CN114206926B - 抗PDL1和TGFβ的双功能融合蛋白及其用途 - Google Patents

抗PDL1和TGFβ的双功能融合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗PDL1抗体及其抗原结合片段，还涉及抗PDL1和TGFβ的双功能融合蛋白及其制备方法和用途。本发明提供的抗体或抗原结合片段或双功能融合蛋白具有以下功能中的一种或多种优势：增强的TGFβ1结合活性、增强的PDL1亲和力、增强的阻断PDL1和PD1结合的能力、增强的阻断TGFβ1功能活性、增强的促进T细胞分泌IFN‑γ的能力、更好的免疫调节效果、更好的肿瘤抑瘤效果。

Description

抗PDL1和TGFβ的双功能融合蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域。具体而言，本发明涉及抗PDL1的抗体、抗PDL1和TGFβ的双功能融合蛋白及其变体和抗原结合片段，以及其制备方法和用于治疗癌症的方法和用途。
背景技术
PD1(程序化细胞死亡-1)和PDL1(程序化细胞死亡-1配体1)是一类重要的免疫检查点蛋白，其中PD1表达于激活的T细胞和NK细胞表面上，肿瘤细胞通过大量表达PDL1，同PD1结合之后抑制T细胞和NK细胞的成熟和增殖，进而逃离免疫监视(Iwai et al.,PNAS99:12293-7,2002)(Ohigashi et al.,Clin Cancer Res 11:2947-53,2005)。因而通过阻断两者相互作用可以重新激活T细胞，识别并杀灭肿瘤细胞，使患者获益。
TGFβ可以抑制早期肿瘤的生长，但随着肿瘤的持续进展，肿瘤细胞对TGFβ变得不再敏感，这时TGFβ通过促进上皮-间质转移和抑制免疫系统，转而促进肿瘤生长(Bierie etah,Nat Rev Cancer.2006；6:506-20)。
TGFβRII的胞外结构域仅长136个氨基酸残基，可结合TGFβ1(Lin et al,J BiolChem.1995；270:2747-54)。可溶TGFβRII-Fc经过作为抗癌剂的实验，并且显示其在鼠模型中可抑制恶性间皮瘤生长(Suzuki et al,Clin Cancer Res.2004；10:5907-18)(Suzuki等，Clin Cancer Res.2004；10:5907-18)。
Merck公司的M7824双功能融合蛋白(中国申请号CN201580007865.3)为抗PDL1抗体Avelumab与TGFβRII通过(G4S)4G连接，其已完成部分I期及II期临床试验，在多种实体瘤中表现良好(MSB0011359C)。
然而，面对患者对于疾病治疗的药物需求，尤其是抗体药物的需求，临床上仍然亟待提供一种结合活性更高、药效更优的抗PDL1的抗体或抗PDL1和TGFβ的双功能融合蛋白。
发明内容
本发明全文中关于VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、LCDR(轻链互补决定区)、HCDR(重链互补决定区)、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3的各个实施方式可以各自单独实施，也可以任意组合实施。
本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段或双功能融合蛋白及其制备方法和用途。
在本发明的一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段，包含3个重链互补决定区，其中HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。进一步地，所述抗体或其抗原结合片段还包含3个轻链互补决定区，其中LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，LCDR2氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在本发明的一方面，本发明提供的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:2所示的重链可变区；优选还含有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区。
在本发明的一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段，包含3个轻链互补决定区，其中LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；和/或3个重链互补决定区，其中HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，HCDR3氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示。
在另一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链可变区，和/或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链可变区。
在另一方面，前述任一方面所述抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的序列为SEQ ID NO:16。
在另一方面，前述任一方面所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的序列为SEQ ID NO:17。
具体地，本发明提供的抗体或其抗原结合片段优选包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链可变区，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链可变区，SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链恒定区和SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链恒定区。或者，本发明提供的抗体或其抗原结合片段优选包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链可变区，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链可变区，SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链恒定区和SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链恒定区。
在另一方面，本发明涉及前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或dsFv片段等。
在另一方面，上述任意一种抗体或其抗原结合片段结合PDL1。
在另一方面，本发明涉及一种双功能融合蛋白，其包括前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段，以及TGFβRII片段，优选地，所述TGFβRII片段包含TGFβRII胞外域。
在另一方面，所述双功能融合蛋白中，前述任一方面所述抗体或其抗原结合片段与TGFβRII片段之间通过接头连接，优选地，所述TGFβRII片段连接在所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的C端，优选通过(G4S)4G(即GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG)接头连接，优选地，所述双功能融合蛋白的重链恒定区的序列为SEQ ID NO:22，优选地，所述双功能融合蛋白的TGFβRII片段的序列为SEQ ID NO:23；具体地，所述双功能融合蛋白结构为：抗体或其抗原结合片段-(G4S)4G-TGFβRII片段。
在另一方面，所述双功能融合蛋白中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的序列为SEQ ID NO:1，重链可变区的序列为SEQ ID NO:2，优选地，所述双功能融合蛋白中，轻链恒定区的序列为SEQ ID NO:16，重链恒定区的序列为SEQ ID NO:22，TGFβRII片段的序列为SEQ ID NO:23；具体地，重链恒定区与TGFβRII片段通过(G4S)4G连接的序列为SEQID NO:18。
在另一方面，所述双功能融合蛋白中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的序列为SEQ ID NO:3，重链可变区的序列为SEQ ID NO:4，优选地，所述双功能融合蛋白中，轻链恒定区的序列为SEQ ID NO:16，重链恒定区的序列为SEQ ID NO:22，TGFβRII片段的序列为SEQ ID NO:23；具体地，重链恒定区与TGFβRII片段通过(G4S)4G连接的序列为SEQID NO:18。
在另一方面，上述任意一种双功能融合蛋白结合PDL1和TGFβ。
在另一方面，本发明涉及一种核酸，其编码前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段或双功能融合蛋白。
在另一方面，本发明涉及一种载体，其包含前一方面所述的核酸，或其可表达前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段或双功能融合蛋白。优选地，所述载体可以是病毒载体；优选地，所述病毒载体包含但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体等；优选地，所述载体可以是非病毒载体；优选地，所述载体可以是哺乳细胞表达载体；优选地，所述表达载体可以是细菌表达载体；优选地，所述表达载体可以是真菌表达载体。
在另一方面，本发明涉及一种细胞，其可表达前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段或双功能融合蛋白的细胞。优选地，所述细胞为细菌细胞；优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞等；优选地，所述细胞为真菌细胞；优选地，所述真菌细胞为酵母细胞；优选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞等；优选地，所述细胞为哺乳动物细胞；优选地，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚胎肾细胞(293)、B细胞、T细胞、DC细胞或NK细胞等。
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段、双功能融合蛋白、核酸、载体或细胞，优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂，优选地，所述药学上可接受的赋形剂包括以下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂等。
在另一方面，所述药物组合物还可以包含其他治疗剂。在一些实施方式中，其他治疗剂包括化疗剂、免疫治疗剂或激素治疗剂。所述抗体或抗原结合片段与其他治疗剂的联合施用能够增强治疗效果。
在另一方面，所述“增强治疗效果”是指增强其他治疗剂或疗法的治疗效果。本发明提供的所述抗体或抗原结合片段可以单独施用，也可以与其他治疗剂或疗法联合施用。在一些实施方式中，其他治疗剂或疗法包括化疗剂、免疫治疗剂、激素治疗剂、放射治疗、手术治疗。
在另一方面，提供一种试剂盒，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或包含双功能融合蛋白，或包含编码抗体或其抗原结合片段或双功能融合蛋白的核酸。
在另一方面，本发明涉及前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段、双功能融合蛋白、核酸、载体或细胞在制备治疗或预防疾病的药物中的应用。
在另一方面，本发明涉及前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段、双功能融合蛋白或核酸在制备诊断或检测试剂盒中的应用。
在另一方面，提供一种治疗或预防疾病的方法，包括将本发明的任一方面所述抗体或抗原结合片段、双功能融合蛋白、核酸、载体、细胞或药物组合物给予有需要的受试者。
在另一方面，提供一种诊断或检测的方法，包括将本发明的任一方面所述抗体或抗原结合片段、双功能融合蛋白、核酸或试剂盒给予有需要的受试者或样本。优选地，所述方法是诊断或检测疾病的方法。
在另一方面，本发明涉及前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段、双功能融合蛋白、核酸、载体、细胞或药物组合物用于治疗或预防疾病的用途。
在另一方面，本发明涉及前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段、双功能融合蛋白、核酸或试剂盒用于检测或诊断的用途。优选地，所述用途是诊断或检测疾病的用途。
在另一方面，所述疾病是癌症。
在另一方面，所述癌症包括胃癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、宫颈癌、肉瘤、细胞瘤、肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤等。
在另一方面，本发明涉及制备前述任一方面所述的抗体或其抗原结合片段或双功能融合蛋白的方法，包括使用上述载体转染细胞，并由转染的细胞表达所述抗体或其抗原结合片段或双功能融合蛋白；或者包括用上述细胞表达所述抗体或其抗原结合片段或双功能融合蛋白。
本发明提供的抗体或抗原结合片段或双功能融合蛋白具有以下一种或多种优势：增强的TGFβ1结合活性、增强的PDL1亲和力、增强的阻断PDL1和PD1结合的能力、增强的阻断TGFβ1功能活性、增强的促进T细胞分泌IFN-γ的能力、更好的免疫调节效果、更好的肿瘤抑瘤效果。
附图说明
图1示出了BoAn-hMab1小鼠五免后血清滴度(2500倍稀释)。
图2示出了双功能融合蛋白与TGFβ1蛋白结合。
图3示出了双功能融合蛋白促进CD4+T分泌IFN-γ。
图4示出了双功能融合蛋白对TGFβ1功能的阻断效应。
图5A示出了MC38-hPD-L1肿瘤模型小鼠体重；图5B示出了MC38-hPD-L1肿瘤模型小鼠肿瘤体积；图5C示出了MC38-hPD-L1肿瘤模型小鼠瘤重。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，举出以下实施例是为了向本发明所属技术领域的一般专业人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的公开和说明，并非用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
材料和试剂：PDL1蛋白(Sinobiological，目录号：10084-H08H)；PD1蛋白(Sinobiological,目录号：10377-H08H)；TGFβ1(Sinobiological,目录号：10804-HNAC)；NaHCO3(国药，10018960)；TMB(北京梅科万德，目录号：1001)；STREP/HRP(R&D，目录号：890803)；HBS-EP+1×缓冲液(GE，目录号：BR-1008-26)；酶标板(苏州海狸，目录号：40301)；生物传感器芯片(GE，目录号：BR100530)；96孔圆底板(Corning，目录号：3799)；抗人IgG Fc氨基偶联试剂盒(GE，cat#BR-1008-39)；
实施例1.抗PDL1和TGFβ的双功能融合蛋白的制备
1.1PDL1蛋白免疫
将PDL1蛋白与弗氏完全佐剂(Sigma，目录号：F5881-10ML)、弗氏不完全佐剂(Sigma，目录号：F5506-10ML)或金佐剂(Sigma，目录号：T2684-1mL)乳化后免疫博安生物全人抗体转基因小鼠BoAn-hMab1(按照中国专利CN103571872B记载的方法制备)。本次共免疫11只小鼠，包括6只雄性和5只雌性，鼠龄为6月-12月，共免疫5次，选取血清滴度较高的6只小鼠用上述PDL1蛋白进行加强免疫。采用ELISA检测的血清滴度(2500倍稀释)见图1。其中PL1Q15、PL1Q16、PL1Q18、PL1Q19、PL1Q21小鼠为弗氏佐剂免疫小鼠，PL1Q24小鼠为金佐剂免疫小鼠。
1.2噬菌体库的建立
处死1.1中血清滴度较高的6只小鼠，解剖取出脾脏，把脾脏用注射器胶塞研磨破碎并用滤网(FALCON，目录号：352350)过滤，把滤过的脾细胞冷冻备用。提取RNA后反转录获得cDNA，噬菌体库的建立步骤参照Carlos F.Barbas III，Phage display：A laboratorymanual中记载的方法进行，用PCR的方法从cDNA中获得重链和轻链的可变区，再将重链和轻链的可变区通过重叠延伸PCR的方法获得单链Fv(scFv)，scFv经SfiI酶(NEB，目录号：#R0123L)酶切后通过T4DNA连接酶(义翘神州)与质粒pCOMB3x(中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，BIOVECTOR510837)连接，然后将连接产物电转染至大肠杆菌TG1感受态细胞(Lucigen，目录号：A96595-2)中，转染后的TG1经37℃220rpm摇床培养后加入噬菌体侵染，然后回收培养物上清浓缩纯化获得噬菌体库。
1.3噬菌体库的筛选
平板筛选：CBS缓冲液的制备：称取Na2CO3(国药，10019260)1.59g、NaHCO3 2.93g加蒸馏水至1L配制成CBS缓冲液。用CBS缓冲液稀释PDL1蛋白至10μg/mL，按100μL/孔加入到筛选平板(Costar，42592)中，每个库用8个孔，4℃放置过夜；第二天弃掉孔板中蛋白溶液，用2％BSA(Solarbio，A8010)封闭平板1h，加入噬菌体库(2x1012/孔)样品37℃孵育2h，用PBST(PBS+0.05％Tween20)洗涤4-10次后，用洗脱缓冲液(向500ml超纯水中加入4.2ml浓盐酸(科密欧)，用甘氨酸粉末(Biotopped，BG0617-500)调节pH至2.2)洗脱PDL1特异结合的噬菌体。
磁珠筛选：将PDL1-mFc蛋白(Acrobiosystems，目录号：PD1-H52A3)进行生物素化(蛋白与生物素摩尔比为1:2)：将PDL1-mFc蛋白换液至0.1M pH8.0NaHCO3中，精密天平称取适量生物素(Thermo，21335)用超纯水溶解，立即向PDL1-mFc蛋白溶液中加入适量溶解后的生物素，在旋转混合仪上避光旋转孵育40min，标记完成后将PDL1-mFc蛋白溶液换液至PBS中。将生物素化的PDL1-mFc蛋白(3μg/库)与磁珠(InvitrogenDynabeads M-280Streptavidin，目录号：00355871)(10μL/库)室温结合1h，经2％BSA封闭后与噬菌体库室温孵育2h，洗涤4-10次后用洗脱缓冲液(pH 2.2)洗脱PDL1特异结合的噬菌体。
噬菌体克隆通过大肠杆菌表达scFv，然后通过ELISA检测scFv对PDL1/PD1结合的阻断，保留阻断活性的克隆进行后续分子构建。
ELISA检测scFv阻断PD1/PDL1的结合：用pH9.6CBS稀释PD1蛋白至0.5μg/mL，包被酶标板，100μL/孔，4℃孵育过夜；洗板后用3％脱脂奶粉于37℃封闭1h。洗板后每孔加入scFv周质50μL。然后加入生物素标记的PDL1-Fc蛋白(终浓度0.2μg/mL)，50μL/孔，37℃孵育1h；洗板后加入PBST稀释的STREP/HRP，100μL/孔，37℃孵育1h。洗板后每孔加入100μL TMB显色，10min后每孔加入50μL 2M H2SO4终止显色，用酶标仪读取OD450。
1.4双功能融合蛋白分子的构建与生产
将磁珠筛选的克隆BA533、BA603、BT613、BA623、BA649、BA669、BA466和平板筛选的克隆BA705送至Invitrogen生物技术有限公司测序。每个克隆的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列记载于表1中。
表1候选克隆的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列(CDR以下划线标出)
Figure BDA0002533895060000051
Figure BDA0002533895060000061
Figure BDA0002533895060000071
通过可变区基因扩增(2*Phanta Max Master Mix，厂家：Vazyme，目录号：P515-AA)、信号肽与可变区重叠延伸、同源重组(ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit，厂家：Vazyme，目录号：C112-01)等方法，最终把编码VH的核苷酸序列片段插入带有编码SEQ IDNO:18的核苷酸序列的载体pCDNA3.4(Life Technology)，其中SEQ ID NO:18包含由(G4S)4G连接的IgG1抗体的重链恒定区序列及TGFβRII序列，把编码VL的核苷酸序列片段插入带有编码抗体轻链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:16)的核苷酸序列的载体pCDNA3.4(LifeTechnology)，然后转染HEK293细胞，并在37℃\8％CO2\125rpm摇床中培养6-7天，最后培养上清通过Protein A填料纯化获得表2中的双功能融合蛋白克隆用于后续检测。
表2抗PDL1-TGFβ的双功能融合蛋白克隆
PLTGBQ19-BA533-IgG1 PLTGBQ24-BA603-IgG1 PLTGBQ16-BA466-IgG1
PLTGBQ21-BA649-IgG1 PLTGBH03-BT613-IgG1 PLTGBQ24-BA705-IgG1
PLTGBQ21-BA669-IgG1 PLTGBQ21-BA623-IgG1 /
对照双功能融合蛋白的生产：Merck公司的M7824双功能融合蛋白为抗PDL1抗体Avelumab与TGFβRII通过(G4S)4G连接，其已完成部分I期及II期临床试验，在多种实体瘤中表现良好。通过IMGT数据库确定Merck公司的Avelumab的可变区氨基酸序列(重链可变区序列为SEQ ID NO:19，轻链可变区序列为SEQ ID NO:20)，全基因合成后插入到载体pCDNA3.4，通过HEK293细胞进行表达，纯化的双功能融合蛋白命名为PLTGB-M7824-IgG1(重链可变区序列为SEQ ID NO:19，轻链可变区序列为SEQ ID NO:20，轻链恒定区序列为SEQID NO:21，重链恒定区及TGFβRII序列为SEQ ID NO:18)。
1.5ELISA检测双功能融合蛋白对PDL1-PD1相互结合的阻断
用pH9.6CBS稀释PD1蛋白至0.5μg/mL，包被酶标板，100μL/孔，4℃孵育过夜；洗板后用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；洗板后分别加入PBST(PBS+0.05％Tween20)稀释不同浓度(0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL、0.03125μg/mL、0.015625μg/mL)双功能融合蛋白，50μL/孔，然后加入标记有生物素的PDL1-Fc蛋白(终浓度0.2μg/mL)，50μL/孔，37℃孵育1h；洗板后加入PBST稀释的STREP/HRP，100μL/孔，37℃孵育1h。洗板后加入TMB显色，10min后每孔加入50μL 2M H2SO4终止显色，酶标仪上读取OD450。结果表明，本发明的候选双功能融合蛋白(PLTGBQ16-BA466-IgG1、PLTGBQ19-BA533-IgG1、PLTGBQ24-BA603-IgG1、PLTGBQ21-BA623-IgG1、PLTGBQ21-BA649-IgG1、PLTGBQ21-BA669-IgG1、PLTGBQ24-BA705-IgG1、PLTGBH03-BT613-IgG1)均能有效阻断PD1与PDL1的结合。
1.6ELISA检测双功能融合蛋白与TGFβ1蛋白结合
用pH9.6CBS稀释TGFβ1至不同浓度(0.2μg/mL、0.05μg/mL、0.0125μg/mL)，分别包被酶标板，100μL/孔，4℃孵育过夜；洗板后用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；洗板后每孔加入100μL PBST(PBS+0.05％Tween20)稀释的候选双功能融合蛋白(1μg/mL)，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP，37℃孵育1h；洗板后加入TMB显色，10min每孔加入50μL 2M H2SO4后终止显色，酶标仪上读取OD450。结果见表3和图2。
候选双功能融合蛋白PLTGBQ19-BA533-IgG1、PLTGBQ21-BA669-IgG1在各个浓度上的OD值均高于对照组PLTGB-M7824-IgG1，说明候选双功能融合蛋白有更好的对TGFβ1有更好的结合能力。
进而预示候选双功能融合蛋白PLTGBQ19-BA533-IgG1、PLTGBQ21-BA669-IgG1相较对照组PLTGB-M7824-IgG1能更好的阻断TGF通路，临床上有更好的免疫调节和抗肿瘤特性。
表3 ELISA检测双功能融合蛋白与TGFβ1蛋白结合数据(对应图2)
Figure BDA0002533895060000081
实施例2双功能融合蛋白的表征
2.1双功能融合蛋白的生产
用ExpiCHO(Thermo，目录号:A29129)表达系统转染并表达双功能融合蛋白，用蛋白A(GE，Mabselect SuRe)柱纯化表达上清：细胞培养液以4500g离心后用0.45μm滤膜过滤，上样后并平衡后用0.1M pH3.2甘氨酸缓冲液洗脱目的双功能融合蛋白，并用pH8.01M Tris进行中和。用分子排阻色谱(上海博格隆，目录号：AG319109)进行精纯：用1.5CV缓冲液平衡柱子，样品上样，样品体积不大于3％CV，用缓冲液继续冲洗，出峰后收集目的双功能融合蛋白。
2.2混合淋巴反应/MLR检测双功能融合蛋白活性
把RPMI 1640(Gibco，目录号：11875-093)、FBS(Gibco，目录号：10091-148)、HEPES(Solarbio，目录号：H1090)按照90:10:1混合以配制完全培养基，分别用完全培养基重悬DC细胞(ALLCELLS，目录号：PB-DC001F-0.3M)和CD4+T细胞(ALLCELLS，目录号：PB009-2F-C-3M)，按1:10细胞比例加入到96孔圆底板中，最终体积150μL/孔。用完全培养基把双功能融合蛋白稀释2个浓度：4μg/mL、0.4μg/mL，分别加入细胞孔中，50μL/孔，最终体积200μL。培养5天后，用IFN-γ试剂盒(cisbio，目录号：62HIFNGPEG)检测培养上清。检测结果见表4和图3。
候选双功能融合蛋白PLTGBQ19-BA533-IgG1、PLTGBQ21-BA669-IgG1在相同浓度上的IFN-γ分泌值均高于对照组PLTGB-M7824-IgG1。
进而预示候选双功能融合蛋白PLTGBQ19-BA533-IgG1、PLTGBQ21-BA669-IgG1相较对照组PLTGB-M7824-IgG1可能有更好的免疫调节和抗肿瘤特性。
表4混合淋巴反应/MLR检测双功能融合蛋白活性数据(对应图3)
Figure BDA0002533895060000082
Figure BDA0002533895060000091
2.3SPR检测双功能融合蛋白与PDL1蛋白的亲和力
抗体结合动力学使用BIAcore8K仪器检测。通过抗人IgG Fc氨基偶联试剂盒将抗人IgG抗体偶联到CM5生物传感器芯片上以获得约1000RU(应答单位)。把PDL1用HBS-EP+1×缓冲液稀释至50nM，然后2倍稀释，共5个浓度(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM)，并设置空白对照。测定步骤及条件如下：双功能融合蛋白进样2μg/mL，进样时间70s，流速5μL/min，稳定5s；PDL1蛋白结合与解离：结合60s，流速30μL/min，解离450s；再生：用3M MgCl2缓冲液再生30s，启动3次。使用一对一Languir模型(BIAcore Evaluation Software version3.2)计算结合常数(ka)和解离常数(kd)，由kd/ka计算得到平衡解离常数KD。各双功能融合蛋白亲和力数据见表5。
结果表明，本发明的候选双功能融合蛋白PLTGBQ19-BA533-IgG1和PLTGBQ21-BA669-IgG1与对照组PLTGB-M7824-IgG1有基本相当的PDL1亲和力。其中PLTGBQ19-BA533-IgG1的PDL1亲和力优于对照组。
表5双功能融合蛋白与PDL1蛋白亲和力
名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
PLTGBQ16-BA466-IgG1 1.14E+06 2.32E-03 2.03E-09
PLTGBQ19-BA533-IgG1 1.50E+06 7.95E-04 5.29E-10
PLTGBQ24-BA603-IgG1 1.70E+06 1.64E-03 9.63E-10
PLTGBQ21-BA623-IgG1 1.34E+06 1.79E-03 1.34E-09
PLTGBQ21-BA649-IgG1 1.85E+06 1.67E-03 9.04E-10
PLTGBQ21-BA669-IgG1 1.78E+06 1.36E-03 7.64E-10
PLTGBQ24-BA705-IgG1 1.45E+06 8.37E-04 5.77E-10
PLTGBH03-BT613-IgG1 1.39E+06 1.01E-03 7.30E-10
PLTGB-M7824-IgG1 4.98E+05 3.00E-04 6.03E-10
2.4用MV-1-Lu细胞检测双功能融合蛋白对TGFβ1功能的阻断效应
把EMEM(ATCC，目录号：30-2003)、FBS(Gibco，目录号：10099-141)、HEPES(Solarbio，目录号：H1090)按照90:10:1混合以配制完全培养基，用完全培养基重悬MV-1-Lu细胞，加入到白色96孔板中(Corning，目录号：3917)，50μL/孔，2000细胞/孔。用完全培养基稀释双功能融合蛋白至333.3ng/mL，然后依次3倍稀释，共6个浓度，加入到细胞孔中，25μL/孔。用完全培养基把TGFβ1稀释至2ng/mL，加入到细胞孔中，25μL/孔。双功能融合蛋白终浓度：83.3ng/mL、27.8ng/mL、9.26ng/mL、3.09ng/mL、1.03ng/mL、0.34ng/mL。培养4天后用CellTiter-Glo试剂盒(Promega，目录号：G7571)检测96孔板中的荧光值(该荧光值可代表细胞数)，检测结果见图4。
可以看出，候选双功能融合蛋白PLTGBQ19-BA533-IgG1、PLTGBQ21-BA669-IgG1相对于对照组PLTGB-M7824-IgG1，有更好的阻断TGFβ1功能的活性。
进而预示候选双功能融合蛋白PLTGBQ19-BA533-IgG1、PLTGBQ21-BA669-IgG1相较对照组PLTGB-M7824-IgG1能更好的阻断TGF通路，有更好的免疫调节和抗肿瘤特性。
实施例3抗PD-L1单抗在小鼠MC38-hPDL1结肠癌模型中的药效测试
构建双功能融合蛋白对应的IgG1单抗，PLTGBQ19-BA533-IgG1对应单抗为BA533-IgG1(重链可变区序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区序列为SEQ ID NO:1，轻链恒定区序列为SEQ ID NO:16，重链恒定区序列为SEQ ID NO:17)；PLTGBQ21-BA669-IgG1对应单抗为BA669-IgG1(重链可变区序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区序列为SEQ ID NO:3，轻链恒定区序列为SEQ ID NO:16，重链恒定区序列为SEQID NO:17)；PLTGB-M7824-IgG1对应单抗为Avelumab(重链可变区序列为SEQ ID NO:19，轻链可变区序列为SEQ ID NO:20，轻链恒定区序列为SEQ ID NO:21，重链恒定区序列为SEQ ID NO:17)。
小鼠结肠癌MC38-hPD-L1细胞购买自北京百奥赛图基因生物技术有限公司。培养条件为DMEM(Gibco,目录号：11965-092)培养基中加10％FBS(Gibco,目录号：10099-141C)、1％P/S(Gibco,目录号：15070-063)，37℃、5％CO2培养箱培养。一周传代2-3次。B-hPD-L1人源化小鼠，雌性，6-8周龄，购买自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。
收集状态良好的MC38-hPD-L1细胞，PBS重悬混匀，调整细胞浓度至5×106/ml，将0.1ml细胞悬液接种于每只小鼠的前肢背侧皮下。当肿瘤平均体积达到87mm3时开始随机分组。共7组，每组6只，分组当天开始给药，用PBS稀释抗PD-L1单抗，每种抗体两个剂量：3mg/kg、10mg/kg，腹腔注射，每2天给药一次，溶剂对照组给予相同体积的PBS作为对照。每周测量小鼠称重、肿瘤体积2-3次，肿瘤体积(mm3)＝0.5×长径×短径2。当对照组肿瘤体积达到2000mm3时，对小鼠实行安乐死，剥取肿瘤进行称重。结果见图5A、图5B、图5C及表6、表7。
如图5A所示，小鼠体重稳定增长，无不良反应出现。
如图5B和7C所示，BA533-IgG1、BA669-IgG1、Avelumab给药剂量为10mg/kg时，均可显著抑制小鼠MC38-hPD-L1肿瘤的生长，相对肿瘤抑制率TGI(％)≥80％，三者之间没有统计学差异。BA533-IgG1、BA669-IgG1、Avelumab给药剂量为3mg/kg时，BA533-IgG1和BA669-IgG1的肿瘤抑制率优于Avelumab。
上述结果说明，低剂量下，候选抗体较对照抗体有更好的抑瘤效果，高剂量也具有相当的抑瘤效果。
表6 MC38-hPD-L1肿瘤模型小鼠肿瘤体积数据(平均值±SEM)(对应图5B)
组 重点肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)
Vehicle(Q2D,i.p.) 1972±224
BA533-IgG1(3mg/kg,Q2D,i.p.) 780±185
BA669-IgG1(3mg/kg,Q2D,i.p.) 679±113
Avelumab(3mg/kg,Q2D,i.p.) 969±208
BA533-IgG1(10mg/kg,Q2D,i.p.) 465±131
BA669-IgG1(10mg/kg,Q2D,i.p.) 392±83
Avelumab(10mg/kg,Q2D,i.p.) 408±90
表7 MC38-hPD-L1肿瘤模型瘤重数据(平均值±SEM)(对应图5C)
组 终点瘤重(g)
Vehicle(Q2D,i.p.) 2.12±0.24
BA533-IgG1(3mg/kg,Q2D,i.p.) 0.92±0.26
BA669-IgG1(3mg/kg,Q2D,i.p.) 0.77±0.13
Avelumab(3mg/kg,Q2D,i.p.) 1.22±0.33
BA533-IgG1(10mg/kg,Q2D,i.p.) 0.46±0.12
BA669-IgG1(10mg/kg,Q2D,i.p.) 0.39±0.08
Avelumab(10mg/kg,Q2D,i.p.) 0.42±0.09
序列表
<110> 山东博安生物技术有限公司
<120> 抗PDL1和TGFβ的双功能融合蛋白及其用途
<150> 201910497064.X
<151> 2019-06-10
<150> 201910497723.X
<151> 2019-06-10
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 2
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Thr Tyr Ala Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Trp Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Asn
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Thr Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Trp Ala Ser
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ile Thr Tyr Ala Gly Ser Asn Glu
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ala Arg Asp Arg Ile Trp Val Asp Tyr
1 5
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Gln Ser Val Leu Tyr Asn Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Gln Gln Tyr Tyr Ser Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 17
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 18
<211> 487
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile
340 345 350
Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp
355 360 365
Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val
370 375 380
Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser
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Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp
405 410 415
Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu
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Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
485
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
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1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
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<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
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Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
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Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
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Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
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<210> 22
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala
325 330
<210> 23
<211> 136
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
1 5 10 15
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
20 25 30
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
50 55 60
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
65 70 75 80
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
85 90 95
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
115 120 125
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
130 135

Claims (13)

1.一种PDL1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含 3个重链互补决定区和3个轻链互补决定区，其中，所述3个重链互补决定区包含如SEQ ID NO: 8所示的HCDR1，如SEQ ID NO: 9所示的HCDR2，如SEQ ID NO: 10所示的HCDR3；所述3个轻链互补决定区包含如SEQ ID NO: 5所示的LCDR1，如SEQ ID NO: 6所示的LCDR2，如SEQ ID NO: 7所示的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的PDL1抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或dsFv片段。
3.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO: 2所示的重链可变区，以及SEQ ID NO: 1所示的轻链可变区。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或dsFv片段。
5.根据权利要求3或4所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合PDL1。
6.一种双功能融合蛋白，所述双功能融合蛋白包括抗体或其抗原结合片段，以及TGFβRII片段，所述抗体或其抗原结合片段与所述TGFβRII片段通过接头连接；
其中，所述抗体或其抗原结合片段为权利要求1或2所述的PDL1抗体或其抗原结合片段，或权利要求3-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
7.一种核酸，所述核酸编码权利要求1或2所述的PDL1抗体或其抗原结合片段，或权利要求3-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求6所述的双功能融合蛋白。
8.一种细胞，所述细胞表达权利要求1或2所述的PDL1抗体或其抗原结合片段，或权利要求3-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求6所述的双功能融合蛋白。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的PDL1抗体或其抗原结合片段，或权利要求3-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求6所述的双功能融合蛋白，或权利要求7所述的核酸，或权利要求8所述的细胞。
10.一种试剂盒，其包含权利要求1或2所述的PDL1抗体或其抗原结合片段，或权利要求3-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求6所述的双功能融合蛋白，或权利要求7所述的核酸。
11.权利要求1或2所述的PDL1抗体或其抗原结合片段，或权利要求3-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求6所述的双功能融合蛋白，或权利要求7所述的核酸在制备治疗、预防、检测或诊断疾病的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，所述疾病是癌症。
13.根据权利要求12所述的应用，所述癌症选自胃癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、宫颈癌、肉瘤、细胞瘤、肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。
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