CN114790242A - 一种结合人pd-l1的抗体 - Google Patents

一种结合人pd-l1的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN114790242A
CN114790242A CN202210040098.8A CN202210040098A CN114790242A CN 114790242 A CN114790242 A CN 114790242A CN 202210040098 A CN202210040098 A CN 202210040098A CN 114790242 A CN114790242 A CN 114790242A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
antibody
val
thr
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210040098.8A
Other languages
English (en)
Inventor
朱祯平
赵杰
黄浩旻
夏梦莹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zi Da Biological Medicine Co ltd
Original Assignee
Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd filed Critical Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Publication of CN114790242A publication Critical patent/CN114790242A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

本发明提供了一种结合人PD‑L1的抗体，以及基于所述的结合人PD‑L1的抗体构建的抗PD‑1和PD‑L1的四价双特异性抗体。本发明的四价双特异性抗体不需要进行Fc修饰，不会产生错配问题，制备方法简便，具有与单抗相似甚至更优的生物学活性和理化性质。

Description

一种结合人PD-L1的抗体
本申请为2021年04月19日提交的202180003496.6的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明公开了一种抗PD-1和PD-L1的四价双特异性 抗体。
背景技术
人程序性细胞死亡受体-1(PD-1)是一种有288个氨基酸的I型膜蛋白，是已知的主要 免疫检查点(Immune Checkpoint)之一(Blank et al,2005,Cancer Immunotherapy,54:307-314)。 PD-1表达在已经激活的T淋巴细胞，它与配体PD-L1(程序性细胞死亡受体-配体1， programmed cell death-Ligand 1)和PD-L2(程序性细胞死亡受体-配体2，programmed cell death-Ligand 2)结合可以抑制T淋巴细胞的活性及相关的体内细胞免疫反应。PD-L2主要表 达在巨噬细胞和树突状细胞，而PD-L1则广泛表达于B、T淋巴细胞及外周细胞如微血管上 皮细胞，肺、肝、心等组织细胞中。大量研究表明，PD-1和PD-L1的相互作用不但是维持体 内免疫系统平衡所必须，也是导致PD-L1表达阳性肿瘤细胞规避免疫监视的主要机制和原因。 通过阻断癌细胞对PD-1/PD-L1信号通路的负调控，激活免疫系统，能够促进T细胞相关的 肿瘤特异性细胞免疫反应，从而打开了一扇新的肿瘤治疗方法的大门--肿瘤免疫疗法。
PD-1(由基因Pdcd1编码)为与CD28和CTLA-4有关的免疫球蛋白超家族成员。研究成果显示，当PD-1与其配体(PD-L1和/或PD-L2)结合时会负调节抗原受体信号转导。目 前已弄清鼠PD-1结构以及小鼠PD-1与人PD-L1的共结晶结构(Zhang，X.等，Immunity 20：337-347(2004)；Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：3011-6(2008))。PD-1及类似的家族成员 为I型跨膜糖蛋白，其含有负责配体结合的Ig可变型(V-型)结构域和负责结合信号转导分 子的胞质尾区。PD-1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体ITIM(免疫受体酪氨酸 抑制作用模体)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。
PD-1在肿瘤的免疫逃避机制中起到了重要的作用。肿瘤免疫疗法，即利用人体自身的免 疫系统抵御癌症，是一种突破性的肿瘤治疗方法，但是肿瘤微环境可保护肿瘤细胞免受有效 的免疫破坏，因此如何打破肿瘤微环境成为抗肿瘤研究的重点。现有研究成果已确定了PD-1 在肿瘤微环境中的作用：PD-L1在许多小鼠和人肿瘤中表达(并在大多数PD-L1阴性肿瘤细 胞系中可由IFNγ诱导)，并被推定为介导肿瘤免疫逃避的重要靶点(Iwai Y.等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：12293-12297(2002)；Strome S.E.等，Cancer Res.，63： 6501-6505(2003))。通过免疫组织化学评估活组织检查，已经在人的很多原发性肿瘤中发现 PD-1(在肿瘤浸润淋巴细胞上)和/或PD-L1在肿瘤细胞上的表达。这样的组织包括肺癌、肝 癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃 癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌和胰腺癌以及头颈肿瘤等。由此可见，阻断PD-1/PD-L1 的相互作用可以提高肿瘤特异性T细胞的免疫活性，有助于免疫系统清除肿瘤细胞，因此PD-1 和PD-L1成为开发肿瘤免疫治疗药物的热门靶点。
双特异性抗体是指能同时特异性结合两种抗原或两种表位的抗体分子。根据对称性，双 特异性抗体可以分为结构对称的和不对称的分子。根据结合位点的多少，双特异性抗体可以 分为二价、三价、四价和多价分子。双特异性抗体正在逐步成为一类新的治疗性抗体，可以 用于治疗各种炎性疾病、癌症和其它疾病。虽然最近报道了大量新的双特异性抗体的构造形 式，然而，生产双特异性抗体的主要技术难点在于获得正确配对的分子。目前现有的双特异 性抗体的形式均存在错配的问题，因此会产生一种或多种错配导致的副产物或者聚集体，从 而影响目的双特异性抗体的产率、纯度和理化稳定性，进而影响双特异性抗体在体内的安全 性和有效性。
发明内容
本发明提供了一种结合人PD-L1的抗体，以及基于所述的结合人PD-L1的抗体构建的抗 PD-1和PD-L1的四价双特异性抗体。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第二个目的在于提供一种编码所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段的 分离的核苷酸。
本发明的第三个目的在于提供一种包含所述的核苷酸的表达载体。
本发明的第四个目的在于提供一种包含所述的表达载体的宿主细胞。
本发明的第五个目的在于提供所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段的制备方法。
本发明的第六个目的在于提供包含所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段的药物 组合物。
本发明的第七个目的在于提供所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段或所述的药 物组合物在制备治疗PD-L1过表达的疾病的药物中的用途。
本发明的第八个目的在于提供所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段或所述的药 物组合物用于治疗PD-L1过表达的疾病的方法。
本发明的第九个目的在于提供一种抗PD-1和PD-L1的四价双特异性抗体。
本发明的第十个目的在于提供一种编码所述的四价双特异性抗体的分离的核苷酸。
本发明的第十一个目的在于提供一种包含所述的核苷酸的表达载体。
本发明的第十二个目的在于提供一种包含所述的表达载体的宿主细胞。
本发明的第十三个目的在于提供所述的四价双特异性抗体的制备方法。
本发明的第十四个目的在于提供包含所述的四价双特异性抗体的药物组合物。
本发明的第十五个目的在于提供所述的四价双特异性抗体或所述的药物组合物在制备治 疗癌症的药物中的用途。
本发明的第十六个目的在于提供所述的四价双特异性抗体或所述的药物组合物用于治疗 癌症的方法。
为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明的第一个方面提供了一种结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，包括：
(a)重链互补决定区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述的H-CDR1的氨基酸序列如 SEQID NO：17所示，所述的H-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，所述的H-CDR3 的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，和
(b)轻链互补决定区L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述的L-CDR1的氨基酸序列如SEQID NO：20所示，所述的L-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，所述的L-CDR3的 氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
根据本发明，所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
根据本发明，所述的抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
根据本发明，所述的抗原结合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段或单链抗体。
根据本发明，所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列 如SEQ ID NO：9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
根据本发明，所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
本发明的第二个方面提供了一种分离的核苷酸，所述的核苷酸编码如上所述的结合人 PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
根据本发明，编码所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段的重链的核苷酸序列如 SEQ ID NO：14所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
本发明的第三个方面提供了一种表达载体，所述的表达载体含有如上所述的核苷酸。
本发明的第四个方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如上所述的表达载体。
本发明的第五个方面提供了所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段的制备方法， 其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而表达所述的结合人PD-L1的抗体 或其抗原结合片段；
(b)分离并纯化(a)所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第六个方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的结合人 PD-L1的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
本发明的第七个方面提供了所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段或如上所述的 药物组合物在制备治疗PD-L1过表达的疾病的药物中的用途。
根据本发明，所述的PD-L1过表达的疾病为癌症。优选的，所述的癌症选自由以下组成 的组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤及其 它赘生性恶性疾病等。
本发明的第八个方面提供了一种治疗PD-L1过表达的疾病的方法，包括向有需要的受试 者施用如上所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段或如上所述的药物组合物。
根据本发明，所述的PD-L1过表达的疾病为癌症。优选的，所述的癌症选自由以下组成 的组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤及其 它赘生性恶性疾病等。
本发明的第九个方面提供了一种抗PD-1和PD-L1的四价双特异性抗体，包含两条多肽 链和四条共同轻链，其中，所述多肽链具有如SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，所述共同轻链具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
本发明的第十个方面提供了一种分离的核苷酸，所述的核苷酸编码所述的四价双特异性 抗体。
根据本发明的优选实施例，所述的核苷酸编码所述多肽链和所述共同轻链，其中，编码 所述多肽链的核苷酸序列如SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32所示，编码所述共同轻链的 核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
本发明的第十一个方面提供了一种表达载体，所述的表达载体含有如上所述的核苷酸。
本发明的第十二个方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如上所述的表达载体。
本发明的第十三个方面提供了所述的四价双特异性抗体的制备方法，所述方法包含以下 步骤：
(a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而表达所述的四价双特异性抗体；
(b)分离并纯化(a)所述的四价双特异性抗体。
本发明的第十四个方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的四价双 特异性抗体和药学上可接受的载体。
本发明的第十五个方面提供了所述的四价双特异性抗体或如上所述的药物组合物在制备 治疗癌症的药物中的用途。
根据本发明，所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺 癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质 细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤及其它赘生性恶性疾病等。
本发明的第十六个方面提供了一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用如上所 述的四价双特异性抗体或如上所述的药物组合物。
根据本发明，所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺 癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质 细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤及其它赘生性恶性疾病等。
有益效果：
本发明提供了一种结合人PD-L1的抗体，以及基于所述的结合人PD-L1的抗体构建的抗PD-1和PD-L1的四价双特异性抗体。本发明的四价双特异性抗体不需要进行Fc修饰，不会 产生错配问题，制备方法简便，具有与单抗相似甚至更优的生物学活性和理化性质。
附图说明
图1为本发明的双特异性抗体的结构示意图，其中，VH-A表示Anti-PDL1或609的重链可变区，VH-B表示609或Anti-PDL1的重链可变区，VL表示共同轻链的轻链可变区，CH1、CH2和CH3是重链恒定区的三个结构域，CL是共同轻链的轻链恒定区，两条重链之间的线 段表示二硫键，重链和轻链之间的线段也表示二硫键，靠近多肽链N末端的CH1和VH-A之 间的线段表示人工设计的连接子，靠近多肽链C末端的CH1和CH2之间的线段表示抗体天 然的连接子和铰链区(如果重链是人IgG4亚型，铰链区会含有S228P点突变，根据EU编码)。
图2为ELISA检测Anti-PDL1对PD-L1的相对亲和力结果。
图3为测定Anti-PDL1阻断PD-1/PD-L1相互作用能力的结果。
图4A和图4B为评估Anti-PDL1增强MLR的能力的结果。
图5A和图5B为Anti-PDL1和609及其杂合抗体的ELISA结果。
图6A和图6B为PDL1-Fab-609-IgG4和609-Fab-PDL1-IgG4的ELISA结果。
图7A～图7D为评估609-Fab-PDL1-IgG4增强MLR的能力的结果。
图8A和图8B为609-Fab-PDL1-IgG4的药代动力学结果。
图9A和图9B为609-Fab-PDL1-IgG4的HPLC-SEC图谱。
图10A～图10D为609-Fab-PDL1-IgG4的CE-SDS图谱。
图11A和图11B为609-Fab-PDL1-IgG4的HPLC-IEC图谱。
图12A和图12B为609-Fab-PDL1-IgG4的DSC图谱。
图13为609-Fab-PDL1-IgG4的分子量质谱图谱。
图14为609-Fab-PDL1-IgG4双特异性抗体在小鼠体内的抗肿瘤作用。
具体实施方式
本发明中涉及的序列信息总结在表1中。
表1、本发明的抗体的序列信息
Figure BDA0003469519280000051
Figure BDA0003469519280000061
本发明中，术语“抗体(Antibody，缩写Ab)”和“免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，缩写IgG)”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型(isotype)的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫 键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是恒定区，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区，轻链恒定区包括一个结 构域CL；轻链的恒定区与重链恒定区的CH1结构域配对，轻链的可变区与重链的可变区配 对。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体 依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity)等。 重链恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型；轻链恒定区包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。 抗体的重链和轻链通过重链的CH1结构域和轻链的CL结构域之间的二硫键共价连接在一起， 抗体的两条重链通过铰链区之间形成的多肽间二硫键共价连接在一起。本发明的抗体包括单 克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体的 抗原结合片段等。本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体等。
本发明中，术语“双特异性抗体(双抗)”是指能同时特异性结合两种抗原(靶点)或两 种表位的抗体分子。
本发明中，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体 中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地 针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同抗原决定簇的不同 抗体的混合物)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单 克隆抗体的好处还在于它们可以通过杂交瘤培养来合成，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰 语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用 任何特殊方法来生产抗体。
本发明中，术语“鼠源抗体”是指来源于大鼠或小鼠的抗体，优选小鼠。本发明的鼠源 抗体为使用人PD-L1的胞外域为抗原免疫小鼠并进行杂交瘤细胞筛选获得。
本发明中，术语“嵌合抗体”是指包含来源于一个物种的重和轻链可变区序列以及来源于 另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重链可变区和轻链可变区的 抗体。
本发明中，术语“人源化抗体”是指其CDR来源于非人物种(优选小鼠)抗体，抗体分子中残余的部分(包括框架区和恒定区)来源于人抗体。此外，框架区残基可被改变以维持结合亲和性。
本发明中，术语“抗原结合片段”是指能够与人PD-L1表位特异性结合的抗体的片段。 本发明的抗原结合片段的例子包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链抗体(scFv)。Fab片段是由抗体的重链的VH和CH1以及轻链的VL和CL结构域组成。F(ab’)2片段是用 胃蛋白酶消化抗体产生的片段。Fv片段是由抗体的重链可变区和轻链可变区紧密非共价关联的二聚物组成。单链抗体(scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。
本发明中，术语“Fc”即可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗体的CH2和CH3 结构域组成。Fc段无抗原结合活性，是抗体与效应分子或细胞相互作用的部位。
本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种 特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。 它集中于重链可变区和轻链可变区中称为互补决定区(complementarity-determining region， CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(frame region，FR)。 天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环 的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密 地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等， NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。
本发明中，术语“抗”和“结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针 对的抗原之间的反应。通常，抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更小的平衡解离常数(KD)结合该抗原。本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗 原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。例如，使用表面等离子体共振术(Surface Plasmon Resonance，缩写SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。
本发明中，术语“价”是指抗体分子中存在指定数量的抗原结合位点。优选的，本发明 的双特异抗体具有四个抗原结合位点，是四价的。本发明中，抗原结合位点包含重链可变区 (VH)和轻链可变区(VL)。
本发明中，术语“表位”是指与抗体特异性结合的多肽决定簇。本发明的表位是抗原中 被抗体结合的区域。
本发明中，术语“共同轻链”是指包含相同的轻链可变区和轻链恒定区的轻链，其能够 与结合第一抗原的第一抗体的重链配对，形成特异性结合第一抗原的结合位点，也能够与结 合第二抗原的第二抗体的重链配对，形成特异性结合第二抗原的结合位点。进一步的，共同 轻链的轻链可变区与第一抗体的重链可变区形成第一抗原结合位点，共同轻链的轻链可变区 与第二抗体的重链可变区形成第二抗原结合位点。
本发明中，术语“表达载体”可以为pTT5，pSECtag系列，pCGS3系列，pcDNA系列 载体等，以及其它用于哺乳动物表达系统的载体等，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
本发明中，术语“宿主细胞”是指适用于表达上述表达载体的细胞，可以是真核细胞， 如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达，CHO(中国仓鼠卵 巢，Chinese Hamster Ovary)，HEK293，COS，BHK以及上述细胞的衍生细胞均可适用于本 发明。
本发明中，术语“药物组合物”是指本发明的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段或 双特异性四价抗体可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥 疗效，这些制剂可以保证本发明公开的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段或双特异性四 价抗体的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但 不限于凝聚、脱氨或氧化)。
以下实施例中使用的蛋白表达和纯化方法说明如下：将目的基因构建到表达载体pcDNA4中，利用PEI(Polyethylenimine)将构建好的表达载体或表达载体的组合转入FreeStyleTM293-F Cells细胞(后文简称HEK293F，购自Thermo Fisher Scientific)中以表达抗 体或重组蛋白，HEK293F细胞在Free Style 293Expression Medium(购自ThermoFisher Scientific)中培养5天后收取细胞上清，然后用ProteinA亲和层析或镍亲和层析纯化抗体或 重组蛋白。
以下实施例中使用的混合淋巴细胞反应(Mixed Lymphocyte Reaction，MLR)的方法说 明如下：用Histopaque(购自Sigma)从人血液中分离出外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，缩写PBMC)，然后通过贴壁法将PBMC中的单核细胞分离出来，然后用 IL-4(25ng/ml)和GM-CSF(25ng/ml)诱导单核细胞分化成树突状细胞。七天之后，消化收 集上述诱导的树突状细胞。用上述方法从另外供体的血液中分离出PBMC，然后用MACS磁 铁和CD4 MicroBeads(购自Miltenyibiotec)从PBMC中分离CD4+T细胞。将诱导的树突状 细胞(104/孔)和分离出的CD4+T细胞(105/孔)按比例混匀后接种到96孔板中，每孔150μl； 数小时后，在上述96孔板中加入50μl梯度稀释的抗体；将96孔板置于37℃细胞培养箱中孵 育3天。上述实验过程中使用AIM-V培养基(购自Thermo Fisher Scientific)培养细胞。然 后按照标准操作流程检测IL-2和IFN-γ的分泌。IL-2和IFN-γ的检测使用双抗夹心ELISA(相 关配对抗体购自BD Biosciences)。用酶标仪(SpectraMax 190)读取OD450，用GraphPad Prism6 进行作图并计算EC50。
以下实施例中使用的理化性质检测方法说明如下：
HPLC-SEC
抗体是高分子量蛋白质，具有高度复杂的二级和三级结构。由于翻译后修饰、聚集和降 解等变化，抗体在生物化学和生物物理特性方面是异质的。当通过分离技术分析双特异性抗 体时，通常会观察到变体、聚集体和降解片段，它们的存在可能会损害安全性和有效性。在 生产和存储抗体的过程中容易出现聚集体、降解片段和不完整组装的分子。本发明使用高效 液相色谱-尺寸排阻色谱(High-performance liquid chromatography–sizeexclusion chromatography，HPLC-SEC)检测样品中上述杂质的含量。聚集体的分子量要大于单体，因 此相应峰的保留时间较短；降解片段或不完整组装分子的分子量要小于单体，因此相应峰的 保留时间较长。HPLC-SEC所用色谱仪为Dionex Ultimate 3000；流动相配制方法如下：取适 量20mM磷酸二氢钠母液，用20mM磷酸氢二钠调节PH至6.8±0.1；进样量：20μg；色谱柱 为TSK G3000SWXL，规格为7.8×300mm 5μm；流速0.5ml/min，洗脱时间30min；柱温25℃， 样品室温度10℃；检测波长214nm。
HPLC-IEC
许多翻译后修饰(例如N糖基化、C末端赖氨酸残基修饰、N末端谷氨酰胺或谷氨酸环 化、天冬酰胺脱酰胺化、天冬氨酸异构化和氨基酸残基氧化等)会直接或间接地引起抗体表 面电荷的改变，导致电荷异质性的产生。基于所带电荷可对电荷变体进行分离和分析，常用 的分析方法有阳离子交换色谱法(cation exchange chromatography，CEX)和阴离子交换色谱 法(anionexchange chromatography，AEX)。当通过基于色谱法的方法分析时，酸性种类(acidic species)和碱性种类(basic species)基于它们相对于主峰(mainpeak)的保留时间来定义。 酸性种类是早于CEX的主峰或晚于AEX的主峰洗脱出来的变体，而碱性种类是晚于CEX的 主峰或早于AEX的主峰洗脱出来的变体。酸性种类和碱性种类所对应的峰分别称作酸性峰和 碱性峰。在生产和存储抗体的过程中容易产生电荷变体。在此使用高效液相色谱-离子交换色 谱(High-performance liquid chromatography-ionexchange chromatography，HPLC-IEC)分析样 品的电荷异质性。HPLC-IEC所用色谱仪为Dionex Ultimate 3000；流动相A：20mM PB pH6.3， 流动相B：20mM PB+200mM NaClpH6.3，两种流动相混合的比例按照预先设置的程序随时 间而改变，流速1.0ml/min；色谱柱：Thermo PropacTM WCX-10；柱温30℃，样品室温度10℃； 进样量：20μg；检测波长：214nm。
CE-SDS
本发明使用CE-SDS(Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate)分析样品中降解 片段或不完整组装的分子的含量。CE分为非还原和还原两种类型，用于前者的样品在变性时 不需要用还原剂DTT将分子内的二硫键破坏，而用于后者的样品在变性时需要用还原剂DTT 将分子内的二硫键破坏。非还原和还原CE-SDS分别记作NR-CE-SDS和R-CE-SDS。所用毛 细管电泳仪为ProteomeLabTM PA800 plus(Beckman Coulter)，配备UV214nm检测器，毛细 管型号为Bare Fused-Silica Capillary，规格30.7cm×50μm，有效长度20.5cm；其它相关试剂 购自Beckman Coulter。仪器关键参数设置如下：毛细管和样品室温度为20±2℃，分离电压为 15kV。
DSC
差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimeter，DSC)主要通过在可控的升温或降温 过程检测生物分子中的热量变化来反映样品的热稳定性。通过加热，蛋白样品的去折叠会吸 收热量，而消除样品池温差所需的补充能量则通过设备记录下来，这些热量变化会在图谱上 形成一个峰形，其中蛋白质样品发生去折叠时所对应的峰顶温度作为熔融温度Tm。Tm是蛋 白热稳定性的一个重要指示，Tm越高，蛋白的稳定性越好。
分子量检测
用PNGase F和内切糖苷酶F2处理抗体以去糖基化。UPLC-XEVO G2 Q-TOF液质联用系统(Waters)用于样品分子量的分析和鉴定。流动相A是含有0.1％三氟乙酸(TFA)的 HPLC级水。流动相B是含有0.1％TFA的乙腈。在检测完整分子量的方法中，使用的色谱柱 为MassPREPTM Micro Desalting Column(规格2.1×5mm)。关键参数设置如下，柱温：80℃； 流动相流速：0.2mL/min；流动相梯度：流动相B在1.5min内从5％升至90％；ESI源温度： 130℃。BiopharmaLynx v1.2(Waters)用于控制液质联用系统和收集数据，质谱信号用BiopharmaLynx v1.2解卷积。
以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施 例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插 入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有 普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch, E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd edition， Cold spring Harbor Laboratory Press。
实施例1人源化抗人PD-L1抗体的制备
实施例1.1 PD-1和PD-L1重组蛋白的制备
PD-1和PD-L1的胞外区编码基因来源如WO2018/137576A1中所述。利用基因重组技术， 在PD-1和PD-L1的胞外区编码基因末端分别连接多聚组氨酸编码序列，然后将重组基因分 别克隆到pcDNA4表达载体中，表达并纯化重组蛋白，所得重组蛋白分别命名为PD1-His和 PD-L1-His。利用基因重组技术，在PD-1和PD-L1的胞外区编码基因末端分别连接人IgG1 的Fc段编码序列，然后将重组基因分别克隆到pcDNA4表达载体中，表达并纯化重组蛋白， 所得重组蛋白分别命名为PD1-ECD-hFc和PD-L1-ECD-hFc。
实施例1.2鼠源抗人PD-L1单克隆抗体的制备
利用上述PD-L1-ECD-hFc作为抗原免疫Balb/c小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司)。 免疫小鼠、滴度检测和杂交瘤克隆筛选的方法参照WO2018/137576A1中实施例2所述。ELISA 筛选杂交瘤阳性克隆的方法如下：用上述PD-L1-His包被酶标板，包被浓度为10ng/孔，用含 有1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBST(KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween-20 0.5ml，加纯水至1L)封闭酶标板。将待测抗体进行梯 度稀释，然后转移到上述包被重组蛋白的酶标板中，室温孵育半小时后洗板；加入适当稀释 的HRP(Horseradish Peroxidase)标记的羊抗鼠抗体(Fc-Specific)(购自Sigma)，室温孵育 半小时后洗板；每孔加入100μl以TMB(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)为底物的显色液(底 物显色A液：醋酸钠·三水13.6g，柠檬酸·一水1.6g，30％双氧水0.3ml，纯水500ml；底 物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸·一水0.95g，甘油50ml，TMB 0.15g溶于3ml DMSO中，纯水500ml；使用前A和B液等体积混匀)，室温孵育1～5min；加50μl终止液 (2M H2SO4)终止反应；酶标仪(SpectraMax 190)读取OD450。
挑选出阳性杂交瘤克隆于24孔板中扩大培养并通过有限稀释法进行亚克隆。通过前述方 法获得稳定表达目的抗体的单克隆杂交瘤细胞株，对这些克隆进行扩增。用无血清培养基 Hybridoma-SFM(购自Thermo Fisher Scientific)培养前述杂交瘤细胞株7天，然后用Protein A/G亲和层析法从培养上清中纯化鼠源抗人PD-L1单克隆抗体。纯化后获得若干株能够结合 人PD-L1的鼠源单抗。用ELISA法评估上述鼠源单抗对人PD-L1的相对亲和力。最终选择 相对亲和力最高的克隆M8进行下一步开发。
实施例1.3鼠源抗PD-L1单抗序列的测定以及人源化
步骤1：鼠源抗人PD-L1单克隆抗体可变区序列的确定
使用Trizol从M8杂交瘤单克隆细胞株中提取总RNA，用逆转录试剂盒将mRNA逆转录 成cDNA，通过文献报道的组合引物(《Antibody Engineering》Volume 1，Edited byRoland Kontermann and Stefan Dübel，组合引物的序列来自第323页)用PCR扩增M8的轻链可变区 和重链可变区基因，然后将PCR产物克隆入pMD18-T载体，测序并分析可变区基因序列。
对M8抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列进行分析，依据Kabat规则分别确定 M8抗体重链和轻链的抗原互补决定区和框架区。M8抗体重链CDR的氨基酸序列为H-CDR1： SYGVH(SEQ ID NO：1)、H-CDR2：LIWSGGGTDYNAAFIS(SEQ ID NO：2)和H-CDR3：QLGLRAMDY(SEQ ID NO：3)，轻链CDR的氨基酸序列为L-CDR1：RASQSIGTTIH(SEQ ID NO：4)、L-CDR2：YASESVS(SEQ ID NO：5)和L-CDR3：QQSNSWPLT(SEQ ID NO： 6)。
步骤2：鼠源抗人PD-L1单克隆抗体的人源化
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/，将鼠源M8抗体的重链可变区与人IgG胚系序列 进行同源性比较，选择IGHV4-59*01为重链CDR移植模板，将鼠源的M8抗体的重链CDR 移植入IGHV4-59*01骨架区，并在H-CDR3之后加入WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：7)作为第四个框架区，获得CDR移植重链可变区序列。同样地，将鼠源M8抗体的轻链可变区与 人IgG胚系序列同源性比较，选择IGKV6-21*01为轻链CDR移植模板，将鼠源M8抗体的 轻链CDR移植入IGKV6-21*01的骨架区，并在L-CDR3之后加入FGAGTKLEIK(SEQ ID NO： 8)作为第四个框架区，获得CDR移植轻链可变区序列。在CDR移植可变区的基础上，对一 些氨基酸位点进行突变。在进行突变时，将氨基酸序列进行Kabat编码，位点的位置由Kabat 码指示。
优选的，对于CDR移植重链可变区，根据Kabat编码，将第6位的E突变为Q，将第9 位的P突变为G，将第16位的E突变为Q，将第17位的T突变为S，将第27位的G突变 为F，将第29位的I突变为L，将第37位的I突变为V，将第61位的A突变为P，将第62 位的A突变为S，将第63位的F突变为L，将第64位的I突变为K，将第67位的V突变为 L，将第71位的V突变为R，将第78位的F突变为V，将第80位的L突变为F，将第82 位的L突变为I，将第82C位的V突变为L。对于CDR移植轻链可变区，将第11位的Q突 变为L，第53位的E突变为Q，第55位的V突变为F，第78位的L突变为V。
上述带有突变位点的重链可变区和轻链可变区分别定义为人源化的重链可变区和轻链可 变区(SEQ ID NO：9和10)。由上海生工生物工程有限公司合成编码上述人源化的重链和轻 链可变区的DNA。将合成的人源化重链可变区与人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：11)相 连，获得全长的人源化重链基因，命名为Anti-PDL1-HC(SEQ ID NO：13和14)；将人源化 轻链可变区与人Kappa链恒定区(SEQ ID NO：12)相连，获得全长的人源化轻链基因，命名为Anti-PDL1-LC(SEQ ID NO：15和16)。将Anti-PDL1-HC和Anti-PDL1-LC基因分别构 建到pcDNA4表达载体中，利用PEI转染法将所得重链和轻链表达载体一起转入HEK293F 细胞中以表达抗体，利用Protein A亲和层析法纯化抗体，所得抗体命名为Anti-PDL1。
最终Anti-PDL1抗体重链CDR的氨基酸序列为H-CDR1：SYGVH(SEQ ID NO：17)、 H-CDR2：LIWSGGGTDYNPSLKS(SEQ ID NO：18)和H-CDR3：QLGLRAMDY(SEQ ID NO：19)，轻链CDR的氨基酸序列为L-CDR1：RASQSIGTTIH(SEQ ID NO：20)、L-CDR2： YASQSFS(SEQ ID NO：21)和L-CDR3：QQSNSWPLT(SEQ ID NO：22)。
实施例1.4对照抗体Atezolizumab-IgG1的制备
从《WHO Drug Information,Vol.29,No.3,2015》中获得阳性对照抗体Atezolizumab的重 链可变区和轻链可变区序列(SEQ ID NO：23和24)。由上海生工生物工程有限公司合成编 码上述可变区的DNA。Atezolizumab的重链可变区(Atezolizumab-VH)与人IgG1重链恒定 区(SEQ ID NO：11)相连，获得全长的重链基因，命名为Atezolizumab-HC；将Atezolizumab 的轻链可变区(Atezolizumab-VL)与人Kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：12)相连，获得全 长的轻链基因，命名为Atezolizumab-LC。将Atezolizumab-HC和Atezolizumab-LC分别构建 到pcDNA4表达载体中，表达并纯化抗体，所得抗体命名为Atezolizumab-IgG1。
实施例1.5 ELISA测定人源化抗人PD-L1抗体对PD-L1的相对亲和力
用上述PD-L1-His包被酶标板，包被浓度为10ng/孔，用含有1％BSA的PBST封闭酶标 板。将待测抗体进行梯度稀释，然后转移到上述包被重组蛋白的酶标板中，室温孵育半小时 后洗板；加入适当稀释的HRP标记的羊抗人抗体(Fc-Specific)(购自Sigma)，室温孵育半 小时后洗板；每孔加入100μl以TMB为底物的显色液，室温孵育1～5min；加50μl终止液(2M H2SO4)终止反应；酶标仪(SpectraMax 190)读取OD450，用GraphPad Prism6进行作图和数据分析，并计算EC50。
如图2所示，Anti-PDL1和Atezolizumab-IgG1均能够有效结合PD-L1-His，EC50分别是 0.1018nM和0.09351nM，两者的表观亲和力相当。同型对照抗体为不结合人PD-L1的人IgG1 抗体。
实施例1.6测定人源化抗人PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力
用Biotin N-hydroxysuccinimide ester(购自Sigma，货号/规格：H1759-100MG)对PD-L1-ECD-hFc进行生物素化标记。用碳酸钠缓冲液(1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3溶于1L纯水中)将人PD-1-ECD-hFc稀释到2μg/ml，用排枪加到96孔ELISA酶标板中，100μl/ 孔，室温孵育4h；用PBST清洗1次，用含1％BSA的PBST封闭，200μl/孔，室温孵育2h； 弃封闭液，拍干，于4℃备用。在96孔板中用含有1％BSA的PBST溶液将生物素化的 PD-L1-ECD-hFc稀释至500ng/ml；用上述蛋白溶液分别梯度稀释抗人PD-L1抗体；将上述稀 释好的抗体和生物素化PD-L1-ECD-hFc的混合溶液转移到上述用人PD1-ECD-hFc包被好的 ELISA板中，室温孵育1小时；PBST洗板3次；加入用1％BSA的PBST溶液以1:1000稀 释的Streptavidin-HRP(购自BD Biosciences)，室温孵育45min；PBST洗板3次；加显色液 (TMB底物溶液)，100μl/孔，室温孵育1～5min；加终止液(2M H2SO4)终止显色反应，50μl/ 孔；用酶标仪读取OD450值；用GraphPad Prism6进行数据整理分析和作图，计算IC50。
如图3所示，Anti-PDL1和Atezolizumab-IgG1均能够有效阻断PD-1与PD-L1之间的相 互作用，IC50分别是1.366nM和1.471nM，两者的阻断能力相当。同型对照抗体为不结合人 PD-L1的人IgG1抗体。
实施例1.7用混合淋巴细胞反应测定人源化抗人PD-L1抗体的功能活性
如图4A所示，Anti-PDL1和Atezolizumab-IgG1均能够有效刺激MLR分泌IL-2，EC50分别是0.306nM和0.29nM。如图4B所示，Anti-PDL1和Atezolizumab-IgG1均能有效刺激 MLR分泌IFN-γ，EC50分别是0.1464nM和0.1294nM。其中同型对照抗体为不结合人PD-L1 的人IgG1抗体。
实施例2抗PD-1和PD-L1的四价双特异性抗体的构建
实施例2.1序列
mAb1-25-Hu(后文中简称为609)是人源化的抗人PD-1单抗，其重链可变区和轻链可 变区序列来自于WO2018/137576A1，人源化的重链可变区和轻链可变区(SEQ ID NO：25和26)分别与人IgG4(S228P)重链恒定区(SEQ ID NO：27)和Kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：12)相连，最终获得完整的人源化mAb1-25-Hu单抗(609)的重链和轻链氨基酸序列。
Anti-PDL1是抗人PD-L1的人源化单抗，其序列参见实施例1.3。
实施例2.2共同轻链的选择
用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)对Anti-PDL1轻链可变区与609轻链可 变区的氨基酸序列进行对比分析，结果显示，两者之间完全相同的氨基酸占比74％(Identities)， 性质相似的氨基酸占比86％(Positives)。
Anti-PDL1的重链和轻链基因分别命名为Anti-PDL1-HC和Anti-PDL1-LC，609的重链和 轻链基因分别命名为609-HC和609-LC，将它们分别构建到pcDNA4表达载体中，将上述重 链和轻链表达载体按照下述方式进行组合：Anti-PDL1-HC+Anti-PDL1-LC、609-HC+609-LC、Anti-PDL1-HC+609-LC和609-HC+Anti-PDL1-LC，表达并纯化抗体，所得的抗体分别命名为 Anti-PDL1、609、Anti-PDL1-HC+609-LC和609-HC+Anti-PDL1-LC。
用上述PD1-ECD-hFc和PD-L1-ECD-hFc分别包被酶标板，包被浓度均为10ng/孔。用含有1％ BSA的PBST封闭酶标板。将待测抗体进行梯度稀释，然后转移到上述包被重组蛋白的酶标 板中，室温孵育半小时后洗板；加入适当稀释的HRP标记的羊抗人抗体(Fab-specific)(购 自Sigma)，室温孵育半小时后洗板；每孔加入100μl以TMB为底物的显色液，室温孵育1～5min； 加50μl终止液(2M H2SO4)终止反应；酶标仪(SpectraMax 190)读取OD450，用GraphPad Prism6进行作图和数据分析，并计算EC50。
如图5A所示，609和609-HC+Anti-PDL1-LC能够有效结合PD1-ECD-hFc，EC50分别是0.2001nM和0.2435nM；而Anti-PDL1和Anti-PDL1-HC+609-LC不能结合PD1-ECD-hFc。如 图5B所示，Anti-PDL1能够有效结合PD-L1-ECD-hFc，EC50为0.1246nM，而609、 Anti-PDL1-HC+609-LC和609-HC+Anti-PDL1-LC不能有效结合PD1-ECD-hFc。在此选择 Anti-PDL1-LC(SEQID NO：15和16)作为共同轻链构建双特异性抗体。
实施例2.3双特异性抗体的构建
将Anti-PDL1的重链可变区与人IgG4的CH1结构域相连，然后再通过人工连接子(在 此使用的连接子是三个串联的GGGGS，SEQ ID NO：28)连接609的重链可变区，最后再连接人IgG4的重链恒定区(CH1+CH2+CH3，铰链区含有S228P突变)，通过此程序构建成 的含有两个重链可变区和两个CH1结构域的长重链基因命名为PDL1-Fab-609-IgG4(SEQ ID NO：29和30)。相似地，将609的重链可变区与人IgG4的CH1结构域相连，然后再通过人 工连接子(在此使用的连接子是三个串联的GGGGS，SEQ ID NO：28)连接Anti-PDL1的 重链可变区，最后再连接人IgG4的重链恒定区(CH1+CH2+CH3，铰链区含有S228P突变)， 通过此程序构建成的含有两个重链可变区和两个CH1结构域的长重链基因命名为 609-Fab-PDL1-IgG4(SEQID NO：31和32)。
将上述序列分别构建到pcDNA4表达载体中，将PDL1-Fab-609-IgG4和 609-Fab-PDL1-IgG4表达载体分别与Anti-PDL1-LC表达载体组合，表达并纯化抗体，所得的 抗体分别命名为PDL1-Fab-609-IgG4和609-Fab-PDL1-IgG4(为简明起见，此处只取重链的 名字作为抗体的名称)。
实施例2.4 ELISA测定相对亲和力
ELISA检测方法参照实施例1.3中所述。
如图6A所示，609-HC+Anti-PDL1-LC、PDL1-Fab-609-IgG4和609-Fab-PDL1-IgG4均能 有效结合PD1-His，EC50分别是0.3821nM、5.308nM和0.4213nM。如图6B所示，Anti-PDL1、PDL1-Fab-609-IgG4和609-Fab-PDL1-IgG4均能有效结合PD-L1-His，EC50分别是0.1204nM、0.1400nM和0.1350nM。其中同型对照抗体为既不结合PD-1也不结合PD-L1的人IgG4抗体。上述结果显示，PDL1-Fab-609-IgG4和609-Fab-PDL1-IgG4既能够结合PD-1又能结合PD-L1，这说明它们是双特异性抗体。
实施例2.5评估增强MLR的能力
A和C的结果来自同一份MLR实验，B和D的结果来自另外一份独立的MLR实验，其 中同型对照抗体为既不结合PD-1也不结合PD-L1的人IgG4抗体。如图7A和7B所示， Anti-PDL1、609-HC+Anti-PDL1-LC和609-Fab-PDL1-IgG4均能有效刺激MLR分泌IL-2，图 7A的EC50分别是0.306nM、0.5384nM和0.1023nM，图7B的EC50分别是0.1016nM、0.6819nM 和0.1259nM。另外，如图7C和7D所示，Anti-PDL1、609-HC+Anti-PDL1-LC和 609-Fab-PDL1-IgG4均能有效刺激MLR分泌IFN-γ，图7C的EC50分别是0.5119nM、1.21nM 和0.1675nM，图7D的EC50分别是0.1464nM、1.29nM和0.05491nM。此外，图7A和7B 显示，在相同浓度下，与单抗Anti-PDL1或609-HC+Anti-PDL1-LC相比，609-Fab-PDL1-IgG4 刺激MLR分泌IL-2的量更多。
实施例2.6 Biacore测定亲和力
在此通过Biacore 8K(GE healthcare)检测上述抗体与PD-1或PD-L1之间的亲和力。在 Biacore 8K上，使用偶联有Protein A/G的芯片分别捕获各种抗体，再将重组蛋白PD1-His或 PD-L1-His进样，得到结合-解离曲线，用6M盐酸胍再生缓冲液洗脱后重复下一个循环；利 用Biacore 8K Evaluation Software对数据进行分析。结果如表2所示。
表2-1.对PD-1的结合和解离动力学参数以及平衡解离常数
Figure BDA0003469519280000161
表2-2.对PD-L1的结合和解离动力学参数以及平衡解离常数
Figure BDA0003469519280000162
实验结果显示，609-Fab-PDL1-IgG4和609-HC+Anti-PDL1-LC对PD-1的结合常数(Kon) 和解离常数(Koff)十分相近，平衡解离常数(KD)也基本相当，KD分别是2.57E-08和3.49E-08。 609-Fab-PDL1-IgG4和609-HC+Anti-PDL1-LC对PD-L1的结合常数(Kon)和解离常数(Koff) 也十分相近，平衡解离常数(KD)也基本相当，KD分别是6.08E-10和8.43E-10。平衡解离 常数(KD)与亲和力高低成反比。
实施例2.7药代动力学研究
本实施例采用SD(Sprague-Dawley)大鼠(购自浙江维通利华实验动物技术有限公司) 进行609-Fab-PDL1-IgG4的药代动力学研究。每组五只大鼠，体重200g左右，每只大鼠通过 静脉注射(Intravenous Injection，I.V.)剂量为1mg的抗体；分别在给药后的特定时间眼眶取 血，血液自然凝固后离心取血清。
血清中目的抗体浓度的测量方法如下：用PD1-His和PD-L1-His分别包被酶标板，包被 浓度分别为20ng/孔和10ng/孔，然后用含有1％牛血清白蛋白的PBST封闭酶标板。将适当稀 释的大鼠血清分别转移到上述包被PD1-His和PD-L1-His的酶标板中；经过1小时的室温孵 育之后洗板，然后加入HRP标记的羊抗人(Fc-Specific)抗体(购自Sigma；该抗体经过种 属交叉吸附处理，不识别大鼠抗体)；经过半小时的室温孵育之后洗板，每孔加入100μl以 TMB为底物的显色液，室温孵育1～5min；加50μl终止液(2M H2SO4)终止反应；酶标仪读取OD450，并用标准曲线将OD450换算成抗体血清浓度；用GraphPad Prism6进行数据分析和作图；用Phoenix软件计算抗体药物在大鼠体内的半衰期。
根据图8A计算出609-Fab-PDL1-IgG4的半衰期为365小时(15.2天)。根据图8B计算出609-Fab-PDL1-IgG4的半衰期为446小时(18.6天)，单抗Anti-PDL1的半衰期为361小时(15.0天)。上述结果表明，609-Fab-PDL1-IgG4具有与Anti-PDL1单抗相近的药代动力学性质。
实施例2.8物理化学性质的表征
实施例2.8.1 HPLC-SEC
图9A表示609单抗的HPLC-SEC图谱，其中存在3个明显的峰，分别是Peak1、Peak2和Peak3，占比分别为0.7％、0.3％和99.0％。其中Peak1和Peak2的保留时间短于主峰Peak3， 说明Peak1和Peak2可能是聚集体产生的，两者占比之和为1.0％；图中没有出现可能代表降 解片段或不完整组装分子的峰。图9B表示609-Fab-PDL1-IgG4的HPLC-SEC图谱，其中存 在3个明显的峰，分别是Peak1、Peak2和Peak3，占比分别为0.2％、99.5％和0.3％。其中Peak1 的保留时间短于主峰Peak2，说明Peak1可能是聚集体产生的；Peak3的保留时间长于主峰 Peak2，说明Peak3可能是由降解片段或不完整组装分子产生的。
实施例2.8.2 CE-SDS
图10A和10B分别表示609单抗的NR-CE-SDS和R-CE-SDS图谱，图10C和图10D分 别表示609-Fab-PDL1-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS图谱。609的NR-CE-SDS主峰Peak8 占比98.92％，609-Fab-PDL1-IgG4的NR-CE-SDS主峰Peak9占比97.70％。609的R-CE-SDS 主峰Peak4(对应轻链)和Peak8(对应重链)分别占比32.03％和66.99％，两者峰面积之比 为1:2.09；609-Fab-PDL1-IgG4的R-CE-SDS主峰Peak3(对应轻链)和Peak9(对应重链) 分别占比38.73％和58.78％，两者峰面积之比为2:3.03。NR-CE-SDS中，609单抗和 609-Fab-PDL1-IgG4的主峰占比十分相近；R-CE-SDS中，609单抗和609-Fab-PDL1-IgG4的 轻链和重链的峰面积之比均符合预期。
实施例2.8.3 HPLC-IEC
图11A和11B分别表示609和609-Fab-PDL1-IgG4的HPLC-IEC图谱，它们的主峰分别占比82.95％和92.70％，结果表明609-Fab-PDL1-IgG4的电荷异质性优于609单抗。
实施例2.8.4 DSC
图12A和12B分别表示609和609-Fab-PDL1-IgG4的DSC图谱。其中TmOnset表示蛋白开始去折叠或变性时的温度，Tm对应峰顶温度。609的TmOnset和Tm分别为63.68℃和72.36℃，609-Fab-PDL1-IgG4的TmOnset和Tm分别为64.22℃和76.25℃。上述结果表明609和609-Fab-PDL1-IgG4的热稳定性非常相近。
实施例2.8.5分子量检测
609-Fab-PDL1-IgG4的每个分子含有两条长重链和四条轻链，其理论分子量(Expected Molecular Weight)的计算考虑了重链C末端赖氨酸残基的修饰，为238099Da。如图13所示， 实际测得的分子量(Measured Molecular Weight)为238100Da，与理论分子量仅差1Da。上 述结果表明609-Fab-PDL1-IgG4的分子结构是符合预期的。
实施例3抗PD-1和PD-L1双特异性抗体在小鼠体内的抗肿瘤作用
利用人外周血单个核细胞(PBMC)在NSG小鼠体内重建人源免疫系统，并在此小鼠上 建立人肺癌NCI-H292皮下移植瘤模型。该小鼠模型同时存在表达人PD-1的T细胞，以及表 达人PD-L1的人类肿瘤细胞，因此可以用来评价抗PD-1和PDL-1双特异性抗体的体内抗肿 瘤活性。具体实施步骤如下：收集体外培养的人非小细胞肺癌NCI-H292细胞(
Figure BDA0003469519280000181
CRL-1848TM)，将细胞悬液浓度调整为1×108/ml，与Matrigel(购自BD Biosciences，货号：356234)以等体积混合。体外复苏购买的PBMC(购自Allcells，货号：PB005-C)，用PBS 重悬PBMC细胞，将PBMC悬液浓度调整为1×107/ml。将混合好的肿瘤细胞悬液和PBMC 悬液以等体积混合。在无菌条件下，接种200μl细胞混合悬液于M-NSG小鼠(购自上海南方 模式生物研究中心)右侧上背部皮下。当天将接种混合细胞的小鼠按体重随机分组，每组10 只小鼠。各组小鼠药物处理情况如下：对照组，注射生理盐水；Opdivo组，注射10mg/kg的 抗PD-1阳性对照抗体Opdivo(由百时美施贵宝生产)；Tecentriq组，注射10mg/kg的抗PD-L1 阳性对照抗体Tecentriq(由罗氏制药生产)；609-Fab-PDL1-IgG4组，注射16mg/kg的 609-Fab-PDL1-IgG4。考虑到双特异性抗体和单克隆抗体的分子量存在差异，本实验中药物剂 量按照等物质的量进行设定。随后，按照上述设计好的方案给药，每周给药2次，共给药8 次，每周测定肿瘤体积2次。最终，测定的各组肿瘤随时间的生长曲线如图14所示。
结果显示，在第30天实验结束时，Opdivo、Tecentriq和609-Fab-PDL1-IgG4的抑瘤率分 别为50.5％、84.4％和96.0％(抑瘤率＝(对照组平均体积－实验组平均体积)/对照组平均 体积×100％)。与Opdivo和Tecentriq相比，609-Fab-PDL1-IgG4能够更加有效地抑制肿瘤生 长。
SEQUENCE LISTING
<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司
<120> 一种结合人PD-L1的抗体
<130> BJ3501-21P450590CN
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Ser Tyr Gly Val His
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Thr Ile His
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Tyr Ala Ser Glu Ser Val Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 重链第四个框架区
<400> 7
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 轻链第四个框架区
<400> 8
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 9
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Phe
65 70 75 80
Lys Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Thr
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人IgG1重链恒定区的氨基酸序列
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人Kappa轻链恒定区的氨基酸序列
<400> 12
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 13
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的重链的氨基酸序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Phe
65 70 75 80
Lys Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 14
<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的重链的核苷酸序列
<400> 14
caggtccagc tgcagcagtc aggagggggc ctggtgaagc catcacagag cctgtccctg 60
acctgcacag tctctgggtt cagtctgact tcatacggag tgcactgggt ccgacagccc 120
cctggaaagg gactggagtg gatcggcctg atttggtctg gcgggggaac agactataac 180
cccagcctga aatcccggct gaccatctct agagatacca gtaagaatca agtgagcttt 240
aaaattagct ccctgacagc cgctgacact gcagtgtact attgtgcaag gcagctggga 300
ctgcgagcta tggattactg gggacagggc acttccgtga ccgtctctag tgcgagcacc 360
aagggacctt ccgtgtttcc cctcgccccc agctccaaaa gcaccagcgg cggaacagct 420
gctctcggct gtctcgtcaa ggattacttc cccgagcccg tgaccgtgag ctggaacagc 480
ggagccctga caagcggcgt ccacaccttc cctgctgtcc tacagtcctc cggactgtac 540
agcctgagca gcgtggtgac agtccctagc agctccctgg gcacccagac atatatttgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtcgataaga aggtggagcc taagtcctgc 660
gacaagaccc acacatgtcc cccctgtccc gctcctgaac tgctgggagg cccttccgtg 720
ttcctgttcc cccctaagcc caaggacacc ctgatgattt ccaggacacc cgaggtgacc 780
tgtgtggtgg tggacgtcag ccacgaggac cccgaggtga aattcaactg gtacgtcgat 840
ggcgtggagg tgcacaacgc taagaccaag cccagggagg agcagtacaa ttccacctac 900
agggtggtgt ccgtgctgac cgtcctccat caggactggc tgaacggcaa agagtataag 960
tgcaaggtga gcaacaaggc cctccctgct cccatcgaga agaccatcag caaagccaag 1020
ggccagccca gggaacctca agtctatacc ctgcctccca gcagggagga gatgaccaag 1080
aaccaagtga gcctcacatg cctcgtcaag ggcttctatc cttccgatat tgccgtcgag 1140
tgggagtcca acggacagcc cgagaacaac tacaagacaa caccccccgt gctcgattcc 1200
gatggcagct tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agtccagatg gcaacaaggc 1260
aacgtcttca gttgcagcgt catgcatgag gccctccaca accactacac ccagaagagc 1320
ctctccctga gccctggaaa g 1341
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的轻链的氨基酸序列
<400> 15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Thr
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 16
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的轻链的核苷酸序列
<400> 16
gaaatcgtgc tgacacagag ccctgacttt ctgtccgtga cacccaagga gaaagtcact 60
atcacctgcc gggctagcca gtccatcgga accacaattc actggtacca gcagaagccc 120
gaccagagcc ctaagctgct gattaaatat gcctctcaga gtttctcagg cgtgccatcc 180
agatttagcg gctccgggtc tggaactgac ttcacactga ctatcaactc tgtcgaggca 240
gaagatgccg ctacctacta ttgtcagcag agtaattcat ggcccctgac ctttggcgcc 300
gggacaaagc tggaaattaa aagaaccgtc gccgctccca gcgtcttcat cttccccccc 360
agcgatgagc agctgaagag cggaaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
cccagggagg ccaaggtgca atggaaggtg gacaacgccc tacagagcgg caactcccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggat agcacctaca gcctgagcag caccctcacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccatcagggc 600
ctgagcagcc ctgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的重链互补决定区H-CDR1的氨基酸序列
<400> 17
Ser Tyr Gly Val His
1 5
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的重链互补决定区H-CDR2的氨基酸序列
<400> 18
Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的重链互补决定区H-CDR3的氨基酸序列
<400> 19
Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的轻链互补决定区L-CDR1的氨基酸序列
<400> 20
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Thr Ile His
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的轻链互补决定区L-CDR2的氨基酸序列
<400> 21
Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-PDL1的轻链互补决定区L-CDR3的氨基酸序列
<400> 22
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 23
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Atezolizumab的重链可变区的氨基酸序列
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Atezolizumab的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> mAb1-25-Hu（609）的重链可变区的氨基酸序列
<400> 25
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> mAb1-25-Hu（609）的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 26
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IgG4（S228P）重链恒定区的氨基酸序列
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 连接子（GGGGSGGGGSGGGGS）
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 29
<211> 674
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> PDL1-Fab-609-IgG4的氨基酸序列
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Phe
65 70 75 80
Lys Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
245 250 255
Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
260 265 270
Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr
275 280 285
Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
290 295 300
Ala Lys Asn Ser His Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
305 310 315 320
Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val
325 330 335
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
340 345 350
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
355 360 365
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
370 375 380
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
385 390 395 400
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
405 410 415
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
420 425 430
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
435 440 445
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
450 455 460
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
465 470 475 480
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
485 490 495
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
500 505 510
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
515 520 525
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
530 535 540
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
545 550 555 560
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
565 570 575
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
580 585 590
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
595 600 605
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
610 615 620
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
625 630 635 640
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
660 665 670
Gly Lys
<210> 30
<211> 2022
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PDL1-Fab-609-IgG4的核苷酸序列
<400> 30
caggtccagc tgcagcagtc aggagggggc ctggtgaagc catcacagag cctgtccctg 60
acctgcacag tctctgggtt cagtctgact tcatacggag tgcactgggt ccgacagccc 120
cctggaaagg gactggagtg gatcggcctg atttggtctg gcgggggaac agactataac 180
cccagcctga aatcccggct gaccatctct agagatacca gtaagaatca agtgagcttt 240
aaaattagct ccctgacagc cgctgacact gcagtgtact attgtgcaag gcagctggga 300
ctgcgagcta tggattactg gggacagggc acttccgtga ccgtctctag tgcaagtacc 360
aagggaccta gtgttttccc tcttgcacct tgctccaggt caacatcaga gtccacagct 420
gctcttggat gtctcgttaa ggactacttc ccagagccag ttaccgtatc ctggaactcc 480
ggagctttga caagcggcgt tcatacattc ccagctgtgt tgcagagttc tgggttgtac 540
agtttgagct cagtggtgac cgtgccttca tcttctttgg gcactaagac ctacacctgc 600
aacgtggatc acaagccaag caacaccaag gtggataaga gggtgggtgg aggcggttca 660
ggcggaggtg gcagcggagg tggcgggagt gaggtcaagc tggtggaaag cggcggcggc 720
ctggtgcagc ctggaggatc cctgcggctg agctgcgctg cctccggctt cgctttcagc 780
tcctatgaca tgtcctgggt gaggcaggcc cctggaaaga ggctggagtg ggtggctacc 840
atctccggag gcggaaggta cacctactac cccgacacag tgaagggaag gttcaccatc 900
agccgggata acgccaaaaa cagccactat ctccagatga actccctgag ggccgaagat 960
acagccgtgt atttctgtgc ctccccctac ggaggctatt ttgacgtgtg gggacagggc 1020
accctggtga ccgtctcctc cgcaagtacc aagggaccta gtgttttccc tcttgcacct 1080
tgctccaggt caacatcaga gtccacagct gctcttggat gtctcgttaa ggactacttc 1140
ccagagccag ttaccgtatc ctggaactcc ggagctttga caagcggcgt tcatacattc 1200
ccagctgtgt tgcagagttc tgggttgtac agtttgagct cagtggtgac cgtgccttca 1260
tcttctttgg gcactaagac ctacacctgc aacgtggatc acaagccaag caacaccaag 1320
gtggataaga gggtggagtc caagtacggc ccaccatgtc ctccatgtcc agcccctgaa 1380
tttttgggcg ggccttctgt ctttctgttt cctcctaaac ctaaagatac cctgatgatc 1440
agccgcacac ccgaagtcac ttgtgtggtc gtggatgtgt ctcaggaaga tcccgaagtg 1500
cagtttaact ggtatgtcga tggcgtggaa gtgcataatg ccaaaactaa gccccgcgaa 1560
gaacagttca acagcactta tcgggtcgtg tctgtgctca cagtcctcca tcaggattgg 1620
ctgaatggga aagaatataa gtgcaaggtg agcaataagg gcctccccag cagcatcgag 1680
aagactatta gcaaagccaa agggcagcca cgggaacccc aggtgtacac tctgcccccc 1740
tctcaggagg agatgactaa aaatcaggtc tctctgactt gtctggtgaa agggttttat 1800
cccagcgaca ttgccgtgga gtgggagtct aatggccagc ccgagaataa ttataagaca 1860
actccccccg tcctggactc tgacggcagc tttttcctgt attctcggct gacagtggac 1920
aaaagtcgct ggcaggaggg caatgtcttt agttgcagtg tcatgcatga ggccctgcac 1980
aatcactata cacagaaaag cctgtctctg agtctgggca aa 2022
<210> 31
<211> 674
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 609-Fab-PDL1-IgG4的氨基酸序列
<400> 31
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
245 250 255
Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
260 265 270
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp
275 280 285
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser
290 295 300
Lys Asn Gln Val Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr
325 330 335
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
340 345 350
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
355 360 365
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
370 375 380
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
385 390 395 400
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
405 410 415
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
420 425 430
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
435 440 445
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
450 455 460
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
465 470 475 480
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
485 490 495
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
500 505 510
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
515 520 525
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
530 535 540
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
545 550 555 560
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
565 570 575
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
580 585 590
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
595 600 605
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
610 615 620
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
625 630 635 640
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
660 665 670
Gly Lys
<210> 32
<211> 2022
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 609-Fab-PDL1-IgG4的核苷酸序列
<400> 32
gaggtcaagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgcggctg 60
agctgcgctg cctccggctt cgctttcagc tcctatgaca tgtcctgggt gaggcaggcc 120
cctggaaaga ggctggagtg ggtggctacc atctccggag gcggaaggta cacctactac 180
cccgacacag tgaagggaag gttcaccatc agccgggata acgccaaaaa cagccactat 240
ctccagatga actccctgag ggccgaagat acagccgtgt atttctgtgc ctccccctac 300
ggaggctatt ttgacgtgtg gggacagggc accctggtga ccgtctcctc cgcaagtacc 360
aagggaccta gtgttttccc tcttgcacct tgctccaggt caacatcaga gtccacagct 420
gctcttggat gtctcgttaa ggactacttc ccagagccag ttaccgtatc ctggaactcc 480
ggagctttga caagcggcgt tcatacattc ccagctgtgt tgcagagttc tgggttgtac 540
agtttgagct cagtggtgac cgtgccttca tcttctttgg gcactaagac ctacacctgc 600
aacgtggatc acaagccaag caacaccaag gtggataaga gggtgggtgg aggcggttca 660
ggcggaggtg gcagcggagg tggcgggagt caggtccagc tgcagcagtc aggagggggc 720
ctggtgaagc catcacagag cctgtccctg acctgcacag tctctgggtt cagtctgact 780
tcatacggag tgcactgggt ccgacagccc cctggaaagg gactggagtg gatcggcctg 840
atttggtctg gcgggggaac agactataac cccagcctga aatcccggct gaccatctct 900
agagatacca gtaagaatca agtgagcttt aaaattagct ccctgacagc cgctgacact 960
gcagtgtact attgtgcaag gcagctggga ctgcgagcta tggattactg gggacagggc 1020
acttccgtga ccgtctctag tgcaagtacc aagggaccta gtgttttccc tcttgcacct 1080
tgctccaggt caacatcaga gtccacagct gctcttggat gtctcgttaa ggactacttc 1140
ccagagccag ttaccgtatc ctggaactcc ggagctttga caagcggcgt tcatacattc 1200
ccagctgtgt tgcagagttc tgggttgtac agtttgagct cagtggtgac cgtgccttca 1260
tcttctttgg gcactaagac ctacacctgc aacgtggatc acaagccaag caacaccaag 1320
gtggataaga gggtggagtc caagtacggc ccaccatgtc ctccatgtcc agcccctgaa 1380
tttttgggcg ggccttctgt ctttctgttt cctcctaaac ctaaagatac cctgatgatc 1440
agccgcacac ccgaagtcac ttgtgtggtc gtggatgtgt ctcaggaaga tcccgaagtg 1500
cagtttaact ggtatgtcga tggcgtggaa gtgcataatg ccaaaactaa gccccgcgaa 1560
gaacagttca acagcactta tcgggtcgtg tctgtgctca cagtcctcca tcaggattgg 1620
ctgaatggga aagaatataa gtgcaaggtg agcaataagg gcctccccag cagcatcgag 1680
aagactatta gcaaagccaa agggcagcca cgggaacccc aggtgtacac tctgcccccc 1740
tctcaggagg agatgactaa aaatcaggtc tctctgactt gtctggtgaa agggttttat 1800
cccagcgaca ttgccgtgga gtgggagtct aatggccagc ccgagaataa ttataagaca 1860
actccccccg tcctggactc tgacggcagc tttttcctgt attctcggct gacagtggac 1920
aaaagtcgct ggcaggaggg caatgtcttt agttgcagtg tcatgcatga ggccctgcac 1980
aatcactata cacagaaaag cctgtctctg agtctgggca aa 2022

Claims (15)

1.一种结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，包括：
(a)重链互补决定区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述的H-CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO：17所示，所述的H-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，所述的H-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，和
(b)轻链互补决定区L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述的L-CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO：20所示，所述的L-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，所述的L-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
2.根据权利要求1所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
4.根据权利要求1所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段或单链抗体。
5.根据权利要求1-4任一项所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
7.一种分离的核苷酸，所述的核苷酸编码如权利要求1-6任一项所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
8.根据权利要求7所述的分离的核苷酸，其中编码所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
9.一种表达载体，所述的表达载体含有权利要求7-8任一项所述的分离的核苷酸。
10.一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有权利要求9所述的表达载体。
11.一种结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如权利要求10所述的宿主细胞，从而表达所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段；
(b)分离并纯化(a)所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
12.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1-6任一项所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
13.权利要求1所述的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段或权利要求12所述的药物组合物在制备治疗PD-L1过表达的疾病的药物中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述的PD-L1过表达的疾病为癌症。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述的癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。
CN202210040098.8A 2020-05-15 2021-04-19 一种结合人pd-l1的抗体 Pending CN114790242A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2020/090442 WO2021226984A1 (zh) 2020-05-15 2020-05-15 一种抗pd-1和pd-l1的四价双特异性抗体
IBPCT/CN2020/090442 2020-05-15
CN202180003496.6A CN113993903A (zh) 2020-05-15 2021-04-19 一种抗pd-1和pd-l1的四价双特异性抗体
PCT/CN2021/088154 WO2021227782A1 (zh) 2020-05-15 2021-04-19 一种抗pd-1和pd-l1的四价双特异性抗体

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180003496.6A Division CN113993903A (zh) 2020-05-15 2021-04-19 一种抗pd-1和pd-l1的四价双特异性抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114790242A true CN114790242A (zh) 2022-07-26

Family

ID=78525956

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180003496.6A Pending CN113993903A (zh) 2020-05-15 2021-04-19 一种抗pd-1和pd-l1的四价双特异性抗体
CN202210040098.8A Pending CN114790242A (zh) 2020-05-15 2021-04-19 一种结合人pd-l1的抗体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180003496.6A Pending CN113993903A (zh) 2020-05-15 2021-04-19 一种抗pd-1和pd-l1的四价双特异性抗体

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230076124A1 (zh)
EP (2) EP4032913A1 (zh)
JP (2) JP7288984B2 (zh)
CN (2) CN113993903A (zh)
TW (2) TWI797609B (zh)
WO (2) WO2021226984A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116199784A (zh) * 2021-11-30 2023-06-02 泽达生物医药有限公司 抗trop-2/pd-l1双特异性抗体
TW202405013A (zh) * 2022-04-08 2024-02-01 大陸商上海濟煜醫藥科技有限公司 一種抗原結合蛋白及其應用
CN114591438B (zh) * 2022-04-25 2023-12-05 达石药业(广东)有限公司 一种采用阳离子交换层析法纯化双特异性抗体的方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20200094A1 (ar) * 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
TN2017000554A1 (en) * 2015-07-29 2019-04-12 Novartis Ag Novel combination for use in the treatment of cancer
BR112018008891A8 (pt) * 2015-11-03 2019-02-26 Janssen Biotech Inc anticorpos que se ligam especificamente a pd-1 e tim-3 e seus usos
WO2017087547A1 (en) * 2015-11-17 2017-05-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Pd-l1-binding agents and uses thereof
CN105461808B (zh) * 2015-12-24 2019-03-19 长春金赛药业股份有限公司 单克隆抗体及其应用
NZ743881A (en) * 2016-02-06 2023-11-24 Epimab Biotherapeutics Inc Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
PE20190510A1 (es) * 2016-06-13 2019-04-10 I Mab Anticuerpos anti-pd-l1 y usos de los mismos
WO2018071913A2 (en) * 2016-10-14 2018-04-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modular tetrameric bispecific antibody platform
CN108341871A (zh) * 2017-01-24 2018-07-31 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗pd-1单克隆抗体及其制备方法和应用
KR101961871B1 (ko) * 2017-02-20 2019-07-17 주식회사 와이바이오로직스 신규 다중특이적 결합 단백질
JP2020512836A (ja) * 2017-04-01 2020-04-30 北京韓美薬品有限公司 抗ｐｄ−ｌ１／抗ｐｄ−１天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体およびその調製方法
AR112603A1 (es) * 2017-07-10 2019-11-20 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos inhibidores de punto de control
CN109721657B (zh) * 2017-10-27 2021-11-02 北京比洋生物技术有限公司 阻断pd-1/pd-l1信号传导途径且活化t细胞的融合蛋白及其用途
AU2019256383A1 (en) * 2018-04-17 2020-11-26 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-CD27 and anti-PD-L1 antibodies and bispecific constructs
CN112673093A (zh) * 2018-07-04 2021-04-16 赛通免疫治疗公司 靶向flt3、pd-1和/或pd-l1的免疫疗法的组合物和方法
US11046769B2 (en) * 2018-11-13 2021-06-29 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof
CN113754775A (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗pd-l1和her2的双特异性抗体
CN113754773A (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗pd1×pdl1的双特异性抗体

Also Published As

Publication number Publication date
TWI797609B (zh) 2023-04-01
TW202144427A (zh) 2021-12-01
JP2022120846A (ja) 2022-08-18
EP3964530A4 (en) 2023-01-18
JP7288984B2 (ja) 2023-06-08
TW202221041A (zh) 2022-06-01
EP3964530A1 (en) 2022-03-09
JP7397897B2 (ja) 2023-12-13
WO2021226984A1 (zh) 2021-11-18
EP4032913A1 (en) 2022-07-27
CN113993903A (zh) 2022-01-28
US20230076124A1 (en) 2023-03-09
JP2022537256A (ja) 2022-08-25
WO2021227782A1 (zh) 2021-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106519034B (zh) 抗pd-1抗体及其用途
TWI797609B (zh) 抗pd-1和pd-l1的四價雙特異性抗體
EP4039704A1 (en) Anti-pd-1 antibody and use thereof
EP4047018B1 (en) Tetravalent bispecific antibody against pd-1 and vegf, preparation method therefor, and use thereof
KR20190026766A (ko) 항-il-22r 항체
CN115298216A (zh) 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途
CN113754774A (zh) 一种抗pd-l1和egfr的四价双特异性抗体
CN115667315A (zh) 一种抗pd1×pdl1的双特异性抗体
US20220135686A1 (en) Antibody that binds to human pd-l1
CN113754771A (zh) 一种抗pdl1×egfr的双特异性抗体
CN113754776A (zh) 一种抗pd-l1/vegf融合蛋白
CN114761434B (zh) Pd-1抗体及其制备方法与应用
WO2022228545A1 (en) Antibodies and variants thereof against human 4-1bb
WO2024061223A1 (zh) 抗体及其在抗肿瘤中的应用
JP2024509369A (ja) 抗ｐｄ－ｌ１抗体及びその使用
CN116135884A (zh) 抗tigit-抗pd-l1双特异性抗体、其药物组合物及用途
CN114075288A (zh) 抗pd-l2抗体
EA042365B1 (ru) Бифункциональное антитело против ctla4 и против pd-1, его фармацевтическая композиция и их применение

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230522

Address after: Craig Mill Chambers, Road City, Tortola, British Virgin Islands

Applicant after: Zi Da Biological Medicine Co.,Ltd.

Address before: 200000 No. 399, libing Road, China (Shanghai) pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai

Applicant before: SUNSHINE GUOJIAN PHARMACEUTICAL (SHANGHAI) Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right