CN113754774A

CN113754774A - 一种抗pd-l1和egfr的四价双特异性抗体

Info

Publication number: CN113754774A
Application number: CN202010487620.8A
Authority: CN
Inventors: 朱祯平; 黄浩旻; 赵杰
Original assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Current assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Priority date: 2020-06-02
Filing date: 2020-06-02
Publication date: 2021-12-07
Also published as: CN115698085A; TW202146446A; WO2021244553A1

Abstract

本发明提供了一种抗PD‑L1和EGFR的四价双特异性抗体。本发明的四价双特异性抗体不需要进行Fc修饰，不会产生错配问题，制备方法简便，具有与单抗相似甚至更优的生物学活性和理化性质。

Description

一种抗PD-L1和EGFR的四价双特异性抗体

技术领域

本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明公开了一种抗PD-L1和EGFR的四价双特异性抗体。

背景技术

人程序性细胞死亡受体-1(PD-1)是一种有288个氨基酸的I型膜蛋白，是已知的主要免疫检查点(Immune Checkpoint)之一(Blank et al,2005,Cancer Immunotherapy,54:307-314)。PD-1表达在已经激活的T淋巴细胞，它与配体PD-L1(程序性细胞死亡受体-配体1，programmed cell death-Ligand 1)和PD-L2(程序性细胞死亡受体-配体2，programmedcell death-Ligand 2)结合可以抑制T淋巴细胞的活性及相关的体内细胞免疫反应。PD-L2主要表达在巨噬细胞和树突状细胞，而PD-L1则广泛表达于B、T淋巴细胞及外周细胞如微血管上皮细胞，肺、肝、心等组织细胞中。大量研究表明，PD-1和PD-L1的相互作用不但是维持体内免疫系统平衡所必须，也是导致PD-L1表达阳性肿瘤细胞规避免疫监视的主要机制和原因。通过阻断癌细胞对PD-1/PD-L1信号通路的负调控，激活免疫系统，能够促进T细胞相关的肿瘤特异性细胞免疫反应，从而打开了一扇新的肿瘤治疗方法的大门--肿瘤免疫疗法。

PD-1(由基因Pdcd1编码)为与CD28和CTLA-4有关的免疫球蛋白超家族成员。研究成果显示，当PD-1与其配体(PD-L1和/或PD-L2)结合时会负调节抗原受体信号转导。目前已弄清鼠PD-1结构以及小鼠PD-1与人PD-L1的共结晶结构(Zhang，X.等，Immunity 20：337-347(2004)；Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：3011-6(2008))。PD-1及类似的家族成员为I型跨膜糖蛋白，其含有负责配体结合的Ig可变型(V-型)结构域和负责结合信号转导分子的胞质尾区。PD-1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体ITIM(免疫受体酪氨酸抑制作用模体)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。

PD-1在肿瘤的免疫逃避机制中起到了重要的作用。肿瘤免疫疗法，即利用人体自身的免疫系统抵御癌症，是一种突破性的肿瘤治疗方法，但是肿瘤微环境可保护肿瘤细胞免受有效的免疫破坏，因此如何打破肿瘤微环境成为抗肿瘤研究的重点。现有研究成果已确定了PD-1在肿瘤微环境中的作用：PD-L1在许多小鼠和人肿瘤中表达(并在大多数PD-L1阴性肿瘤细胞系中可由IFN-γ诱导)，并被推定为介导肿瘤免疫逃避的重要靶点(Iwai Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：12293-12297(2002)；Strome S.E.等，Cancer Res.，63：6501-6505(2003))。通过免疫组织化学评估活组织检查，已经在人的很多原发性肿瘤中发现PD-1(在肿瘤浸润淋巴细胞上)和/或PD-L1在肿瘤细胞上的表达。这样的组织包括肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌和胰腺癌以及头颈肿瘤等。由此可见，阻断PD-1/PD-L1的相互作用可以提高肿瘤特异性T细胞的免疫活性，有助于免疫系统清除肿瘤细胞，因此PD-L1成为开发肿瘤免疫治疗药物的热门靶点。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR的突变或异常表达在肿瘤的生长、发展中扮演着重要作用。抗EGFR单克隆抗体药物具有阻滞肿瘤细胞周期进程、加速肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤浸润和转移、增强放化疗效果等功能，作用机理清晰，因而在癌症治疗方面备受关注。以EGFR为靶点的抗肿瘤治疗已成为癌症研究中十分活跃的领域之一，并且取得了巨大的进展。但是以EGFR为靶点的抗肿瘤治疗依然还存在很多缺陷等着去完善。

双特异性抗体是指能同时特异性结合两种抗原或两种表位的抗体分子。根据对称性，双特异性抗体可以分为结构对称的和不对称的分子。根据结合位点的多少，双特异性抗体可以分为二价、三价、四价和多价分子。双特异性抗体正在逐步成为一类新的治疗性抗体，可以用于治疗各种炎性疾病、癌症和其它疾病。虽然最近报道了大量新的双特异性抗体的构造形式，然而，生产双特异性抗体的主要技术难点在于获得正确配对的分子。目前现有的双特异性抗体的形式均存在错配的问题，因此会产生一种或多种错配导致的副产物或者聚集体，从而影响目的双特异性抗体的产率、纯度和理化稳定性，进而影响双特异性抗体在体内的安全性和有效性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗PD-L1和EGFR的四价双特异性抗体。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种抗PD-L1和EGFR的四价双特异性抗体。

本发明的第二个目的在于提供一种编码所述的四价双特异性抗体的分离的核苷酸。

本发明的第三个目的在于提供一种包含所述的核苷酸的表达载体。

本发明的第四个目的在于提供一种包含所述的表达载体的宿主细胞。

本发明的第五个目的在于提供所述的四价双特异性抗体的制备方法。

本发明的第六个目的在于提供包含所述的四价双特异性抗体的药物组合物。

本发明的第七个目的在于提供所述的四价双特异性抗体或所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。

本发明的第八个目的在于提供所述的四价双特异性抗体或所述的药物组合物用于治疗癌症的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明的第一个方面提供了一种抗PD-L1和EGFR的四价双特异性抗体，包含两条多肽链和四条共同轻链，其中，所述多肽链具有如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，所述共同轻链具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

本发明的第二个方面提供了一种分离的核苷酸，所述的核苷酸编码所述的四价双特异性抗体。

根据本发明的优选实施例，所述的核苷酸编码所述多肽链和所述共同轻链，其中，编码所述多肽链的核苷酸序列如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示，编码所述共同轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

本发明的第三个方面提供了一种表达载体，所述的表达载体含有如上所述的核苷酸。

本发明的第四个方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如上所述的表达载体。

本发明的第五个方面提供了所述的四价双特异性抗体的制备方法，所述方法包含以下步骤：

(a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而表达所述的四价双特异性抗体；

(b)分离并纯化(a)所述的四价双特异性抗体。

本发明的第六个方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的四价双特异性抗体和药学上可接受的载体。

本发明的第七个方面提供了如上所述的四价双特异性抗体或如上所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。

根据本发明，所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤及其它赘生性恶性疾病等。

本发明的第八个方面提供了一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用如上所述的四价双特异性抗体或如上所述的药物组合物。

有益效果：本发明提供了一种抗PD-L1和EGFR的四价双特异性抗体。本发明的四价双特异性抗体不需要进行Fc修饰，不会产生错配问题，制备方法简便，具有与单抗相似甚至更优的生物学活性和理化性质。

附图说明

图1为本发明的双特异性抗体的结构示意图，其中，VH-A表示Anti-PDL1或Cetuximab的重链可变区，VH-B表示Cetuximab或Anti-PDL1的重链可变区，VL表示共同轻链的轻链可变区，CH1、CH2和CH3是重链恒定区的三个结构域，CL是共同轻链的轻链恒定区，两条重链之间的线段表示二硫键，重链和轻链之间的线段也表示二硫键，靠近多肽链N末端的CH1和VH-A之间的线段表示人工设计的连接子，靠近多肽链C末端的CH1和CH2之间的线段表示抗体天然的连接子和铰链区(如果重链是人IgG4亚型，铰链区会含有S228P点突变，根据EU编码)。

图2为Cetuximab和Anti-PDL1及其杂合抗体的ELISA结果；其中，图2A和图2B为分别用PD-L1-His和EGFR-ECD-hFc包被酶标板。

图3为PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1的ELISA结果；其中，图3A和图3B为分别用PD-L1-His和EGFR-ECD-hFc包被酶标板。

图4为评估PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1抑制A431细胞增殖的功能活性的结果。

图5为Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的HPLC-SEC图谱；其中，图5A表示Anti-PDL1的HPLC-SEC图谱，图5B表示PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的HPLC-SEC图谱。

图6为Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的NR-CE-SDS和R-CE-SDS图谱；其中，图6A和图6B分别表示Anti-PDL1的NR-CE-SDS和R-CE-SDS图谱，图6C和图6D分别表示PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的NR-CE-SDS和R-CE-SDS图谱。

具体实施方式

本发明中涉及的序列信息总结在表1中。

表1、本发明的抗体的序列信息

SEQ ID NO：	序列名称
		1	Anti-PDL1的重链可变区的氨基酸序列
2	Anti-PDL1的轻链可变区的氨基酸序列
		3	人IgG1重链恒定区的氨基酸序列
4	Anti-PDL1的重链的氨基酸序列
		5	Anti-PDL1的重链的核苷酸序列
6	人Kappa轻链恒定区的氨基酸序列
		7	Anti-PDL1的轻链的氨基酸序列
8	Anti-PDL1的轻链的核苷酸序列
		9	Cetuximab的重链可变区的氨基酸序列
10	Cetuximab的轻链可变区的氨基酸序列
		11	连接子(GGGGSGGGGSGGGGS)
12	PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的氨基酸序列
		13	PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的核苷酸序列
14	Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1的氨基酸序列
		15	Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1的核苷酸序列

本发明中，术语“抗体(Antibody，缩写Ab)”和“免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，缩写IgG)”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型(isotype)的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是恒定区，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区，轻链恒定区包括一个结构域CL；轻链的恒定区与重链恒定区的CH1结构域配对，轻链的可变区与重链的可变区配对。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重链恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型；轻链恒定区包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗体的重链和轻链通过重链的CH1结构域和轻链的CL结构域之间的二硫键共价连接在一起，抗体的两条重链通过铰链区之间形成的多肽间二硫键共价连接在一起。

本发明中，术语“双特异性抗体(双抗)”是指能同时特异性结合两种抗原(靶点)或两种表位的抗体分子。

本发明中，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同抗原决定簇的不同抗体的混合物)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们可以通过杂交瘤培养来合成，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本发明中，术语“人源化”是指其CDR来源于非人物种(优选小鼠)抗体，抗体分子中残余的部分(包括框架区和恒定区)来源于人抗体。此外，框架区残基可被改变以维持结合亲和性。

本发明中，术语“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可将抗体裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段。Fab段由抗体的重链的VH和CH1以及轻链的VL和CL结构域组成。Fc段即可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗体的CH2和CH3结构域组成。Fc段无抗原结合活性，是抗体与效应分子或细胞相互作用的部位。

本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于重链可变区和轻链可变区中称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(frame region，FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。

本发明中，术语“抗”、“结合”和“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。通常，抗体以小于大约10^-7M，例如小于大约10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或更小的平衡解离常数(KD)结合该抗原。本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。例如，使用表面等离子体共振术(Surface Plasmon Resonance，缩写SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。

本发明中，术语“价”是指抗体分子中存在指定数量的抗原结合位点。优选的，本发明的双特异性抗体具有四个抗原结合位点，是四价的。本发明中，抗原结合位点包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

本发明中，术语“表位”是指与抗体特异性结合的多肽决定簇。本发明的表位是抗原中被抗体结合的区域。

本发明中，术语“共同轻链”是指包含相同的轻链可变区和轻链恒定区的轻链，其能够与结合第一抗原的第一抗体的重链配对，形成特异性结合第一抗原的结合位点，也能够与结合第二抗原的第二抗体的重链配对，形成特异性结合第二抗原的结合位点。进一步的，共同轻链的轻链可变区与第一抗体的重链可变区形成第一抗原结合位点，共同轻链的轻链可变区与第二抗体的重链可变区形成第二抗原结合位点。

本发明中，术语“表达载体”可以为pTT5，pSECtag系列，pCGS3系列，pcDNA系列载体等，以及其它用于哺乳动物表达系统的载体等，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

本发明中，术语“宿主细胞”是指适用于表达上述表达载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达，CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)，HEK293，COS，BHK以及上述细胞的衍生细胞均可适用于本发明。

本发明中，术语“药物组合物”是指本发明的四价双特异性抗体可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段或四价双特异性抗体的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。

以下实施例中使用的蛋白表达和纯化方法说明如下：将目的基因构建到表达载体pcDNA4中，利用PEI(Polyethylenimine)将构建好的表达载体或表达载体的组合转入FreeStyle ^TM293-F细胞(后文简称HEK293F，购自Thermo Fisher Scientific)中以表达抗体或重组蛋白，HEK293F细胞在Free Style 293Expression Medium(购自Thermo FisherScientific)中培养5天后收取细胞上清，然后用ProteinA亲和层析或镍亲和层析纯化抗体或重组蛋白。

以下实施例中使用的理化性质检测方法说明如下：

HPLC-SEC

抗体是高分子量蛋白质，具有高度复杂的二级和三级结构。由于翻译后修饰、聚集和降解等变化，抗体在生物化学和生物物理特性方面是异质的。当通过分离技术分析双特异性抗体时，通常会观察到变体、聚集体和降解片段，它们的存在可能会损害安全性和有效性。在生产和存储抗体的过程中容易出现聚集体、降解片段和不完整组装的分子。本发明使用高效液相色谱-尺寸排阻色谱(High-performance liquid chromatography–sizeexclusion chromatography，HPLC-SEC)检测样品中上述杂质的含量。聚集体的分子量要大于单体，因此相应峰的保留时间较短；降解片段或不完整组装分子的分子量要小于单体，因此相应峰的保留时间较长。HPLC-SEC所用色谱仪为Dionex Ultimate 3000；流动相配制方法如下：取适量20mM磷酸二氢钠母液，用20mM磷酸氢二钠调节PH至6.8±0.1；进样量：20μg；色谱柱为TSK G3000SWXL，规格为7.8×300mm 5μm；流速0.5ml/min，洗脱时间30min；柱温25℃，样品室温度10℃；检测波长214nm。

CE-SDS

本发明使用CE-SDS(Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate)分析样品中降解片段或不完整组装的分子的含量。CE分为非还原和还原两种类型，用于前者的样品在变性时不需要用还原剂DTT将分子内的二硫键破坏，而用于后者的样品在变性时需要用还原剂DTT将分子内的二硫键破坏。非还原和还原CE-SDS分别记作NR-CE-SDS和R-CE-SDS。所用毛细管电泳仪为ProteomeLab^TM PA800 plus(Beckman Coulter)，配备UV214nm检测器，毛细管型号为Bare Fused-Silica Capillary，规格30.7cm×50μm，有效长度20.5cm；其它相关试剂购自Beckman Coulter。仪器关键参数设置如下：毛细管和样品室温度为20±2℃，分离电压为15kV。

以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

实施例1 抗PD-L1和EGFR的双特异性抗体的构建

实施例1.1 序列

Anti-PDL1是抗人PD-L1的人源化单抗，其重链可变区和轻链可变区序列(SEQ IDNO：1和2)来源于PCT/CN2020/090442。将合成的人源化重链可变区与人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：3)相连，获得全长的人源化重链基因，命名为Anti-PDL1-HC(SEQ ID NO：4和5)；将人源化轻链可变区与人Kappa链恒定区(SEQ ID NO：6)相连，获得全长的人源化轻链基因，命名为Anti-PDL1-LC(SEQ ID NO：7和8)。

从公开的文献资料(Magdelaine-Beuzelin C,Kaas Q,Wehbi V,etal.Structure–function relationships of the variable domains of monoclonalantibodies approved for cancer treatment[J].Critical reviews in oncology/hematology,2007,64(3):210-225.)中获得Cetuximab抗体的重链可变区和轻链可变区序列(SEQ ID NO：9和10)。由上海生工生物工程有限公司合成编码其重链可变区(Cetuximab-VH)和轻链可变区(Cetuximab-VL)的DNA。Cetuximab-VH和Cetuximab-VL分别与人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：3)和人Kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：6)相连，构建成全长的Cetuximab抗体的重链和轻链基因，分别命名为Cetuximab-HC和Cetuximab-LC。

实施例1.2 共同轻链的选择

用BLAST对Anti-PDL1轻链可变区与Cetuximab轻链可变区的氨基酸序列进行对比分析，结果显示，两者之间完全相同的氨基酸占比75％(Identities)，性质相似的氨基酸占比89％(Positives)。

将Cetuximab-HC和Cetuximab-LC的基因序列分别构建到pcDNA4表达载体中。将Anti-PDL1-HC、Anti-PDL1-LC、Cetuximab-HC和Cetuximab-LC的表达载体按照下述方式进行组合：Anti-PDL1-HC+Anti-PDL1-LC、Cetuximab-HC+Cetuximab-LC、Anti-PDL1-HC+Cetuximab-LC和Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC，表达纯化抗体，所得的抗体分别命名为Anti-PDL1、Cetuximab、Anti-PDL1-HC+Cetuximab-LC和Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC。

PD-L1的胞外区编码基因来源如WO2018/137576A1中所述。利用基因重组技术，在PD-L1的胞外区编码基因末端连接多聚组氨酸编码序列，然后将重组基因克隆到pcDNA4表达载体中，表达并纯化重组蛋白，所得重组蛋白命名为PD-L1-His。利用基因重组技术，在人EGFR的胞外区(序列来自NCBI，Accession：NP_005219)编码基因末端连接人IgG1的Fc段编码序列，然后将重组基因克隆到pcDNA4表达载体中，表达并纯化重组蛋白，所得重组蛋白命名为EGFR-ECD-hFc。用EGFR-ECD-hFc和PD-L1-His分别包被酶标板，包被浓度分别为40ng/孔和10ng/孔。用含有1％牛血清白蛋白的PBST(KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl8.0g，KCl 0.2g，Tween-20 0.5ml，加纯水至1L)封闭酶标板。将待测抗体进行梯度稀释，然后转移到上述包被重组蛋白的酶标板中，室温孵育半小时后洗板；加入适当稀释的HRP(Horseradish Peroxidase)标记的羊抗人抗体(Fab-specific，购自Sigma)，室温孵育半小时后洗板；每孔加入100μl以TMB为底物的显色液(底物显色A液：醋酸钠·三水13.6g，柠檬酸·一水1.6g，30％双氧水0.3ml，纯水500ml；底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸·一水0.95g，甘油50ml，TMB 0.15g溶于3ml DMSO中，纯水500ml；使用前A和B液等体积混匀)，室温孵育1～5min；加50μl终止液(2M H₂SO₄)终止反应；酶标仪(SpectraMax190)读取OD450，用GraphPad Prism6进行作图和数据分析，并计算EC50。

如图2A所示，Anti-PDL1能够有效结合PD-L1-His，EC50是0.0924nM；而Cetuximab、Anti-PDL1-HC+Cetuximab-LC和Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC均不能结合PD-L1-His。如图2B所示，Cetuximab和Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC均能有效结合EGFR-ECD-hFc，EC50为0.2096nM和0.2484nM，而Anti-PDL1和Anti-PDL1-HC+Cetuximab-LC不能有效结合EGFR-ECD-hFc。在此选择Anti-PDL1-LC(SEQ ID NO：7和8)作为共同轻链构建双特异性抗体。

实施例1.3 双特异抗体的构建

将Anti-PDL1的重链可变区与人IgG4的CH1结构域相连，然后再通过人工连接子(在此使用的连接子是三个串联的GGGGS，SEQ ID NO：11)连接Cetuximab的重链可变区，最后再连接人IgG1的重链恒定区(CH1+CH2+CH3)，通过此程序构建成的含有两个重链可变区和两个CH1结构域的长重链基因命名为PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1(SEQ ID NO：12和13)。相似地，将Cetuximab的重链可变区与人IgG4的CH1结构域相连，然后再通过人工连接子(在此使用的连接子是三个串联的GGGGS，SEQ ID NO：11)连接Anti-PDL1的重链可变区，最后再连接人IgG1的重链恒定区(CH1+CH2+CH3)，通过此程序构建成的含有两个重链可变区和两个CH1结构域的长重链基因命名为Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1(SEQ ID NO：14和15)。

将上述序列分别构建到pcDNA4表达载体中，将PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1表达载体分别与Anti-PDL1-LC表达载体组合，表达纯化抗体，所得的抗体分别命名为PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1(为简明起见，此处只取重链的名字作为抗体的名称)。

实施例2 ELISA测定相对亲和力

ELISA检测方法参照实施例1.2中所述。

如图3A所示，Anti-PDL1、PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1均能有效结合PD-L1-His，EC50分别是0.2177nM、0.2003nM和0.3356nM。如图3B所示，Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC、PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1均能有效结合EGFR-ECD-hFc，EC50分别是0.2253nM、0.2388nM和0.1852nM。上述结果显示，PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1既能够结合PD-L1又能结合EGFR，这说明它们是双特异性抗体。

实施例3 评估抑制A431细胞增殖的功能活性

A431(

CRL-1555^TM)是人类表皮癌细胞系，过量表达野生型EGFR。抗EGFR抗体能够在体外和体内抑制A431细胞的增殖。

本实施例评估上述抗体抑制A431细胞增殖的功能活性。方法如下：用DMEM将处于对数生长期的A431细胞洗2遍，1000rpm离心5min；用含1％胎牛血清的DMEM(胎牛血清和DMEM购自Gibco)将细胞重悬到适当密度，接种到96孔板中，10⁴个/150μl/孔；然后在含1％胎牛血清的DMEM中将上述抗体进行梯度稀释；将稀释好的抗体加入上述接种A431细胞的96孔板中，50μl/孔；在37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育3天；3天后每孔加入20μl CCK-8(购自Dojindo)溶液，在培养箱中继续孵育4小时；用酶标仪读取OD450；GraphPad Prism6进行数据分析，作图并计算IC50。

如图4所示，Cetuximab、Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC、PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1均能有效抑制A431细胞的增殖，IC50分别是0.6322nM、0.5629nM、0.7094nM和0.9597nM。

实施例4 Biacore测定亲和力

在此通过Biacore 8K(GE healthcare)检测上述抗体与PD-L1或EGFR之间的亲和力。在Biacore 8K上，使用偶联有Protein A/G的芯片分别捕获各种抗体，再将重组蛋白PD-L1-His(自制)或EGFR-His(带有His标签的EGFR重组蛋白，购自北京义翘神州)进样，得到结合-解离曲线，用6M盐酸胍再生缓冲液洗脱后重复下一个循环；利用Biacore 8KEvaluation Software对数据进行分析。结果如表2所示。

表2-1.对PD-L1的结合和解离动力学参数以及平衡解离常数

表2-2.对EGFR的结合和解离动力学参数以及平衡解离常数

表2-1显示，Anti-PDL1、PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1对PD-L1的结合常数(Kon)和解离常数(Koff)十分相近，平衡解离常数(KD)也基本相当，KD分别是9.66E-10、6.46E-10和7.79E-10。表2-2显示，Cetuximab、Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1对EGFR的结合常数(Kon)和解离常数(Koff)十分相近，平衡解离常数(KD)也基本相当，KD分别是6.14E-10、9.46E-10和9.57E-10；与前三者相比，PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1对EGFR的平衡解离常数(KD)略大，为14.2E-10。平衡解离常数(KD)与亲和力高低成反比。

实施例5 物理化学性质的表征

实施例5.1 HPLC-SEC

图5A表示Anti-PDL1的HPLC-SEC图谱，其中存在2个明显的峰，分别是Peak1和Peak2，占比分别为0.2％和99.8％(主峰)。图5B表示PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的HPLC-SEC图谱，其中存在3个明显的峰，分别是Peak1、Peak2和Peak3，占比分别为0.3％、99.5％(主峰)和0.2％。Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的主峰占比相近。

实施例5.2 CE-SDS

图6A和图6B分别表示Anti-PDL1的NR-CE-SDS和R-CE-SDS图谱，图6C和图6D分别表示PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的NR-CE-SDS和R-CE-SDS图谱。Anti-PDL1的NR-CE-SDS主峰Peak8占比98.11％，PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的NR-CE-SDS主峰Peak9占比97.14％。Anti-PDL1的R-CE-SDS主峰Peak5(对应轻链)和Peak10(对应重链)分别占比32.62％和63.55％，两者峰面积之比为1:1.95，两者峰面积占比之和为96.17％；PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的R-CE-SDS主峰Peak4(对应轻链)和Peak11(对应重链)分别占比38.27％和57.37％，两者峰面积之比为2:3.0，两者峰面积占比之和为95.64％。NR-CE-SDS中，Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的主峰占比十分相近；R-CE-SDS中，Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的轻链和重链的峰面积之比均符合预期，两者的主峰占比之和十分相近。

序列表

<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司

<120> 一种抗PD-L1和EGFR的四价双特异性抗体

<130> 2020

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

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65 70 75 80

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115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Thr

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala

65 70 75 80

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

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210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

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260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

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305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 4

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Phe

65 70 75 80

Lys Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

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Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

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325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

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Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210> 5

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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cctggaaagg gactggagtg gatcggcctg atttggtctg gcgggggaac agactataac 180

cccagcctga aatcccggct gaccatctct agagatacca gtaagaatca agtgagcttt 240

aaaattagct ccctgacagc cgctgacact gcagtgtact attgtgcaag gcagctggga 300

ctgcgagcta tggattactg gggacagggc acttccgtga ccgtctctag tgcgagcacc 360

aagggacctt ccgtgtttcc cctcgccccc agctccaaaa gcaccagcgg cggaacagct 420

gctctcggct gtctcgtcaa ggattacttc cccgagcccg tgaccgtgag ctggaacagc 480

ggagccctga caagcggcgt ccacaccttc cctgctgtcc tacagtcctc cggactgtac 540

agcctgagca gcgtggtgac agtccctagc agctccctgg gcacccagac atatatttgc 600

aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtcgataaga aggtggagcc taagtcctgc 660

gacaagaccc acacatgtcc cccctgtccc gctcctgaac tgctgggagg cccttccgtg 720

ttcctgttcc cccctaagcc caaggacacc ctgatgattt ccaggacacc cgaggtgacc 780

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ggcgtggagg tgcacaacgc taagaccaag cccagggagg agcagtacaa ttccacctac 900

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tgcaaggtga gcaacaaggc cctccctgct cccatcgaga agaccatcag caaagccaag 1020

ggccagccca gggaacctca agtctatacc ctgcctccca gcagggagga gatgaccaag 1080

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tgggagtcca acggacagcc cgagaacaac tacaagacaa caccccccgt gctcgattcc 1200

gatggcagct tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agtccagatg gcaacaaggc 1260

aacgtcttca gttgcagcgt catgcatgag gccctccaca accactacac ccagaagagc 1320

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<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

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<210> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Thr

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Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala

65 70 75 80

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85 90 95

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

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Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 8

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

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Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

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100 105 110

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115

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

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65 70 75 80

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<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 12

<211> 679

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

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Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Phe

65 70 75 80

Lys Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

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Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

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Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly

225 230 235 240

Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly

245 250 255

Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly

260 265 270

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp

275 280 285

Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser

290 295 300

Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr

305 310 315 320

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe

325 330 335

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr

340 345 350

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

355 360 365

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

370 375 380

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

385 390 395 400

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

405 410 415

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

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Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

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Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

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Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

580 585 590

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

660 665 670

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

675

<210> 13

<211> 2037

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caggtccagc tgcagcagtc aggagggggc ctggtgaagc catcacagag cctgtccctg 60

acctgcacag tctctgggtt cagtctgact tcatacggag tgcactgggt ccgacagccc 120

cctggaaagg gactggagtg gatcggcctg atttggtctg gcgggggaac agactataac 180

cccagcctga aatcccggct gaccatctct agagatacca gtaagaatca agtgagcttt 240

aaaattagct ccctgacagc cgctgacact gcagtgtact attgtgcaag gcagctggga 300

ctgcgagcta tggattactg gggacagggc acttccgtga ccgtctctag tgcaagtacc 360

aagggaccta gtgttttccc tcttgcacct tgctccaggt caacatcaga gtccacagct 420

gctcttggat gtctcgttaa ggactacttc ccagagccag ttaccgtatc ctggaactcc 480

ggagctttga caagcggcgt tcatacattc ccagctgtgt tgcagagttc tgggttgtac 540

agtttgagct cagtggtgac cgtgccttca tcttctttgg gcactaagac ctacacctgc 600

aacgtggatc acaagccaag caacaccaag gtggataaga gggtgggtgg aggcggttca 660

ggcggaggtg gcagcggagg tggcgggagt caggtgcagc tgaagcagtc cggacctggc 720

ctggtgcagc cttcccagtc cctgtccatc acctgcaccg tgtccggctt ttccctgacc 780

aactacggcg tgcactgggt gaggcagtcc cctggcaagg gcctggaatg gctgggcgtg 840

atctggtccg gcggcaacac cgactacaac acccccttca cctcccggct gtccatcaac 900

aaggacaaca gcaagtccca ggtgttcttc aagatgaact ccctgcagag caacgacacc 960

gccatctact actgcgccag agccctgacc tattacgact acgagttcgc ctactggggc 1020

cagggcacac tggtgaccgt gtccgccgcg agcaccaagg gaccttccgt gtttcccctc 1080

gcccccagct ccaaaagcac cagcggcgga acagctgctc tcggctgtct cgtcaaggat 1140

tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg aacagcggag ccctgacaag cggcgtccac 1200

accttccctg ctgtcctaca gtcctccgga ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgacagtc 1260

cctagcagct ccctgggcac ccagacatat atttgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 1320

accaaggtcg ataagaaggt ggagcctaag tcctgcgaca agacccacac atgtcccccc 1380

tgtcccgctc ctgaactgct gggaggccct tccgtgttcc tgttcccccc taagcccaag 1440

gacaccctga tgatttccag gacacccgag gtgacctgtg tggtggtgga cgtcagccac 1500

gaggaccccg aggtgaaatt caactggtac gtcgatggcg tggaggtgca caacgctaag 1560

accaagccca gggaggagca gtacaattcc acctacaggg tggtgtccgt gctgaccgtc 1620

ctccatcagg actggctgaa cggcaaagag tataagtgca aggtgagcaa caaggccctc 1680

cctgctccca tcgagaagac catcagcaaa gccaagggcc agcccaggga acctcaagtc 1740

tataccctgc ctcccagcag ggaggagatg accaagaacc aagtgagcct cacatgcctc 1800

gtcaagggct tctatccttc cgatattgcc gtcgagtggg agtccaacgg acagcccgag 1860

aacaactaca agacaacacc ccccgtgctc gattccgatg gcagcttctt cctgtactcc 1920

aagctgaccg tggacaagtc cagatggcaa caaggcaacg tcttcagttg cagcgtcatg 1980

catgaggccc tccacaacca ctacacccag aagagcctct ccctgagccc tggaaag 2037

<210> 14

<211> 679

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

210 215 220

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val

245 250 255

Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro

260 265 270

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Trp Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp

290 295 300

Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala

305 310 315 320

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ala Met

325 330 335

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

340 345 350

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

355 360 365

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

370 375 380

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

385 390 395 400

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

405 410 415

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

420 425 430

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

435 440 445

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

450 455 460

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

465 470 475 480

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

485 490 495

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

500 505 510

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

515 520 525

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

530 535 540

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

545 550 555 560

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

565 570 575

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

580 585 590

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

595 600 605

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

610 615 620

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

625 630 635 640

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

645 650 655

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

660 665 670

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

675

<210> 15

<211> 2037

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caggtgcagc tgaagcagtc cggacctggc ctggtgcagc cttcccagtc cctgtccatc 60

acctgcaccg tgtccggctt ttccctgacc aactacggcg tgcactgggt gaggcagtcc 120

cctggcaagg gcctggaatg gctgggcgtg atctggtccg gcggcaacac cgactacaac 180

acccccttca cctcccggct gtccatcaac aaggacaaca gcaagtccca ggtgttcttc 240

aagatgaact ccctgcagag caacgacacc gccatctact actgcgccag agccctgacc 300

tattacgact acgagttcgc ctactggggc cagggcacac tggtgaccgt gtccgccgca 360

agtaccaagg gacctagtgt tttccctctt gcaccttgct ccaggtcaac atcagagtcc 420

acagctgctc ttggatgtct cgttaaggac tacttcccag agccagttac cgtatcctgg 480

aactccggag ctttgacaag cggcgttcat acattcccag ctgtgttgca gagttctggg 540

ttgtacagtt tgagctcagt ggtgaccgtg ccttcatctt ctttgggcac taagacctac 600

acctgcaacg tggatcacaa gccaagcaac accaaggtgg ataagagggt gggtggaggc 660

ggttcaggcg gaggtggcag cggaggtggc gggagtcagg tccagctgca gcagtcagga 720

gggggcctgg tgaagccatc acagagcctg tccctgacct gcacagtctc tgggttcagt 780

ctgacttcat acggagtgca ctgggtccga cagccccctg gaaagggact ggagtggatc 840

ggcctgattt ggtctggcgg gggaacagac tataacccca gcctgaaatc ccggctgacc 900

atctctagag ataccagtaa gaatcaagtg agctttaaaa ttagctccct gacagccgct 960

gacactgcag tgtactattg tgcaaggcag ctgggactgc gagctatgga ttactgggga 1020

cagggcactt ccgtgaccgt ctctagtgcg agcaccaagg gaccttccgt gtttcccctc 1080

gcccccagct ccaaaagcac cagcggcgga acagctgctc tcggctgtct cgtcaaggat 1140

tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg aacagcggag ccctgacaag cggcgtccac 1200

accttccctg ctgtcctaca gtcctccgga ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgacagtc 1260

cctagcagct ccctgggcac ccagacatat atttgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 1320

accaaggtcg ataagaaggt ggagcctaag tcctgcgaca agacccacac atgtcccccc 1380

tgtcccgctc ctgaactgct gggaggccct tccgtgttcc tgttcccccc taagcccaag 1440

gacaccctga tgatttccag gacacccgag gtgacctgtg tggtggtgga cgtcagccac 1500

gaggaccccg aggtgaaatt caactggtac gtcgatggcg tggaggtgca caacgctaag 1560

accaagccca gggaggagca gtacaattcc acctacaggg tggtgtccgt gctgaccgtc 1620

ctccatcagg actggctgaa cggcaaagag tataagtgca aggtgagcaa caaggccctc 1680

cctgctccca tcgagaagac catcagcaaa gccaagggcc agcccaggga acctcaagtc 1740

tataccctgc ctcccagcag ggaggagatg accaagaacc aagtgagcct cacatgcctc 1800

gtcaagggct tctatccttc cgatattgcc gtcgagtggg agtccaacgg acagcccgag 1860

aacaactaca agacaacacc ccccgtgctc gattccgatg gcagcttctt cctgtactcc 1920

aagctgaccg tggacaagtc cagatggcaa caaggcaacg tcttcagttg cagcgtcatg 1980

catgaggccc tccacaacca ctacacccag aagagcctct ccctgagccc tggaaag 2037

Claims

1.抗PD-L1和EGFR的四价双特异性抗体，其特征在于，包含两条多肽链和四条共同轻链，其中，所述多肽链具有如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，所述共同轻链具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

2.一种分离的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸编码如权利要求1所述的四价双特异性抗体。

3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸编码所述多肽链和所述共同轻链，其中，编码所述多肽链的核苷酸序列如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示，编码所述共同轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有如权利要求2或3所述的核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求4所述的表达载体。

6.如权利要求1所述的四价双特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

(a)在表达条件下，培养如权利要求5所述的宿主细胞，从而表达所述的四价双特异性抗体；

(b)分离并纯化(a)所述的四价双特异性抗体。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1所述的四价双特异性抗体和药学上可接受的载体。

8.如权利要求1所述的四价双特异性抗体或如权利要求7所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤及其它赘生性恶性疾病。

10.一种治疗癌症的方法，其特征在于，包括向有需要的受试者施用如权利要求1所述的四价双特异性抗体或如权利要求7所述的药物组合物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤及其它赘生性恶性疾病。