TW202146460A - 抗pd1×pdl1的雙特異性抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了一種抗PD1×PDL1的雙特異性抗體及其製備方法和用途，實驗結果顯示該雙特異性抗體能夠較好的保持各自單抗的活性，並且能夠同時特異性結合PD-1和PD-L1兩個靶點，具有良好的理化性質。

Description

抗PD1×PDL1的雙特異性抗體
本發明涉及抗體領域，具體涉及一種抗PD1×PDL1的雙特異性抗體及其製備方法和用途。
人程式性細胞死亡受體-1（PD-1）是一種有288個氨基酸的I型膜蛋白，是已知的主要免疫檢查點（Immune Checkpoint）之一（Blank et al, 2005, Cancer Immunotherapy, 54:307-314）。PD-1表達在已經啟動的T淋巴細胞，它與配體PD-L1（程式性細胞死亡受體-配體1，programmed cell death-Ligand 1）和PD-L2（程式性細胞死亡受體-配體2，programmed cell death-Ligand 2）結合可以抑制T淋巴細胞的活性及相關的體內細胞免疫反應。PD-L2主要表達在巨噬細胞和樹突狀細胞，而PD-L1則廣泛表達於B、T淋巴細胞及外周細胞如微血管上皮細胞，肺、肝、心等組織細胞中。大量研究表明，PD-1和PD-L1的相互作用不但是維持體內免疫系統平衡所必須，也是導致PD-L1表達陽性腫瘤細胞規避免疫監視的主要機制和原因。通過阻斷癌細胞對PD-1/PD-L1信號通路的負調控，啟動免疫系統，能夠促進T細胞相關的腫瘤特異性細胞免疫反應，從而打開了一扇新的腫瘤治療方法的大門—腫瘤免疫療法。
PD-1（由基因Pdcd1編碼）為與CD28和CTLA-4有關的免疫球蛋白超家族成員。研究成果顯示，當PD-1與其配體（PD-L1和/或PD-L2）結合時會負調節抗原受體信號轉導。目前已弄清鼠PD-1結構以及小鼠PD-1與人PD-L1的共結晶結構（Zhang，X.等，Immunity 20：337-347(2004)；Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：3011-6(2008)）。PD-1及類似的家族成員為I型跨膜糖蛋白，其含有負責配體結合的Ig可變型（V-型）結構域和負責結合信號轉導分子的胞質尾區。PD-1胞質尾區含有兩個基於酪氨酸的信號轉導模體ITIM（免疫受體酪氨酸抑制作用模體）和ITSM（免疫受體酪氨酸轉換作用模體）。
PD-1在腫瘤的免疫逃避機制中起到了重要的作用。腫瘤免疫療法，即利用人體自身的免疫系統抵禦癌症，是一種突破性的腫瘤治療方法，但是腫瘤微環境可保護腫瘤細胞免受有效的免疫破壞，因此如何打破腫瘤微環境成為抗腫瘤研究的重點。現有研究成果已確定了PD-1在腫瘤微環境中的作用：PD-L1在許多小鼠和人腫瘤中表達（並在大多數PD-L1陰性腫瘤細胞系中可由IFN-γ誘導），並被推定為介導腫瘤免疫逃避的重要靶點（Iwai Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：12293-12297(2002)；Strome S.E.等，Cancer Res.，63：6501-6505(2003)）。通過免疫組織化學評估活組織檢查，已經在人的很多原發性腫瘤中發現PD-1（在腫瘤浸潤淋巴細胞上）和/或PD-L1在腫瘤細胞上的表達。這樣的組織包括肺癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、結腸癌、神經膠質瘤、膀胱癌、乳腺癌、腎癌、食道癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌、尿道上皮細胞癌和胰腺癌以及頭頸腫瘤等。由此可見，阻斷PD-1/PD-L1的相互作用可以提高腫瘤特異性T細胞的免疫活性，有助於免疫系統清除腫瘤細胞，因此PD-1和PD-L1成為開發腫瘤免疫治療藥物的熱門靶點。
雙特異性抗體是指能同時特異性結合兩種抗原或兩種表位的抗體分子。根據對稱性，雙特異性抗體可以分為結構對稱的和不對稱的分子。根據結合位元點的多少，雙特異性抗體可以分為二價、三價、四價和多價分子。雙特異性抗體正在逐步成為一類新的治療性抗體，可以用於治療各種炎性疾病、癌症和其它疾病。
本發明提供了一種抗PD1×PDL1的雙特異性抗體。
因此，本發明的第一個目的在於提供一種抗PD1×PDL1的雙特異性抗體。
本發明的第二個目的在於提供一種編碼所述雙特異性抗體的分離的核苷酸。
本發明的第三個目的在於提供一種包含所述核苷酸的表達載體。
本發明的第四個目的在於提供一種包含所述表達載體的宿主細胞。
本發明的第五個目的在於提供所述雙特異性抗體的製備方法。
本發明的第六個目的在於提供包含所述雙特異性抗體的藥物組合物。
本發明的第七個目的在於提供所述的雙特異性抗體或所述藥物組合物在製備治療癌症的藥物中的用途。
本發明的第八個目的在於提供所述雙特異性抗體或所述藥物組合物用於治療癌症的方法。
為了達到上述目的，本發明提供了以下技術方案：
本發明的第一個方面提供一種抗PD1×PDL1的雙特異性抗體，所述雙特異性抗體包含兩條多肽鏈和兩條輕鏈：
a）各所述多肽鏈從N末端至C末端依次包含VH-PDL1—CH1—CH2—CH3—linker2—VL-PD1—linker1—VH-PD1或VH-PDL1—CH1—CH2—CH3—linker2—VH-PD1—linker1—VL-PD1或VL-PD1—linker1—VH-PD1—linker2—VH-PDL1—CH1—CH2—CH3或VH-PD1—linker1—VL-PD1—linker2—VH-PDL1—CH1—CH2—CH3，各所述輕鏈從N末端至C末端依次包含VL-PDL1—CL；或
b）各所述多肽鏈從N末端至C末端依次包含VH-PD1—CH1—CH2—CH3—linker2—VL-PDL1—linker1—VH-PDL1或VH-PD1—CH1—CH2—CH3—linker2—VH-PDL1—linker1—VL-PDL1或VL-PDL1—linker1—VH-PDL1—linker2—VH-PD1—CH1—CH2—CH3或VH-PDL1—linker1—VL-PDL1—linker2—VH-PD1—CH1—CH2—CH3，各所述輕鏈從N末端至C末端依次包含VL-PD1—CL；
其中，所述VH-PDL1為結合PD-L1的重鏈可變區，所述CH1-CH2-CH3為重鏈恒定區，所述VL-PD1為結合PD-1的輕鏈可變區，所述VH-PD1為結合PD-1的重鏈可變區，所述VL-PDL1為結合PD-L1的輕鏈可變區，所述CL為輕鏈恒定區。
所述抗PD1×PDL1的雙特異性抗體中，所述VH-PDL1與所述VL-PDL1形成特異性結合PD-L1的抗原結合位點，所述VL-PD1與所述VH-PD1形成特異性結合PD-1的抗原結合位點。
根據本發明的優選實施例，所述抗PD1×PDL1的雙特異性抗體還包括以下中的一項或多項：
所述VH-PDL1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示的重鏈CDR；
所述VL-PDL1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示的輕鏈CDR；
所述VH-PD1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：7-9所示的重鏈CDR；
所述VL-PD1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：10-12所示的輕鏈CDR。
在一種實施方式中，所述VH-PDL1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的H-CDR1。
在一種實施方式中，所述VH-PDL1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的H-CDR2。
在一種實施方式中，所述VH-PDL1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的H-CDR3。
在一種實施方式中，所述VL-PDL1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的L-CDR1。
在一種實施方式中，所述VL-PDL1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的L-CDR2。
在一種實施方式中，所述VL-PDL1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的L-CDR3。
在一種實施方式中，所述VH-PD1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的H-CDR1。
在一種實施方式中，所述VH-PD1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的H-CDR2。
在一種實施方式中，所述VH-PD1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的H-CDR3。
在一種實施方式中，所述VL-PD1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的L-CDR1。
在一種實施方式中，所述VL-PD1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的L-CDR2。
在一種實施方式中，所述VL-PD1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示的L-CDR3。
根據本發明的優選實施例，所述VH-PDL1具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，和/或，所述VL-PDL1具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，和/或，所述VH-PD1具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，和/或，所述VL-PD1具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
所述linker2為3個G4 S，所述linker1為4個G4 S。
根據本發明，所述的重鏈恒定區包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恒定區，所述的輕鏈恒定區包括κ或λ輕鏈恒定區。
根據本發明的優選實施例，所述多肽鏈具有如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，和/或，所述的輕鏈具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；或所述多肽鏈具有如SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，和/或，所述的輕鏈具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。
本發明的第二個方面提供了一種分離的核苷酸，所述核苷酸編碼所述雙特異性抗體。
本發明所述核苷酸的製備方法為本領域常規的製備方法，較佳地包括以下製備方法：通過基因克隆技術例如PCR方法等，獲得編碼上述單克隆抗體的核苷酸，或者通過人工全序列合成的方法得到編碼上述單克隆抗體的核苷酸。
本領域技術人員知曉，編碼上述雙特異性抗體的氨基酸序列的核苷酸序列可以適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的同系物可以通過對編碼該雙特異性抗體基因的一個或多個堿基在保持抗體活性範圍內進行替換、缺失或增加來制得。
本發明的第三個方面提供了一種表達載體，所述表達載體含有如上所述核苷酸。
其中所述表達載體為本領域常規的表達載體，是指包含適當的調控序列，例如啟動子序列、終止子序列、多腺苷醯化序列、增強子序列、標記基因和/或序列以及其他適當的序列的表達載體。所述表達載體可以是病毒或質粒，如適當的噬菌體或者噬菌粒，更多技術細節請參見例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。許多用於核酸操作的已知技術和方案請參見Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等編著。
本發明所述表達載體較佳地為pTT5，pDR1，pcDNA3.1，pcDNA3.4，pDHFF，pGM-CSF或pCHO1.0，更佳地為pcDNA3.4，pTT5。
本發明的第四個方面提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有如上所述的表達載體。
本發明所述的宿主細胞為本領域常規的各種宿主細胞，只要能滿足使上述重組表達載體穩定地自行複製，且所攜帶所述的核苷酸可被有效表達即可。其中所述宿主細胞包括原核表達細胞和真核表達細胞。具體的，所述宿主細胞例如為：COS、CHO (中國倉鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3) 、E .coli TG1、BL21(DE3)細胞或者CHO-K1細胞、293E細胞或TG1。所述宿主細胞更佳地為CHO細胞和/或293E細胞。
本發明的第五個方面提供了所述雙特異性抗體的製備方法，所述方法包含以下步驟：
（步驟a）在表達條件下，培養如上所述的宿主細胞，從而表達所述雙特異性抗體；
（步驟b）分離並純化（步驟a）所述的雙特異性抗體。
本發明所述的宿主細胞的培養方法、所述抗PD1×PDL1的雙特異性抗體的分離和純化方法為本領域常規方法，具體操作方法請參考相應的細胞培養技術手冊以及雙特異性抗體分離純化技術手冊。本發明中公開的抗PD1×PDL1的雙特異性抗體的製備方法包括：在表達條件下，培養上述的宿主細胞，從而表達抗PD1×PDL1的雙特異性抗體；分離和純化所述的抗PD1×PDL1的雙特異性抗體。利用上述方法，可以將重組蛋白純化為基本均一的物質，例如在SDS-PAGE電泳上為單一條帶。
可以利用親和層析的方法對本發明公開的抗PD1×PDL1的雙特異性抗體進行分離純化，根據所利用的親和柱的特性，可以使用常規的方法例如高鹽緩衝液、改變PH等方法洗脫結合在親和柱上的雙特異性抗體。本發明的發明人對所得抗PD1×PDL1的雙特異性抗體進行了檢測實驗，實驗結果表明該雙特異性抗體能很好地與PD-1、PDL-1結合，具有較高的親和力。
本發明的第六個方面提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有如上所述的雙特異性抗體和藥學上可接受的載體。
本發明提供的抗PD1×PDL1的雙特異性抗體，可以和藥學上可接受的載體一起組成藥物組合物從而更穩定地發揮療效。藥物組合物具有一定的製劑形式可以保證本發明公開的抗PD1×PDL1的雙特異性抗體的氨基酸核心序列的構象完整性，同時還保護蛋白質的多官能團防止其降解(包括但不限於凝聚、脫氨或氧化)。
本發明的第七個方面提供了如上所述的雙特異性抗體或如上所述的藥物組合物在製備治療癌症的藥物中的用途。
根據本發明，所述癌症選自黑色素瘤、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、淋巴癌、乳腺癌、結直腸癌、白血病、前列腺癌、骨髓癌及其它贅生性惡性疾病中的一種或多種。
本發明所述抗PD1×PDL1的雙特異性抗體可以單獨使用或與其它抗腫瘤藥物聯合使用。
本發明所稱的治療癌症的藥物，指具有抑制和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴隨腫瘤相關症狀發展的延遲和/或這些症狀嚴重程度的降低，進一步還包括已存在的腫瘤伴隨症狀的減輕並防止其他症狀的出現，還包括減少或防止腫瘤的轉移等。
本發明中抗PD1×PDL1的雙特異性抗體及其藥物組合物在對包括人在內的動物給藥時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結果和種種情況，總給藥量不能超過一定範圍。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明的第八個方面提供了一種治療癌症的方法，包括向有需要的受試者施用如上所述的雙特異性抗體或如上所述的藥物組合物。
根據本發明，所述癌症選自黑色素瘤、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、淋巴癌、乳腺癌、結直腸癌、白血病、前列腺癌、骨髓癌及其它贅生性惡性疾病中的一種或多種。
所述抗PD1×PDL1的雙特異性抗體及其藥物組合物在向受試者施用時，給藥劑量需為治療有效量。所述治療有效量是指在治療癌症中有效果的量。具體的，所述抗PD1×PDL1的雙特異性抗體及其藥物組合物在向受試者施用時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結果和種種情況，總給藥量不能超過一定範圍。
本發明的有益效果如下：本發明提供了一種抗PD1×PDL1的雙特異性抗體，實驗結果顯示該雙抗能夠較好的保持各自單抗的活性，並且能夠同時特異性結合PD-1和PD-L1兩個靶點，具有良好的理化性質。
本發明中，術語“抗體（Antibody，縮寫Ab）”和“免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，縮寫IgG）”是有相同結構特徵的異四聚糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈（L）和兩條相同的重鏈（H）組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型（isotype）的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區（VH），其後是恒定區，重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2、以及CH3構成。每條輕鏈的一端有可變區（VL），另一端有恒定區，輕鏈恒定區包括一個結構域CL；輕鏈的恒定區與重鏈恒定區的CH1結構域配對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區配對。恒定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ）等。重鏈恒定區包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型；輕鏈恒定區包括κ（Kappa）或λ（Lambda）。抗體的重鏈和輕鏈通過重鏈的CH1結構域和輕鏈的CL結構域之間的二硫鍵共價連接在一起，抗體的兩條重鏈通過鉸鏈區之間形成的多肽間二硫鍵共價連接在一起。
本發明中，術語“雙特異性抗體（以下簡稱雙抗）”是指能同時特異性結合兩種抗原（靶點）或兩種表位的抗體分子。
本發明中，術語“單克隆抗體（單抗）”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對單個抗原位點。而且，與常規多克隆抗體製劑（通常是具有針對不同抗原決定簇的不同抗體的混合物）不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在於它們可以通過雜交瘤培養來合成，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。
本發明中，術語“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可將抗體裂解為兩個完全相同的Fab段和一個Fc段。Fab段由抗體的重鏈的VH和CH1以及輕鏈的VL和CL結構域組成。Fc段即可結晶片段（fragment crystallizable，Fc），由抗體的CH2和CH3結構域組成。Fc段無抗原結合活性，是抗體與效應分子或細胞相互作用的部位。
本發明中，術語“scFv”為單鏈抗體（single chain antibody fragment，scFv），由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過15～25個氨基酸的短肽（linker）連接而成。
本發明中，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分佈在整個抗體可變區中。它集中于重鏈可變區和輕鏈可變區中稱為互補決定區（complementarity-determining region，CDR）或超變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱為框架區（frame region，FR）。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR通過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位（參見 Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669頁（1991））。
本發明中，術語“抗”、“結合”、“特異性結合”是指兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。通常，抗體以小於大約10-7 M，例如小於大約10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M或更小的平衡解離常數（KD）結合該抗原。本發明中，術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。例如，使用表面等離子體共振術（Surface Plasmon Resonance，縮寫SPR）在BIACORE儀中測定抗體與抗原的結合親和力或使用ELISA測定抗體與抗原結合的相對親和力。
本發明中，術語“表位”是指與抗體特異性結合的多肽決定簇。本發明的表位是抗原中被抗體結合的區域。
本發明中，術語“表達載體”可以為pTT5，pSECtag 系列，pCGS3系列，pcDNA系列載體等，以及其它用於哺乳動物表達系統的載體等，表達載體中包括連接有合適的轉錄和翻譯調節序列的融合DNA序列。
本發明中，術語“宿主細胞”是指適用於表達上述表達載體的細胞，可以是真核細胞，如哺乳動物或昆蟲宿主細胞培養系統均可用于本發明的融合蛋白的表達，CHO（中國倉鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary），HEK293，COS，BHK以及上述細胞的衍生細胞均可適用于本發明。
本發明中，術語“藥物組合物”是指本發明的雙特異性抗體可以和藥學上可以接受的載體一起組成藥物製劑組合物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明公開的雙特異性抗體的氨基酸核心序列的構象完整性，同時還保護蛋白質的多官能團防止其降解（包括但不限於凝聚、脫氨或氧化）。
以下實施例中使用的實驗材料說明如下：
pcDNA™ 3.4 TOPO® vector ：購自Thermo fisher公司，貨號A14697；
CHO細胞：購自Thermo fisher公司，貨號A29133；
293E細胞：來自NRC biotechnology Research Institute；
PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay, Propagation model：購自Promega公司，貨號J1252；
人胃癌細胞株NCI-N87：購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）；
SD大鼠：購自上海靈暢生物科技有限公司。
以下實施例中使用的實驗試劑說明如下：
抗PD-L1單抗：根據PCT/CN2020/090442中的序列製備；
抗PD-1單抗：根據WO2018/137576中的序列製備；
HRP標記的鼠抗人Fab抗體：購自sigma，貨號A0293；
HRP標記的anti-6×His抗體：購自abcam，貨號ab178563；
羊抗人IgG-FITC：購自sigma，貨號F4143；
PBS：購自生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號B548117；
PBST：PBS+0.05%Tween 20；
BSA：購自生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號A60332；
FBS：購自Gibco，貨號10099；
TMB：購自BD公司，貨號555214；
Bio-Glo Luciferase Assay System：購自 Promega，貨號G7940。
以下實施例中使用的實驗儀器說明如下：
PCR儀：購自BioRad，貨號C1000 Touch Thermal Cycler；
HiTrap MabSelectSuRe柱：購自GE公司，貨號11-0034-95；
Beckman Coulter CytoFLEX流式細胞儀：購自Beckman公司；
SpectraMax i3x酶標儀：購自Molecular Devices公司。
以下實施例、實驗例是對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法。這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook, J., Fritsch, E．F． and Maniais， T．（1989） Molecular Cloning： A Laboratory Manual，2nd  edition， Cold spring Harbor Laboratory Press。
實施例1 抗PD1×PDL1雙抗分子的構建
本發明採用將抗人PD-1單抗mAb1-25-Hu（序列來源於WO2018/137576）的scFv（VL-linker1-VH，linker1為4個GGGGS），通過linker2（為3個GGGGS），串聯在抗人PD-L1單抗M8（序列來源於PCT/CN2020/090442）的重鏈C-末端的方式，構建了抗PD1×PDL1雙特異性抗體，命名為anti-PD1×PDL1 BsAb。結構如圖1所示。
本發明採用了將抗人PD-1單抗mAb1-25-Hu的scFv2（VH-linker1-VL，linker1為4個GGGGS），通過linker2（為3個GGGGS），串聯在抗人PD-L1單抗M8的重鏈N-末端的方式，構建了抗PD1×PDL1雙特異性抗體，命名為anti-PD1×PDL1 Rev2。
本發明採用了將抗人PD-1單抗mAb1-25-Hu的scFv2（VH-linker1-VL，linker1為4個GGGGS），通過linker2（為3個GGGGS），串聯在抗人PD-L1單抗M8的重鏈C-末端的方式，構建了抗PD1×PDL1雙特異性抗體，命名為anti-PD1×PDL1 Rev3。
本發明採用了將抗人PD-1單抗mAb1-25-Hu的scFv（VL-linker1-VH，linker1為4個GGGGS），通過linker2（為3個GGGGS），串聯在抗人PD-L1單抗M8的重鏈N-末端的方式，構建了抗PD1×PDL1雙特異性抗體，命名為anti-PD1×PDL1 Rev4。
本發明採用了將抗人PD-L1單抗M8的scFv3（VL-linker1-VH，linker1為4個GGGGS），通過linker2（為3個GGGGS），串聯在抗人PD-1單抗mAb1-25-Hu的重鏈C-末端的方式，構建了抗PD1×PDL1雙特異性抗體，命名為anti-PD1×PDL1 Rev5。
本發明採用了將抗人PD-L1單抗M8的scFv4（VH-linker1-VL，linker1為4個GGGGS），通過linker2（為3個GGGGS），串聯在抗人PD-1單抗mAb1-25-Hu的重鏈C-末端的方式，構建了抗PD1×PDL1雙特異性抗體，命名為anti-PD1×PDL1 Rev6。
本發明採用了將抗人PD-L1單抗M8的scFv4（VH-linker1-VL，linker1為4個GGGGS），通過linker2（為3個GGGGS），串聯在抗人PD-1單抗mAb1-25-Hu的重鏈N-末端的方式，構建了抗PD1×PDL1雙特異性抗體，命名為anti-PD1×PDL1 Rev7。
本發明採用了將抗人PD-L1單抗M8的scFv3（VL-linker1-VH，linker1為4個GGGGS），通過linker2（為3個GGGGS），串聯在抗人PD-1單抗mAb1-25-Hu的重鏈N-末端的方式，構建了抗PD1×PDL1雙特異性抗體，命名為anti-PD1×PDL1 Rev8。
通過基因合成及常規的分子克隆方法獲得雙特異性抗體及其對應的單克隆抗體的重鏈和輕鏈表達載體，其對應的氨基酸序列如表1所示，其中CDR根據Kabat規則編碼。
表1、本發明的抗體的序列資訊
SEQ ID NO： 序列名稱
1 抗PD-L1單抗的重鏈互補決定區H-CDR1的氨基酸序列
2 抗PD-L1單抗的重鏈互補決定區H-CDR2的氨基酸序列
3 抗PD-L1單抗的重鏈互補決定區H-CDR3的氨基酸序列
4 抗PD-L1單抗的輕鏈互補決定區L-CDR1的氨基酸序列
5 抗PD-L1單抗的輕鏈互補決定區L-CDR2的氨基酸序列
6 抗PD-L1單抗的輕鏈互補決定區L-CDR3的氨基酸序列
7 抗PD-1單抗的重鏈互補決定區H-CDR1的氨基酸序列
8 抗PD-1單抗的重鏈互補決定區H-CDR2的氨基酸序列
9 抗PD-1單抗的重鏈互補決定區H-CDR3的氨基酸序列
10 抗PD-1單抗的輕鏈互補決定區L-CDR1的氨基酸序列
11 抗PD-1單抗的輕鏈互補決定區L-CDR2的氨基酸序列
12 抗PD-1單抗的輕鏈互補決定區L-CDR3的氨基酸序列
13 抗PD-L1單抗的重鏈可變區的氨基酸序列
14 抗PD-L1單抗的輕鏈可變區的氨基酸序列
15 抗PD-1單抗的重鏈可變區的氨基酸序列
16 抗PD-1單抗的輕鏈可變區的氨基酸序列
17 anti-PD1×PDL1 BsAb的多肽鏈的氨基酸序列
18 抗PD-L1單抗的輕鏈的氨基酸序列
19 抗PD-L1單抗的重鏈的氨基酸序列
20 抗PD-1單抗的重鏈的氨基酸序列
21 抗PD-1單抗的輕鏈的氨基酸序列
22 anti-PD1×PDL1 Rev2的多肽鏈的氨基酸序列
23 anti-PD1×PDL1 Rev3的多肽鏈的氨基酸序列
24 anti-PD1×PDL1 Rev4的多肽鏈的氨基酸序列
25 anti-PD1×PDL1 Rev5的多肽鏈的氨基酸序列
26 anti-PD1×PDL1 Rev6的多肽鏈的氨基酸序列
27 anti-PD1×PDL1 Rev7的多肽鏈的氨基酸序列
28 anti-PD1×PDL1 Rev8的多肽鏈的氨基酸序列
實施例2 抗PD1×PDL1雙抗的表達與純化
將抗PD1×PDL1雙抗anti-PD1×PDL1 BsAb的兩條多肽鏈和輕鏈的DNA片段分別亞克隆到pcDN3.4載體中，抽提重組質粒共轉染CHO細胞和/或293E細胞，細胞培養5-7天后，將培養液通過高速離心、微孔濾膜過濾後，上樣至HiTrap MabSelectSuRe柱，用含有100mM檸檬酸，pH3.5的洗脫液洗脫蛋白，並透析至pH7.4的PBS。
將純化後的蛋白用HPLC檢測，抗PD1×PDL1雙抗anti-PD1×PDL1 BsAb的HPLC-SEC檢測圖譜如圖2A所示，雙抗單體純度達到96%以上。SDS-PAGE檢測結果如圖2B所示，泳道1與2為抗PD1×PDL1雙抗的還原與非還原SDS-PAGE，泳道3與4為抗PD-L1單抗的還原與非還原SDS-PAGE。雙抗理論分子量為197KD。
實施例3 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測抗PD1×PDL1雙抗對抗原的親和力
3.1 與PD-1抗原的親和力檢測
為了檢測抗PD1×PDL1雙抗與PD-1抗原的親和力，用pH7.4的 PBS緩衝液將PD1-ECD-hFc蛋白（根據UniProt提供的序列（序號Q15116）合成胞外域基因並在其N端加上信號肽序列，C末端加上hFc，通過EcoRI和HindIII兩個酶切位點分別構建到表達載體pcDNA3.4或pTT5中，轉染HEK-293E細胞表達並純化獲得）稀釋至200ng/ml，然後100μL/孔加入ELISA板中；4℃孵育過夜；次日用PBST洗板兩次；每孔加入PBST+1%BSA進行封閉，37℃封閉1小時；用PBST洗板兩次；然後加入用PBS+1%BSA梯度稀釋的待檢測抗體，抗PD-1單抗作為陽性對照，起始濃度為200nM，逐級3倍稀釋12個梯度。37℃孵育1小時；PBST洗板兩次，加入二抗HRP標記的鼠抗人Fab，37℃再孵育40分鐘；PBST洗板三次並拍幹，每孔加入100μL TMB，室溫(20±5℃)避光放置5分鐘；每孔加入50μL的2M H2 SO4 終止液終止底物反應，酶標儀450nm處讀取OD值，GraphPad Prism進行資料分析，作圖並計算EC50 。
實驗結果如圖3A所示，抗PD-1單抗和抗PD1×PDL1雙抗anti-PD1×PDL1 BsAb與PD-1抗原結合的EC50 分別為0.29nM和0.30 nM，兩者親和力相當。
3.2 與PD-L1抗原的親和力檢測
為了檢測抗PD1×PDL1雙抗與PD-L1抗原的親和力，用pH7.4的PBS緩衝液將PDL1-ECD-His蛋白（根據NCBI提供的序列（NCBI登記號為NP_054862.1）合成PD-L1胞外域基因並在其N端加上信號肽序列 ，C末端加上6×His標籤，通過EcoRI和HindIII兩個酶切位點分別構建到表達載體pcDNA3.4或pTT5中，轉染HEK-293E細胞表達並純化獲得）稀釋至1000ng/ml，然後100μL/孔加入ELISA板中；4℃孵育過夜；次日用PBST洗板兩次；每孔加入PBST+1%BSA進行封閉，37℃封閉1小時；用PBST洗板兩次；然後加入用PBS+1%BSA梯度稀釋的待檢測抗體，抗PD-L1單抗作為陽性對照，起始濃度為200nM，逐級3倍稀釋12個梯度。37℃孵育1小時；PBST洗板兩次，加入二抗HRP標記的鼠抗人Fab，37℃再孵育40分鐘；PBST洗板三次並拍幹，每孔加入100μL TMB，室溫(20±5℃)避光放置5分鐘；每孔加入50μL 2M H2 SO4 終止液終止底物反應，酶標儀450nm處讀取OD值，GraphPad Prism進行資料分析，作圖並計算EC50 。
實驗結果如圖3B所示，抗PD-L1單抗及抗PD1×PDL1雙抗anti-PD1×PDL1 BsAb與PD-L1抗原結合的EC50 為0.27 nM和0.29 nM，兩者親和力相當。
實施例4 雙特異ELISA檢測抗PD1×PDL1雙抗同時結合兩個抗原的能力
為了檢測抗PD1×PDL1雙抗同時結合PD-1抗原和PD-L1抗原的能力，用pH7.4的 PBS緩衝液將PD1-ECD-hFc蛋白稀釋至200ng/ml，然後100μL/孔加入ELISA板中；4℃孵育過夜；次日用PBST洗板兩次；每孔加入PBST+1%BSA進行封閉，37℃封閉1小時；用PBST洗板兩次；然後加入用PBS+1%BSA梯度稀釋的待檢測抗體，起始濃度為100nM，逐級3倍稀釋12個梯度。37℃孵育1小時；PBST洗板兩次，再加入pH7.4的 PBS稀釋的1000ng/ml 的PDL1-ECD-His，100μL/孔加入ELISA板中。37℃孵育1小時；PBST洗板兩次，加入二抗HRP-anti-His，37℃再孵育40分鐘；PBST洗板三次並拍幹，每孔加入100μL TMB，室溫(20±5℃)避光放置5分鐘；每孔加入50μL 2M H2 SO4 終止液終止底物反應，酶標儀450nm處讀取OD值，GraphPad Prism進行資料分析，作圖並計算EC50 。
實驗結果如圖4 所示，抗PD1×PDL1雙抗anti-PD1×PDL1 BsAb的EC50 為0.36 nM，而抗PD-1單抗和抗PD-L1單抗沒有同時結合這兩種抗原的能力。
實施例5檢測抗PD1×PDL1雙抗對靶細胞的結合親和力
細胞表面表達PD-1的CHO穩轉細胞作為靶細胞，通過流式細胞儀測定抗PD1×PDL1雙抗對該細胞的結合親和力。用含有0.5% BSA的PBS洗滌三次細胞，每次300g離心5分鐘，棄上清。0.5% BSA的PBS重懸細胞，細胞密度為1×106 細胞/mL，100μL/孔加入96孔板。將抗PD1×PDL1雙抗及陽性對照抗PD-1單抗200nM起始，逐級稀釋11個梯度，100μL/孔加入96孔板，4℃孵育1小時。PBS洗滌細胞兩次以去除未結合的待檢抗體。再加入100μL的羊抗人IgG-FITC，於4℃孵育30分鐘。300g離心5分鐘，PBS洗滌細胞兩次以去除未結合的二抗。最後將細胞重懸在200μL PBS中，通過Beckman Coulter CytoFLEX流式細胞儀測定雙抗對該細胞的結合親和力。所得資料通過GraphPad Prism軟體擬合分析。實驗結果如圖5A所示，抗PD-1單抗和抗PD1×PDL1雙抗anti-PD1×PDL1 BsAb的EC50 分別為0.64nM和1.43 nM，兩者親和力相當。
N87-PDL1為本實驗室採用慢病毒轉染法給NCI-N87轉染了PD-L1構建的穩轉細胞株。取對數生長期的N87-PDL1用胰酶消化後，用含有0.5% BSA的PBS洗滌三次，每次300g離心5分鐘，棄上清。0.5% BSA的PBS重懸細胞，細胞密度為1×106 細胞/mL，100μL/孔加入96孔板。將抗PD1×PDL1雙抗及陽性對照抗PD-L1單抗稀釋為120nM，逐級稀釋11個梯度，100μL/孔加入96孔板，與N87-PDL1細胞混合均勻。其餘方法同上。實驗結果如圖5B所示，抗PD-L1單抗的EC50 為0.11nM，抗PD1×PDL1雙抗anti-PD1×PDL1 BsAb的EC50 為0.15nM，兩者親和力相當。
實施例6抗PD1×PDL1雙抗阻斷PD-1/PD-L1的細胞水準的活性
本實驗採用Promega的PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay,Propagation model及方法。
取對數期生長的PD-L1 aAPC/CHO-K1穩定細胞株，胰酶消化成單個細胞後轉移到白色底透96孔板，100µL/孔，40000細胞/孔，置於37°C，5% CO2 ，孵育過夜。取抗PD1×PDL1雙抗、抗PD-L1單抗、抗PD-1單抗稀釋成2×工作液濃度，起始濃度為100nM，逐級3倍梯度。取密度在1.4~2×106 細胞/mL、細胞活率在95%以上的PD1效應細胞，胰酶消化成1.25×106 細胞/ml的單細胞懸液。取前一天鋪好的PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞，棄掉上清，加入40µl梯度稀釋的待檢抗體工作液；再加入等體積的PD1效應細胞。置於37°C，5% CO2 ，孵育6小時。每孔加入80µl檢測試劑Bio-Glo。室溫孵育10分鐘後，用spectramax i3讀取luminescence。用GraphPad Prism進行資料分析，作圖並計算IC50 。
實驗結果如圖6所示，anti-PD1×PDL1 BsAb、抗PD-L1 單抗、抗PD-1單抗的IC50 分別為0.24nM、0.42nM、1.60nM，雙抗anti-PD1×PDL1 BsAb與抗PD-L1單抗的IC50 接近，抗PD-1單抗的IC50 偏大，但其高平臺稍高。
anti-PD1×PDL1 rev2，rev3，rev4，rev5，rev6，rev7，rev8阻斷細胞上PD-1/PD-L1信號通路的活性，結果如圖7A、7B和7C所示，anti-PD1×PDL1 rev2明顯比陽性對照抗PD-1單抗差；anti-PD1×PDL1 rev3，rev6的活性與陽性對照抗PD-L1單抗相當；anti-PD1×PDL1 rev4, rev5的活性比陽性對照抗PD-L1單抗略差；anti-PD1×PDL1 rev7, rev8的活性比陽性對照抗PD-L1單抗明顯較差。
實施例7抗PD1×PDL1雙抗的藥代動力學研究
取每組4只SD大鼠，體重200 g左右，每只大鼠通過尾靜脈注射劑量為2 mg的實施例2製備的抗體。給藥後取血時間點為：0小時、3小時、 24小時、48小時、96小時、168小時、336小時、504小時。眼眶取血，血液自然凝固後8000 rpm/min離心取血清。
抗PD1×PDL1雙抗anti-PD1×PDL1 BsAb的血清中藥物濃度採用以下方法檢測：
1）protein A包被ELISA板，檢測抗體Fab段。用protein A包被，包被量為100ng/孔，4℃過夜；次日PBST洗板兩次，然後用PBS+2%BSA於37℃封閉2小時。PBST洗板兩次。抗PD1×PDL1雙抗的標準品從1000ng/mL起始，逐級兩倍稀釋12個梯度。大鼠血清樣品1000-4000倍稀釋。以上兩組樣品加入封閉後的ELISA板，孵育1小時；PBST洗板兩次後加入HRP標記的鼠抗人Fab抗體，37℃放置30分鐘；PBST洗板3次後，在吸水紙上儘量拍幹殘留液滴，每孔加入100μL的TMB，室溫(20±5℃)避光放置5分鐘；每孔加入50μL 2M的H2 SO4 終止液終止底物反應，酶標儀450nm處讀取OD值。計算所得的半衰期為275.6小時。
2）PD1-ECD-hFc包被ELISA板，20ng/孔。其餘方法同上。計算所得的半衰期為303.5小時。
3）PDL1-ECD-hFc包被ELISA板，100ng/孔。其餘方法同上。計算所得的半衰期為307小時。
如表2-4所示，由以上三組ELISA結果，計算的半衰期結果相近，均為300小時左右，說明分析資料可靠。
表2、protein A包板ELISA結果
實驗組 半衰期（小時） 最高濃度(µg/mL)
1 247.50433 170
2 316.48482 166
3 273.29592 150
4 265.20196 164
表3、PD1-ECD-hFc包板ELISA結果
實驗組 半衰期（小時） 最高濃度(µg/mL)
1 299.46777 196
2 348.73796 202
3 295.3837 170
4 270.42874 174
表4、PDL1-ECD-hFc包板ELISA結果
實驗組 半衰期（小時） 最高濃度(µg/mL)
1 280.15463 166
2 336 152
3 320.97912 146
4 291.3996 166
以上的實施例是為了說明本發明公開的實施方案，並不能理解為對本發明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發明中方法的變化，在不脫離本發明的範圍和精神的前提下對本領域內的技術人員來說是顯而易見的。雖然已結合本發明的多種具體優選實施例對本發明進行了具體的描述，但應當理解，本發明不應僅限於這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領域內的技術人員來說顯而易見的修改來獲取發明都應包括在本發明的範圍內。
圖1為本發明的抗PD1×PDL1雙抗的結構示意圖。
圖2A為本發明的抗PD1×PDL1雙抗的HPLC-SEC檢測圖譜。
圖2B為本發明的抗PD1×PDL1雙抗的SDS-PAGE檢測結果。
圖3A為ELISA檢測本發明的抗PD1×PDL1雙抗與PD-1的結合結果。
圖3B為ELISA檢測本發明的抗PD1×PDL1雙抗與PD-L1的結合結果。
圖4為雙特異ELISA檢測本發明的抗PD1×PDL1雙抗同時與PD-1和PD-L1的結合結果。
圖5A為FACS檢測本發明的抗PD1×PDL1雙抗與PD-1/CHO細胞的結合結果。
圖5B為FACS檢測本發明的抗PD1×PDL1雙抗與N87-PDL1細胞的結合結果。
圖6為本發明的抗PD1×PDL1雙抗阻斷細胞上PD1/PD-L1的活性結果。
圖7A為anti-PD1×PDL1 rev2阻斷細胞上PD1/PD-L1信號通路的活性結果。
圖7B為anti-PD1×PDL1 rev3，rev4，rev5阻斷細胞上PD1/PD-L1信號通路的活性結果。
圖7C為anti-PD1×PDL1 rev6，rev7，rev8阻斷細胞上PD1/PD-L1信號通路的活性結果。

Claims (16)

  1. 一種抗PD1×PDL1的雙特異性抗體，其中，所述雙特異性抗體包含兩條多肽鏈和兩條輕鏈： a）各所述多肽鏈從N末端至C末端依次包含VH-PDL1—CH1—CH2—CH3—linker2—VL-PD1—linker1—VH-PD1或VH-PDL1—CH1—CH2—CH3—linker2—VH-PD1—linker1—VL-PD1或VL-PD1—linker1—VH-PD1—linker2—VH-PDL1—CH1—CH2—CH3或VH-PD1—linker1—VL-PD1—linker2—VH-PDL1—CH1—CH2—CH3，各所述輕鏈從N末端至C末端依次包含VL-PDL1—CL；或 b）各所述多肽鏈從N末端至C末端依次包含VH-PD1—CH1—CH2—CH3—linker2—VL-PDL1—linker1—VH-PDL1或VH-PD1—CH1—CH2—CH3—linker2—VH-PDL1—linker1—VL-PDL1或VL-PDL1—linker1—VH-PDL1—linker2—VH-PD1—CH1—CH2—CH3或VH-PDL1—linker1—VL-PDL1—linker2—VH-PD1—CH1—CH2—CH3，各所述輕鏈從N末端至C末端依次包含VL-PD1—CL， 其中，所述VH-PDL1為結合PD-L1的重鏈可變區，所述CH1-CH2-CH3為重鏈恒定區，所述VL-PD1為結合PD-1的輕鏈可變區，所述VH-PD1為結合PD-1的重鏈可變區，所述VL-PDL1為結合PD-L1的輕鏈可變區，所述CL為輕鏈恒定區。
  2. 如請求項1所述的抗PD1×PDL1的雙特異性抗體，其中，所述VH-PDL1與所述VL-PDL1形成特異性結合PD-L1的抗原結合位點，所述VL-PD1與所述VH-PD1形成特異性結合PD-1的抗原結合位點。
  3. 如請求項1所述的抗PD1×PDL1的雙特異性抗體，其中，所述VH-PDL1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1~3所示的重鏈CDR；所述VL-PDL1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：4~6所示的輕鏈CDR；所述VH-PD1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：7~9所示的重鏈CDR；所述VL-PD1包含氨基酸序列如SEQ ID NO：10~12所示的輕鏈CDR。
  4. 如請求項1所述的抗PD1×PDL1的雙特異性抗體，其中，所述VH-PDL1具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，和/或，所述VL-PDL1具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，和/或，所述VH-PD1具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，和/或，所述VL-PD1具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
  5. 如請求項1所述的抗PD1×PDL1的雙特異性抗體，其中，所述linker2為3個G4 S，所述linker1為4個G4 S。
  6. 如請求項1所述的抗PD1×PDL1的雙特異性抗體，其中，所述重鏈恒定區包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4重鏈恒定區，所述輕鏈恒定區包括κ或λ輕鏈恒定區。
  7. 如請求項1所述的抗PD1×PDL1的雙特異性抗體，其中，所述多肽鏈具有如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，和/或，所述輕鏈具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；或所述多肽鏈具有如SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，和/或，所述輕鏈具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。
  8. 一種分離的核苷酸，其中，所述核苷酸編碼如請求項1~7中任一所述的雙特異性抗體。
  9. 一種表達載體，其中，所述表達載體包括如請求項8所述的核苷酸。
  10. 一種宿主細胞，其中，所述宿主細胞包括如請求項9所述的表達載體。
  11. 如請求項1~7中任一所述的雙特異性抗體的製備方法，其中，所述製備方法包括以下步驟： 步驟a）在表達條件下，培養如請求項10所述的宿主細胞，從而表達所述雙特異性抗體； 步驟b）分離並純化步驟a）所得的雙特異性抗體。
  12. 一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含請求項1~7中任一所述的雙特異性抗體和藥學上可接受的載體。
  13. 請求項1~7中任一所述的雙特異性抗體或請求項12所述的藥物組合物在製備治療癌症的藥物中的用途。
  14. 如請求項13所述的用途，其中，所述癌症選自黑色素瘤、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、淋巴癌、乳腺癌、結直腸癌、白血病、前列腺癌、骨髓癌及其它贅生性惡性疾病。
  15. 一種治療癌症的方法，其中，所述方法包括向受試者施用請求項1~7中任一所述的雙特異性抗體或請求項12所述的藥物組合物。
  16. 如請求項15所述的方法，其中，所述癌症選自黑色素瘤、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、淋巴癌、乳腺癌、結直腸癌、白血病、前列腺癌、骨髓癌及其它贅生性惡性疾病。
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JP2019506863A (ja) * 2016-02-02 2019-03-14 カドモン コーポレイション，リミティド ライアビリティ カンパニー Ｐｄ−ｌ１及びｋｄｒに対する二重結合タンパク質
AR112603A1 (es) * 2017-07-10 2019-11-20 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos inhibidores de punto de control
WO2019148412A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-pd-1/lag3 bispecific antibodies
US11046769B2 (en) * 2018-11-13 2021-06-29 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof
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