는데 IFN-γ(Interferon gamma)에 의해 발현이 유도될 수 있다.
TIGIT은 제1형 막단백질로서 1개의 면역글로불린 가변 도메인이 세포막 밖에 발현되어 있고 세포질 쪽에 면역저해 모티프인 ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)과 ITT (immunoglobulin tyrosine tail)-유사 모티프를 1개씩 가지고 있다. DNAM-1, CD96, CD155, CD111, CD112, CD113 그리고 PVRL4 등도 ITIM 모티프와 서열 유사성이 높은 면역글로불린 가변 도메인을 가지고 있다. 인간 TIGIT는 마우스 TIGIT와 약 58%의 서열 유사성을 가지고 있는데, ITIM 모티프의 서열은 동일하다.
TIGIT는 리간드 중 CD155에 대한 친화도가 가장 높다. CD155에 대한 TIGIT의 친화도는 DNAM-1보다 높기 때문에 우월한 리간드 결합력으로 DNAM-1을 방해하거나 세포질에 있는 ITIM/ITT 모티프의 작용을 통해 DNAM-1 활성을 막을 수 있다. TIGIT과 CD155는 각각 동종이량체(homodimer)로 존재하고 있는데 결합하면 이종사량체(heterotetramer)를 형성한다.
TIGIT는 다양한 저해기작을 가지고 있는데 CTL과 NK 세포의 활성은 억제하고 Treg 세포의 면역조절능력은 향상시켜 여러 면역세포들의 저해를 초래한다. 이로 인해 특히 T helper 1 (Th1)과 Th17 반응들이 감소한다. TIGIT이 수지상세포의 표면에 발현되어 있는 CD155에 결합하게 되면 면역억제 사이토카인 IL-10 (Interleukin 10)의 분비가 증가하고 전염증성 사이토카인 IL-12는 감소한다. CD155가 발현되어 있는 제1형 대식세포 표면에서 CD155/TIGIT 축(axis)이 형성되면 대식세포는 IL-10을 분비하는 제2형으로 분극화(polarization)된다.
TIGIT는 NK 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 Treg 세포 표면에 발현되어 있는데, 발현양이 Naive 세포에서는 미약하지만 기억 T 세포, 활성화 T 세포 그리고 활성화 NK 세포에서는 매우 높다. TIGIT의 발현은 종양-침윤성 림프구 (tumor-infiltrating lymphocytes; TILs)에서 증가되어 있다고 보고되어 있는데, CD8+ T 세포뿐만 아니라 Treg과 NK 세포에서도 현저히 높다. 전임상 결과나 암환자의 CD8+ T 세포에 발현되어 있는 TIGIT의 증가량은 종종 PD-1 (Programmed cell death protein 1), LAG-3 (lymphocyte activation gene 3) 및 TIM-3 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3)의 발현증가량과 연관되어 있는 반면, 감소된 DNAM-1과도 상관적이다. 위암 환자의 TIGIT 양성 CD8+ T 세포는 증식, 사이토카인 분비능, 이동(migration) 기능이 감소되어 있다. TIGIT 양성 말초혈액 CD8+ T 세포와 종양-상재(tumor-resident) NK 세포는 질환 중증도(disease severity)와 연관성이 높고, 침윤성 T reg 세포에서 TIGIT/DNAM-1의 높은 비율은 좋지 못한 임상 결과와 강력한 상관관계를 보인다. 다양한 악성종양, 예를 들어, 흑색종(melanoma), 유방암(breast cancer), 비소세포 폐암(non-small-cell lung carcinoma; NSCLC), 결장 선암(colon adenocarcinoma; COAD), 위암(gastric cancer), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukaemia; AML) 및 다발성 골수종(multiple myeloma; MM)등에서도 TIGIT의 발현은 높다고 보고되어 있다.
B16F10과 MC38 피하 종양 모델에서 TIGIT를 결핍시키면 암발생이 줄어들고 B16의 실험적 폐 전이(experimental lung metastasis)가 감소되었으며, 마우스 골수종 모델(Vk12598, 5TGM1) 등에서 항-TIGIT 봉쇄(blockade)는 종양 부담(tumor burden)을 감소시킬 수 있음이 확인되었다(J. Clin. Investig., 125:4053-62 (2015); Blood, 132:1689-94 (2018) 및 Nat. Immunol. 19:723-32 (2018)). 또한, MC38, CT-26 모델이나 GL261 교모세포종(glioblastoma)에서의 병용 (TIGIT/PD-1 또는 TIGIT/PD-L1 공동 봉쇄) 치료 결과는 단독 결과에 비해 우수한 항암 효능이 입증되었다(J. Immunol. (Balt), 200:3000-7 (2018); Oncoimmunology, 7:e1466769 (2018) 및 J. Immunother. Cancer, 7:160 (2019)).
TIGIT이 결핍된 마우스는 생명에 지장이 없고 irAE(immune related adverse events) 등이 거의 초래되지 않는다고 알려져 있다. 가장 보편적인 irAEs는 피부, 위장관, 폐, 혹은 간에서 발생되며 종종 생명을 위협하는데, 임상에서 이필리무맙(Ipilimumab, anti-CTLA-4)을 처치받은 환자들은 다양한 등급의 면역관련부작용이 나타나고, PD-1 봉쇄를 처방받은 환자들도 다소 완화된 부작용을 보였다. CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)나 PD-1이 결핍된 마우스에서는 매우 심각한 자가면역증상이 초래되고, 림프구증식 증후군이 나타난다. 그러나 TIGIT이 결핍된 마우스에서는 어떠한 자가면역적 사인이나 조혈모세포 분화 결손도 보고되지 않았다.
전임상 및 임상을 통해, TIGIT를 타겟하는 항체 형태의 저해제 10여개 이상에 대해 단독 혹은 병용요법으로 다양한 암종에 대한 유효성과 안전성이 테스트되고 있다. 그러나, 치료적으로 우수한 효과를 나타내는 항-TIGIT 항체가 여전히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 인간 TIGIT 뿐만 아니라 비인간(예컨대, Cynomolgus monkey, Mouse) TIGIT에도 친화력을 가지고 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체 서열로 구성된 항-TIGIT 항체를 개발하였고, 이 항체가 T 세포의 억제된 기능을 회복시키므로써, 암, 자가면역질환 또는 염증 질환의 치료제로 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기에 기술된 정보들은 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 및 이를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이를 이용한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진단용 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 중쇄 CDR(Complementarity Determining Region)1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4 또는 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 5 또는 23의 경쇄 CDR2 및 서열번호 6 또는 24의 경쇄 CDR3를 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 (i) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (ⅱ) 얻어진 세포 배양액으로부터 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC)를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 다중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체, 또는 상기 다중특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체, 또는 상기 다중특이적 항체를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진단용 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIGIT 뿐만 아니라 비-인간(예컨대, Cynomolgus monkey, Mouse) TIGIT에도 친화력을 가지고 결합하며, 완전 인간 항체 서열로 구성되어 있고, T 세포의 억제된 기능을 회복시킬 수 있으므로, 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 TIGIT 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 TIGIT 단백질들을 환원(reducing) 및 비환원(non-reducing) 조건에서 SDS-PAGE로 정제한 결과를 나타낸다.
도 3은 패닝 횟수에 따른 양성 폴리 scFv-파지 항체 풀(pool)의 TIGIT 항원에 대한 결합력 증가 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 TIGIT 항원에 대한 결합능이 강한 모노 파지를 선별하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 선별된 항-TIGIT 항체를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 항-TIGIT 항체의 in vitro 유효성을 평가한 결과로서, TIGIT/CD155 결합에 의해 저해되어 있던 T 세포 활성신호가 항-TIGIT 항체의 TIGIT에 대한 결합으로 인해 회복된 정도를 보여준다.
도 7a 내지 7c는 세포 표면 TIGIT에 대한 항-TIGIT 항체의 결합력을 FACS로 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 7a는 세포주 별 TIGIT 발현 정도를 측정한 결과이고, 도 7b는 TIGIT 발현이 없는 세포주에서 항-TIGIT 항체의 비특이 결합력을 측정한 결과이고, 도 7c는 TIGIT 발현이 높은 세포주에서 항-TIGIT 항체의 특이적 결합력을 측정한 결과이다.
도 8a 내지 8c는 항-TIGIT 항체의 이종 TIGIT 항원과의 결합력을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 8a는 세포주 별 TIGIT 발현 정도를 측정한 결과이고, 도 8b는 마우스 TIGIT이 발현된 세포주에서 항-TIGIT 항체의 특이적 결합력을 측정한 FACS 결과이고, 도 8c는 필리핀 원숭이(Cynomolgus monkey) TIGIT이 발현된 세포주에서 항-TIGIT 항체의 특이적 결합력을 측정한 FACS 결과이고, 도 8d는 마우스 TIGIT에 대한 항-TIGIT 항체의 교차 결합력을 측정한 ELISA 결과이다.
도 9는 항-TIGIT 항체가 TIGIT/CD155 결합체에 경쟁적으로 결합하는 것을 측정한 ELISA 결과이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원으로 작용하는 TIGIT 단백질은 면역 세포의 활성 억제와 밀접한 관련이 있으며, 면역 세포의 표면에 존재하는 막 단백질로서, 면역 세포의 보조 억제 수용체로서 작용한다. 상기 TIGIT은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 랫트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "TIGIT"는 세포에 의해 천연적으로 발현되는, TIGIT의 임의의 변이체, 이소형 및 종 상동체를 총칭하는 개념이다. 바람직하게는 인간의 TIGIT를 의미하지만, 이에 한정되지 않고, 다른 포유류 동물의 TIGIT를 포함하는 개념일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIGIT 단백질(NCBI accession No.: NM_173799.2)의 아미노산 서열 또는 그 일부, 예를 들어, 서열번호 30의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어, "항체(antibody)"는 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항-TIGIT 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 TIGIT에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐만 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등의 형태일 수 있다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로서 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 두 개의 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다.
이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머(dimer)와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있음), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중 어느 하나의 이소타입일 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 발명의 항체는 완전 인간 항체 서열로 이루어져 있다. 상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다. 필요에 따라, 본 발명의 항체는 당 분야에 알려진 방법에 따라 인간화 항체, 키메라 항체 등의 다양한 형태로 변형될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (Complementarity Determining Region; CDR), 및 골격 영역 (Framework Region; FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
본 발명은 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3, 서열번호 4 또는 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 5 또는 23의 경쇄 CDR2 및 서열번호 6 또는 24의 경쇄 CDR3를 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR들을 가진다.
본 발명의 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 중쇄 FR1, 서열번호 8의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 중쇄 FR2, 서열번호 9의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 중쇄 FR3, 서열번호 10의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 중쇄 FR4, 서열번호 11 또는 25의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 경쇄 FR1, 서열번호 12 또는 26의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 13 또는 27의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 경쇄 FR3, 및 서열번호 14의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 항-TIGIT 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR1, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR2, 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR3, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 FR4, 서열번호 11 또는 25의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR1, 서열번호 12 또는 26의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 13 또는 27의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR3 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함한다.
본 발명의 상기 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 서열번호 17 또는 28의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역과, 서열번호 17 또는 28의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
상기 항체의 결합 친화도(KD)는 1 x 10-8 M 내지 1 x 10-10 M, 또는 1 x 10-9 M 내지 1 x 10-10 M 범위 내에 있다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수도 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다.
본 발명의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편에는 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 보존적 치환을 통해 아미노산 서열의 일부가 치환된 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 포함된다.
본 명세서에서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 의미한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이다. 본 발명의 항체는 상기와 같은 보존적 아미노산 치환을 가지더라도 여전히 활성을 보유할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 핵산은 세포, 세포 용해물(lysate) 중에 존재하거나, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수도 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기 영동 및 해당 기술분야에 잘 알려진 기타의 것을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 기타 오염 물질, 예를 들어 다른 세포의 핵산 또는 단백질로부터 정제되어 나올 경우 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 된" 것이다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체를 코딩하는 핵산은 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드, 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 18, 19 및 29의 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변형들을 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬(alignment)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(예: NCBI Basic Local Alignment Search Tool; BLAST), 수동 정렬, 육안 검사 등을 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 위하여, 부분적이거나 전장인 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술(예를 들어, PCR 증폭 또는 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있으며, DNA가 전사 및 번역 제어 서열에 "작동되도록 연결"되어 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 벡터 성분에는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 하도록 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자가 벡터 내로 라이게이션된다는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현용 세포와 상용성이 있도록 선택된다. 항체의 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입되거나, 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 효소 부위의 라이게이션, 또는 제한 효소 부위가 전혀 존재하지 않을 경우 블런트(blunt) 말단 라이게이션)으로 발현 벡터 내로 삽입된다.
경우에 따라서, 상기 재조합 발현 벡터는 형질전환된 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 상기 항체 사슬 유전자 및 신호 펩티드-코딩 서열은 신호 펩티드가 항체 사슬의 아미노 말단에 결합되어 발현되도록 프레임에 맞게 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 면역글로불린 외 단백질 유래의 신호 펩티드)일 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터는 형질전환된 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절서열을 포함할 수 있다. "조절서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 형질전환시킬 세포의 선택, 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 조절 서열을 달리 선택하여, 발현 벡터의 디자인이 달라질 수 있음을 인식할 수 있다.
본 발명의 벡터는 또한 벡터로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 항체 유전자에 융합시킬 다른 서열을 포함할 수 있다. 이 서열은 예를 들어, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA), 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등의 유전자일 수 있다. 상기 벡터는 선택 표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 이러한 유전자로는 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또한 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 본 발명에 따른 세포는 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균 및 곤충세포 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로는 본 발명에 따른 세포는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등의 하등진핵 세포, 및 고등 진핵생물(예: 곤충)의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 세포는 식물이나 포유동물로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, COS-7(monkey kidney cells 7), BHK(baby hamster kidney), CHO(Chinese hamster ovary), CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS0, U20S, 또는 HT1080 등이 이용 가능하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 COS7 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, CHO 세포, W138, BHK 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포, 특히 바람직하게는 CHO 세포가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체를 발현시키기 위해 다양한 세포/벡터 조합이 이용될 수 있다. 구체적으로, 진핵 세포에 적합한 발현 벡터로는 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 벡터가 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 세균 세포에 사용할 수 있는 발현 벡터로는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같은 대장균(E. coli)-유래 세균성 플라스미드; RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드; λgt10, λgt11, 및 NM989와 같은 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체 등의 파지 DNA; 및 M13과 필라멘트성 단일가닥 DNA 파지와 같은 기타 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 YEp 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.
상기 벡터는 세포에 형질주입 또는 트랜스펙션(transfection)된다. "형질주입" 또는 "트랜스펙션"을 위해 원핵 또는 진핵 세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 (i) 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 (ⅱ) 얻어진 세포 배양액에서 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계;를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다. 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터가 포유류 세포 내로 도입될 경우, 세포에서 항체가 발현되게 하기에 충분한 기간 동안, 또는 더 바람직하게는 세포가 배양되는 배양 배지 내로 항체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 세포를 배양함으로써 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조할 수 있다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있으며, 배양 배지로는 시판용 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 선별된 숙주세포에서 단백질 발현을 위해 적합한 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
경우에 따라서, 발현된 항체를 세포 배양액으로부터 분리하여 균일하게 정제할 수 있다. 상기 항체의 분리 또는 정제는 통상의 단백질 분리 및 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 프로틴 A 컬럼 또는 프로틴 G 컬럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 또는 히드록실아파타이트 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다.
항체-약물 접합체는 타겟 암세포로 항암 약물을 전달하기 전까지 항암 약물이 항체에 안정적으로 결합되어 있어야 한다. 타겟으로 전달된 약물은 항체로부터 유리되어 타겟 세포의 사멸을 유도해야 한다. 이를 위해서는 약물이 항체에 안정적으로 결합함과 동시에 타겟 세포에서 유리될 때는 타겟 세포의 사멸을 유도할 충분한 세포독성을 가져야 한다.
상기 약물은 약리학적 효과를 나타내는 제제로 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합될 수 있고, 산성조건에 의하여 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 분리될 수 있으며, 표적 세포에 대한 치료 효과를 나타내는 화합물을 의미한다. 상기 약물은 세포독소(cytotoxin), 방사성 동위원소, 항증식제, 아폽토시스 촉진제(pro-apoptotic agent), 화학요법제 및 치료용 핵산이 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항체-약물 접합체는 세포로 내재화될 수 있으며, 항체 의존성 세포독성을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "세포독성 활성"은 항체-약물 접합체 또는 항체-약물 접합체의 세포 내 대사물질의 세포-사멸, 세포증식 억제 또는 성장 억제 효과를 의미한다. 세포독성 활성은 1/2의 세포가 생존하는 단위 부피당 농도(몰 또는 질량)인 IC5O 값으로서 표현될 수 있다.
용어 "세포독소"란 일반적으로 세포의 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포를 파괴하는 제제를 말한다. 대표적인 세포독소에는 항생제, 튜불린 중합 억제제, DNA에 결합하여 이를 파괴하는 알킬화제, 및 단백질 키나제, 포스파타제, 토포아이소머라제, 효소 및 사이클린과 같은 필수적인 세포 단백질의 기능 또는 단백질 합성을 파괴하는 제제가 포함된다. 세포독소의 예는 택솔, 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시안트라신디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신 D(actinomycin D), 1-디하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라노롤(propranolol) 및 퓨로마이신(puromycin) 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
방사선요법 적용을 위해, 본 발명의 항체는 고 에너지 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 당해 동위원소는 예를 들면, 항체 내에 존재하는 시스테인 잔기에서 항체에 직접적으로 결합될 수 있거나, 또는 킬레이트를 사용하여 항체와 방사성 동위원소의 결합을 매개할 수 있다. 방사선요법에 적합한 방사성 동위원소에는, α-방출기, β-방출기 및 오제 전자(auger electron)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 진단상 적용에 유용한 방사성 동위원소에는 양전자방출기 및 γ-방출기가 포함된다.
항증식제 및 아폽토시스 촉진제에는 PPAR-감마(예를 들면, 사이클로펜테논 프로스타글란딘(cyPGs)), 레티노이드, 트리테르피노이드(예를 들면, 사이클로아르탄, 루판, 우르산, 올레아난, 프리에델란, 담마란, 쿠쿠르비타신 및 리모노이드 트리테르페노이드), EGF 수용체의 억제제(예를 들면, HER4), 라파마이신, 칼시트리올(1,25-디하이드록시콜레칼시페롤(비타민 D)), 아로마타제 억제제(FEMARA　(레트로존)), 텔로머라제 억제제, 철킬레이트제(예를 들면, 3-아미노피리딘-2-카복스알데하이드 티오세미카르바존(트리아핀)), 아폽틴(바이러스 단백질 3-닭 빈혈 바이러스로부터의 VP3), Bcl-2 및 Bcl-X(L)의 억제제, TNF-알파, FAS 리간드, TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL/Apo2L), TNF-알파/FAS 리간드/TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL/Apo2L) 신호전달의 활성화제, 및 PI3K-Akt 생존 경로 신호전달의 억제제(예를 들면, UCN-01 및 겔다나마이신)가 포함된다.
"화학요법제"는 작용의 메커니즘과는 관계없이, 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 부류는 알킬화제, 대사길항물질, 방추체 독성 식물 알칼로이드, 세포독성/항종양 항생제, 국소이성화효소 억제물질, 항체, 감광제, 그리고 키나아제 억제물질을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 화학요법제는 "표적화된 요법" 및 전통적인 화학요법에 이용되는 화합물을 포함한다.
상기 접합체는 약물을 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합시켜 공지된 방법으로 제작할 수 있다. 항체와 약물은 그들 자신이 가진 연결기 등을 통해 직접 결합할 수도 있고, 링커나 다른 물질을 통해 간접적으로 결합할 수도 있다. 약물이 항체로부터 절단되도록 하는 주요 기전에는 리소좀(히드라존, 아세탈 및 시스-아코니테이트-유사 아미드)의 산성 pH에서의 가수분해, 리소좀 효소(카텝신 및 기타 리소좀 효소)에 의한 펩타이드 절단 및 디설파이드의 환원이 포함된다. 이러한 다양한 절단 기전의 결과로서, 약물을 항체에 연결시키는 기전은 매우 다양하며 어떠한 적합한 링커라도 사용될 수 있다.
항체와 약물이 결합하기 위한 적절한 연결기는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 이황화 기, 티오에테르 기, 산분해성 기, 광분해성 기, 펩티다제 분해성 기 및 에스테라아제 분해성 기를 포함한다.
약물이 직접 결합될 경우 연결기(linking group)는 예로서는, SH기를 이용한 이황화결합이나 말레이미드를 매개로 하는 결합을 들 수 있다. 예를 들면, 항체 Fc영역의 분자 내 이황화결합과 약물의 이황화결합을 환원하여, 양자를 이황화결합으로 연결한다. 또한, 말레이미드를 통하는 방법 및 항체 내에 시스테인을 유전공학적으로 도입하는 방법도 있다.
항체와 약물을 다른 물질(링커)을 통해 간접적으로 결합시킬 수도 있다. 링커로는 항체, 약물 또는 모두와 반응하는 작용기를 1 또는 2종류 이상 가지는 것이 바람직하다. 작용기의 예로는 아미노기, 카르복실기, 머캡토기, 말레이미드기, 피리디닐기 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체를 제공한다. 다중특이적 항체는 서로 다른 두 종류 이상의 항원(표적 단백질)에 결합할 수 있는 항체를 의미하고, 유전공학 또는 임의의 방법에 의해 제조된 형태이다. 다중특이적(Multi-specific) 항체는 이중특이적(Bi-specific) 항체, 삼중특이적(Tri-specific) 항체 또는 사중특이적(Tetra-specific) 항체를 포함한다.
다중특이적 항체는 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체가 면역효능세포-특이적 표적분자에 대한 결합능을 가지는 항체 또는 그 단편과 결합된 형태인 것이 바람직하다. 면역효능세포-특이적 표적 분자는 TCR/CD3, CD16(FcγRⅢa) CD44, CD56, CD69, CD64(FcγRI), CD89 및 CD11b/CD18(CR3)에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중특이적 항체는 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체가 면역을 자극하거나 저해시키는 사이토킨에 대한 결합능을 가지는 항체 또는 그 단편과 결합된 형태인 것이 바람직하다. 면역을 자극하거나 저해시키는 사이토킨은 예를 들면, IL-2, IL-6, IL-7, IFNα, GM-CSF, IL-10, 및 TGF-β에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중특이적 항체는 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체가 암 치료에 사용되고 있는 타겟, 예를 들면, PD-1, PD-L1, VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 기타 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CTLA-4, B7-H3, TIM-3, LAG-3, OX-40, 4-IBB 및 ICOS에 대한 결합능을 가지는 항체 또는 그 단편과 결합된 형태인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중특이적 항체에 속하는 항체들은 scFv 기반 항체, Fab 기반 항체 및 IgG 기반 항체 등으로 구분할 수 있다. 이중특이적 항체의 경우 두 개의 신호를 동시에 억제 또는 증폭시킬 수 있기 때문에 하나의 신호를 억제/증폭하는 경우보다 더욱 효과적일 수 있으며, 각각의 신호를 각각의 신호억제제로 처리했을 경우와 비교하면, 저용량 투약이 가능하며, 동일한 시간 및 공간에서의 두 개의 신호를 억제/증폭시킬 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개의 중쇄가 상이한 특이성을 가지는 조건에서 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 근간으로 한다.
scFv를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 상이한 scFv들의 VL과 VH를 각기 서로 조합하여 혼성 scFv를 이종이량체(heterodimer) 형태로 제조하여 디아바디(diabody)를 만들 수 있고, 상이한 scFv를 서로 연결해서 탠덤(tendem) ScFv를 제조할 수 있으며, Fab의 CH1과 CL을 각각의 scFv의 말단에 발현시켜 이종이량체성 미니항체(miniantibody)를 제조할 수 있고, Fc의 동종이량체성 도메인인 CH3 도메인의 일부 아미노산을 치환하여 'knob into hole' 형태의 이종이량체 구조로 변경시켜, 이들 변경된 CH3 도메인을 상이한 각각의 scFv 말단에 발현시킴으로써 이종이량체성 scFv 형태의 미니바디(minibody)를 제조할 수 있다.
Fab를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 특정 항원에 대한 개별 Fab'를 이황화결합 또는 매개체를 이용해서 서로 조합하여 이종이량체성 Fab 형태로 제조할 수 있고, 특정 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 발현시킴으로써 항원 결합가(valency)를 2개로 하거나, Fab과 scFv 사이에 경첩부위(hinge region)를 둠으로써 동종이량체 형태로 4개의 항원결합가를 가지도록 제조할 수 있다. 또한, Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 만든 이중표적 바이바디(bibody) 및 Fab의 경쇄말단과 중쇄말단에 상이한 scFv를 각각 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 가지도록 한 삼중표적 바이바디 형채로 제조할 수 있고, 상이한 Fab 3개를 화학적으로 접합시켜도 수득할 수 있다.
IgG를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 마우스와 렛트 하이브리도마를 다시 교잡함으로써 하이브리드 하이브리도마, 일명 쿼드로마(quadromas)를 제조하여 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 알려져 있다. 또한, 경쇄 부분은 공유하면서, 상이한 중쇄에 대해서 Fc의 CH3 동종이량체성 도메인의 일부 아미노산을 변형시켜 이종이량체 형태로 제작한 이른 바 'Holes and Knob' 형태로 이중특이적 항체를 제조할 수도 있다. 상이한 2종의 scFv를 IgG의 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 대신 불변(constant) 도메인에 각각 융합 발현시켜 동종이량체 형태의 (scFv)4-IgG를 제조할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 상기 다중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 TIGIT의 발현 또는 과발현과 관련된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, "암"과 "종양"은 동일한 의미로 사용되며, 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장 및 증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 의미한다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암 또는 종양의 발전 억제, 암 또는 종양의 경감 또는 제거, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 억제, 경감 또는 제거를 의미한다.
본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 이러한 암의 예는 흑색종 등의 피부암, 간암, 간세포암(hepatocellular carcinoma), 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 이자암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 비소세포폐암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종(astrocytoma), 아교모세포종(glioblastoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 신경교종(glioma) 및 기타 종양(예컨대, small round blue cell tumors of childhood)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 바람직하게, 상기 암 또는 종양은 TIGIT 단백질이 발현된 것을 특징으로 하며, 전립선암, 난소암, 유방암, 결장암, 신장암, 비소세포폐암, 췌장암, 두경부암, 흑색종, 아교모세포종, 신경모세포종 및 기타 종양(예컨대, small round blue cell tumors of childhood)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자가면역 질환(autoimmune disease) 또는 염증성 질환(inflammatory disease)은 천식(asthma), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis) 또는 다발성 경화증(multiple sclerosis) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 치료적 유효량의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. "약학적으로 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 독성 효과를 야기하지 않는다.
상기 첨가제는 환자를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제 등을 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 제형으로 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 각 제제는 약제학 분야에 잘 알려진 방법들을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 하루에 1회 또는 다회 용량으로 인간, 쥐(rat), 마우스(mouse), 가축 등을 포함하는 포유동물 내로 전형적으로 허용된 경구 또는 비경구 경로의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 구강, 직장내, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비내, 흡입, 안구내, 폐내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, Fab 단편으로 대표되는 본 발명의 항-TIGIT 항체의 항원 결합 단편의 볼루스(bolus) 투여는 0.0025 내지 100 mg/kg 체중, 0.025 내지 0.25 mg/kg, 0.010 내지 0.10 mg/kg 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg의 양일 수 있다. 연속 주입의 경우, Fab 단편으로 대표되는 본 발명의 항-TIGIT 항체의 항원 결합 단편은 0.001 내지 100 mg/kg 체중/분, 0.0125 내지 1.25 mg/kg/분, 0.010 내지 0.75 mg/kg/분, 0.010 내지 1.0 mg/kg/분 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg/분으로 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 12시간, 2시간 내지 12시간, 6시간 내지 12시간, 2시간 내지 8시간, 또는 1시간 내지 2시간의 기간 동안 투여될 수 있다. 본 발명의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 경우, 투여량은 약 1 내지 10 mg/kg 체중, 2 내지 8 mg/kg, 또는 5 내지 6 mg/kg일 수 있다. 전장 항-TIGIT 항체는 전형적으로 30분 내지 35분의 기간 동안 지속되는 주입을 통해 투여한다. 투여 빈도는 상태의 중증도에 따라 달라진다. 빈도는 1주당 3회 내지 매 1주 또는 2주 마다 1회의 범위일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 다중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체의 치료적 유효량을 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 상기 예방 또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 상기 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 종래의 다른 항암 치료제와 병용함으로써 TIGIT을 발현하는 종양 세포를 효과적으로 표적화하고, 항-종양 T 세포 활성을 증가시켜 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 기타 항-신생물제 또는 면역원성 제제, 예를 들면, 약화된 암 세포, 종양 항원(재조합 단백질, 펩타이드 및 탄수화물 분자를 포함함), 항원 전달 세포(예를 들면, 종양 기원된 항원 또는 핵산으로 펄스된 가지세포), 면역 자극 사이토킨(예를 들면, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 면역 자극 사이토킨을 암호화하는 유전자로 형질감염된 세포; 표준 암 치료요법, 예를 들면, 화학 치료요법, 방사선치료요법 또는 수술; 또는 기타 항체, 예를 들면, PD-1, PD-L1, VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 기타 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CTLA-4, OX-40, 4-IBB, 및 ICOS에 대한 항체와 함께 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 약학 조성물은 기존의 항암 치료제와 동시에 투여되거나, 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체, 또는 상기 다중특이적 항체를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진단용 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체, 또는 상기 다중특이적 항체를 통해 시료에서의 TIGIT 발현 수준을 측정함으로써 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 진단할 수 있다. 발현 수준은 통상적인 면역분석 방법에 따라 측정할 수 있으며, 상기 TIGIT에 대한 항체를 이용한 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 통해 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 결과, 생물학적 시료에서의 TIGIT 단백질 발현이 정상 생물학적 시료(예컨대, 정상 위조직, 혈액, 혈장 또는 혈청)보다 높게 나오는 경우에는 상기 질환들로 진단될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 진단용 조성물을 포함하는 진단용 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체 및 검출가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 포함할 수 있다. 상기 레이블은 항체에 결합된 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 호스 래디쉬 퍼옥시다제, 루시퍼라제 또는 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 때 효소에 대한 기질은 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
시료와 항체가 반응함으로써 나타내는 시그널의 세기를 분석하여 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 진단할 수 있다. 진단을 위해 사용되는 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이를 통해 TIGIT 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: TIGIT 항원 발현 및 정제
실시예 1-1: TIGIT 단백질 발현 벡터 제작
TIGIT의 세포 외 도메인(extracellular domain)만을 클로닝하기 위해, Jurkat 세포 cDNA 라이브러리(Stratagene, 미국) 및 5'과 3'에 제한효소 SfiⅠ 사이트가 포함된 TIGIT에 대한 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물과 N293F 벡터를 이용하여 TIGIT의 세포 외 도메인의 카복시-말단에 6x His, 인간 Fc, 또는 마우스 Fc가 융합된 단백질을 각각 발현하는 발현벡터들을 제작하였다(도 1).
TIGIT 클로닝용 프라이머
명칭 5'→3' 서열 서열번호
TIGIT-F acaggcacaatagaaacaacg 20
TIGIT-R tggaatctggaacctggcaccg 21
실시예 1-2: TIGIT 항원의 발현 및 정제
형질감염(transfection)은 최적화된 조건에서 PEI(polyethylenimine, 23966, Polysciences)를 이용하여 수행하였다. 인간 HEK293F 세포를 ㎖당 5x105 세포만큼 배지(#Freestyle 293 AGT type; AG100009P1, Thermo.)에 접종하고 1x106 세포/㎖이 될 때까지 배양하였다. 실시예 1-1에서 얻은 각 발현벡터와 PEI를 섞어 폴리플렉스(polyplex)를 형성하게 한 후, 상기 세포에 첨가하여 형질전환시킨 다음 소이톤(Soytone; #212488, DIFCO) 5 g/L를 첨가한 후 6일을 더 배양하였다. 발현된 TIGIT-Fc 항원들을 protein A agarose 및 Superdex 200(1.5 cm*100 cm) 젤 여과 크로마토그래피를 순차적으로 이용하여 정제하였다. 각 항원 생산 배양액을 8,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 세포 잔해를 제거하고, 0.22 μm 공극 크기의 보틀 탑 필터를 이용하여 여과하였다. 정제를 수행하기 위해, 빈 칼럼에 3 ml의 Ni-NTA 레진(#30230, QIAGEN)을 넣은 후 20 ㎖의 결합 버퍼(10 mM imidazole)로 레진을 패킹하였다. 패킹된 레진에 여과된 배양액을 분당 0.2 ㎖의 속도로 레진에 결합되도록 중력 유속(gravity-flow)으로 흘려주었다. 100 ㎖의 세척 버퍼(20 mM Imidazole)로 세척을 수행한 후 용출 버퍼(250 mM imidazole)로 용출하였다. 용출 버퍼로 얻은 용출액을 투석(dialysis)을 통하여 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 버퍼 교환하였다(1 L, 3회). 단백질의 농도는 나노-드롭(Nano-drop)으로 측정하였다. SDS-PAGE (도 2)와 크기 배제 크로마토그래피(#TSK-GEL G-3000 SWXL Size-exclusion chromatography (SEC), Tosoh)를 이용하여 각 단백질을 정제하고 순도를 확인하였으며, 순도는 모두 95% 이상이었다.
실시예 2: TIGIT 인간 항체의 선별
실시예 2-1: 항원 준비
실시예 1에서 제조한 각 TIGIT 항원 50 ㎍을 면역흡착튜브(Immunosorb tube)에 코팅한 후 블로킹 (blocking)을 수행하였다.
실시예 2-2: 인간항체 라이브러리 파지 준비
2.7x1010의 다양성을 가진 인간 scFv 라이브러리 파지((주)와이바이오로직스)를 대장균에 감염시킨 후, 얻어진 대장균을 30℃에서 16시간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 상층액을 PEG(polyethylene glycol)로 농축한 다음, 이를 PBS(phosphate buffered saline) 완충용액에 녹여 인간 항체 라이브러리 파지를 준비하였다.
실시예 2-3: 바이오패닝
실시예 2-1에서 준비된 면역흡착튜브에 실시예 2-2에서 얻은 라이브러리 파지를 넣고 실온에서 2시간 반응시킨 다음, 1x PBST와 1x PBS로 세척 후, 100 mM TAE와 Tris-HCl(pH 7.5) 용액을 차례로 처리하여 항원에 특이적으로 결합한 scFv-파지들만을 용출시켰다. 용출된 파지를 다시 대장균에 감염시켜 증폭시키는 패닝과정을 통해 양성 파지의 풀(pool)을 얻고, 첫 번째 라운드의 패닝에서 증폭된 파지를 가지고 PBST(PBS + tween-20) 세척 단계에서 횟수만 늘리고, 나머지는 동일한 방법으로 2라운드와 3라운드 패닝을 수행하였다. 그 결과, 표 2와 같이 3라운드 패닝에서 항원에 결합한 파지 수가 다소 증가였음을 확인하였다.
패닝에 따른 항체의 역가 비교
패닝 횟수 파지의 유입 수 파지의 결합 수
1회 2.0 x 1013 3.6 x 107
2회 1.2 x 1013 7.0 x 107
3회 2.0 x 1013 2.0 x 109
실시예 2-4: 폴리 파지 ELISA
각 라운드의 패닝을 통해 얻어진 양성 폴리(poly) scFv-파지 항체 풀의 항원 특이성을 알아보기 위해 폴리 파지 ELISA를 수행하였다. 항원인 TIGIT-6x His와 TIGIT-hFc로 각각 코팅한 면역-플레이트(immuno-plate)와 비특이적 결합(nonspecific binding)의 지표로 사용된 ITGA6-Fc 단백질로 코팅된 면역-플레이트를 이용하여 각 라운드에서 얻어진 파지 풀로 동시에 ELISA를 수행하였다. ELISA의 음성 대조군(negative control)으로 항체가 디스플레이되지 않은 M13 파지인 #38을 같이 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 패닝 횟수가 증가할수록 TIGIT 항원에 대한 양성 폴리 scFv-파지 항체 풀의 결합능이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 2-5: 양성 파지 선별
폴리 파지 ELISA에서 결합능이 큰 것으로 확인된 3라운드 패닝의 양성 파지 풀로부터 수천여 개의 모노 클론들을 선별하였고, 이들을 96-딥웰 플레이트(96-deep well plate)에서 헬퍼 파지를 감염하여 배양한 다음, 상층액에 존재하는 모노 scFv-파지를 TIGIT 항원이 코팅된 면역-플레이트에 옮겨 ELISA를 수행하였다. 이 때, TIGIT-6x His 또는 TIGIT-hFc에 대한 모노 파지 ELISA와 비특이적 항원 대조군인 IGA6-Fc 단백질에 대한 ELISA도 동시에 수행하여, 얻어진 양성 파지 클론이 TIGIT에 특이적인지를 확인하였다.
그 결과, 도 4에서와 같이, 모노 scFv-파지 클론들은 TIGIT 항원에만 결합능이 강함을 확인하였으며, 수십 종의 예비 항체 클론이 선별되었다. 한편, 특성분석으로 선별된 클론들의 친화도 증가 패닝을 시도하여 우수한 항체 클론들을 추가로 확보하였다.
실시예 2-6: 양성 파지 항체의 염기서열 분석
선별된 2종의 단일 클론들에 대해 DNA 정제 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 파지미드(phagemid) DNA를 분리하여 DNA 염기서열을 분석하였다. 중쇄와 경쇄의 CDR (Complementarity-determining regions), FR (Framework) 및 가변영역의 아미노산 서열과 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 아래 표 3 내지 6에 기재하였다.
중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열
항체 CDR 서열 서열번호
SA2209 CDRH1 GVSIRQGHW 1
CDRH2 IYQTGRT 2
CDRH3 TTGSGWYPIDY 3
CDRL1 SLRGFY 4
CDRL2 GVK 5
CDRL3 NSRDSNGAMM 6
SA2699 CDRH1 GVSIRQGHW 1
CDRH2 IYQTGRT 2
CDRH3 TTGSGWYPIDY 3
CDRL1 SLRGFY 4
CDRL2 GVK 5
CDRL3 NSRDSNGAMM 6
SA2734 CDRH1 GVSIRQGHW 1
CDRH2 IYQTGRT 2
CDRH3 TTGSGWYPIDY 3
CDRL1 SLRSFY 22
CDRL2 GKD 23
CDRL3 SSRDRSANVV 24
중쇄 FR 및 경쇄 FR의 아미노산 서열
항체 FR 서열 서열번호
SA2209 FRH1 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVS 7
FRH2 WSWVRQPPGKGLEWIGE 8
FRH3 NYNPSLKSRVTISVGKSRNHISLKLSSVTAADTAVYYC 9
FRH4 WGQGTLVTVSS 10
FRL1 SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGD 11
FRL2 ASWYQQKPGQAPLLVLY 12
FRL3 DRPSGIPDRFSGSRSGTTASL X ITGAQAEDEADYYC (X=T) 13
FRL4 FGGGTKLTVL 14
SA2699 FRH1 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVS 7
FRH2 WSWVRQPPGKGLEWIGE 8
FRH3 NYNPSLKSRVTISVGKSRNHISLKLSSVTAADTAVYYC 9
FRH4 WGQGTLVTVSS 10
FRL1 SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGD 11
FRL2 ASWYQQKPGQAPLLVLY 12
FRL3 DRPSGIPDRFSGSRSGTTASL X ITGAQAEDEADYYC (X=I) 13
FRL4 FGGGTKLTVL 14
SA2734 FRH1 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVS 7
FRH2 WSWVRQPPGKGLEWIGE 8
FRH3 NYNPSLKSRVTISVGKSRNHISLKLSSVTAADTAVYYC 9
FRH4 WGQGTLVTVSS 10
FRL1 SYELTQDPAVSVASGQTVRITCQGD 25
FRL2 ASWYQQKPGQAPILLTY 26
FRL3 TRPSDIPDRFSASSSGDTSSLTITGAQAEDEADYYC 27
FRL4 FGGGTKLTVL 14
중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열
항체 가변영역 아미노산 서열 서열번호
SA2209 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSIRQGHWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYQTGRTNYNPSLKSRVTISVGKSRNHISLKLSSVTAADTAVYYCTTGSGWYPIDYWGQGTLVTVSS 15
경쇄 SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRGFYASWYQQKPGQAPLLVLYGVKDRPSGIPDRFSGSRSGTTASL T ITGAQAEDEADYYCNSRDSNGAMMFGGGTKLTVL (X=T) 17
SA2699 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSIRQGHWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYQTGRTNYNPSLKSRVTISVGKSRNHISLKLSSVTAADTAVYYCTTGSGWYPIDYWGQGTLVTVSS 15
경쇄 SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRGFYASWYQQKPGQAPLLVLYGVKDRPSGIPDRFSGSRSGTTASL I ITGAQAEDEADYYCNSRDSNGAMMFGGGTKLTVL (X=I) 17
SA2734 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSIRQGHWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYQTGRTNYNPSLKSRVTISVGKSRNHISLKLSSVTAADTAVYYCTTGSGWYPIDYWGQGTLVTVSS 15
경쇄 SYELTQDPAVSVASGQTVRITCQGDSLRSFYASWYQQKPGQAPILLTYGKDTRPSDIPDRFSASSSGDTSSLTITGAQAEDEADYYCSSRDRSANVVFGGGTKLTVL 28
중쇄 및 경쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열
항체 가변영역 뉴클레오타이드 서열 서열번호
SA2209 중쇄 CAGGTGCAGCTACAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTCTGGTGTCTCCATCCGGCAGGGTCACTGGTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGGAAATCTATCAGACGGGGAGGACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGCGTCACCATATCAGTAGGCAAGTCCAGGAACCATATCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTACCACAGGCAGTGGCTGGTACCCAATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 16
경쇄 TCCTATGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGTCTCAGAGGCTTTTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTTTACTTGTCCTCTATGGTGTAAAAGACCGACCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGGTCAGGAACCACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAATTCTCGAGACAGCAATGGTGCCATGATGTTTGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 18
SA2699 중쇄 CAGGTGCAGCTACAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTCTGGTGTCTCCATCCGGCAGGGTCACTGGTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGGAAATCTATCAGACGGGGAGGACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGCGTCACCATATCAGTAGGCAAGTCCAGGAACCATATCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTACCACAGGCAGTGGCTGGTACCCAATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 16
경쇄 TCCTATGAGCTGACACAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGTCTCAGAGGCTTTTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTTTACTTGTCCTCTATGGTGTAAAAGACCGACCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGGTCAGGAACCACTGCTTCCTTGATCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAATTCTCGAGACAGCAATGGTGCCATGATGTTTGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 19
SA2734 중쇄 CAGGTGCAGCTACAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTCTGGTGTCTCCATCCGGCAGGGTCACTGGTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGGAAATCTATCAGACGGGGAGGACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGCGTCACCATATCAGTAGGCAAGTCCAGGAACCATATCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTACCACAGGCAGTGGCTGGTACCCAATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 16
경쇄 TCCTATGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTCGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAGGGAGACAGCCTCAGAAGCTTTTATGCAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGGCCCCTATACTTCTCACCTATGGAAAAGACACGCGGCCCTCAGACATCCCAGACCGATTCTCTGCCTCCAGTTCAGGAGACACATCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAGCTCCCGGGACAGAAGTGCTAATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 29
실시예 3: 항-TIGIT 인간 항체의 생산
실시예 3-1: scFv 형태를 IgG 형태로 전환 (conversion)
실시예 2에서 선별된 단일클론 파지 항체를 scFv 형태에서 IgG 형태로 전환하기 위해, 중쇄 가변 영역의 염기서열을 제한효소 SfiI/NheI 사이트를 이용하여 pNATVH(Y-Biologics)에 클로닝하여 N293F HC 벡터를 제조하였고, 경쇄 가변 영역의 염기서열을 제한 효소 SfiI/BglⅡ 사이트를 이용하여 pNATVL(Y-Biologics)에 클로닝하여 N293F LC 벡터를 제조하였다.
실시예 3-2: 인간 항체 생산 및 정제
N293F HC와 N293F LC 벡터를 HEK293F 세포에 동시 형질감염(co-transfection)시키고, 배양 7일차에 배양액을 수거하여 원심분리 및 0.22 ㎛ Top-필터 여과를 통해 세포와 부유물질을 제거한 후, 상층액을 모아 단백질 A 비드 (protein A bead)로 정제하였다. 항-TIGIT 항체의 순도는 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다(도 5).
(1) 단백질 A 크로마토그래피
배양액을 8,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 세포 잔해를 제거하고 0.22 μm 공극 크기의 보틀 탑 필터(bottle top filter: Steritop-GP Filter Unit. #SCGPS01RE, Millipore)를 이용하여 여과하였다. 한편, 빈 칼럼(#BR731-1550, Bio-rad)에 4 ㎖의 단백질 A 세파로스 레진 슬러리(KANEKA KanCapA™, Cat. No. KKC20170403_01)를 넣은 후 100 ㎖의 DPBS(#LB001-02)로 레진을 패킹 및 세척하였다. 패킹된 레진에 여과된 배지를 로딩하고 1분당 1 ㎖의 속도로 흘려 주었다(#EP-1 Econo pump, Bio-Rad). 150 ㎖의 DPBS로 세척한 후, 10 ㎖의 0.1 M 글라이신(glycine)-HCl (pH 3.3)로 용출하였다. 용출액에 1 M Tris-HCl (pH 9.0)을 10% 첨가하여 pH를 중화시키고, Amicon Ultra-10(#UFC901096, Millipore)를 이용하여 DPBS로 버퍼를 바꾸어 주었다. 이 과정을 약 3회 실시한 후 1 ㎖ 정도로 농축되었을 때 멈추고, Nano-drop으로 농도를 측정하였다.
(2) SDS-PAGE
정제가 끝난 단백질의 순도를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. 정제 단백질 샘플 3 ㎍을 환원 샘플 버퍼 및 비환원 샘플 버퍼 5 ㎕와 각각 혼합하여 100℃에서 3분 동안 보일링(boiling)하였다. 러닝 탱크(Running tank, #165-8027, Bio-Rad)에 12% 겔을 장착하고 1x 러닝 버퍼를 겔 안쪽에 가득 채우고, 바깥쪽은 1/3 가량 채워 준비된 샘플을 피펫을 이용하여 버블이 들어가지 않게 웰에 로딩하였다. AccuBand Prestained Protein Marker 4 ㎕를 맨 왼쪽 웰에 로딩하였다. 겔 챔버의 윗 덮개를 장착하고 전원을 연결시켜 200V, 1시간 조건으로 러닝하였다. 한 시간 후에 탱크에서 겔을 분리하여 염색 버퍼에 잠길 정도로 해서 1시간 교반기 위에서 염색하였다. 이 후, 염색액을 버리고, 탈색액으로 1시간 정도 교반하면서 탈색하고, 한 번 더 탈색액을 갈아서 다시 탈색을 시켰다. 탈색이 끝난 겔을 증류수로 세척한 후 이미지 장비를 이용하여 이미지를 저장하였다.
(3) Western Blotting
(2)에서와 같이 SDS-PAGE를 1시간 동안 러닝시킨 후, 탱크에서 겔을 분리하여 NC 막을 겔 밑에 두고 카세트를 고정시켜 트랜스퍼 탱크(#165-8027, Bio-Rad)에 넣고, 그 안에 트랜스퍼 버퍼를 채운 다음 110V로 2시간 가량 러닝하였다. 트랜스퍼가 다되었다고 예상되면 트랜스퍼를 중지하고 NC 막을 꺼내어 블로킹 용액(1% Skim milk/PBS)으로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 그런 다음, 2차 항체인 항hFc-HRP(#31413, Thermo)와 항His-HRP(#A7058, Sigma)를 블로킹용액에 1:4,000이 되도록 희석한 후 NC 막에 넣어주고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1x PBST로 10 ㎖씩 5회 세척하였다. 그 후 NC 막에 ECL 용액(#16024, Intron)을 흩뿌린 다음, Chemi Doc(UVITEC, mini HD)을 감지하는데, 노출 시간을 1초, 30초, 1분으로 하여 잘 나온 이미지를 선택하여 저장하였다.
실시예 4: 항-TIGIT 단일클론 항체의 특성
실시예 4-1: 고발현 세포주를 이용한 In vitro Efficacy 평가
인간 TIGIT이 과발현되어 있는 Jurkat 세포주(#CS198809, Promega)를 96-웰 플레이트(#3917, Corning)에 도말하고 37℃의 CO2 배양기에서 16시간 이상 배양한 후, 일정 농도로 연속 희석된 항-TIGIT 항체(SA2209, SA2699, SA2734)를 각각 처리하고, 인간 CD155가 고발현되어 있는 CHO-K1 세포주(#CS198810, Promega)를 넣고 6시간 동안 함께 배양하였다. 항체의 저해 회복 정도는 루시퍼라제(Luciferase)가 기질(#G7941, promega)을 분해하여 나오는 발광세기로 알 수 있고 발광광도계(GloMax® Discover System, Promega)로 측정하였다. 대조항체로는 BMS사가 개발한 22G2 클론의 가변영역 서열(미국공개특허 제2016-0176963호)이 포함되어 있는 IgG 형태의 인간항체, SC0030을 제조하여 사용하였다.
항-TIGIT 항체는 항체 농도 의존적으로 저해되어 있던 신호를 회복시켰고 그 효능은 대조항체와 유사하거나 우수하였다(도 6).
실시예 4-2: 세포표면에 발현된 인간 TIGIT 항원에 대한 특이적 결합력
인간 TIGIT을 발현하는 세포(TIGIT/NFAT-NlucP/Jurkat)(Promega)와 발현하지 않는 세포(Jurkat) 각각을 시료당 0.5x106 세포가 되도록 준비하고, 항-TIGIT 항체를 각각 일정한 배수로 희석한 후 준비된 세포와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 세포를 2% 소 태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 PBS(#LB001-02, welgene)로 3회 세척하고, FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광물질이 결합된 항-인간 IgG 항체(#FI-3000, Vectorlabs) 또는 PE-anti-hIgG 항체(#555787, BD)를 사용하여 4℃에서 20분간 반응시킨 후, 상기와 동일하게 세척하였다. 세포를 0.5 ㎖의 2% FBS(#26140-079, Thermo)가 든 PBS로 현탁시킨 후, 유세포 분석기인 FACSCanto Ⅱ flow cytometer(BD Biosciences, 미국)를 사용하여 결합력을 분석하였다. 각 세포주의 TIGIT 발현 여부를 PE-anti-TIGIT(#FAB7898P, R&D) 항체로 조사한 결과, TIGIT/NFAT-NlucP/Jurkat 세포만이 TIGIT을 발현함을 확인하였다(도 7a).
또한, 항-TIGIT 항체는 TIGIT이 발현되어 있지 않은 Jurkat 세포주에는 결합하지 않았고 TIGIT이 높게 발현되어 있는 TIGIT/NFAT-NlucP/Jurkat 세포주에는 농도 의존적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 7b 및 7c).
실시예 4-3: 세포표면에 발현된 마우스/원숭이 TIGIT에 대한 특이적 결합력
CHO-DG44 세포주에 마우스(mouse) TIGIT과 원숭이(Cynomolgus Monkey) TIGIT이 각각 발현되어 있는 세포주를 사용하여 특이적 결합력 실험을 실시하였다. 원숭이 TIGIT 발현은 SC0050(WO2016/028656A1의 31C6 클론)와 FITC-anti-human IgG(H+L)로 사용하여 확인하였고, 마우스 TIGIT 발현은 PE-Cy7 anti-mouse TIGIT(#142107, Biolegend)을 사용하여 확인하였다(도 8a).
마우스 TIGIT과 원숭이 TIGIT이 각각 발현되어 있는 CHO-DG44 세포주 0.5x105 세포에 항-TIGIT 항체를 농도별로 섞고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 세포를 2% 소 태아 혈청이 포함된 PBS로 3차례 세척하고, FITC 형광물질이 결합된 항-인간 IgG 항체(#FI-3000, Vectorlabs) 또는 Alexa Fluor® 647 Goat Anti-Human IgG (H+L)(#109-605-003, Jackson Immunoresearch)와 함께 4℃에서 20분간 반응시킨 후, 상기와 동일하게 세척하였다. 0.5 ㎖의 2% FBS(#26140-079, Thermo)가 든 PBS로 세포를 현탁시키고, 유세포 분석기인 FACSCanto Ⅱ flow cytometer(BD Biosciences)를 사용하여 항체의 결합정도를 분석하였다.
그 결과, 대조항체 SC0030은 마우스 TIGIT에 대한 교차 결합력이 없으나, 항-TIGIT 항체는 교차 결합력을 보였고, Cynomolgus Monkey TIGIT에 대해서도 항-TIGIT 항체들의 교차 결합력이 확인되었다(도 8b 및 8c).
마우스 TIGIT 단백질을 희석용액(4% skim milk/0.05% tween-20/PBS)을 사용하여 1 ㎍/㎖로 준비한 후, 100 ㎕씩 면역 플레이트(#439454, Thermo)의 각 웰에 넣고 16시간 이상 4℃에서 정치 배양시켰다. 300 ㎕ 세척액(0.05% tween-20/PBS)으로 3회 세척한 후, 200 ㎕ 차단용액(4% skim milk/0.05% tween-20/PBS)을 웰에 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 3회 세척 후, 10 ㎍/㎖로부터 1/5 배수로 연속 희석된 항-TIGIT 항체를 각 100 ㎕씩 각 웰에 넣고 상온에서 1시간 흔들어주었다(rocking). 3회 세척 후, 1:3,000의 희석비율로 준비된 항-인간 Fc-HRP(anti-human Fc-HRP; #31413, Pierce) 100 ㎕를 각 웰에 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 3회 세척 후, 100 ㎕ TMB 기질(#T0440, Sigma)을 각 웰에 넣고 차광 하에 상온에서 반응시키면서 발색이 확인되었을 때 50 ㎕ 반응정지용액(1N H2SO4)을 넣어 반응을 정지시켰다. 흡광광도계(GM3000, Promega)로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 대조항체 SC0030이 마우스 TIGIT에 대해 농도 상관적인 결합력을 보였고, 항-TIGIT 항체인 SA2734 항체는 대조항체에 비해 상대적으로 월등히 높은 교차 결합력이 확인되었다(도 8d).
실시예 4-4: 항-TIGIT 항체의 에피토프 도메인 탐색
항-TIGIT 항체가 TIGIT의 어느 부위에 결합하는지를 탐색하기 위해, 인간 TIGIT의 세포외 도메인에 대한 서열 유사성이 60% 미만인 Pteropus TIGIT 서열을 참고로 하여 인간 TIGIT의 일부 아미노산을 치환시킴으로써 아래 표 7에서와 같이 다양한 돌연변이 인간 TIGIT을 제조하였다. 표 7에 기재된 야생형(wild type) TIGIT-FC 단백질은 인간 TIGIT 단백질의 24번 내지 141번 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드(서열번호 22)의 c-말단에 인간 FC 서열을 결합시킨 것이며, 각 돌연변이 단백질은 특정 부위에서 인간 TIGIT의 아미노산을 Pteropus TIGIT의 대응 아미노산으로 치환한 것이다.
돌연변이 인간 TIGIT 서열
단백질 명칭 아미노산 치환 부위
TIGIT-FC 야생형(wild type)
TIGIT-M1-Fc T26R,E28V,T30V
TIGIT-M2-Fc K37E,I41V,I42N
TIGIT-M3-Fc S49F,Q53A
TIGIT-M4-Fc C69H,N70H,D72K,L73M
TIGIT-M5-Fc I77T,S80A,K82R,D83E
TIGIT-M6-Fc A86V,P89S,G90D,G92S
TIGIT-M7-Fc Q96H,V100A
TIGIT-M8-Fc T117M,T119K,I122L
TIGIT-M9-Fc E125K,E128L,S129N,V131E
TIGIT-M10-Fc G135S,A136S,Q139L,I140T
TIGIT-M11(M4-1)-Fc C69H,N70H
TIGIT-M12(M4-2)-Fc D72K,L73M
TIGIT-M13(M5-1)-Fc I77T,S80A
TIGIT-M14(M5-2)-Fc K82R D83E
TIGIT-M15(M9-1)-Fc E125K,E128L
에피토프 부위를 찾기 위한 방법으로 ELISA를 실시하였다. 각 TIGIT 단백질을 희석용액(4% skim milk/0.05% tween-20/PBS)을 사용하여 1 ㎍/㎖로 준비한 후, 100 ㎕씩 면역 플레이트(#439454, Thermo)의 각 웰에 넣고 16시간 이상 4℃에서 정치 배양시켰다. 300 ㎕ 세척액(0.05% tween-20/PBS)으로 3회 세척한 후, 200 ㎕ 차단용액(4% skim milk/0.05% tween-20/PBS)을 웰에 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 3회 세척 후, 1.5 ㎍/㎖로 희석된 항-TIGIT 항체 100 ㎕를 웰에 넣고 상온에서 1시간 흔들어주었다(rocking). 3회 세척 후, 1:5,000으로 준비된 항-인간 카파-HRP(anti-human kappa-HRP; #A7164, Sigma) 100 ㎕를 각 웰에 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 3회 세척 후, 100 ㎕ TMB 기질(#T0440, Sigma)을 각 웰에 넣고 차광 하에 상온에서 반응시키면서 발색이 확인되었을 때 50 ㎕ 반응정지용액(1N H2SO4)을 넣어 반응을 정지시켰다. 흡광광도계(GM3000, Promega)로 흡광도를 측정하였다.
항-TIGIT 항체가 정상서열을 가지고 있는 야생형 TIGIT에 대해 충분한 결합력을 보이는 조건에서, 항체의 결합력이 사라지거나 매우 낮아진 돌연변이 TIGIT 단백질을 확인하였다. 그 결과, 아래 표와 같이 M4, M5 및 M9에 대해 결합력이 사라졌는데, 특히 M4-2, M5-1 및 M9-1 돌연변이에 대해 결합력을 상실하여, 해당 부위들이 TIGIT 에피토프 부위로 탐색되었다(표 8).
항체의 결합이 사라진 돌연변이 TIGIT 부위 (v 표시)
단백질 명칭 아미노산 치환 부위 SA2209의 결합이 사라진 단백질 SA2699의 결합이 사라진 단백질
TIGIT-FC 야생형(wild type)
TIGIT-M1-Fc T26R,E28V,T30V
TIGIT-M2-Fc K37E,I41V,I42N
TIGIT-M3-Fc S49F,Q53A
TIGIT-M4-Fc C69H,N70H,D72K,L73M v v
TIGIT-M5-Fc I77T,S80A,K82R,D83E v v
TIGIT-M6-Fc A86V,P89S,G90D,G92S
TIGIT-M7-Fc Q96H,V100A
TIGIT-M8-Fc T117M,T119K,I122L
TIGIT-M9-Fc E125K,E128L,S129N,V131E v v
TIGIT-M10-Fc G135S,A136S,Q139L,I140T
TIGIT-M11(M4-1)-Fc C69H,N70H
TIGIT-M12(M4-2)-Fc D72K,L73M v v
TIGIT-M13(M5-1)-Fc I77T,S80A v v
TIGIT-M14(M5-2)-Fc K82R D83E
TIGIT-M15(M9-1)-Fc E125K,E128L v v
실시예 4-5: 항-TIGIT 항체와 CD155의 TIGIT에 대한 경쟁적 결합
TIGIT과 리간드인 CD155의 결합복합체에 대해서 항-TIGIT 항체가 경쟁적으로 TIGIT에 결합할 수 있는지를 확인하기 위해 ELISA를 수행하였다.
10 ㎍/㎖ TIGIT-Fc(#S1469, Y-Biologics)를 면역 플레이트(#439454, Thermo)의 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 4℃에서 16시간 이상 부착시킨 후, 300 ㎕의 세척액(0.05% tween-20/PBS)으로 3회 세척하였다. 200 ㎕ 블로킹 용액(4% skim milk/0.05% tween-20/PBS)을 웰에 넣고 상온에서 1시간 반응시킨 후, 3회 세척하였다. 10 ㎍/㎖ CD155/PVR-his(S1858, Y-Biologics)를 100 ㎕씩 웰에 넣고 상온에서 1시간 동안 흔들며 반응시켰다. 3회 세척 후, 항-TIGIT 항체를 10 ㎍/㎖로부터 2배수로 연속 희석시켜 10개 샘플을 준비하고 각 웰에 100 ㎕씩 넣은 후 상온에서 흔들면서 80분간 반응시켰다. 3회 세척 후, 1:2,000으로 희석된 비오틴-항-His 항체(biotin-anti-His antibody; #MA1-21315, Thermo)를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 1시간 흔들면서 반응시켰다. 3회 세척 후, 1:5,000으로 희석된 streptavidin poly-HRP(#21140-QF219965, pierce)를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 1시간 흔들면서 반응시켰다. 3회 세척 후, 100 ㎕ TMB 기질용액(#T0440, Sigma)을 각 웰에 넣고 차광하여 37℃에서 20분간 정치 반응시켰다. 발색이 확인되었을 때 1N N2SO4 용액(#S1478, Samchun)을 50 ㎕씩 웰에 넣어 반응을 정지시킨 후, 흡광광도계(GM3000, Promega)를 사용하여 흡광도(OD450nm)를 측정하였다.
도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, TIGIT에 CD155의 결합이 충분히 이루어진 조건에서 항-TIGIT 항체의 농도가 증가함에 따라 CD155의 결합이 감소하였다. 이로부터, SA2209, SA2699 및 SA2734 항체는 TIGIT에 경쟁적으로 결합할 수 있고, 결합되어 있던 CD155를 해리시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 4-6: 항-TIGIT 항체의 TIGIT에 대한 결합친화도
Octet QK 기기(Fortebio Inc.)를 사용하여 BLI(biolayer interferometry) 원리를 바탕으로 하여 TIGIT 항원에 대한 항체의 결합친화도를 측정하였다. AHC(Anti-Human IgG Fc Capture) 바이오센서(Fortebio Inc.)에 항-TIGIT 항체를 고정시키고, 여기에 농도별로 준비한 인간 TIGIT-His 항원을 결합시켜서 친화도(KD)를 구하였다. 모든 완충액은 키네틱 버퍼(Kinetic Buffer; Fortebio Inc.)를 사용하였다. 먼저, 바이오센서를 완충액에 담가 안정시키고, 완충액에 10 ㎍/㎖ 농도로 녹인 상기 항-TIGIT 항체를 5분 정도 반응시켜서 AHC 바이오센서에 고정하였다. 바이오센서를 완충액으로 3-5분 세척하여 고정되지 않은 항체를 제거하고, 농도별(15 nM ~ 1.88 nM)로 준비한 TIGIT 항원과 10분간 결합 반응을 수행한 다음, 10분간 해리 반응을 수행하였다. 모든 실험은 30℃, 1,000 rpm 조건에서 수행하였고, 시간에 따른 결합과 해리 과정 중의 센소그램(sensorgram) 데이터를 수집하였다. Octet 데이터 분석 소프트웨어 9.0에 따라 1:1 global binding fitting model을 적용해 평형 해리상수(KD)를 구하였다.
그 결과 KD 값은 약 3~4 nM로 TIGIT 항원에 대해 높은 친화도를 보였다(표 9).
항-TIGIT 항체의 TIGIT에 대한 친화도(OCTET)
항체 KD (M) Kon (1/Ms) Koff (1/s)
SA2209 3.43ⅹ10-9 3.97ⅹ105 1.36ⅹ10-3
SA2699 3.91ⅹ10-9 5.82ⅹ105 2.27ⅹ10-3
SA2734 1.40ⅹ10-9 6.46ⅹ105 9.06ⅹ10-4
실시예 4-7: 항-TIGIT 항체의 열안정성
시차 주사 형광측정법(Differential Scanning Fluorimetry)을 이용하여 항체의 열안정성을 테스트하였다. 항체 단백질을 DPBS에 희석하여 3 μM, 45 ㎕를 만들고, 200x sypro orange dye(#S6650, Thermo) 5 ㎕와 섞어서 qPCR 튜브(#TLS0851-white, Bio-Rad)에 50 ㎕씩 분주하고 뚜껑(#TCS0803, Bio-Rad)을 닫는다. Biorad CFX96 실시간 PCR 기기를 사용하여 qPCR을 실시하였다. qPCR은 25℃에서 30초간 반응시킨 후, 99℃까지 0.5℃씩 증가시키되 각 온도에서 0.5분간 반응시키고, 마지막으로 25℃에서 10초간 반응시켜 마무리하였다. 항체 구조가 풀리는 속도 상수로는 Melt Tm(용융 온도)을 사용하였다. 그 결과는 아래 표 10과 같다.
용융 온도
시료 Melt Tm (℃)
DPBS
SA2209 63.5
SA2699 63.5
SA2734 63.0
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Y-Biologics Inc. <120> Antibody specifically binding to TIGIT and uses thereof <130> PN20382 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 1 Gly Val Ser Ile Arg Gln Gly His Trp 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 2 Ile Tyr Gln Thr Gly Arg Thr 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 3 Thr Thr Gly Ser Gly Trp Tyr Pro Ile Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 4 Ser Leu Arg Gly Phe Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 5 Gly Val Lys 1 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 6 Asn Ser Arg Asp Ser Asn Gly Ala Met Met 1 5 10 <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRH1 <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser 20 25 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRH2 <400> 8 Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 15 Glu <210> 9 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRH3 <400> 9 Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Arg Asn His Ile Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRH4 <400> 10 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRL1 <400> 11 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp 20 25 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRL2 <400> 12 Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Tyr <210> 13 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRL3 <400> 13 Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly 1 5 10 15 Thr Thr Ala Ser Leu Xaa Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala 20 25 30 Asp Tyr Tyr Cys 35 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRL4 <400> 14 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Arg Gln Gly 20 25 30 His Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr Gln Thr Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Lys Ser Arg Asn His Ile Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Gly Ser Gly Trp Tyr Pro Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 16 caggtgcagc tacaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcgctg tgtctggtgt ctccatccgg cagggtcact ggtggagttg ggtccgccag 120 cccccaggga agggactgga gtggattggg gaaatctatc agacggggag gaccaactac 180 aacccgtccc tcaagagtcg cgtcaccata tcagtaggca agtccaggaa ccatatctcc 240 ctgaaactga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtac cacaggcagt 300 ggctggtacc caattgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 17 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Gly Phe Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Leu Tyr 35 40 45 Gly Val Lys Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Arg Ser Gly Thr Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Asn Gly Ala Met 85 90 95 Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 18 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA2209 VL <400> 18 tcctatgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagtct cagaggcttt tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120 caggcccctt tacttgtcct ctatggtgta aaagaccgac cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccaggtcagg aaccacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taattctcga gacagcaatg gtgccatgat gtttggcgga 300 gggaccaagc tgaccgtcct a 321 <210> 19 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA2699 VL <400> 19 tcctatgagc tgacacagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagtct cagaggcttt tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120 caggcccctt tacttgtcct ctatggtgta aaagaccgac cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccaggtcagg aaccactgct tccttgatca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taattctcga gacagcaatg gtgccatgat gtttggcgga 300 gggaccaagc tgaccgtcct a 321 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 acaggcacaa tagaaacaac g 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tggaatctgg aacctggcac cg 22 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 22 Ser Leu Arg Ser Phe Tyr 1 5 <210> 23 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 23 Gly Lys Asp 1 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 24 Ser Ser Arg Asp Arg Ser Ala Asn Val Val 1 5 10 <210> 25 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRL1 <400> 25 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Ser Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp 20 25 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRL2 <400> 26 Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Leu Thr 1 5 10 15 Tyr <210> 27 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRL3 <400> 27 Thr Arg Ser Asp Asp Arg Ser Ala Ser Ser Ser Gly Asp Thr Ser Ser 1 5 10 15 Thr Thr Gly Ala Ala Asp Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA2734 VL <400> 28 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Ser Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Phe Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Leu Thr Tyr 35 40 45 Gly Lys Asp Thr Arg Pro Ser Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asp Thr Ser Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Arg Ser Ala Asn Val 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 29 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA2734 VL <400> 29 tcctatgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct cgggacagac agtcaggatc 60 acatgccagg gagacagcct cagaagcttt tatgcaagtt ggtaccagca gaaaccagga 120 caggccccta tacttctcac ctatggaaaa gacacgcggc cctcagacat cccagaccga 180 ttctctgcct ccagttcagg agacacatct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg tagctcccgg gacagaagtg ctaatgtggt attcggcgga 300 gggaccaagc tgaccgtcct a 321 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr 20 25 30 Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala 35 40 45 Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro 50 55 60 Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr 65 70 75 80 Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr 85 90 95 Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His Gly 100 105 110 Ala Arg Phe Gln Ile Pro 115

Claims (16)

  1. 서열번호 1의 중쇄 CDR(Complementarity Determining Region)1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4 또는 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 5 또는 23의 경쇄 CDR2 및 서열번호 6 또는 24의 경쇄 CDR3를 포함하는 항-TIGIT (T cell immunoreceptor with immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain) 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 7의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 중쇄 FR(Framework Region)1, 서열번호 8의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 중쇄 FR2, 서열번호 9의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 중쇄 FR3, 서열번호 10의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 중쇄 FR4, 서열번호 11 또는 25의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 경쇄 FR1, 서열번호 12 또는 26의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 경쇄 FR2, 서열번호 13 또는 27의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 경쇄 FR3, 및 서열번호 14의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 경쇄 FR4를 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 17 또는 28의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  6. 제5항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  7. 제6항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 세포는 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균 및 곤충세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
  9. 제7항에 있어서, 상기 세포는 COS-7(monkey kidney cells 7) 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, CHO(Chinese hamster ovary) 세포, W138, BHK(baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포, 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
  10. (i) 제7항에 따른 세포를 배양하는 단계; 및
    (ⅱ) 얻어진 세포 배양액으로부터 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  11. 제1항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC).
  12. 제1항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체.
  13. 제1항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 제11항의 항체-약물 접합체; 또는 제12항의 다중특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 전립선암, 난소암, 유방암, 결장암, 신장암, 비소세포폐암, 췌장암, 두경부암, 흑색종, 아교모세포종 및 신경모세포종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 천식, 류마티스 관절염 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  16. 제1항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 제11항의 항체-약물 접합체; 또는 제12항의 다중특이적 항체를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진단용 조성물.
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WO2023234748A1 (ko) * 2022-06-03 2023-12-07 메디맵바이오 주식회사 항-tigit 항체 및 이의 용도

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