JP2022537256A - Pd-1及びpd-l1を標的とする四価二重特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
a)重鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号17で表されるH-CDR1、アミノ酸配列が配列番号18で表されるH-CDR2、およびアミノ酸配列が配列番号19で表されるH-CDR3と、
b)軽鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号20で表されるL-CDR1、アミノ酸配列が配列番号21で表されるL-CDR2、およびアミノ酸配列が配列番号22で表されると、を含む。
1.1)PD-1及びPD-L1組換えタンパク質の調製
PD-1及びPD-L1の細胞外領域をコードする遺伝子は、国際出願WO2018/137576A1に記載のものであった。遺伝子組換え技術を利用し、PD-1及びPD-L1の細胞外領域をコードする遺伝子末端にそれぞれポリヒスチジンをコードする配列を付け、組換え遺伝子をpcDNA4発現ベクターに導入して発現させ、組換えタンパク質を精製してそれぞれPD1-His及びPD-L1-Hisと名づけた。また、遺伝子組換え技術を利用し、PD-1及びPD-L1の細胞外領域をコードする遺伝子末端にそれぞれヒトIgG1のFcフラグメントをコードする配列を付け、組換え遺伝子をpcDNA4発現ベクターに導入して発現させ、組換えタンパク質を精製してそれぞれPD1-ECD-hFc及びPD-L1-ECD-hFcと名づけた。
上記PD-L1-ECD-hFcを抗原とし、Balb/cマウス(上海霊暢バイオテック社製)に対して免疫を行った。マウス免疫、抗体価の測定、ハイブリドーマのクローニング及びスクリーニングは、WO2018/137576A1の明細書実施例2の記載を参照することができる。ELISAを利用してハイブリドーマから陽性クローンを選別する際には、以下の通りに行われた。つまり、上記PD-L1-Hisを用いて1ウェル当たり10ngの量でELISAプレートを被覆し、1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBST(KH2PO4 0.2g、Na2HPO4・12H2O 2.9g、NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Tween-20 0.5mLを含み、純水で1Lに調整したもの)を加えてELISAプレートをブロッキング処理した。一方、測定抗体を段階的に希釈し、上記組換えタンパク質で被覆したELISAプレートに加えて室温、30分間インキュベートした後にプレートを洗い流した。HRP標識のヤギ抗ラット抗体(Fc特異的なものであり、Sigma社製)を適宜希釈してウェルに加え、室温、30分間インキュベートしてからプレートを洗い流した。そして、各ウェルにTMBを基質とする着色液(着色液Aとしては酢酸ナトリウム三水和物13.6g、クエン酸一水和物1.6g、30%の過酸化水素水0.3mLを含み、純水で500mLに調整し、着色液Bはエチレンジアミン四酢酸2ナトリウム0.2g、クエン酸一水和物0.95g、グリセロール50mL、TMB 0.15gを含み、純水で500mLに調整した。TMBは、着色液Bに供えて予め3mLのDMSOに溶かし、使用直前に着色液Aと着色液Bを体積比1:1の割合で均一に混ぜ合わせた)を100μL加えて室温、1~5分間インキュベートした後、停止液として2MのH2SO4を50μL加えて反応を停止させ、SpectraMax 190プレートリーダーでOD450値を読み取った。
まず、ステップ1ではラット由来のヒトPD-L1モノクローナル抗体の可変領域配列を測定した。具体的には、Trizolを用いてM8モノクローナル株からトータルRNAを抽出し、逆転写キットを用いてmRNAからcDNAを合成し、Roland Kら編集の「抗体工程」第I巻第323頁に記載のプライマーペアを用い、PCR法によってM8クローンの軽鎖可変領域および重鎖可変領域の遺伝子を増幅し、得られたPCR産物をpMD18-Tベクターに導入し、配列測定を行って可変領域の遺伝子配列を解析した。
陽性対照物抗体であるアテゾリズマブの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列(配列番号23および配列番号24)は、「WHO薬物情報」第29巻第3号(2015)に記載されている配列情報を参考し、上海生工バイオテック社に委託して上記可変領域をコードするDNAを合成した。アテゾリズマブの重鎖可変領域(アテゾリズマブ-VH)とヒトIgG1の重鎖定常領域(配列番号11)を繋いで得られた全長の重鎖遺伝子をアテゾリズマブ-HCと名づけ、アテゾリズマブの軽鎖可変領域(アテゾリズマブ-VL)とヒトKappa軽鎖の定常領域(配列番号12)を繋いで得られた全長の軽鎖遺伝子をアテゾリズマブ-LCと名づけた。アテゾリズマブ-HC及びアテゾリズマブ-LCをそれぞれpcDNA4発現ベクターに導入し、HEK293F細胞で発現し、抗体を精製してアテゾリズマブ-IgG1と名づけた。
上記PD-L1-Hisを、1ウェル当たり10ng入れてELISAプレートを被覆し、1%のBSAを含むPBSTでブロッキング処理した。測定抗体を段階的に希釈し、上記組換えタンパク質で被覆したELISAプレートに入れて室温、30分間インキュベートした後、ELISAプレートを洗い流した。適宜希釈したHRP標識のヤギ抗ヒト抗体(Fc特異的なものであり、Sigma社製)を入れて室温、30分間インキュベートし、プレートを洗い流した。各ウェルにTMBを基質とする着色液を100μL加え、室温、1~5m分間インキュベートした後、2MのH2SO4停止液を50μL加えて反応を停止した。SpectraMax 190プレートリーダーでOD450値を測定し、得られたデータをGraphPad Prism6で処理して解析グラフを作成し、EC50を算出した。
PD-L1-ECD-hFcを、ビオチンN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(商品番号&規格H1759-100MG、Sigma社製)を用いてビオチン化した。ヒトPD-1-ECD-hFcを炭酸ナトリウム緩衝液(Na2CO3 1.59gとNaHCO3 2.93gを含み、純水1Lで調製したもの)で希釈して濃度が2μg/mLとなるようにし、ピペットで吸い取って96ウェルのELISAプレートに1ウェル当たり100μLずつ加え、室温で4時間インキュベートした。プレートをPBSTで1回洗い流した後、1ウェル当たりに1%のBSAを含むPBSTを200μL加えて室温、2時間インキュベートすることによりブロッキング処理を行った。ブロッキング処理液を捨て、さらにプレートを軽く叩いて残液が残らないようにし、次の処理に備えて4℃に保存した。96ウェルプレートにおいて、1%のBSAを含むPBST溶液を用いてビオチン標識のPD-L1-ECD-hFcを希釈して濃度が500ng/mLになるようにし、また、上記タンパク溶液を用いてヒトPD-L1抗体を段階的に希釈した。希釈済の抗体とビオチン化PD-L1-ECD-hFcの混合溶液を上記ヒトPD1-ECD-hFcで被覆したELISAプレートに入れて室温、1時間インキュベートした後、PBSTでプレートを3回洗い流した。1%のBSAを含むPBST溶液を用いて1:1000の体積比で希釈したHRP標識ストレプトアビジン(BD Biosciences社製)を加え、室温で45分間インキュベートし、PBSTでプレートを3回洗い流した。TMBを基質とする着色液を1ウェル当たり100μLずつ加えて室温、1~5分間インキュベートし、2MのH2SO4停止液を1ウェル当たり50μLずつ加えて反応を停止し、プレートリーダーでOD450値を読み取り、得られたデータをGraphPad Prism6で処理して解析グラフを作成し、IC50を算出した。
図4Aに示すように、PDL1抗体およびアテゾリズマブ-IgG1は、何れもMLR細胞のIL-2分泌を効果的に刺激し、EC50がそれぞれ0.306nMおよび0.29nMであった。また、図4Bに示すように、PDL1抗体およびアテゾリズマブ-IgG1は、何れもMLR細胞のIFN-γ分泌を効果的に刺激し、EC50がそれぞれ0.1464nMおよび0.1294nMであった。この試験では、同種対照物抗体としてヒトPD-L1に結合しないヒトIgG1抗体を用いた。
2.1)配列
mAb1-25-Hu(以下、「609」とも略称する)はヒト化抗ヒトPD-1モノクローナル抗体であり、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列としてはWO2018/137576A1に記載のものであった。このようなヒト化重鎖可変領域および軽鎖可変領域(配列番号25および配列番号226)を、ヒトIgG4(S228P)の重鎖定常領域(配列番号27)およびKappaの軽鎖定常領域(配列番号12)にそれぞれ繋いで完全なヒト化mAb1-25-Huモノクローナル抗体(609)を作製した。ここで、PDL1抗体は、ヒトPD-L1を標的とするヒト化モノクローナル抗体であり、その配列は実施例1.3に記載されたものと同様であった。
PDL1抗体の軽鎖可変領域と609の軽鎖可変領域については、BLAST法を利用して配列解析を行い、両者のアミノ酸配列において完全に共有するアミノ酸残基が74%を占め、性質面で類似したアミノ酸残基が86%を占めることが確認できた。
PDL1抗体の重鎖可変領域とヒトIgG4のCH1構造ドメインを繋ぎ、そして人工リンカーを介して609の重鎖可変領域を付け、このとき人工リンカーとしては配列番号28で表されるGGGGSGGGGSGGGGSを用い、最後にヒトIgG4の重鎖定常領域(CH1+CH2+CH3、ヒンジ領域にサイト変異としてS228Pを含む)を付けることにより、2つの重鎖可変領域および2つのCH1構造ドメインを含む重鎖遺伝子を構築し、PDL1-Fab-609-IgG4(配列番号29及び配列番号30)と名づけた。同様に、609の重鎖可変領域とヒトIgG4のCH1構造ドメインを繋ぎ、そして人工リンカーを介してPDL1抗体の重鎖可変領域を付け、このとき人工リンカーとしては配列番号28で表されるGGGGSGGGGSGGGGSを用い、最後にヒトIgG4の重鎖定常領域(CH1+CH2+CH3、ヒンジ領域にサイト変異としてS228Pを含む)を付けることにより、2つの重鎖可変領域及び2つのCH1構造ドメインを含む重鎖遺伝子を構築し、609-Fab-PDL1-IgG4(配列番号31及び配列番号32)と名づけた。
ELISA法を利用し、上記1.3と同様にして相対結合親和性を測定した。
AおよびCの結果は同じMLR実験から得られ、BおよびDの結果は他の独立したMLR実験から得られ、このとき同種対照物抗体としてはPD-1及びPD-L1に結合しないヒトIgG4抗体を用いた。図7A及び図7Bに示すように、PDL1抗体、609-HC+PDL1-LC抗体及び609-Fab-PDL1-IgG4は何れもMLR細胞のIL-2分泌を効果的に刺激し、EC50は、図7Aに示された通りそれぞれ0.306nM、0.5384nMおよび0.1023nMであり、また、図7Bに示された通りそれぞれ0.1016nM、0.6819nMおよび0.1259nMであった。なお、図7C及び図7Dに示すように、PDL1抗体、609-HC+PDL1-LC抗体及び609-Fab-PDL1-IgG4は何れもMLR細胞のIFN-γ分泌を効果的に刺激し、EC50は、図7Cに示された通りそれぞれ0.5119nM、1.21nMおよび0.1675nMであり、並びに図7Dに示された通りそれぞれ0.1464nM、1.29nMおよび0.05491nMであった。なお、図7A~図7Bに示すように、MLR細胞のIL-2分泌量に対する刺激活性において、609-Fab-PDL1-IgG4は、同じ使用濃度でPDL1モノクローナル抗体又は609-HC+PDL1-LC抗体に比べてより優れた刺激活性を示すことが確認できた。
GE healthcare社製のBiacore 8K装置を用い、上述の抗体とPD-1又はPD-L1の結合力を測定した。具体的には、Biacore 8K装置において、Protein-A/Gが固定されたチップで各抗体を捕捉し、そして組換えタンパク質PD1-His又はPD-L1-Hisを注入することにより結合・解離グラフを取得し、チップ再生には6Mのグアニジン塩酸塩溶液を用いた。得られたデータをBiacore 8K専用の解析ソフトで解析し、結果を下記表2に纏めて示す。
本実施例では、SDラット(浙江維通利華実験動物技術会社により購入)を用いて609-Fab-PDL1-IgG4の薬物動態を検討した。具体的には、ラットを幾つかの組に分け、各組は5匹ずつであり、ラットの平均体重は約200gであった。そして、ラットには尾静脈経由で1mgの抗体を投与し、投与後の指定時点で眼窩から採血し、血液が自然凝固するまで待ってから遠心して血清を回収した。
2.8.1)HPLC-SEC
図9Aは、モノクローナル抗体609のHPLC-SECスペクトルであり、スペクトルにおいてピーク1、ピーク2およびピーク3といった3つのピークが特に目立ち、各ピークの占有割合はそれぞれ0.7%、0.3%および99.0%であった。そのうち、ピーク1およびピーク2の保持時間が主要ピークに当たるピーク3より短く、凝集体によるものと考えられ、両者の占有割合は合計1.0%であった。また、スペクトルからは分解した断片(切断断片)および組織化が不完全な分子を表わすピークが確認できなかった。図9Bは、609-Fab-PDL1-IgG4のHPLC-SECスペクトルであり、スペクトルにおいてピーク1、ピーク2およびピーク3といった3つのピークが特に目立ち、各ピークの占有割合はそれぞれ0.2%、99.5%および0.3%であった。そのうち、ピーク1の保持時間が主要ピークに当たるピーク2より短く、凝集体によるものと考えられ、ピーク3の保持時間が主要ピークに当たるピーク2より長く、分解した断片(切断断片)および組織化が不完全な分子によるものと考えられる。
図10A~10Bは、それぞれモノクローナル抗体609のNR-CE-SDSおよびR-CE-SDSスペクトルであり、図10C~図10Dは、それぞれ609-Fab-PDL1-IgG4のNR-CE-SDSおよびR-CE-SDSスペクトルである。609のNR-CE-SDS主要ピークに当たるピーク8の占有割合が98.92%であり、609-Fab-PDL1-IgG4のNR-CE-SDS主要ピークに当たるピーク9の占有割合が97.70%であった。609のR-CE-SDS主要ピークに当たるピーク4(軽鎖に対応するピーク)およびピーク8(重鎖に対応するピーク)の占有割合は、それぞれ32.03%および66.99%であり、両者の面積比が1:2.09であった。また、609-Fab-PDL1-IgG4のR-CE-SDS主要ピークに当たるピーク3(軽鎖に対応するピーク)およびピーク9(重鎖に対応するピーク)の占有割合は、それぞれ38.73%および58.78%であり、両者の面積比が2:3.03であった。また、NR-CE-SDSにおいて、モノクローナル抗体609及び609-Fab-PDL1-IgG4の主要ピークがほぼ同じ占有割合を示し、かつR-CE-SDSにおいて、モノクローナル抗体609および609-Fab-PDL1-IgG4の軽鎖と重鎖のピーク面積比が予測通りであった。
図11A~図11Bは、それぞれモノクローナル609及び609-Fab-PDL1-IgG4のHPLC-IECスペクトルであり、かかる主要ピークの占有割合がそれぞれ82.95%及び92.70%であった。この結果から、帯電特性からして609-Fab-PDL1-IgG4がモノクローナル抗体609を上回ることが実証された。
図12A~図12Bは、それぞれ609及び609-Fab-PDL1-IgG4のDSCスペクトルであり、そのうち、TmOnsetは、タンパク質の折り畳みが解け又はタンパク質が変性するときの温度であり、Tmはピーク温度である。609のTmOnsetおよびTmは、それぞれ63.68℃及び72.36℃であり、609-Fab-PDL1-IgG4のTmOnsetおよびTmは、それぞれ64.22℃および76.25℃であった。この結果から、熱安定性からして609及び609-Fab-PDL1-IgG4がほぼ同じであることが実証された。
609-Fab-PDL1-IgG4において、各分子はそれぞれ2つの長い重鎖および4つの軽鎖を含み、重鎖C末端におけるリシン残基の修飾を考慮した場合の分子量理論値(Expected Molecular Weight)が238099Daであった。一方、図13に示すように、分子量測定値(Measured Molecular Weight)が238100Daであり、理論値と僅か1Daの差があった。この結果から、609-Fab-PDL1-IgG4が予測通りの分子構造を有することが実証された。
ヒト末梢血単核球(PBMC)を用いてNSGマウス体内においてヒト化免疫系を再構築し、さらに、前記マウスを用いてヒト肺がんNCI-H292の皮下移植腫瘍モデルを作製した。該マウス腫瘍モデルは、ヒトPD-1を発現するT細胞及びヒトPD-L1を発現するヒト腫瘍細胞を兼ね備え、PD-1及びPDL-1を標的とする二重特異性抗体の体内における抗腫瘍活性を評価することができる。具体的には、以下の通りに評価を行った。体外においてヒト非小細胞肺がん株であるNCI-H292細胞(ATCC(登録商標)CRL-1848TM)を培養し、細胞懸濁液を調整して濃度が1×108個細胞/mLとなるようにした後、Matrigel(BD Biosciences社製、製品番号356234)と1:1の体積比で混ぜ合わせた。また、購入したPBMC細胞(Allcells社製、製品番号PB005-C)を復活させ、PBSで再懸濁し、PBMC懸濁液を調整して濃度が1×107個細胞/mLとなるようにした。上述の腫瘍細胞懸濁液とPBMC懸濁液を1:1の体積比で混ぜ合わせ、混合液200μLを取って無菌条件下でM-NSGマウス(上海南方モデル生物研究センターにより入手)の背中右側皮下に接種した。接種当日に接種済みのマウスを体重に従ってランダムで幾つかの組に分け、各組にはそれぞれ10匹のマウスを配分した。マウスへの投与は、それぞれ対照物組に生理食塩水、Opdivo組にPD-1陽性対照物抗体であるOpdivo(ブリストル・マイヤーズスクイブ社製)10mg/kg、Tecentriq組にPD-L1陽性対照物抗体であるTecentriq(ロシュ製薬社製)10mg/kg、及び609-Fab-PDL1-IgG4組に16mg/kgの609-Fab-PDL1-IgG4を注射することで行われた。二重特異性抗体とモノクローナル抗体の分子量が異なるため、本実験ではそれぞれの抗体を物質量に換算してからそれぞれの抗体を同じ物質量で投与した。その後、上述の投与計画に従って週2回の頻度で合計8回投与し、腫瘍体積については毎週2回測定した。最後に、図14に示すように、各組の腫瘍生長状況を時系列に従って整理して生長グラフを作成した。
Claims (11)
- PD-1及びPD-L1を標的とする四価二重特異性抗体であって、
2つのポリペプチド鎖および4つの共通軽鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖は、配列番号29又は配列番号31で表されるアミノ酸配列を有し、
前記共通軽鎖は、配列番号15で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、四価二重特異性抗体。 - 単離されたヌクレオチドであって、
請求項1に記載の四価二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド。 - 前記ヌクレオチドは、前記ポリペプチド鎖又は前記共通軽鎖をコードし、
前記ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号30又は配列番号32で表され、前記共通軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号16で表される、請求項2に記載のヌクレオチド。 - 請求項2又は請求項3に記載のヌクレオチドを含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
- 請求項4に記載の発現ベクターを含んでなることを特徴とする、ホスト細胞。
- 請求項1に記載の四価二重特異性抗体を製造する方法であって、
発現条件下で請求項5に記載のホスト細胞を培養することにより、前記四価二重特異性抗体を発現するステップaと、
ステップaで発現した前記四価二重特異性抗体を分離、精製するステップbと
を含むことを特徴とする、製造方法。 - 請求項1に記載の四価二重特異性抗体および薬学的に許容可能な担体を含んでなる、薬物組成物。
- 請求項1に記載の四価二重特異性抗体又は請求項7に記載の薬物組成物の、がんを治療するための薬物の製造における用途。
- 前記がんは、メラノーマ、腎臓がん、前立腺がん、膵癌、乳がん、結腸がん、肺がん、食道がん、頭頚部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫及びその他の腫瘍性悪性疾患からなる群より選ばれる、請求項8に記載の用途。
- 請求項1に記載の四価二重特異性抗体又は請求項7前記の薬物組成物を、要治療の被験者に投与することを特徴とする、がんを治療するための方法。
- 前記がんは、メラノーマ、腎臓がん、前立腺がん、膵癌、乳がん、結腸がん、肺がん、食道がん、頭頚部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫及びその他の腫瘍性悪性疾患からなる群より選ばれる、請求項10に記載の方法。
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