TW202221041A - 一種結合人pd-l1的抗體 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了一種結合人PD-L1的抗體，以及基於所述的結合人PD-L1的抗體構建的抗PD-1和PD-L1的四價雙特異性抗體。本揭露的四價雙特異性抗體不需要進行Fc修飾，不會產生錯配問題，製備方法簡便，具有與單抗相似甚至更佳的生物學活性和理化性質。

Description

一種結合人PD-L1的抗體
本揭露涉及抗體領域，更具體地，本揭露公開了一種抗PD-1和PD-L1的四價雙特異性抗體。
人程式性細胞死亡受體-1(PD-1)是一種有288個胺基酸的I型膜蛋白，是已知的主要免疫檢查點(Immune Checkpoint)之一(Blank et al, 2005, Cancer Immunotherapy, 54:307-314)。PD-1表達在已經激活的T淋巴細胞，它與配體PD-L1(程式性細胞死亡受體-配體1，programmed cell death-Ligand 1)和PD-L2(程式性細胞死亡受體-配體2，programmed cell death-Ligand 2)結合可以抑制T淋巴細胞的活性及相關的體內細胞免疫反應。PD-L2主要表達在巨噬細胞和樹突狀細胞，而PD-L1則廣泛表達於B、T淋巴細胞及外周細胞如微血管上皮細胞，肺、肝、心等組織細胞中。大量研究表明，PD-1和PD-L1的相互作用不但是維持體內免疫系統平衡所必須，也是導致PD-L1表達陽性腫瘤細胞規避免疫監視的主要機制和原因。通過阻斷癌細胞對PD-1/PD-L1信號通路的負調控，啟動免疫系統，能夠促進T細胞相關的腫瘤特異性細胞免疫反應，從而打開了一扇新的腫瘤治療方法的大門--腫瘤免疫療法。
PD-1(由基因Pdcd1編碼)為與CD28和CTLA-4有關的免疫球蛋白超家族成員。研究成果顯示，當PD-1與其配體(PD-L1和/或PD-L2)結合時會負調節抗原受體信號轉導。目前已弄清鼠PD-1結構以及小鼠PD-1與人PD-L1的共結晶結構(Zhang，X.等，Immunity 20:337-347(2004)；Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:3011-6(2008))。PD-1及類似的家族成員為I型跨膜糖蛋白，其含有負責配體結合的Ig可變型(V-型)結構域和負責結合信號轉導分子的胞質尾區。PD-1胞質尾區含有兩個基於酪胺酸的信號轉導模體ITIM(免疫受體酪胺酸抑制作用模體)和ITSM(免疫受體酪胺酸轉換作用模體)。
PD-1在腫瘤的免疫逃避機制中起到了重要的作用。腫瘤免疫療法，即利用人體自身的免疫系統抵禦癌症，是一種突破性的腫瘤治療方法，但是腫瘤微環境可保護腫瘤細胞免受有效的免疫破壞，因此如何打破腫瘤微環境成為抗腫瘤研究的重點。現有研究成果已確定了PD-1在腫瘤微環境中的作用:PD-L1在許多小鼠和人腫瘤中表達(並在大多數PD-L1陰性腫瘤細胞系中可由IFNγ誘導)，並被推定為介導腫瘤免疫逃避的重要靶點(Iwai Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293-12297(2002)；Strome S.E.等，Cancer Res.，63:6501-6505(2003))。通過免疫組織化學評估活組織檢查，已經在人的很多原發性腫瘤中發現PD-1(在腫瘤浸潤淋巴細胞上)和/或PD-L1在腫瘤細胞上的表達。這樣的組織包括肺癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、結腸癌、神經膠質瘤、膀胱癌、乳腺癌、腎癌、食道癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌、尿道上皮細胞癌和胰腺癌以及頭頸腫瘤等。由此可見，阻斷PD-1/PD-L1的相互作用可以提高腫瘤特異性T細胞的免疫活性，有助於免疫系統清除腫瘤細胞，因此PD-1和PD-L1成為開發腫瘤免疫治療藥物的熱門靶點。
雙特異性抗體是指能同時特異性結合兩種抗原或兩種表位的抗體分子。根據對稱性，雙特異性抗體可以分為結構對稱的和不對稱的分子。根據結合位點的多少，雙特異性抗體可以分為二價、三價、四價和多價分子。雙特異性抗體正在逐步成為一類新的治療性抗體，可以用於治療各種炎性疾病、癌症和其它疾病。雖然最近報導了大量新的雙特異性抗體的構造形式，然而，生產雙特異性抗體的主要技術難點在於獲得正確配對的分子。目前現有的雙特異性抗體的形式均存在錯配的問題，因此會產生一種或多種錯配導致的副產物或者聚集體，從而影響目的雙特異性抗體的產率、純度和理化穩定性，進而影響雙特異性抗體在體內的安全性和有效性。
本揭露提供了一種結合人PD-L1的抗體，以及基於所述的結合人PD-L1的抗體構建的抗PD-1和PD-L1的四價雙特異性抗體。
因此，本揭露的第一個目的在於提供一種結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段。
本揭露的第二個目的在於提供一種編碼所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段的分離的核苷酸。
本揭露的第三個目的在於提供一種包含所述的核苷酸的表達載體。
本揭露的第四個目的在於提供一種包含所述的表達載體的宿主細胞。
本揭露的第五個目的在於提供所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段的製備方法。
本揭露的第六個目的在於提供包含所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段的藥物組合物。
本揭露的第七個目的在於提供所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段或所述的藥物組合物在製備治療PD-L1過表達的疾病的藥物中的用途。
本揭露的第八個目的在於提供所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段或所述的藥物組合物用於治療PD-L1過表達的疾病的方法。
本揭露的第九個目的在於提供一種抗PD-1和PD-L1的四價雙特異性抗體。
本揭露的第十個目的在於提供一種編碼所述的四價雙特異性抗體的分離的核苷酸。
本揭露的第十一個目的在於提供一種包含所述的核苷酸的表達載體。
本揭露的第十二個目的在於提供一種包含所述的表達載體的宿主細胞。
本揭露的第十三個目的在於提供所述的四價雙特異性抗體的製備方法。
本揭露的第十四個目的在於提供包含所述的四價雙特異性抗體的藥物組合物。
本揭露的第十五個目的在於提供所述的四價雙特異性抗體或所述的藥物組合物在製備治療癌症的藥物中的用途。
本揭露的第十六個目的在於提供所述的四價雙特異性抗體或所述的藥物組合物用於治療癌症的方法。
為了達到上述目的，本揭露提供了以下技術方案:
本揭露的第一個方面提供了一種結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段，包括: (a)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述的H-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述的H-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述的H-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO:19所示，和 (b)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述的L-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO:20所示，所述的L-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO:21所示，所述的L-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
根據本揭露，所述的抗體為單株抗體或多株抗體。
根據本揭露，所述的抗體為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
根據本揭露，所述的抗原結合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段或單鏈抗體。
根據本揭露，所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
根據本揭露，所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段的重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
本揭露的第二個方面提供了一種分離的核苷酸，所述的核苷酸編碼如上所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段。
根據本揭露，編碼所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段的重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，編碼輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
本揭露的第三個方面提供了一種表達載體，所述的表達載體含有如上所述的核苷酸。
本揭露的第四個方面提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有如上所述的表達載體。
本揭露的第五個方面提供了所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段的製備方法，包括以下步驟: (a)在表達條件下，培養如上所述的宿主細胞，從而表達所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段； (b)分離並純化(a)所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段。
本揭露的第六個方面提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有如上所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的載體。
本揭露的第七個方面提供了所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段或如上所述的藥物組合物在製備治療PD-L1過表達的疾病的藥物中的用途。
根據本揭露，所述的PD-L1過表達的疾病為癌症。較佳的，所述的癌症選自由以下組成的組:黑素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、白血病、淋巴瘤及其它贅生性惡性疾病等。
本揭露的第八個方面提供了一種治療PD-L1過表達的疾病的方法，包括向有需要的受試者施用如上所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段或如上所述的藥物組合物。
根據本揭露，所述的PD-L1過表達的疾病為癌症。較佳的，所述的癌症選自由以下組成的組:黑素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、白血病、淋巴瘤及其它贅生性惡性疾病等。
本揭露的第九個方面提供了一種抗PD-1和PD-L1的四價雙特異性抗體，包含兩條多肽鏈和四條共同輕鏈，其中，所述多肽鏈具有如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列，所述共同輕鏈具有如SEQ ID NO:15所示的胺基酸序列。
本揭露的第十個方面提供了一種分離的核苷酸，所述的核苷酸編碼所述的四價雙特異性抗體。
根據本揭露的較佳實施例，所述的核苷酸編碼所述多肽鏈和所述共同輕鏈，其中，編碼所述多肽鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示，編碼所述共同輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
本揭露的第十一個方面提供了一種表達載體，所述的表達載體含有如上所述的核苷酸。
本揭露的第十二個方面提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有如上所述的表達載體。
本揭露的第十三個方面提供了所述的四價雙特異性抗體的製備方法，所述方法包含以下步驟: (a)在表達條件下，培養如上所述的宿主細胞，從而表達所述的四價雙特異性抗體； (b)分離並純化(a)所述的四價雙特異性抗體。
本揭露的第十四個方面提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有如上所述的四價雙特異性抗體和藥學上可接受的載體。
本揭露的第十五個方面提供了所述的四價雙特異性抗體或如上所述的藥物組合物在製備治療癌症的藥物中的用途。
根據本揭露，所述癌症選自由以下組成的組:黑素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、白血病、淋巴瘤及其它贅生性惡性疾病等。
本揭露的第十六個方面提供了一種治療癌症的方法，包括向有需要的受試者施用如上所述的四價雙特異性抗體或如上所述的藥物組合物。
根據本揭露，所述癌症選自由以下組成的組:黑素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、白血病、淋巴瘤及其它贅生性惡性疾病等。
有益效果:
本揭露提供了一種結合人PD-L1的抗體，以及基於所述的結合人PD-L1的抗體構建的抗PD-1和PD-L1的四價雙特異性抗體。本揭露的四價雙特異性抗體不需要進行Fc修飾，不會產生錯配問題，製備方法簡便，具有與單抗相似甚至更佳的生物學活性和理化性質。
本揭露中涉及的序列資訊總結在表1中。 表1、本揭露的抗體的序列資訊
SEQ ID NO: 序列名稱
1 鼠源M8抗體的重鏈互補決定區H-CDR1的胺基酸序列
2 鼠源M8抗體的重鏈互補決定區H-CDR2的胺基酸序列
3 鼠源M8抗體的重鏈互補決定區H-CDR3的胺基酸序列
4 鼠源M8抗體的輕鏈互補決定區L-CDR1的胺基酸序列
5 鼠源M8抗體的輕鏈互補決定區L-CDR2的胺基酸序列
6 鼠源M8抗體的輕鏈互補決定區L-CDR3的胺基酸序列
7 重鏈第四個框架區(WGQGTSVTVSS)
8 輕鏈第四個框架區(FGAGTKLEIK)
9 Anti-PDL1的重鏈可變區的胺基酸序列
10 Anti-PDL1的輕鏈可變區的胺基酸序列
11 人IgG1重鏈恆定區的胺基酸序列
12 人Kappa輕鏈恆定區的胺基酸序列
13 Anti-PDL1的重鏈的胺基酸序列
14 Anti-PDL1的重鏈的核苷酸序列
15 Anti-PDL1的輕鏈的胺基酸序列
16 Anti-PDL1的輕鏈的核苷酸序列
17 Anti-PDL1的重鏈互補決定區H-CDR1的胺基酸序列
18 Anti-PDL1的重鏈互補決定區H-CDR2的胺基酸序列
19 Anti-PDL1的重鏈互補決定區H-CDR3的胺基酸序列
20 Anti-PDL1的輕鏈互補決定區L-CDR1的胺基酸序列
21 Anti-PDL1的輕鏈互補決定區L-CDR2的胺基酸序列
22 Anti-PDL1的輕鏈互補決定區L-CDR3的胺基酸序列
23 Atezolizumab的重鏈可變區的胺基酸序列
24 Atezolizumab的輕鏈可變區的胺基酸序列
25 mAb1-25-Hu(609)的重鏈可變區的胺基酸序列
26 mAb1-25-Hu(609)的輕鏈可變區的胺基酸序列
27 IgG4(S228P)重鏈恆定區的胺基酸序列
28 連接子(GGGGSGGGGSGGGGS)
29 PDL1-Fab-609-IgG4的胺基酸序列
30 PDL1-Fab-609-IgG4的核苷酸序列
31 609-Fab-PDL1-IgG4的胺基酸序列
32 609-Fab-PDL1-IgG4的核苷酸序列
本揭露中，術語「抗體(Antibody，縮寫Ab)」和「免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，縮寫IgG)」是有相同結構特徵的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型(isotype)的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是恆定區，重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2、以及CH3構成。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區，輕鏈恆定區包括一個結構域CL；輕鏈的恆定區與重鏈恆定區的CH1結構域配對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區配對。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重鏈恆定區包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型；輕鏈恆定區包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗體的重鏈和輕鏈通過重鏈的CH1結構域和輕鏈的CL結構域之間的二硫鍵共價連接在一起，抗體的兩條重鏈通過鉸鏈區之間形成的多肽間二硫鍵共價連接在一起。本揭露的抗體包括單株抗體、多株抗體、由至少兩種抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體的抗原結合片段等。本揭露的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體等。
本揭露中，術語「雙特異性抗體(雙抗)」是指能同時特異性結合兩種抗原(靶點)或兩種表位的抗體分子。
本揭露中，術語「單株抗體(單抗)」指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單株抗體高特異性地針對單個抗原位點。而且，與常規多株抗體製劑(通常是具有針對不同抗原決定簇的不同抗體的混合物)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單株抗體的好處還在於它們可以通過雜交瘤培養來合成，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語「單株」表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。
本揭露中，術語「鼠源抗體」是指來源於大鼠或小鼠的抗體，較佳為小鼠。本揭露的鼠源抗體為使用人PD-L1的胞外域為抗原免疫小鼠並進行雜交瘤細胞篩選獲得。
本揭露中，術語「嵌合抗體」是指包含來源於一個物種的重和輕鏈可變區序列以及來源於另一個物種的恆定區序列的抗體，例如具有與人恆定區連接的鼠重鏈可變區和輕鏈可變區的抗體。
本揭露中，術語「人源化抗體」是指其CDR來源於非人物種(較佳為小鼠)抗體，抗體分子中殘餘的部分(包括框架區和恆定區)來源於人抗體。此外，框架區殘基可被改變以維持結合親和性。
本揭露中，術語「抗原結合片段」是指能夠與人PD-L1表位特異性結合的抗體的片段。本揭露的抗原結合片段的例子包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、單鏈抗體(scFv)。Fab片段是由抗體的重鏈的VH和CH1以及輕鏈的VL和CL結構域組成。F(ab’)2片段是用胃蛋白酶消化抗體產生的片段。Fv片段是由抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區緊密非共價關聯的二聚物組成。單鏈抗體(scFv)，是由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過15-20個胺基酸的短肽(linker)連接而成的抗體。
本揭露中，術語「Fc」即可結晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗體的CH2和CH3結構域組成。Fc段無抗原結合活性，是抗體與效應分子或細胞相互作用的部位。
本揭露中，術語「可變」表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分佈在整個抗體可變區中。它集中於重鏈可變區和輕鏈可變區中稱為互補決定區(complementarity-determining region，CDR)或超變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱為框架區(frame region，FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR通過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見 Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669頁(1991))。
本揭露中，術語「抗」和「結合」是指兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。通常，抗體以小於大約10 -7M，例如小於大約10 -8M、10 -9M、10 -10M、10 -11M或更小的平衡解離常數(KD)結合該抗原。本揭露中，術語「KD」是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。例如，使用表面等離子體共振術(Surface Plasmon Resonance，縮寫SPR)在BIACORE儀中測定抗體與抗原的結合親和力或使用ELISA測定抗體與抗原結合的相對親和力。
本揭露中，術語「價」是指抗體分子中存在指定數量的抗原結合位點。較佳的，本揭露的雙特異抗體具有四個抗原結合位點，是四價的。本揭露中，抗原結合位點包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。
本揭露中，術語「表位」是指與抗體特異性結合的多肽決定簇。本揭露的表位是抗原中被抗體結合的區域。
本揭露中，術語「共同輕鏈」是指包含相同的輕鏈可變區和輕鏈恆定區的輕鏈，其能夠與結合第一抗原的第一抗體的重鏈配對，形成特異性結合第一抗原的結合位點，也能夠與結合第二抗原的第二抗體的重鏈配對，形成特異性結合第二抗原的結合位點。進一步的，共同輕鏈的輕鏈可變區與第一抗體的重鏈可變區形成第一抗原結合位點，共同輕鏈的輕鏈可變區與第二抗體的重鏈可變區形成第二抗原結合位點。
本揭露中，術語「表達載體」可以為pTT5，pSECtag系列，pCGS3系列，pcDNA系列載體等，以及其它用於哺乳動物表達系統的載體等，表達載體中包括連接有合適的轉錄和翻譯調節序列的融合DNA序列。
本揭露中，術語「宿主細胞」是指適用於表達上述表達載體的細胞，可以是真核細胞，如哺乳動物或昆蟲宿主細胞培養系統均可用於本揭露的融合蛋白的表達，CHO(中國倉鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)，HEK293，COS，BHK以及上述細胞的衍生細胞均可適用於本揭露。
本揭露中，術語「藥物組合物」是指本揭露的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段或雙特異性四價抗體可以和藥學上可以接受的載體一起組成藥物製劑組合物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本揭露公開的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段或雙特異性四價抗體的胺基酸核心序列的構象完整性，同時還保護蛋白質的多官能團防止其降解(包括但不限於凝聚、脫胺或氧化)。
以下實施例中使用的蛋白表達和純化方法說明如下:將目的基因構建到表達載體pcDNA4中，利用PEI(Polyethylenimine)將構建好的表達載體或表達載體的組合轉入FreeStyle ™293-F Cells細胞(後文簡稱HEK293F，購自Thermo Fisher Scientific)中以表達抗體或重組蛋白，HEK293F細胞在Free Style 293 Expression Medium(購自Thermo Fisher Scientific)中培養5天後收取細胞上清，然後用ProteinA親和層析或鎳親和層析純化抗體或重組蛋白。
以下實施例中使用的混合淋巴細胞反應(Mixed Lymphocyte Reaction，MLR)的方法說明如下:用Histopaque(購自Sigma)從人血液中分離出外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，縮寫PBMC)，然後通過貼壁法將PBMC中的單核細胞分離出來，然後用IL-4(25 ng/mL)和GM-CSF(25 ng/mL)誘導單核細胞分化成樹突狀細胞。七天之後，消化收集上述誘導的樹突狀細胞。用上述方法從另外供體的血液中分離出PBMC，然後用MACS磁鐵和CD4 MicroBeads(購自Miltenyibiotec)從PBMC中分離CD4 +T細胞。將誘導的樹突狀細胞(10 4/孔)和分離出的CD4 +T細胞(10 5/孔)按比例混勻後接種到96孔板中，每孔150μL；數小時後，在上述96孔板中加入50μL梯度稀釋的抗體；將96孔板置於37°C細胞培養箱中孵育3天。上述實驗過程中使用AIM-V培養基(購自Thermo Fisher Scientific)培養細胞。然後按照標準操作流程檢測IL-2和IFN-γ的分泌。IL-2和IFN-γ的檢測使用雙抗夾心ELISA(相關配對抗體購自BD Biosciences)。用酶標儀(SpectraMax 190)讀取OD450，用GraphPad Prism6進行作圖並計算EC50。
以下實施例中使用的理化性質檢測方法說明如下:
HPLC-SEC
抗體是高分子量蛋白質，具有高度複雜的二級和三級結構。由於翻譯後修飾、聚集和降解等變化，抗體在生物化學和生物物理特性方面是異質的。當通過分離技術分析雙特異性抗體時，通常會觀察到變體、聚集體和降解片段，它們的存在可能會損害安全性和有效性。在生產和存儲抗體的過程中容易出現聚集體、降解片段和不完整組裝的分子。本揭露使用高效液相色譜-尺寸排阻色譜(High-performance liquid chromatography–size exclusion chromatography，HPLC-SEC)檢測樣品中上述雜質的含量。聚集體的分子量要大於單體，因此相應峰的保留時間較短；降解片段或不完整組裝分子的分子量要小於單體，因此相應峰的保留時間較長。HPLC-SEC所用色譜儀為Dionex Ultimate 3000；流動相配製方法如下:取適量20mM磷酸二氫鈉母液，用20mM磷酸氫二鈉調節PH至6.8±0.1；進樣量:20µg；色譜柱為TSK G3000SWXL，規格為7.8×300mm 5μm；流速0.5 mL/分鐘，洗脫時間30 分鐘；柱溫25°C，樣品室溫度10°C；檢測波長214nm。
HPLC-IEC
許多翻譯後修飾(例如N醣基化、C末端賴胺酸殘基修飾、N末端穀胺醯胺或谷胺酸環化、天冬醯胺脫醯胺化、天冬胺酸異構化和胺基酸殘基氧化等)會直接或間接地引起抗體表面電荷的改變，導致電荷異質性的產生。基於所帶電荷可對電荷變體進行分離和分析，常用的分析方法有陽離子交換色譜法(cation exchange chromatography，CEX)和陰離子交換色譜法(anionexchange chromatography，AEX)。當通過基於色譜法的方法分析時，酸性種類(acidic species)和鹼性種類(basic species)基於它們相對於主峰(main peak)的保留時間來定義。酸性種類是早於CEX的主峰或晚於AEX的主峰洗脫出來的變體，而鹼性種類是晚於CEX的主峰或早於AEX的主峰洗脫出來的變體。酸性種類和鹼性種類所對應的峰分別稱作酸性峰和鹼性峰。在生產和存儲抗體的過程中容易產生電荷變體。在此使用高效液相色譜-離子交換色譜(High-performance liquid chromatography-ionexchange chromatography，HPLC-IEC)分析樣品的電荷異質性。HPLC-IEC所用色譜儀為Dionex Ultimate 3000；流動相A:20mM PB pH6.3，流動相B:20mM PB+200mM NaCl pH6.3，兩種流動相混合的比例按照預先設置的程式隨時間而改變，流速1.0 mL/分鐘；色譜柱:Thermo PropacTM WCX-10；柱溫30°C，樣品室溫度10°C；進樣量:20µg；檢測波長:214nm。
CE-SDS
本揭露使用CE-SDS(Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate)分析樣品中降解片段或不完整組裝的分子的含量。CE分為非還原和還原兩種類型，用於前者的樣品在變性時不需要用還原劑DTT將分子內的二硫鍵破壞，而用於後者的樣品在變性時需要用還原劑DTT將分子內的二硫鍵破壞。非還原和還原CE-SDS分別記作NR-CE-SDS和R-CE-SDS。所用毛細管電泳儀為ProteomeLab TMPA800 plus(Beckman Coulter)，配備UV 214nm檢測器，毛細管型號為Bare Fused-Silica Capillary，規格30.7cm×50μm，有效長度20.5cm；其它相關試劑購自Beckman Coulter。儀器關鍵參數設置如下:毛細管和樣品室溫度為20±2°C，分離電壓為15 kV。
DSC
差示掃描量熱法(Differential Scanning Calorimeter，DSC)主要通過在可控的升溫或降溫過程檢測生物分子中的熱量變化來反映樣品的熱穩定性。通過加熱，蛋白樣品的去折疊會吸收熱量，而消除樣品池溫差所需的補充能量則通過設備記錄下來，這些熱量變化會在圖譜上形成一個峰形，其中蛋白質樣品發生去折疊時所對應的峰頂溫度作為熔融溫度Tm。Tm是蛋白熱穩定性的一個重要指示，Tm越高，蛋白的穩定性越好。
分子量檢測
用PNGase F和內切糖苷酶F2處理抗體以去糖基化。UPLC-XEVO G2 Q-TOF液質聯用系統(Waters)用於樣品分子量的分析和鑒定。流動相A是含有0.1%三氟乙酸(TFA)的HPLC級水。流動相B是含有0.1%TFA的乙腈。在檢測完整分子量的方法中，使用的色譜柱為Mass PREPTM Micro Desalting Column(規格2.1×5mm)。關鍵參數設置如下，柱溫:80°C；流動相流速:0.2mL/分鐘；流動相梯度:流動相B在1.5分鐘內從5%升至90%；ESI源溫度:130°C。BiopharmaLynx v1.2(Waters)用於控制液質聯用系統和收集資料，質譜信號用BiopharmaLynx v1.2解卷積。
以下實施例、實驗例是對本揭露進行進一步的說明，不應理解為對本揭露的限制。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法。這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook, J., Fritsch, E．F． and Maniais， T．(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd  edition， Cold spring Harbor Laboratory Press。
實施例1人源化抗人PD-L1抗體的製備
實施例1.1PD-1和PD-L1重組蛋白的製備
PD-1和PD-L1的胞外區編碼基因來源如WO2018/137576A1中所述。利用基因重組技術，在PD-1和PD-L1的胞外區編碼基因末端分別連接多聚組胺酸編碼序列，然後將重組基因分別選殖到pcDNA4表達載體中，表達並純化重組蛋白，所得重組蛋白分別命名為PD1-His和PD-L1-His。利用基因重組技術，在PD-1和PD-L1的胞外區編碼基因末端分別連接人IgG1的Fc段編碼序列，然後將重組基因分別選殖到pcDNA4表達載體中，表達並純化重組蛋白，所得重組蛋白分別命名為PD1-ECD-hFc和PD-L1-ECD-hFc。
實施例1.2鼠源抗人PD-L1單株抗體的製備
利用上述PD-L1-ECD-hFc作為抗原免疫Balb/c小鼠(購自上海靈暢生物科技有限公司)。免疫小鼠、滴度檢測和雜交瘤選殖篩選的方法參照WO2018/137576A1中實施例2所述。ELISA篩選雜交瘤陽性選殖的方法如下:用上述PD-L1-His包被酶標板，包被濃度為10 ng/孔，用含有1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBST(KH 2PO 40.2g，Na 2HPO 4•12H 2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween-20 0.5mL，加純水至1L)封閉酶標板。將待測抗體進行梯度稀釋，然後轉移到上述包被重組蛋白的酶標板中，室溫孵育半小時後洗板；加入適當稀釋的HRP(Horseradish Peroxidase)標記的羊抗鼠抗體(Fc-Specific)(購自Sigma)，室溫孵育半小時後洗板；每孔加入100μL以TMB(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)為底物的顯色液(底物顯色A液:醋酸鈉•三水 13.6g，檸檬酸•一水 1.6g，30%雙氧水 0.3mL，純水 500mL；底物顯色B液:乙二胺四乙酸二鈉 0.2g，檸檬酸•一水 0.95g，甘油50mL，TMB 0.15g溶於3ml DMSO中，純水 500mL；使用前A和B液等體積混勻)，室溫孵育1-5分鐘；加50μL終止液(2M H 2SO 4)終止反應；酶標儀(SpectraMax 190)讀取OD450。
挑選出陽性雜交瘤選殖於24孔板中擴大培養並通過有限稀釋法進行亞選殖。通過前述方法獲得穩定表達目的抗體的單株雜交瘤細胞株，對這些殖株進行擴增。用無血清培養基Hybridoma-SFM(購自Thermo Fisher Scientific)培養前述雜交瘤細胞株7天，然後用Protein A/G親和層析法從培養上清中純化鼠源抗人PD-L1單株抗體。純化後獲得若干株能夠結合人PD-L1的鼠源單抗。用ELISA法評估上述鼠源單抗對人PD-L1的相對親和力。最終選擇相對親和力最高的殖株M8進行下一步開發。
實施例1.3 鼠源抗PD-L1單抗序列的測定以及人源化
步驟1:鼠源抗人PD-L1單株抗體可變區序列的確定
使用Trizol從M8雜交瘤單株細胞株中提取總RNA，用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA，通過文獻報導的組合引物(《Antibody Engineering》Volume 1，Edited by Roland Kontermann and Stefan Dübel，組合引物的序列來自第323頁)用PCR擴增M8的輕鏈可變區和重鏈可變區基因，然後將PCR產物選殖入pMD18-T載體，測序並分析可變區基因序列。
對M8抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區胺基酸序列進行分析，依據Kabat規則分別確定M8抗體重鏈和輕鏈的抗原互補決定區和框架區。M8抗體重鏈CDR的胺基酸序列為H-CDR1:SYGVH(SEQ ID NO:1)、H-CDR2:LIWSGGGTDYNAAFIS(SEQ ID NO:2)和H-CDR3:QLGLRAMDY(SEQ ID NO:3)，輕鏈CDR的胺基酸序列為L-CDR1:RASQSIGTTIH(SEQ ID NO:4)、L-CDR2:YASESVS(SEQ ID NO:5)和L-CDR3:QQSNSWPLT(SEQ ID NO:6)。
步驟2:鼠源抗人PD-L1單株抗體的人源化
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/，將鼠源M8抗體的重鏈可變區與人IgG胚系序列進行同源性比較，選擇IGHV4-59*01為重鏈CDR移植範本，將鼠源的M8抗體的重鏈CDR移植入IGHV4-59*01骨架區，並在H-CDR3之後加入WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)作為第四個框架區，獲得CDR移植重鏈可變區序列。同樣地，將鼠源M8抗體的輕鏈可變區與人IgG胚系序列同源性比較，選擇IGKV6-21*01為輕鏈CDR移植範本，將鼠源M8抗體的輕鏈CDR移植入IGKV6-21*01的骨架區，並在L-CDR3之後加入FGAGTKLEIK(SEQ ID NO:8)作為第四個框架區，獲得CDR移植輕鏈可變區序列。在CDR移植可變區的基礎上，對一些胺基酸位點進行突變。在進行突變時，將胺基酸序列進行Kabat編碼，位元點的位置由Kabat碼指示。
較佳的，對於CDR移植重鏈可變區，根據Kabat編碼，將第6位元的E突變為Q，將第9位的P突變為G，將第16位的E突變為Q，將第17位的T突變為S，將第27位的G突變為F，將第29位的I突變為L，將第37位的I突變為V，將第61位的A突變為P，將第62位的A突變為S，將第63位的F突變為L，將第64位的I突變為K，將第67位的V突變為L，將第71位的V突變為R，將第78位的F突變為V，將第80位的L突變為F，將第82位的L突變為I，將第82C位的V突變為L。對於CDR移植輕鏈可變區，將第11位的Q突變為L，第53位的E突變為Q，第55位的V突變為F，第78位的L突變為V。
上述帶有突變位點的重鏈可變區和輕鏈可變區分別定義為人源化的重鏈可變區和輕鏈可變區(SEQ ID NO:9和10)。由上海生工生物工程有限公司合成編碼上述人源化的重鏈和輕鏈可變區的DNA。將合成的人源化重鏈可變區與人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO:11)相連，獲得全長的人源化重鏈基因，命名為Anti-PDL1-HC(SEQ ID NO:13和14)；將人源化輕鏈可變區與人Kappa鏈恆定區(SEQ ID NO:12)相連，獲得全長的人源化輕鏈基因，命名為Anti-PDL1-LC(SEQ ID NO:15和16)。將Anti-PDL1-HC和Anti-PDL1-LC基因分別構建到pcDNA4表達載體中，利用PEI轉染法將所得重鏈和輕鏈表達載體一起轉入HEK293F細胞中以表達抗體，利用Protein A親和層析法純化抗體，所得抗體命名為Anti-PDL1。
最終Anti-PDL1抗體重鏈CDR的胺基酸序列為H-CDR1:SYGVH(SEQ ID NO:17)、H-CDR2:LIWSGGGTDYNPSLKS(SEQ ID NO:18)和H-CDR3:QLGLRAMDY(SEQ ID NO:19)，輕鏈CDR的胺基酸序列為L-CDR1:RASQSIGTTIH(SEQ ID NO:20)、L-CDR2:YASQSFS(SEQ ID NO:21)和L-CDR3:QQSNSWPLT(SEQ ID NO:22)。
實施例1.4對照抗體Atezolizumab-IgG1的製備
從《WHO Drug Information, Vol. 29, No. 3, 2015》中獲得陽性對照抗體Atezolizumab的重鏈可變區和輕鏈可變區序列(SEQ ID NO:23和24)。由上海生工生物工程有限公司合成編碼上述可變區的DNA。Atezolizumab的重鏈可變區(Atezolizumab-VH)與人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO:11)相連，獲得全長的重鏈基因，命名為Atezolizumab-HC；將Atezolizumab的輕鏈可變區(Atezolizumab-VL)與人Kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:12)相連，獲得全長的輕鏈基因，命名為Atezolizumab-LC。將Atezolizumab-HC和Atezolizumab-LC分別構建到pcDNA4表達載體中，表達並純化抗體，所得抗體命名為Atezolizumab-IgG1。
實施例1.5ELISA測定人源化抗人PD-L1抗體對PD-L1的相對親和力
用上述PD-L1-His包被酶標板，包被濃度為10 ng/孔，用含有1%BSA的PBST封閉酶標板。將待測抗體進行梯度稀釋，然後轉移到上述包被重組蛋白的酶標板中，室溫孵育半小時後洗板；加入適當稀釋的HRP標記的羊抗人抗體(Fc-Specific)(購自Sigma)，室溫孵育半小時後洗板；每孔加入100μL以TMB為底物的顯色液，室溫孵育1-5分鐘；加50μL終止液(2M H 2SO 4)終止反應；酶標儀(SpectraMax 190)讀取OD450，用GraphPad Prism6進行作圖和資料分析，並計算EC50。
如第2圖所示，Anti-PDL1和Atezolizumab-IgG1均能夠有效結合PD-L1-His，EC50分別是0.1018nM和0.09351nM，兩者的表觀親和力相當。同型對照抗體為不結合人PD-L1的人IgG1抗體。
實施例1.6測定人源化抗人PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L1相互作用的能力
用Biotin N-hydroxysuccinimide ester(購自Sigma，貨號/規格:H1759-100MG)對PD-L1-ECD-hFc進行生物素化標記。用碳酸鈉緩衝液(1.59g Na 2CO 3和2.93g NaHCO 3溶於1L純水中)將人PD-1-ECD-hFc稀釋到2 μg/mL，用排槍加到96孔ELISA酶標板中，100 μL/孔，室溫孵育4小時；用PBST清洗1次，用含1%BSA的PBST封閉，200 μL/孔，室溫孵育2小時；棄封閉液，拍乾，於4°C備用。在96孔板中用含有1% BSA的PBST溶液將生物素化的PD-L1-ECD-hFc稀釋至500 ng/mL；用上述蛋白溶液分別梯度稀釋抗人PD-L1抗體；將上述稀釋好的抗體和生物素化PD-L1-ECD-hFc的混合溶液轉移到上述用人PD1-ECD-hFc包被好的ELISA板中，室溫孵育1小時；PBST洗板3次；加入用1% BSA的PBST溶液以1:1000稀釋的Streptavidin-HRP(購自BD Biosciences)，室溫孵育45分鐘；PBST洗板3次；加顯色液(TMB底物溶液)，100 μL/孔，室溫孵育1-5分鐘；加終止液(2M H 2SO 4)終止顯色反應，50 μL/孔；用酶標儀讀取OD450值；用GraphPad Prism6進行資料整理分析和作圖，計算IC50。
如第3圖所示，Anti-PDL1和Atezolizumab-IgG1均能夠有效阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用，IC50分別是1.366nM和1.471nM，兩者的阻斷能力相當。同型對照抗體為不結合人PD-L1的人IgG1抗體。
實施例1.7用混合淋巴細胞反應測定人源化抗人PD-L1抗體的功能活性
如第4A圖所示，Anti-PDL1和Atezolizumab-IgG1均能夠有效刺激MLR分泌IL-2，EC50分別是0.306nM和0.29nM。如第4B圖所示，Anti-PDL1和Atezolizumab-IgG1均能有效刺激MLR分泌IFN-γ，EC50分別是0.1464nM和0.1294nM。其中同型對照抗體為不結合人PD-L1的人IgG1抗體。
實施例2 抗PD-1和PD-L1的四價雙特異性抗體的構建
實施例2.1序列
mAb1-25-Hu(後文中簡稱為609)是人源化的抗人PD-1單抗，其重鏈可變區和輕鏈可變區序列來自於WO2018/137576A1，人源化的重鏈可變區和輕鏈可變區(SEQ ID NO:25和26)分別與人IgG4(S228P)重鏈恆定區(SEQ ID NO:27)和Kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:12)相連，最終獲得完整的人源化mAb1-25-Hu單抗(609)的重鏈和輕鏈胺基酸序列。
Anti-PDL1是抗人PD-L1的人源化單抗，其序列參見實施例1.3。
實施例2.2共同輕鏈的選擇
用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)對Anti-PDL1輕鏈可變區與609輕鏈可變區的胺基酸序列進行對比分析，結果顯示，兩者之間完全相同的胺基酸占比74%(Identities)，性質相似的胺基酸占比86%(Positives)。
Anti-PDL1的重鏈和輕鏈基因分別命名為Anti-PDL1-HC和Anti-PDL1-LC，609的重鏈和輕鏈基因分別命名為609-HC和609-LC，將它們分別構建到pcDNA4表達載體中，將上述重鏈和輕鏈表達載體按照下述方式進行組合:Anti-PDL1-HC+Anti-PDL1-LC、609-HC+609-LC、Anti-PDL1-HC+609-LC和609-HC+Anti-PDL1-LC，表達並純化抗體，所得的抗體分別命名為Anti-PDL1、609、Anti-PDL1-HC+609-LC和609-HC+Anti-PDL1-LC。
用上述PD1-ECD-hFc和PD-L1-ECD-hFc分別包被酶標板，包被濃度均為10 ng/孔。用含有1% BSA的PBST封閉酶標板。將待測抗體進行梯度稀釋，然後轉移到上述包被重組蛋白的酶標板中，室溫孵育半小時後洗板；加入適當稀釋的HRP標記的羊抗人抗體(Fab-specific)(購自Sigma)，室溫孵育半小時後洗板；每孔加入100μL以TMB為底物的顯色液，室溫孵育1-5分鐘；加50μL終止液(2M H 2SO 4)終止反應；酶標儀(SpectraMax 190)讀取OD450，用GraphPad Prism6進行作圖和資料分析，並計算EC50。
如第5A圖所示，609和609-HC+Anti-PDL1-LC能夠有效結合PD1-ECD-hFc，EC50分別是0.2001nM和0.2435nM；而Anti-PDL1和Anti-PDL1-HC+609-LC不能結合PD1-ECD-hFc。如第5B圖所示，Anti-PDL1能夠有效結合PD-L1-ECD-hFc，EC50為0.1246nM，而609、Anti-PDL1-HC+609-LC和609-HC+Anti-PDL1-LC不能有效結合PD1-ECD-hFc。在此選擇Anti-PDL1-LC(SEQ ID NO:15和16)作為共同輕鏈構建雙特異性抗體。
實施例2.3雙特異性抗體的構建
將Anti-PDL1的重鏈可變區與人IgG4的CH1結構域相連，然後再通過人工連接子(在此使用的連接子是三個串聯的GGGGS，SEQ ID NO:28)連接609的重鏈可變區，最後再連接人IgG4的重鏈恆定區(CH1+CH2+CH3，鉸鏈區含有S228P突變)，通過此程式構建成的含有兩個重鏈可變區和兩個CH1結構域的長重鏈基因命名為PDL1-Fab-609-IgG4(SEQ ID NO:29和30)。相似地，將609的重鏈可變區與人IgG4的CH1結構域相連，然後再通過人工連接子(在此使用的連接子是三個串聯的GGGGS，SEQ ID NO:28)連接Anti-PDL1的重鏈可變區，最後再連接人IgG4的重鏈恆定區(CH1+CH2+CH3，鉸鏈區含有S228P突變)，通過此程式構建成的含有兩個重鏈可變區和兩個CH1結構域的長重鏈基因命名為609-Fab-PDL1-IgG4(SEQ ID NO:31和32)。
將上述序列分別構建到pcDNA4表達載體中，將PDL1-Fab-609-IgG4和609-Fab-PDL1-IgG4表達載體分別與Anti-PDL1-LC表達載體組合，表達並純化抗體，所得的抗體分別命名為PDL1-Fab-609-IgG4和609-Fab-PDL1-IgG4(為簡明起見，此處只取重鏈的名字作為抗體的名稱)。
實施例2.4ELISA測定相對親和力
ELISA檢測方法參照實施例1.3中所述。
如第6A圖所示，609-HC+Anti-PDL1-LC、PDL1-Fab-609-IgG4和609-Fab-PDL1-IgG4均能有效結合PD1-His，EC50分別是0.3821nM、5.308nM和0.4213nM。如第6B圖所示，Anti-PDL1、PDL1-Fab-609-IgG4和609-Fab-PDL1-IgG4均能有效結合PD-L1-His，EC50分別是0.1204nM、0.1400nM和0.1350nM。其中同型對照抗體為既不結合PD-1也不結合PD-L1的人IgG4抗體。上述結果顯示，PDL1-Fab-609-IgG4和609-Fab-PDL1-IgG4既能夠結合PD-1又能結合PD-L1，這說明它們是雙特異性抗體。
實施例2.5 評估增強MLR的能力
A和C的結果來自同一份MLR實驗，B和D的結果來自另外一份獨立的MLR實驗，其中同型對照抗體為既不結合PD-1也不結合PD-L1的人IgG4抗體。如第7A圖和第7圖B所示，Anti-PDL1、609-HC+Anti-PDL1-LC和609-Fab-PDL1-IgG4均能有效刺激MLR分泌IL-2，第7A圖的EC50分別是0.306nM、0.5384nM和0.1023nM，第7B圖的EC50分別是0.1016nM、0.6819nM和0.1259nM。另外，如第7C圖和第7D圖所示，Anti-PDL1、609-HC+Anti-PDL1-LC和609-Fab-PDL1-IgG4均能有效刺激MLR分泌IFN-γ，第7C圖的EC50分別是0.5119nM、1.21nM和0.1675nM，第7D圖的EC50分別是0.1464nM、1.29nM和0.05491nM。此外，第7A圖和第7B圖顯示，在相同濃度下，與單抗Anti-PDL1或609-HC+Anti-PDL1-LC相比，609-Fab-PDL1-IgG4刺激MLR分泌IL-2的量更多。
實施例2.6Biacore測定親和力
在此通過Biacore 8K(GE healthcare)檢測上述抗體與PD-1或PD-L1之間的親和力。在Biacore 8K上，使用偶聯有Protein A/G的晶片分別捕獲各種抗體，再將重組蛋白PD1-His或PD-L1-His進樣，得到結合-解離曲線，用6M鹽酸胍再生緩衝液洗脫後重複下一個迴圈；利用Biacore 8K Evaluation Software對資料進行分析。結果如表2所示。 表2-1.對PD-1的結合和解離動力學參數以及平衡解離常數
樣品名稱 Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD(M)
609-Fab-PDL1-IgG4 1.73E+05 4.43E-03 2.57E-08
609-HC+Anti-PDL1-LC 1.26E+05 4.39E-03 3.49E-08
表2-2.對PD-L1的結合和解離動力學參數以及平衡解離常數
樣品名稱 Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD(M)
609-Fab-PDL1-IgG4 1.85E+06 1.12E-03 6.08E-10
Anti-PDL1 1.63E+06 1.38E-03 8.43E-10
實驗結果顯示，609-Fab-PDL1-IgG4和609-HC+Anti-PDL1-LC對PD-1的結合常數(Kon)和解離常數( Koff)十分相近，平衡解離常數(KD)也基本相當，KD分別是2.57E-08和3.49E-08。609-Fab-PDL1-IgG4和609-HC+Anti-PDL1-LC對PD-L1的結合常數(Kon)和解離常數( Koff)也十分相近，平衡解離常數(KD)也基本相當，KD分別是6.08E-10和8.43E-10。平衡解離常數(KD)與親和力高低成反比。
實施例2.7藥代動力學研究
本實施例採用SD(Sprague-Dawley)大鼠(購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司)進行609-Fab-PDL1-IgG4的藥代動力學研究。每組五隻大鼠，體重200g左右，每隻大鼠通過靜脈注射(Intravenous Injection，I.V.)劑量為1mg的抗體；分別在給藥後的特定時間眼眶取血，血液自然凝固後離心取血清。
血清中目的抗體濃度的測量方法如下:用PD1-His和PD-L1-His分別包被酶標板，包被濃度分別為20 ng/孔和10 ng/孔，然後用含有1%牛血清白蛋白的PBST封閉酶標板。將適當稀釋的大鼠血清分別轉移到上述包被PD1-His和PD-L1-His的酶標板中；經過1小時的室溫孵育之後洗板，然後加入HRP標記的羊抗人(Fc-Specific)抗體(購自Sigma；該抗體經過種屬交叉吸附處理，不識別大鼠抗體)；經過半小時的室溫孵育之後洗板，每孔加入100μL以TMB為底物的顯色液，室溫孵育1-5分鐘；加50μL終止液(2M H 2SO 4)終止反應；酶標儀讀取OD450，並用標準曲線將OD450換算成抗體血清濃度；用GraphPad Prism6進行資料分析和作圖；用Phoenix軟體計算抗體藥物在大鼠體內的半衰期。
根據第8A圖計算出609-Fab-PDL1-IgG4的半衰期為365小時(15.2天)。根據第8B圖計算出609-Fab-PDL1-IgG4的半衰期為446小時(18.6天)，單抗Anti-PDL1的半衰期為361小時(15.0天)。上述結果表明，609-Fab-PDL1-IgG4具有與Anti-PDL1單抗相近的藥代動力學性質。
實施例2.8物理化學性質的表徵
實施例2.8.1 HPLC-SEC
第9A圖表示609單抗的HPLC-SEC圖譜，其中存在3個明顯的峰，分別是Peak1、Peak2和Peak3，占比分別為0.7%、0.3%和99.0%。其中Peak1和Peak2的保留時間短於主峰Peak3，說明Peak1和Peak2可能是聚集體產生的，兩者占比之和為1.0%；圖中沒有出現可能代表降解片段或不完整組裝分子的峰。第9B圖表示609-Fab-PDL1-IgG4的HPLC-SEC圖譜，其中存在3個明顯的峰，分別是Peak1、Peak2和Peak3，占比分別為0.2%、99.5%和0.3%。其中Peak1的保留時間短於主峰Peak2，說明Peak1可能是聚集體產生的；Peak3的保留時間長於主峰Peak2，說明Peak3可能是由降解片段或不完整組裝分子產生的。
實施例2.8.2 CE-SDS
第10A圖和第10B圖分別表示609單抗的NR-CE-SDS和R-CE-SDS圖譜，第10C圖和第10D圖分別表示609-Fab-PDL1-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS圖譜。609的NR-CE-SDS主峰Peak8占比98.92%，609-Fab-PDL1-IgG4的NR-CE-SDS主峰Peak9占比97.70%。609的R-CE-SDS主峰Peak4(對應輕鏈)和Peak8(對應重鏈)分別占比32.03%和66.99%，兩者峰面積之比為1:2.09；609-Fab-PDL1-IgG4的R-CE-SDS主峰Peak3(對應輕鏈)和Peak9(對應重鏈)分別占比38.73%和58.78%，兩者峰面積之比為2:3.03。NR-CE-SDS中，609單抗和609-Fab-PDL1-IgG4的主峰占比十分相近；R-CE-SDS中，609單抗和609-Fab-PDL1-IgG4的輕鏈和重鏈的峰面積之比均符合預期。
實施例2.8.3 HPLC-IEC
第11A圖和第11B圖分別表示609和609-Fab-PDL1-IgG4的HPLC-IEC圖譜，它們的主峰分別占比82.95%和92.70%，結果表明609-Fab-PDL1-IgG4的電荷異質性優於609單抗。
實施例2.8.4 DSC
第12A圖和第12B圖分別表示609和609-Fab-PDL1-IgG4的DSC圖譜。其中TmOnset表示蛋白開始去折疊或變性時的溫度，Tm對應峰頂溫度。609的TmOnset和Tm分別為63.68°C和72.36°C，609-Fab-PDL1-IgG4的TmOnset和Tm分別為64.22°C和76.25°C。上述結果表明609和609-Fab-PDL1-IgG4的熱穩定性非常相近。
實施例2.8.5 分子量檢測
609-Fab-PDL1-IgG4的每個分子含有兩條長重鏈和四條輕鏈，其理論分子量(Expected Molecular Weight)的計算考慮了重鏈C末端賴胺酸殘基的修飾，為238099Da。如第13圖所示，實際測得的分子量(Measured Molecular Weight)為238100Da，與理論分子量僅差1 Da。上述結果表明609-Fab-PDL1-IgG4的分子結構是符合預期的。
實施例3抗PD-1和PD-L1雙特異性抗體在小鼠體內的抗腫瘤作用
利用人外周血單個核細胞(PBMC)在NSG小鼠體內重建人源免疫系統，並在此小鼠上建立人肺癌NCI-H292皮下移植瘤模型。該小鼠模型同時存在表達人PD-1的T細胞，以及表達人PD-L1的人類腫瘤細胞，因此可以用來評價抗PD-1和PDL-1雙特異性抗體的體內抗腫瘤活性。具體實施步驟如下:收集體外培養的人非小細胞肺癌NCI-H292細胞(ATCC ®CRL-1848 ™)，將細胞懸液濃度調整為1×10 8/mL，與Matrigel(購自BD Biosciences，貨號:356234)以等體積混合。體外復蘇購買的PBMC(購自Allcells，貨號:PB005-C)，用PBS重懸PBMC細胞，將PBMC懸液濃度調整為1×10 7/mL。將混合好的腫瘤細胞懸液和PBMC懸液以等體積混合。在無菌條件下，接種200μL細胞混合懸液於M-NSG小鼠(購自上海南方模式生物研究中心)右側上背部皮下。當天將接種混合細胞的小鼠按體重隨機分組，每組10隻小鼠。各組小鼠藥物處理情況如下:對照組，注射生理鹽水；Opdivo組，注射10 mg/kg的抗PD-1陽性對照抗體Opdivo(由百時美施貴寶生產)；Tecentriq組，注射10 mg/kg的抗PD-L1陽性對照抗體Tecentriq(由羅氏製藥生產)；609-Fab-PDL1-IgG4組，注射16 mg/kg的609-Fab-PDL1-IgG4。考慮到雙特異性抗體和單株抗體的分子量存在差異，本實驗中藥物劑量按照等物質的量進行設定。隨後，按照上述設計好的方案給藥，每週給藥2次，共給藥8次，每週測定腫瘤體積2次。最終，測定的各組腫瘤隨時間的生長曲線如第14圖所示。
結果顯示，在第30天實驗結束時，Opdivo、Tecentriq和609-Fab-PDL1-IgG4的抑瘤率分別為50.5%、84.4%和96.0%(抑瘤率=(對照組平均體積－實驗組平均體積)／對照組平均體積×100%)。與Opdivo和Tecentriq相比，609-Fab-PDL1-IgG4能夠更加有效地抑制腫瘤生長。
無
第1圖為本揭露的雙特異性抗體的結構示意圖，其中，VH-A表示Anti-PDL1或609的重鏈可變區，VH-B表示609或Anti-PDL1的重鏈可變區，VL表示共同輕鏈的輕鏈可變區，CH1、CH2和CH3是重鏈恆定區的三個結構域，CL是共同輕鏈的輕鏈恆定區，兩條重鏈之間的線段表示二硫鍵，重鏈和輕鏈之間的線段也表示二硫鍵，靠近多肽鏈N末端的CH1和VH-A之間的線段表示人工設計的連接子，靠近多肽鏈C末端的CH1和CH2之間的線段表示抗體天然的連接子和鉸鏈區(如果重鏈是人IgG4亞型，鉸鏈區會含有S228P點突變，根據EU編碼)。 第2圖為ELISA檢測Anti-PDL1對PD-L1的相對親和力結果。 第3圖為測定Anti-PDL1阻斷PD-1/PD-L1相互作用能力的結果。 第4A圖和第4B圖為評估Anti-PDL1增強MLR的能力的結果。 第5A圖和第5B圖為Anti-PDL1和609及其雜合抗體的ELISA結果。 第6A圖和第6B圖為PDL1-Fab-609-IgG4和609-Fab-PDL1-IgG4的ELISA結果。 第7A圖-第7D圖為評估609-Fab-PDL1-IgG4增強MLR的能力的結果。 第8圖和第8B圖為609-Fab-PDL1-IgG4的藥代動力學結果。 第9A圖和第9B圖為609-Fab-PDL1-IgG4的HPLC-SEC圖譜。 第10A圖-第10D圖為609-Fab-PDL1-IgG4的CE-SDS圖譜。 第11A圖和第11B圖為609-Fab-PDL1-IgG4的HPLC-IEC圖譜。 第12A圖和第12B圖為609-Fab-PDL1-IgG4的DSC圖譜。 第13圖為609-Fab-PDL1-IgG4的分子量質譜圖譜。 第14圖為609-Fab-PDL1-IgG4雙特異性抗體在小鼠體內的抗腫瘤作用。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無 
[序列表]
          <![CDATA[<110>  三生國健藥業(上海)股份有限公司]]>
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          Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
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          <![CDATA[<400>  9]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 
                      100                 105                 110         
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Anti-PDL1的輕鏈可變區的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
          Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Thr 
                      20                  25                  30          
          Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  330]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人IgG1重鏈恆定區的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人Kappa輕鏈恆定區的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  447]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Anti-PDL1的重鏈的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 
              210                 215                 220                 
          Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 
                          245                 250                 255     
          Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 
                      260                 265                 270         
          Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 
                  275                 280                 285             
          Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 
              290                 295                 300                 
          Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 
                          325                 330                 335     
          Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 
                      340                 345                 350         
          Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 
                  355                 360                 365             
          Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 
              370                 375                 380                 
          Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 
                          405                 410                 415     
          Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 
                      420                 425                 430         
          His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  435                 440                 445         
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  1341]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Anti-PDL1的重鏈的核�˙藹レC]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          caggtccagc tgcagcagtc aggagggggc ctggtgaagc catcacagag cctgtccctg       60
          acctgcacag tctctgggtt cagtctgact tcatacggag tgcactgggt ccgacagccc      120
          cctggaaagg gactggagtg gatcggcctg atttggtctg gcgggggaac agactataac      180
          cccagcctga aatcccggct gaccatctct agagatacca gtaagaatca agtgagcttt      240
          aaaattagct ccctgacagc cgctgacact gcagtgtact attgtgcaag gcagctggga      300
          ctgcgagcta tggattactg gggacagggc acttccgtga ccgtctctag tgcgagcacc      360
          aagggacctt ccgtgtttcc cctcgccccc agctccaaaa gcaccagcgg cggaacagct      420
          gctctcggct gtctcgtcaa ggattacttc cccgagcccg tgaccgtgag ctggaacagc      480
          ggagccctga caagcggcgt ccacaccttc cctgctgtcc tacagtcctc cggactgtac      540
          agcctgagca gcgtggtgac agtccctagc agctccctgg gcacccagac atatatttgc      600
          aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtcgataaga aggtggagcc taagtcctgc      660
          gacaagaccc acacatgtcc cccctgtccc gctcctgaac tgctgggagg cccttccgtg      720
          ttcctgttcc cccctaagcc caaggacacc ctgatgattt ccaggacacc cgaggtgacc      780
          tgtgtggtgg tggacgtcag ccacgaggac cccgaggtga aattcaactg gtacgtcgat      840
          ggcgtggagg tgcacaacgc taagaccaag cccagggagg agcagtacaa ttccacctac      900
          agggtggtgt ccgtgctgac cgtcctccat caggactggc tgaacggcaa agagtataag      960
          tgcaaggtga gcaacaaggc cctccctgct cccatcgaga agaccatcag caaagccaag     1020
          ggccagccca gggaacctca agtctatacc ctgcctccca gcagggagga gatgaccaag     1080
          aaccaagtga gcctcacatg cctcgtcaag ggcttctatc cttccgatat tgccgtcgag     1140
          tgggagtcca acggacagcc cgagaacaac tacaagacaa caccccccgt gctcgattcc     1200
          gatggcagct tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agtccagatg gcaacaaggc     1260
          aacgtcttca gttgcagcgt catgcatgag gccctccaca accactacac ccagaagagc     1320
          ctctccctga gccctggaaa g                                               1341
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Anti-PDL1的輕鏈的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
          Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Thr 
                      20                  25                  30          
          Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  642]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Anti-PDL1的輕鏈的核�˙藹レC]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          gaaatcgtgc tgacacagag ccctgacttt ctgtccgtga cacccaagga gaaagtcact       60
          atcacctgcc gggctagcca gtccatcgga accacaattc actggtacca gcagaagccc      120
          gaccagagcc ctaagctgct gattaaatat gcctctcaga gtttctcagg cgtgccatcc      180
          agatttagcg gctccgggtc tggaactgac ttcacactga ctatcaactc tgtcgaggca      240
          gaagatgccg ctacctacta ttgtcagcag agtaattcat ggcccctgac ctttggcgcc      300
          gggacaaagc tggaaattaa aagaaccgtc gccgctccca gcgtcttcat cttccccccc      360
          agcgatgagc agctgaagag cggaaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac      420
          cccagggagg ccaaggtgca atggaaggtg gacaacgccc tacagagcgg caactcccag      480
          gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggat agcacctaca gcctgagcag caccctcacc      540
          ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccatcagggc      600
          ctgagcagcc ctgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc                         642
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Anti-PDL1的重鏈互補決定區H-CDR1的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Ser Tyr Gly Val His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Anti-PDL1的重鏈互補決定區H-CDR2的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Anti-PDL1的重鏈互補決定區H-CDR3的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Anti-PDL1的輕鏈互補決定區L-CDR1的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Thr Ile His 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Anti-PDL1的輕鏈互補決定區L-CDR2的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Anti-PDL1的輕鏈互補決定區L-CDR3的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Atezolizumab的重鏈可變區的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 
                      20                  25                  30          
          Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Atezolizumab的輕鏈可變區的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  117]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  mAb1-25-Hu(609)的重鏈可變區的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser 
                  115         
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  mAb1-25-Hu(609)的輕鏈可變區的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe 
                      20                  25                  30          
          Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  327]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG4(S228P)重鏈恆定區的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
              130                 135                 140                 
          Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
                      180                 185                 190         
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                          245                 250                 255     
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                      260                 265                 270         
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                  275                 280                 285             
          Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 
              290                 295                 300                 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 
                          325         
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 連接子(GGGGSGGGGSGGGGS)]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  674]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PDL1-Fab-609-IgG4的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 
                          245                 250                 255     
          Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 
                      260                 265                 270         
          Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr 
                  275                 280                 285             
          Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Asn Ser His Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val 
                          325                 330                 335     
          Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 
                      340                 345                 350         
          Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 
                  355                 360                 365             
          Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 
              370                 375                 380                 
          Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 
                          405                 410                 415     
          Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 
                      420                 425                 430         
          Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 
                  435                 440                 445             
          Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 
              450                 455                 460                 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 
                          485                 490                 495     
          Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                      500                 505                 510         
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 
                  515                 520                 525             
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
              530                 535                 540                 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 
          545                 550                 555                 560 
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                          565                 570                 575     
          Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                      580                 585                 590         
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
                  595                 600                 605             
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
              610                 615                 620                 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                          645                 650                 655     
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 
                      660                 665                 670         
          Gly Lys 
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  2022]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PDL1-Fab-609-IgG4的核�˙藹レC]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          caggtccagc tgcagcagtc aggagggggc ctggtgaagc catcacagag cctgtccctg       60
          acctgcacag tctctgggtt cagtctgact tcatacggag tgcactgggt ccgacagccc      120
          cctggaaagg gactggagtg gatcggcctg atttggtctg gcgggggaac agactataac      180
          cccagcctga aatcccggct gaccatctct agagatacca gtaagaatca agtgagcttt      240
          aaaattagct ccctgacagc cgctgacact gcagtgtact attgtgcaag gcagctggga      300
          ctgcgagcta tggattactg gggacagggc acttccgtga ccgtctctag tgcaagtacc      360
          aagggaccta gtgttttccc tcttgcacct tgctccaggt caacatcaga gtccacagct      420
          gctcttggat gtctcgttaa ggactacttc ccagagccag ttaccgtatc ctggaactcc      480
          ggagctttga caagcggcgt tcatacattc ccagctgtgt tgcagagttc tgggttgtac      540
          agtttgagct cagtggtgac cgtgccttca tcttctttgg gcactaagac ctacacctgc      600
          aacgtggatc acaagccaag caacaccaag gtggataaga gggtgggtgg aggcggttca      660
          ggcggaggtg gcagcggagg tggcgggagt gaggtcaagc tggtggaaag cggcggcggc      720
          ctggtgcagc ctggaggatc cctgcggctg agctgcgctg cctccggctt cgctttcagc      780
          tcctatgaca tgtcctgggt gaggcaggcc cctggaaaga ggctggagtg ggtggctacc      840
          atctccggag gcggaaggta cacctactac cccgacacag tgaagggaag gttcaccatc      900
          agccgggata acgccaaaaa cagccactat ctccagatga actccctgag ggccgaagat      960
          acagccgtgt atttctgtgc ctccccctac ggaggctatt ttgacgtgtg gggacagggc     1020
          accctggtga ccgtctcctc cgcaagtacc aagggaccta gtgttttccc tcttgcacct     1080
          tgctccaggt caacatcaga gtccacagct gctcttggat gtctcgttaa ggactacttc     1140
          ccagagccag ttaccgtatc ctggaactcc ggagctttga caagcggcgt tcatacattc     1200
          ccagctgtgt tgcagagttc tgggttgtac agtttgagct cagtggtgac cgtgccttca     1260
          tcttctttgg gcactaagac ctacacctgc aacgtggatc acaagccaag caacaccaag     1320
          gtggataaga gggtggagtc caagtacggc ccaccatgtc ctccatgtcc agcccctgaa     1380
          tttttgggcg ggccttctgt ctttctgttt cctcctaaac ctaaagatac cctgatgatc     1440
          agccgcacac ccgaagtcac ttgtgtggtc gtggatgtgt ctcaggaaga tcccgaagtg     1500
          cagtttaact ggtatgtcga tggcgtggaa gtgcataatg ccaaaactaa gccccgcgaa     1560
          gaacagttca acagcactta tcgggtcgtg tctgtgctca cagtcctcca tcaggattgg     1620
          ctgaatggga aagaatataa gtgcaaggtg agcaataagg gcctccccag cagcatcgag     1680
          aagactatta gcaaagccaa agggcagcca cgggaacccc aggtgtacac tctgcccccc     1740
          tctcaggagg agatgactaa aaatcaggtc tctctgactt gtctggtgaa agggttttat     1800
          cccagcgaca ttgccgtgga gtgggagtct aatggccagc ccgagaataa ttataagaca     1860
          actccccccg tcctggactc tgacggcagc tttttcctgt attctcggct gacagtggac     1920
          aaaagtcgct ggcaggaggg caatgtcttt agttgcagtg tcatgcatga ggccctgcac     1980
          aatcactata cacagaaaag cctgtctctg agtctgggca aa                        2022
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  674]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  609-Fab-PDL1-IgG4的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 
                          245                 250                 255     
          Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly 
                      260                 265                 270         
          Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp 
                  275                 280                 285             
          Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 
              290                 295                 300                 
          Lys Asn Gln Val Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr 
                          325                 330                 335     
          Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 
                      340                 345                 350         
          Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 
                  355                 360                 365             
          Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 
              370                 375                 380                 
          Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 
                          405                 410                 415     
          Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 
                      420                 425                 430         
          Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 
                  435                 440                 445             
          Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 
              450                 455                 460                 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 
                          485                 490                 495     
          Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                      500                 505                 510         
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 
                  515                 520                 525             
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
              530                 535                 540                 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 
          545                 550                 555                 560 
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                          565                 570                 575     
          Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                      580                 585                 590         
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
                  595                 600                 605             
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
              610                 615                 620                 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                          645                 650                 655     
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 
                      660                 665                 670         
          Gly Lys 
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  2022]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  609-Fab-PDL1-IgG4的核�˙藹レC]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          gaggtcaagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgcggctg       60
          agctgcgctg cctccggctt cgctttcagc tcctatgaca tgtcctgggt gaggcaggcc      120
          cctggaaaga ggctggagtg ggtggctacc atctccggag gcggaaggta cacctactac      180
          cccgacacag tgaagggaag gttcaccatc agccgggata acgccaaaaa cagccactat      240
          ctccagatga actccctgag ggccgaagat acagccgtgt atttctgtgc ctccccctac      300
          ggaggctatt ttgacgtgtg gggacagggc accctggtga ccgtctcctc cgcaagtacc      360
          aagggaccta gtgttttccc tcttgcacct tgctccaggt caacatcaga gtccacagct      420
          gctcttggat gtctcgttaa ggactacttc ccagagccag ttaccgtatc ctggaactcc      480
          ggagctttga caagcggcgt tcatacattc ccagctgtgt tgcagagttc tgggttgtac      540
          agtttgagct cagtggtgac cgtgccttca tcttctttgg gcactaagac ctacacctgc      600
          aacgtggatc acaagccaag caacaccaag gtggataaga gggtgggtgg aggcggttca      660
          ggcggaggtg gcagcggagg tggcgggagt caggtccagc tgcagcagtc aggagggggc      720
          ctggtgaagc catcacagag cctgtccctg acctgcacag tctctgggtt cagtctgact      780
          tcatacggag tgcactgggt ccgacagccc cctggaaagg gactggagtg gatcggcctg      840
          atttggtctg gcgggggaac agactataac cccagcctga aatcccggct gaccatctct      900
          agagatacca gtaagaatca agtgagcttt aaaattagct ccctgacagc cgctgacact      960
          gcagtgtact attgtgcaag gcagctggga ctgcgagcta tggattactg gggacagggc     1020
          acttccgtga ccgtctctag tgcaagtacc aagggaccta gtgttttccc tcttgcacct     1080
          tgctccaggt caacatcaga gtccacagct gctcttggat gtctcgttaa ggactacttc     1140
          ccagagccag ttaccgtatc ctggaactcc ggagctttga caagcggcgt tcatacattc     1200
          ccagctgtgt tgcagagttc tgggttgtac agtttgagct cagtggtgac cgtgccttca     1260
          tcttctttgg gcactaagac ctacacctgc aacgtggatc acaagccaag caacaccaag     1320
          gtggataaga gggtggagtc caagtacggc ccaccatgtc ctccatgtcc agcccctgaa     1380
          tttttgggcg ggccttctgt ctttctgttt cctcctaaac ctaaagatac cctgatgatc     1440
          agccgcacac ccgaagtcac ttgtgtggtc gtggatgtgt ctcaggaaga tcccgaagtg     1500
          cagtttaact ggtatgtcga tggcgtggaa gtgcataatg ccaaaactaa gccccgcgaa     1560
          gaacagttca acagcactta tcgggtcgtg tctgtgctca cagtcctcca tcaggattgg     1620
          ctgaatggga aagaatataa gtgcaaggtg agcaataagg gcctccccag cagcatcgag     1680
          aagactatta gcaaagccaa agggcagcca cgggaacccc aggtgtacac tctgcccccc     1740
          tctcaggagg agatgactaa aaatcaggtc tctctgactt gtctggtgaa agggttttat     1800
          cccagcgaca ttgccgtgga gtgggagtct aatggccagc ccgagaataa ttataagaca     1860
          actccccccg tcctggactc tgacggcagc tttttcctgt attctcggct gacagtggac     1920
          aaaagtcgct ggcaggaggg caatgtcttt agttgcagtg tcatgcatga ggccctgcac     1980
          aatcactata cacagaaaag cctgtctctg agtctgggca aa                        2022
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030

Claims (15)

  1. 一種結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段，包括： (a) 重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，該H-CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，該H-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，該H-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，和 (b) 輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，該L-CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，該L-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，該L-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
  2. 如請求項1所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
  3. 如請求項2所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
  4. 如請求項1所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段或單鏈抗體。
  5. 如請求項1-4任一項所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段，其中該結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
  6. 如請求項1-5任一項所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段，其中該結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段的重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
  7. 一種分離的核苷酸，該核苷酸編碼如請求項1-6任一項所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段。
  8. 如請求項7所述的分離的核苷酸，其中編碼該結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段的重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，編碼輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
  9. 一種表達載體，所述的表達載體含有請求項7-8任一項所述的分離的核苷酸。
  10. 一種宿主細胞，該宿主細胞含有請求項9所述的表達載體。
  11. 一種結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段的製備方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟： (a) 在表達條件下，培養如請求項10所述的宿主細胞，從而表達該結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段； (b) 分離並純化 (a) 所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段。
  12. 一種藥物組合物，所述藥物組合物含有請求項1-6任一項所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的載體。
  13. 一種如請求項1所述的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段或請求項12所述的藥物組合物在製備治療PD-L1過表達的疾病的藥物中的用途。
  14. 一種如請求項13所述的用途，其中該PD-L1過表達的疾病為癌症。
  15. 如請求項14所述的用途，其中該癌症選自由以下組成的組：黑素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、白血病和淋巴瘤。
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