KR20220007118A

KR20220007118A - PDL1 및 TGFβ에 대한 2기능성 융합 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220007118A
Application number: KR1020217040151A
Authority: KR
Inventors: 데용 송; 홍구앙 수; 젠 한
Original assignee: 샨동 보안 바이오테크놀로지 컴퍼니, 리미티드
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2022-01-18
Also published as: WO2020248926A1; JP2022528007A; CA3135988A1; CN114206926B; US20220213195A1; JP7297090B2; BR112021024820A2; CN114206926A; AU2020290119A1; EP3929215A1; EP3929215A4

Abstract

항-PDL1 항체 및 이의 항원-결합 단편이 제공되며, PDL1 및 TGFβ에 대한 2기능성 융합 단백질 및 이에 대한 제조 방법 그리고 이의 용도가 추가로 제공된다. 항체 또는 항원-결합 단편 또는 2기능성 융합 단백질은 하기 장점 중 하나 이상을 갖는다: 증강된 TGFβ1 결합 활성, 증강된 PDL1에 대한 친화도, 증강된 PDL1 및 PD1의 결합 차단 능력, 증강된 TGFβ1 기능의 차단 활성, 증강된 T 세포에 의한 IFN-γ 분비 촉진 능력, 더 우수한 면역조절 효과 및 더 우수한 종양 억제 효과.

Description

PDL1 및 TGFβ에 대한 2기능성 융합 단백질 및 이의 용도

본 발명은 생물의약 또는 생물약학의 기술 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항-PDL1 항체, PDL1 및 TGFβ에 대한 2기능성 융합 단백질, 및 이의 변이체 및 항원-결합 단편뿐만 아니라 이의 제조 방법 및 암을 치료하는 방법 및 용도에 관한 것이다.

PD1(세포 예정사-1) 및 PDL1(세포 예정사-1 리간드 1)은 중요한 종류의 면역 관문 단백질로, 여기서 PD1은 활성화된 T 세포 및 NK 세포의 표면 상에서 발현되며, 종양 세포는 다량으로 PDL1을 발현함으로써 PD1에 결합한 뒤 T 세포 및 NK 세포의 성숙 및 증식을 억제한 후, 면역 감독으로부터 탈출한다(Iwai et al., PNAS 99:12293-7, 2002)(Ohigashi et al., Clin Cancer Res 11:2947-53, 2005). 따라서, PD1 및 PDL1 간 상호작용을 차단함으로써, T 세포가 재활성화될 수 있고, 종양 세포가 확인되고 사멸되어 환자에게 이익을 제공할 수 있다.

TGFβ는 초기 종양의 성장을 억제할 수 있지만, 종양이 계속 진행됨에 따라, 종양 세포는 더 이상 TGFβ에 민감하지 않게 되고, 이 시점에, TGFβ는 다시 상피-간질 전달을 촉진하고 면역계를 억제함으로써 종양 성장을 촉진한다(Bierie et al., Nat Rev Cancer. 2006; 6:506-20).

TGFβRII의 세포외 도메인은 단지 136 아미노산 잔기 길이이며 TGFβRII는 TGFβ1에 결합할 수 있다(Lin et al., J Biol Chem. 1995; 270:2747-54). 가용성 TGFβRII-Fc는 항암제로 평가되었으며 이것이 쥣과 모델에서 악성 중피종의 성장을 억제할 수 있음을 나타내었다(Suzuki et al., Clin Cancer Res. 2004; 10:5907-18)(Suzuki et al., Clin Cancer Res. 2004; 10:5907-18).

Merck사의 M7824 2기능성 융합 단백질(중국 출원 번호 CN201580007865.3)은 (G₄S)₄G에 의해 TGFβRII에 연결된 항-PDL1 항체 아벨루맙(Avelumab)이며, 일부 I상 및 II상 시험이 완료되었고, 다양한 고형 종양에서 잘 작용하였다(MSB0011359C).

그러나, 질병 치료를 위한 환자의 의약 요구, 특히 항체 약물에 대한 요구에 직면하여, 더 높은 결합 활성 및 더 우수한 유효성을 갖는 항-PDL1 항체 또는 PDL1 및 TGFβ에 대한 2기능성 융합 단백질을 제공할 긴급한 임상적 필요성이 여전히 존재한다.

본 발명의 전체 텍스트에서, VL(경쇄 가변 영역), VH(중쇄 가변 영역), LCDR(경쇄 상보성 결정 영역), HCDR(중쇄 상보성 결정 영역), LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3에 관한 다양한 구현예가 개별적으로 또는 임의의 조합으로 구현될 수 있다.

본 발명은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 2기능성 융합 단백질 및 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 HCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8로 나타내고, HCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9로 나타내고, HCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10으로 나타낸다. 또한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역이 또한 포함되며, 여기서 LCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5로 나타내고, LCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6으로 나타내고, LCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7로 나타낸다.

본 발명의 일 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에는 SEQ ID NO: 2로 나타내는 중쇄 가변 영역이 포함되며; 바람직하게는, SEQ ID NO: 1로 나타내는 경쇄 가변 영역이 추가로 포함된다.

본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 3개의 경쇄 상보성 결정 영역으로서, LCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11로 나타내며, LCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6으로 나타내고, LCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12로 나타내는 경쇄 상보성 결정 영역; 및/또는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역으로서, HCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13으로 나타내고, HCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14로 나타내고, HCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 15로 나타내는 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3으로 나타내는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO: 4로 나타내는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 16이다.

또 다른 양태에서, 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 17이다.

구체적으로, 본 발명에서 제공되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에는 바람직하게는 SEQ ID NO: 1로 나타내는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 2로 나타내는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 16으로 나타내는 아미노산 서열의 경쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 17로 나타내는 아미노산 서열의 중쇄 불변 영역이 포함된다. 대안적으로, 본 발명에서 제공되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에는 바람직하게는 SEQ ID NO: 3으로 나타내는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 4로 나타내는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 16으로 나타내는 아미노산 서열의 경쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 17로 나타내는 아미노산 서열의 중쇄 불변 영역이 포함된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv 단편, dsFv 단편 등을 포함하는 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 하나는 PDL1에 결합한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 2기능성 융합 단백질에 관한 것이며 TGFβRII 단편, 바람직하게는 TGFβRII 단편에는 TGFβRII 세포외 도메인이 포함된다.

또 다른 양태에서, 2기능성 융합 단백질에서, 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 링커에 의해 TGFβRII 단편에 연결되며, 바람직하게는, TGFβRII 단편은 바람직하게는 (G₄S)₄G(즉, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG) 링커에 의해, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 불변 영역의 C-말단에 연결되며, 바람직하게는, 2기능성 융합 단백질의 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 22이고, 바람직하게는 2기능성 융합 단백질의 TGFβRII 단편의 서열은 SEQ ID NO: 23이고; 구체적으로, 2기능성 융합 단백질의 구조는 항체 또는 이의 항원-결합 단편-(G₄S)₄G-TGFβRII 단편이다.

또 다른 양태에서, 2기능성 융합 단백질에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 1이며, 중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 2이고, 바람직하게는, 2기능성 융합 단백질에서, 경쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 16이며, 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 22이고, TGFβRII 단편의 서열은 SEQ ID NO: 23이고; 구체적으로, (G₄S)₄G에 의해 연결되는 중쇄 불변 영역 및 TGFβRII 단편의 서열은 SEQ ID NO: 18이다.

또 다른 양태에서, 2기능성 융합 단백질에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 3이며, 중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 4이고, 바람직하게는, 2기능성 융합 단백질에서, 경쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 16이고, 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 22이고, TGFβRII 단편의 서열은 SEQ ID NO: 23이고; 구체적으로, (G₄S)₄G에 의해 연결되는 중쇄 불변 영역 및 TGFβRII 단편의 서열은 SEQ ID NO: 18이다.

또 다른 양태에서, 상기 2기능성 융합 단백질 중 어느 하나는 PDL1 및 TGFβ에 결합한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 2기능성 융합 단백질을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 양태의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이거나, 벡터는 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 2기능성 융합 단백질을 발현할 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다; 바람직하게는 바이러스 벡터에는 비제한적으로 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등이 포함된다; 바람직하게는 벡터는 비-바이러스 벡터일 수 있다; 바람직하게는 벡터는 포유류 세포 발현 벡터일 수 있다; 바람직하게는 발현 벡터는 박테리아 발현 벡터일 수 있다; 그리고 바람직하게는 발현 벡터는 진균 발현 벡터일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 2기능성 융합 단백질의 세포를 발현할 수 있는 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 세포는 박테리아 세포이다; 바람직하게는 박테리아 세포는 대장균(E. coli) 세포 등이다; 바람직하게는 세포는 진균 세포이다; 바람직하게는 진균 세포는 효모 세포이다; 바람직하게는 효모 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 등이다; 바람직하게는 세포는 포유류 세포이다; 바람직하게는 포유류 세포는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) 세포(CHO), 인간 배아 신장 세포(293), B 세포, T 세포, DC 세포, NK 세포 등이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 2기능성 융합 단백질, 핵산, 벡터 또는 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이며, 바람직하게는, 약학 조성물에는 약학적으로 허용 가능한 부형제가 추가로 포함되고, 바람직하게는, 약학적으로 허용 가능한 부형제에는 약학적으로 허용 가능한 용매, 분산제, 첨가제, 가소제 등 중 하나 이상이 포함된다.

또 다른 양태에서, 약학 조성물에는 다른 치료제가 추가로 포함될 수 있다. 일부 구현에서, 다른 치료제에는 화학치료제, 면역치료제, 또는 호르몬 치료제가 포함된다. 항체 또는 항원-결합 단편 및 다른 치료제의 조합된 투여는 치료 효과를 증강시킬 수 있다.

또 다른 양태에서, "치료 효과를 증강시킨다"는 다른 치료제 또는 치료법의 치료 효과 증강을 나타낸다. 본 발명에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편은 개별적으로 또는 다른 치료제 또는 치료법과의 조합으로 투여될 수 있다. 일부 구현에서, 다른 치료제 또는 치료법에는 화학치료제, 면역치료제, 호르몬 치료제, 방사선 치료법 및 수술이 포함된다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나, 2기능성 융합 단백질을 포함하거나, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 2기능성 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 키트가 제공된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 질병의 치료 또는 예방용 약제의 제조에서의 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 2기능성 융합 단백질, 핵산, 벡터 또는 세포의 적용에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 진단 또는 검출 키트의 제조에서의 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 2기능성 융합 단백질 또는 핵산의 적용에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체에 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 2기능성 융합 단백질, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질병을 치료하거나 방지하는 방법이 제공된다.

또 다른 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체 또는 샘플에 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 2기능성 융합 단백질, 핵산 또는 키트를 투여하는 단계를 포함하는 진단 또는 검출 방법이 제공된다. 바람직하게는, 방법은 질병을 진단하거나 검출하는 방법이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 질병의 치료 또는 예방을 위한 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 2기능성 융합 단백질, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 검출 또는 진단을 위한 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 2기능성 융합 단백질, 핵산, 또는 키트의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 용도는 질병을 진단하거나 검출하기 위한 것이다.

또 다른 양태에서, 질병은 암이다.

또 다른 양태에서, 암에는 위암, 식도암, 두부경부암, 방광암, 자궁경부암, 육종, 세포종, 폐암, 결장암, 난소암, 신장암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 흑색종, 유방암, 골수종, 교종, 백혈병, 림프종 등이 포함된다

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 벡터로 세포를 전달감염시키는 단계, 및 전달감염된 세포에 의해 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 2기능성 융합 단백질을 발현하는 단계를 포함하거나; 상기 세포로 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 2기능성 융합 단백질을 발현하는 단계를 포함하는, 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 2기능성 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 제공되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 2기능성 융합 단백질은 하기 장점 중 하나 이상을 갖는다: 증강된 TGFβ1 결합 활성, 증강된 PDL1 친화도, 증강된 PDL1의 PD1에 대한 결합 차단 능력, 증강된 TGFβ1 기능의 차단 활성, 증강된 T 세포의 IFN-γ 분비 촉진 능력, 더 우수한 면역조절 효과, 및 더 우수한 종양 억제 효과.

도 1은 5회 면역화(2500배 희석) 후 BoAn-hMab1 마우스의 혈청 역가를 나타낸다.
도 2는 TGFβ1 단백질에 대한 2기능성 융합 단백질의 결합을 나타낸다.
도 3은 2기능성 융합 단백질이 CD4+T에 의해 IFN-γ의 분비를 촉진함을 나타낸다.
도 4는 TGFβ1 기능에 대한 2기능성 융합 단백질의 차단 효과를 나타낸다.
도 5a는 MC38-hPD-L1 종양 모델 마우스의 체중을 나타낸다; 도 5b는 MC38-hPD-L1 종양 모델 마우스의 종양 부피를 나타낸다; 그리고 도 5c는 MC38-hPD-L1 종양 모델 마우스의 종양 중량을 나타낸다.

본 발명은 이제 구체적 구현예와 관련하여 아래에서 추가 설명될 것이다. 기재된 구현예는 모든 구현예가 아니라, 본 발명의 구현예의 일부이다. 하기 실시예는 본 발명에 속하는 기술 분야의 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 어떻게 사용하는지에 대한 일반적 개시 및 설명을 제공하기 위해 주어지며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본 발명의 구현예에 기반하여, 발명의 창의적 수행 없이 당업자에 의해 수득된 모든 다른 구현예는 본 발명의 범위 내에 속한다.

물질 및 시약: PDL1 단백질(Sinobiological, 카탈로그 번호: 10084-H08H); PD1 단백질(Sinobiological, 카탈로그 번호: 10377-H08H); TGFβ1(Sinobiological, 카탈로그 번호: 10804-HNAC); NaHCO₃(Sinopharm, 10018960); TMB(Beijing Makewonder, 카탈로그 번호: 1001); STREP/HRP(R&D, 카탈로그 번호: 890803); HBS-EP +1× 완충액(GE, 카탈로그 번호: BR-1008-26); 효소 표지 플레이트(Suzhou Beaver, 카탈로그 번호: 40301); 바이오센서 칩(GE, 카탈로그 번호: BR100530); 96-웰 둥근 바닥 플레이트(Corning, 카탈로그 번호: 3799); 항 인간 IgG Fc 아미노 커플링 키트(GE, cat # BR-1008-39);

실시예 1 PDL1 및 TGFβ에 대한 2기능성 융합 단백질의 제조

1.1 PDL1 단백질의 면역화

PDL1 단백질을 프로인트 완전 아주반트(Sigma, 카탈로그 번호: F5881-10ML), 프로인트 불완전 아주반트(Sigma, 카탈로그 번호: F5506-10ML) 또는 금 아주반트(Sigma, 카탈로그 번호: T2684-1mL)로 유화시켜 Boan bio의 완전 인간 항체 트랜스제닉 마우스 BoAn-hMab1(중국 특허 CN103571872B에 기재된 방법에 따라 제조됨)을 면역화한다. 6마리 수컷 및 5마리 암컷을 포함하는 총 11마리 마우스를 상기 시점에 면역화하였고, 마우스의 연령은 6월령 내지 12월령이었고, 총 5회 면역화를 수행하였고, 더 높은 혈청 역가를 갖는 6마리 마우스를 상기 PDL1 단백질로의 추가접종 면역화를 위해 선택하였다. ELISA에 의해 검출된 혈청 역가(2500배 희석)를 도 1에 나타낸다. 여기서, PL1Q15, PL1Q16, PL1Q18, PL1Q19 및 PL1Q21 마우스는 프로인트 아주반트로 면역화된 마우스였고, PL1Q24 마우스는 금 아주반트로 면역화된 마우스였다.

1.2 파지 라이브러리의 확립

1.1에서 더 높은 혈청 역가를 갖는 6마리 마우스를 희생시키고 비장을 절제하고, 비장을 시린지 고무 마개로 분쇄하고 파괴하여 필터(FALCON, 카탈로그 번호: 352350)로 여과하고, 여과된 비장 세포를 추후의 사용을 위해 냉동하였다. RNA 추출 후, 역전사를 수행하여 cDNA를 수득하고, 파지 라이브러리를 확립하기 위한 단계는 문헌[Carlos F. Barbas III, Phage display: A laboratory manual]에 기재된 방법을 참조하고, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 PCR에 의해 cDNA로부터 수득한 후 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 중첩 연장 PCR에 의해 단일쇄 Fv(scFv)를 수득하고, scFv를 SfiI 효소(NEB, 카탈로그 번호: # R0123L)로 소화시킨 후 T4 DNA 리가제(Sino Biological)에 의해 플라스미드 pCOMB3x(BIOVECTOR, Chinese Center, Plasmid Vector Strain Cell Line Gene Collection., 510837)와 결찰하고, 결찰 산물을 대장균 TG1 적격 세포(Lucigen, 카탈로그 번호: A96595-2) 내로 전기전달감염시키고, 37℃ 220 rpm 진탕기에서 전달감염된 TG1을 인큐베이션한 후, 감염시키기 위해 파지를 첨가하고, 배양 상청액을 회수하고, 농축하고 정제하여 파지 라이브러리를 수득하였다.

1.3 파지 라이브러리의 스크리닝

플레이트 스크리닝: CBS 완충액의 제조: 1.59 g의 Na₂CO₃(Sinopharm, 10019260) 및 2.93 g의 NaHCO₃를 칭량하고, 증류수를 1 ℓ가 되게 첨가하여 CBS 완충액을 제조하였다. PDL1 단백질을 CBS 완충액으로 10 ㎍/㎖로 희석한 후, 100 ㎍/웰로 스크리닝 플레이트(Costar, 42592)에 첨가하고, 8개 웰을 각각의 라이브러리를 위해 사용하고 스크리닝 플레이트를 4℃에서 하룻밤 방치하였다; 웰 플레이트 내 단백질 용액을 다음 날 폐기하고, 플레이트를 1 h 동안 2% BSA(Solarbio, A8010)로 씰링하고, 파지 라이브러리(2 × 10¹²/웰) 샘플을 첨가하여 2 h 동안 37℃에서 인큐베이션하고, PBST(PBS+0.05% Tween20)로 4회 내지 10회 세척한 후 PDL1 특이적 결합 파지를 용출 완충액(4.2 ㎖의 진한 염화수소산(Comeo)을 500 ㎖의 초순수에 첨가하고 글리신 분말(Biotopped, BG0617-500)로 pH를 2.2로 조정함)으로 용출하였다.

자기 비드 스크리닝: PDL1-mFc 단백질(Acrobiosystems, 카탈로그 번호: PD1-H52A3)의 바이오틴화(단백질 대 바이오틴의 몰 비는 1:2임): PDL1-mFc 단백질을 0.1 M pH 8.0 NaHCO₃ 내로 충전하고, 적절한 양의 바이오틴(Thermo, 21335)을 정밀 천칭에 의해 칭량한 후 초순수로 희석하고, 적절한 양의 용해된 바이오틴을 PDL1-mFc 단백질 용액에 즉시 첨가하고, 40분 동안 암소에서 회전 혼합기 상에서 인큐베이션한 후, 표지 후 PDL1-mFc 단백질 용액을 PBS 내로 충전하였다. 바이오틴화된 PDL1-mFc 단백질(3 ㎍/라이브러리)을 실온에서 1 h 동안 자기 비드(Invitrogen Dynabeads M-280 스트렙타비딘, 카탈로그 번호: 00355871)(10 ㎕/라이브러리)에 결합시킨 후, 2% BSA로 씰링한 뒤 2 h 동안 실온에서 파지 라이브러리와 인큐베이션하고, 4회 내지 10회 세척한 후 PDL1 특이적 결합 파지를 용출 완충액(pH 2.2)으로 용출하였다.

파지 클론이 대장균을 통해 scFv를 발현한 후, ELISA를 통해 scFv에 의한 PDL1/PD1 결합 차단을 검출하고, 활성을 차단하는 클론을 후속 분자의 작제를 위해 보유한다.

scFv에 의한 PDL1/PD1 결합 차단의 ELISA 검출: PDL1 단백질을 pH 9.6 CBS로 0.5 ㎍/㎖로 희석하고, 효소-표지 플레이트를, 100 ㎕/웰로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다; 그리고 플레이트를 세척한 후 3% 탈지 분유를 1 h 동안 37℃에서 씰링을 위해 사용하였다. 플레이트를 세척한 후 50 ㎕의 scFv 원형질막공간을 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 바이오틴-표지 PDL1-Fc 단백질(최종 농도는 0.2 ㎍/㎖이었음)을, 50 ㎕/웰로 첨가하고, 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다; 플레이트를 세척한 후 PBST로 희석된 STREP/HRP를, 100 ㎕/웰로 첨가하고, 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, 발색을 위해 100 ㎕의 TMB를 각각의 웰에 첨가하고, 10분 후, 발색을 중지시키기 위해 50 ㎕의 2 M H₂SO₄를 각각의 웰에 첨가하고, OD450을 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다.

1.4 2기능성 융합 단백질의 작제 및 생산

자기 비드 스크리닝된 클론 BA533, BA603, BA613, BA623, BA649, BA669, BA446 및 플레이트 스크리닝된 클론 BA705를 서열분석을 위해 Invitrogen Biotechnology Ltd로 보냈다. 각각의 클론의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 아래에서 표 1에 제시한다.

가변 영역 유전자 증폭(2*Phanta Max Master Mix, 제조업체: Vazyme, 카탈로그 번호: P515-AA), 신호 펩티드 및 가변 영역 중첩 연장, 상동 재조합(ClonExpress II One Step 클로닝 키트, 제조업체: Vazyme, 카탈로그 번호: C112-01) 및 다른 방법을 통해, VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 단편을 SEQ ID NO: 18을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 벡터 pCDNA3.4(Life Technology) 내에 최종 삽입하였고, 여기서 SEQ ID NO: 18은 by(G₄S)₄G에 의해 연결된 IgG1 항체의 중쇄 불변 영역의 서열 및 TGFβRII 서열을 함유하고, VL을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 단편을 항체의 경쇄 불변 영역 아미노산 서열(SEQ ID NO: 16)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 벡터 pCDNA3.4(Life Technology) 내에 삽입한 후, HEK293 세포를 전달감염시키고, 6일 내지 7일 동안 37℃＼8% CO₂＼125 rpm 진탕기에서 인큐베이션하고, 최종적으로 배양 상청액을 단백질 A 충전제에 의해 정제하여 후속 검출을 위해 표 2에서 2기능성 융합 단백질의 클론을 수득하였다.

대조군 2기능성 융합 단백질의 생산: Merck사의 M7824 2기능성 융합 단백질은 (G₄S)₄G에 의해 TGFβRII에 연결된 항-PDL1 항체 아벨루맙이며, 일부 I상 및 II상 임상 시험이 완료되었고, 다양한 고형 종양에서 잘 작용하였다. Merck사 아벨루맙의 가변 영역의 아미노산 서열(중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 19이고, 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 20임)을 IMGT 데이터베이스에 의해 결정하고, 전체 유전자를 합성한 후 HEK293 세포에서의 발현을 위해 벡터 pCDNA3.4 내로 삽입하고, 정제된 2기능성 융합 단백질을 PLTGB-M7824-IgG1로 명명한다(중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 19이며, 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 20이고, 경쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 21이고, 중쇄 불변 영역 및 TGFβRII의 서열은 SEQ ID NO: 18임).

1.5 2기능성 융합 단백질에 의한 PDL1-PD1 결합 차단의 ELISA 검출

PD1 단백질을 pH 9.6에서 CBS로 0.5 ㎍/㎖로 희석한 후, 효소-표지 플레이트를, 100 ㎕/웰로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다; 플레이트를 세척한 후 3% 탈지 분유를 1 h 동안 37℃에서 씰링을 위해 사용하였다; 플레이트를 세척한 후 PBST(PBS + 0.05% Tween20)를 첨가하여 2기능성 융합 단백질을 상이한 농도(0.5 ㎍/㎖, 0.25 ㎍/㎖, 0.125 ㎍/㎖, 0.0625 ㎍/㎖, 0.03125 ㎍/㎖, 0.015625 ㎍/㎖)로, 50 ㎕/웰로 희석한 후, 바이오틴-표지 PDL1-Fc 단백질(최종 농도는 0.2 ㎍/㎖임)을, 50 ㎕/웰로 첨가하고, 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다; PBST로 희석된 STREP/HRP를, 100 ㎕/웰로 첨가하고, 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후 발색을 위해 TMB를 첨가하고, 10분 후 발색을 중지시키기 위해 50 ㎕의 2 M H₂SO₄를 각각의 웰에 첨가하고, OD450을 마이크로플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 결과는 본 발명의 후보 2기능성 융합 단백질(PLTGBQ16-BA466-IgG1, PLTGBQ19-BA533-IgG1, PLTGBQ24-BA603-IgG1, PLTGBQ21-BA623-IgG1, PLTGBQ21-BA649-IgG1, PLTGBQ21-BA669-IgG1, PLTGBQ24-BA705-IgG1, PLTGBH03-BT613-IgG1)이 PDL1에 대한 PD1의 결합을 효과적으로 차단할 수 있음을 나타낸다.

1.6 TGFβ1 단백질에 대한 2기능성 융합 단백질 결합의 ELISA 검출

TGFβ1을 pH 9.6 CBS로 상이한 농도(0.2 ㎍/㎖, 0.05 ㎍/㎖, 0.0125 ㎍/㎖)로 희석한 후, 각각 효소-표지 플레이트를, 100 ㎕/웰로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다; 플레이트를 세척한 후 3% 탈지 분유를 1 h 동안 37℃에서 씰링을 위해 사용하였다; 플레이트를 세척한 후 100 ㎕의 PBST(PBS+0.05% Tween20) 희석된 후보 2기능성 융합 단백질(1 ㎍/㎖)을 각각의 웰에 첨가하고, 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다; 이어서 염소 항-인간 IgG/HRP를 첨가하고 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다; 플레이트를 세척한 후 발색을 위해 TMB를 첨가하고, 10분 후 발색을 중지시키기 위해 50 ㎕의 2 M H₂SO₄를 각각의 웰에 첨가하고, OD450을 마이크로플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 결과를 표 3 및 도 2에 나타낸다.

후보 2기능성 융합 단백질 PLTGBQ19-BA533-IgG1 및 PLTGBQ21-BA669-IgG1은 다양한 농도에서 대조군 PLTGB-M7824-IgG1보다 높은 OD 값을 가져서, 후보 2기능성 융합 단백질이 TGFβ1에 대해 더 우수한 결합 능력을 가짐을 시사하였다.

또한, 후보 2기능성 융합 단백질 PLTGBQ19-BA533-IgG1 및 PLTGBQ21-BA669-IgG1이 대조군 PLTGB-M7824-IgG1보다 우수하게 TGF 경로를 차단할 수 있고 임상에서 더 우수한 면역 조절 및 항-종양 특성을 가짐이 예측된다.

실시예 2 2기능성 융합 단백질의 특징화

2.1 2기능성 융합 단백질의 생산

ExpiCHO(Thermo, 카탈로그 번호: A29129) 발현 시스템을 사용하여 2기능성 융합 단백질을 전달감염시키고 발현하고, 단백질 A(GE, Mabselect SuRe) 칼럼을 사용하여 상청액을 정제한다: 세포 배양액을 4500 g에서 원심분리하고 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 로딩 및 평형화 후 표적 2기능성 융합 단백질을 0.1 M pH 3.2 글리신 완충액으로 용출하고, pH 8.0 1 M Tris로 중화하였다. 크기 배제 크로마토그래피(Shanghai Bestchrom, 카탈로그 번호: AG319109)를 사용하여 정제한다; 칼럼을 1.5 CV의 완충액으로 평형화하고, 샘플을 로딩하고, 샘플 부피는 3% CV 이하이고, 계속해서 완충액으로 헹구고 피크가 나타난 후 표적 2기능성 융합 단백질을 수집한다.

2.2 2기능성 융합 단백질 활성의 혼합된 림프구 반응/MLR 검출

RPMI 1640(Gibco, 카탈로그 번호: 11875-093), FBS(Gibco, 카탈로그 번호: 10091-148), HEPES(Solarbio, 카탈로그 번호: H1090)를 90:10:1에 따라 혼합하여 완전 배지를 제조하고, DC 세포(ALLCELLS, 카탈로그 번호: PB-DC001F-0.3M) 및 CD4+T 세포(ALLCELLS, 카탈로그 번호: PB009-2F-C-3M)를 각각 완전 배지로 재현탁한 후, 1:10의 세포 비에 따라 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하고, 최종 부피는 150 ㎕/웰이다. 2기능성 융합 단백질을 완전 배지로, 2개 농도: 4 ㎍/㎖ 및 0.4 ㎍/㎖로 희석하고, 각각 세포 웰 내로, 50 ㎕/웰로 첨가하고, 최종 부피는 200 ㎕이다. 5일 동안 배양한 후, 배양 상청액을 IFN-γ 키트(cisbio, 카탈로그 번호: 62HIFNGPEG)로 검출하였다. 검출 결과를 표 4 및 도 3에 나타낸다.

후보 2기능성 융합 단백질 PLTGBQ19-BA533-IgG1 및 PLTGBQ21-BA669-IgG1은 동일한 농도에서 대조군 PLTGB-M7824-IgG1보다 높은 IFN-γ 분비값을 갖는다.

또한, 후보 2기능성 융합 단백질 PLTGBQ19-BA533-IgG1 및 PLTGBQ21-BA669-IgG1이 대조군 PLTGB-M7824-IgG1에 비해 더 우수한 면역 조절 및 항-종양 특성을 가질 수 있음이 예측된다.

2.3 2기능성 융합 단백질 및 PDL1 단백질 친화도의 SPR 검출

항체 결합 동력학을 검출하기 위해 BIAcore8K 기기를 차용한다. 항-인간 IgG Fc 아미노 커플링 키트에 의해 항-인간 IgG 항체를 CM5 바이오센서 칩에 커플링하여 대략 1000 RU(반응 단위)를 수득하였다. PDL1을 HBS-EP +1× 완충액으로 50 nM로 희석한 후, 2배씩 총 5개 농도(50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.125 nM)로 희석하고, 빈 대조군을 설정하였다. 측정 단계 및 조건은 하기와 같았다: 2기능성 융합 단백질 샘플 주입 2 ㎍/㎖, 샘플 주입 시간 70s, 유속 5 ㎕/분, 안정성 시간 5s; PDL1 단백질 결합 및 해리: 결합 60s, 유속 30 ㎕/분, 해리 450s; 재생: 재생은 30s 동안 3 M MgCl₂ 완충액으로, 3회부터 시작하여 수행하였다. 연합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 1-대-1 랭귀어 모델(BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산하고, 평형 해리 상수 KD는 kd/ka로부터 계산한다. 각각의 2기능성 융합 단백질의 친화도 데이터를 표 5에 나타낸다.

결과는 본 발명의 후보 2기능성 융합 단백질 PLTGBQ19-BA533-IgG1 및 PLTGBQ21-BA669-IgG1이 대조군 PLTGB-M7824-IgG1에서와 실질적으로 동등한 PDL1 친화도를 가짐을 나타낸다. 여기서, PLTGBQ19-BA533-IgG1은 대조군보다 우수한 PDL1 친화도를 갖는다.

2.4 MV-1-Lu 세포에 의한 TGFβ1 기능에 대한 2기능성 융합 단백질의 차단 효과 검출

EMEM(ATCC, 카탈로그 번호: 30-2003), FBS(Gibco, 카탈로그 번호: 10099-141) 및 HEPES(Solarbio, 카탈로그 번호: H1090)를 90:10:1에 따라 혼합하여 완전 배지를 제조하고, MV-1-Lu 세포를 완전 배지로 재현탁하고, 흰색 96-웰 플레이트(Corning, 카탈로그 번호: 3917)에, 50 ㎕/웰, 2000 세포/웰로 첨가하였다. 2기능성 융합 단백질을 완전 배지로 333.3 ng/㎖로 희석한 후, 순서대로 3회, 총 6개 농도로 희석하고, 세포 웰 내로, 25 ㎕/웰로 첨가하였다. TGFβ1을 완전 배지로 2 ng/㎖로 희석하고 세포 웰 내로, 25 ㎕/웰로 첨가하였다. 2기능성 융합 단백질의 최종 농도: 83.3 ng/㎖, 27.8 ng/㎖, 9.26 ng/㎖, 3.09 ng/㎖, 1.03 ng/㎖ 및 0.34 ng/㎖. 4일 동안 배양한 후, 96-웰 플레이트의 형광값(형광값은 세포수를 나타낼 수 있음)을 CellTiter-Glo 키트(Promega, 카탈로그 번호: G7571)로 검출하고, 검출 결과를 도 4에 나타낸다.

후보 2기능성 융합 단백질 PLTGBQ19-BA533-IgG1 및 PLTGBQ21-BA669-IgG1이 대조군 PLTGB-M7824-IgG1보다 TGFβ1 기능의 차단에서 더 우수한 활성을 가짐을 알 수 있다.

또한, 후보 2기능성 융합 단백질 PLTGBQ19-BA533-IgG1 및 PLTGBQ21-BA669-IgG1이 대조군 PLTGB-M7824-IgG1보다 TGF 경로를 더 잘 차단할 수 있고, 더 우수한 면역 조절 및 항-종양 특성을 가짐이 예측된다.

실시예 3 마우스 MC38-hPDL1 결장암 모델에서 항-PD-L1 모노클로날 항체의 유효성 평가

2기능성 융합 단백질에 대응하는 IgG1 모노클로날 항체를 작제하고, PLTGBQ19-BA533-IgG1에 대응하는 모노클로날 항체는 BA533-IgG1이다(중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 2이고, 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 1이고, 경쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 16이고, 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 17임); PLTGBQ21-BA669-IgG1에 대응하는 모노클로날 항체는 BA669-IgG1이다(중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 4이고, 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 3이고, 경쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 16이고, 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 17임); 그리고 PLTGB-M7824-IgG에 대응하는 모노클로날 항체는 아벨루맙이다(중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 19이고, 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 20이고, 경쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 21이고, 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 17임).

마우스 결장암 MC38-hPD-L1 세포를 Beijing Biocytogen Co., Ltd.로부터 구입하였다. 배양 조건은 10% FBS(Gibco, 카탈로그 번호: 10099-141C) 및 1% P/S(Gibco, 카탈로그 번호: 15070-063)를 DMEM(Gibco, 카탈로그 번호: 11965-092) 배지 중에 첨가하고, 37℃에서 5% CO₂로 인큐베이터에서 배양하는 것이다. 하위배양을 1주 2회 내지 3회 수행한다. B-hPD-L1 인간화 마우스, 암컷, 6주 내지 8주령, Jiangsu Biocytogen Co., Ltd.로부터 구입함.

우수한 상태의 MC38-hPD-L1 세포를 수집하고, PBS 중에 재현탁하고 혼합하고, 세포 농도를 5×10⁶/㎖로 조정하고, 0.1 ㎖의 세포 현탁액을 각각의 마우스의 등쪽 사지 상에 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 87 ㎣에 도달했을 때, 무작위화를 시작하였다. 각각 6마리 마우스의 7개 군이 존재하며, 투여는 군 설정일에 시작하였고, 항-PD-L1 모노클로날 항체를 PBS로 희석하고, 각각의 항체는 2일 1회의 복강내 주사에 의해 투여된, 2개 용량: 3 ㎎/㎏ 및 10 ㎎/㎏을 가졌고, 동일한 부피의 PBS를 대조군으로 용매 대조군에서 제공하였다. 마우스를 칭량하고, 종양 부피를 1주 2회 내지 3회 측정하고, 종양 부피(㎣) = 0.5 × 장축 지름 × 단축 지름²이었다. 대조군의 종양 부피가 2000 ㎣에 도달했을 때, 마우스를 안락사시키고, 종양을 제거하고 칭량하였다. 결과를 도 5a, 도 5b, 도 5c 및 표 6 및 7에 나타낸다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, 마우스의 체중은 임의의 유해 반응 없이 일정하게 증가한다.

도 5b 및 도 7c에 나타낸 바와 같이, BA533-IgG1, BA669-IgG1, 및 아벨루맙을 10 ㎎/㎏의 용량으로 투여하였고, 이들은 마우스 MC38-hPD-L1의 종양 성장을 유의미하게, 상대 종양 억제율 TGI(%) 80% 이상으로 억제할 수 있었고, 3개 간에 통계적 차이는 존재하지 않는다. BA533-IgG1, BA669-IgG1, 및 아벨루맙을 3 ㎎/㎏의 용량으로 투여한 경우, BA533-IgG1 및 BA669-IgG1의 종양 억제율이 아벨루맙보다 우수하였다.

상기 결과는, 저용량에서, 후보 항체가 대조군 항체보다 더 우수한 종양 억제 효과를 가지며, 고용량에서, 이들이 또한 필적하는 종양 억제 효과를 가짐을 시사한다.

SEQUENCE LISTING <110> Shandong Boan Biotechnology Co., Ltd. <120> BIFUNCTIONAL FUSION PROTEIN AGAINST PDL1 AND TGF┑ AND USE THEREOF <150> 201910497064.X <151> 2019-06-10 <150> 201910497723.X <151> 2019-06-10 <160> 23 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Thr Tyr Ala Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Ile Trp Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Asn 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Thr Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Trp Ala Ser 1 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ile Thr Tyr Ala Gly Ser Asn Glu 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Arg Asp Arg Ile Trp Val Asp Tyr 1 5 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gln Ser Val Leu Tyr Asn Ser Asn Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gln Gln Tyr Tyr Ser Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 17 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 18 <211> 487 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly 325 330 335 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile 340 345 350 Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp 355 360 365 Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val 370 375 380 Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser 385 390 395 400 Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp 405 410 415 Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro 420 425 430 Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys 435 440 445 Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys 450 455 460 Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu 465 470 475 480 Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 485 <210> 19 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 21 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 22 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala 325 330 <210> 23 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr 1 5 10 15 Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp 20 25 30 Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys 35 40 45 Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val 50 55 60 Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp 65 70 75 80 Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro 85 90 95 Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met 100 105 110 Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu 115 120 125 Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 130 135

Claims

3개의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, HCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8로 나타내고, HCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9로 나타내고, HCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10으로 나타내는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서, 3개의 경쇄 상보성 결정 영역을 추가로 포함하며, LCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5로 나타내고, LCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6으로 나타내고, LCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7로 나타내는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
SEQ ID NO: 2로 나타내는 중쇄 가변 영역을 포함하며; 바람직하게는, SEQ ID NO: 1로 나타내는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이의 항원-결합 단편이 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv 단편, 또는 dsFv 단편을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PDL1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 TGFβRII 단편을 포함하는 2기능성 융합 단백질로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 TGFβRII 단편이 링커에 의해 연결되는, 2기능성 융합 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제6항의 2기능성 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 또는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제6항의 2기능성 융합 단백질을 발현하는 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제6항의 2기능성 융합 단백질, 또는 제7항의 핵산 또는 세포를 포함하는 약학 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제6항의 2기능성 융합 단백질, 또는 제7항의 핵산을 포함하는 키트.
질병의 치료, 예방, 검출 또는 진단을 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제6항의 2기능성 융합 단백질, 또는 제7항의 핵산의 용도로서, 바람직하게는, 질병이 암이며; 보다 바람직하게는, 질병이 위암, 식도암, 두부경부암, 방광암, 자궁경부암, 육종, 세포종, 폐암, 결장암, 난소암, 신장암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 흑색종, 유방암, 골수종, 교종, 백혈병 및 림프종인, 용도.