CN116284427A - 抗muc17/cd3双特异性抗体、其制备方法及用途 - Google Patents

抗muc17/cd3双特异性抗体、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗MUC17/CD3双特异性抗体、其制备方法和在抗肿瘤中的应用。具体地，该双特异性抗体包含结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段和结合人CD3的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性识别和结合表达MUC17的肿瘤细胞和表达CD3分子的T细胞，能够激活T细胞，并使激活的T细胞与肿瘤细胞交联，进而更有效的杀伤肿瘤细胞。

Description

抗MUC17/CD3双特异性抗体、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于肿瘤治疗和生物技术领域，涉及一种抗人MUC17和CD3的双特异性抗体、以及所述抗体的制备方法及用途。
背景技术
Mucin17(MUC17)是一种跨膜蛋白，表达于正常胃肠黏膜上皮细胞的顶膜上，属于粘蛋白(mucin)家族成员，其一级结构包含信号肽、由61个串联重复序列的中心区构成的大的细胞外结构域、两个表皮生长因子(EGF)结构域、集聚蛋白(SEA)和具有80个氨基酸的细胞质尾。MUC17在一些癌症中异常表达，例如，MUC17 mRNA在一种胰腺细胞系和三种结肠癌细胞系中表达(Gun等人2002)；免疫组织化学研究确认了MUC17蛋白在胰腺癌中的表达(Moniaux等人2006)；在胃癌及胃食管交界处癌细胞膜上MUC17过表达；然而，在结肠癌中，MUC17蛋白表达量较低(Senapati等人,J.Clin.Pathol.2010)。虽然如此，MUC17的表达模式使其成为用于治疗不同形式的恶性肿瘤的潜在靶标。
CD3分子是表达于所有成熟T淋巴细胞表面的蛋白，通过与TCR结合形成TCR-CD3复合物而启动对抗原刺激的体液免疫应答，因此成为介导免疫细胞(如T细胞，NK细胞等)杀伤型双特异性抗体中应用最多的效应细胞表面触发分子。CD3可以募集具有杀伤作用的CTL细胞，靶向CD3的双特异性抗体通过分别结合T细胞表面CD3分子和靶细胞表面抗原，激活T细胞，并使CTL与靶细胞直接接触，进而诱导其有效杀伤靶细胞。
因此，为进一步改善MUC17的抗体抗肿瘤功能，激活T细胞的肿瘤杀伤活性，开发同时靶向MUC17和CD3的双特异性抗体以治疗MUC17异常表达的肿瘤具有较好的临床应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结合人MUC17和CD3的双特异性抗体；提供编码所述双特异性抗体的多核苷酸分子；提供包含所述多核苷酸分子的表达载体；提供包含所述表达载体的宿主细胞；提供所述双特异性抗体的制备方法；提供包含所述双特异性抗体的药物组合物；提供所述双特异性抗体在制备药物中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种结合人MUC17和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
(a)第一抗原结合功能域，和
(b)第二抗原结合功能域，
以及，任选的，还包含(c)Fc结构域；
其中，所述第一抗原结合功能域为结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段；和/或
所述第二抗原结合功能域为结合人CD3的抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗原结合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fv片段或单链Fv(scFv)片段。
在另一优选例中，所述第一抗原结合功能域可以是1个、2个、3个或多个，和/或所述第二抗原结合功能域可以是1个、2个、3个或多个。
在另一优选例中，所述Fc结构域包含2个Fc多肽单体，每个Fc多肽单体从N端到C端包含CH2-CH3，所述Fc多肽单体通过二硫键连接。
在另一优选例中，所述Fc结构域选自同源二聚体的Fc结构域或异源二聚体的Fc结构域；优选地，所述异源二聚体的Fc结构域包含异源二聚修饰。所述异源二聚修饰是指可以诱导Fc结构域的异二聚化的修饰方式，包括但不限于杵臼结构(knob-into-hole)修饰、空间位阻修饰、电荷修饰(电荷突变)、氢键作用修饰、疏水作用改变修饰或其组合。更优选的，所述修饰在Fc结构域的CH3区。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含单体或单体形成的二聚体，所述二聚可以是同源或异源二聚体，所述单体从N端到C端包含选自下组的结构：
Figure BDA0003401759570000021
Figure BDA0003401759570000031
其中，
A1、A2、A3、A4、A5各自独立地为无或与人MUC17结合的抗原结合片段，且至少一个不为无；
B1、B2、B3、B4、B5各自独立地为无或与人CD3结合的抗原结合片段，且至少一个不为无；
VLA代表结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
VHA代表结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段的重链可变区；
VLB代表结合人CD3的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
VHB代表结合人CD3的抗体或其抗原结合片段的重链可变区；
CL代表轻链恒定区；CH代表重链恒定区；
L2、L3、L4、L5、L6、L7各自独立地为无或键或肽接头；
“～”代表二硫键或共价键；“-”代表肽键；
其中，所述双特异性抗体具有同时结合人MUC17以及结合人CD3的活性。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含单体或单体形成的二聚体，所述二聚可以是同源或异源二聚体，所述单体从N端到C端包含选自下组的结构：
Figure BDA0003401759570000032
Figure BDA0003401759570000041
其中，
A1、A2、A3、A4、A5各自独立地为无或与人MUC17结合的抗原结合片段，且至少一个不为无；
B1、B2、B3、B4、B5各自独立地为无或与人CD3结合的抗原结合片段，且至少一个不为无；
VLA代表结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
VHA代表结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段的重链可变区；
VLB代表结合人CD3的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
VHB代表结合人CD3的抗体或其抗原结合片段的重链可变区；
CL代表轻链恒定区；CH代表重链恒定区；
L2、L3、L4、L5、L6、L7各自独立地为无或键或肽接头；
“～”代表二硫键或共价键；“-”代表肽键；
其中，所述双特异性抗体具有同时结合人MUC17以及结合人CD3的活性。
在另一优选例中，所述L2、L3、L4、L5、L6、L7为肽接头，序列为(G4S)n，n为整数；较佳地，n为1-6的整数；优选地，n为3。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含选自以下组的结构：
(a)结构Ⅰa或Ⅰb的单体形成的同源二聚体；
(b)结构Ⅰa和结构Ⅱ的单体形成的异源二聚体；
(c)结构Ⅲ的单体；
(d)结构Ⅳ的单体；和
(e)结构Ⅴ的单体。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含轻链和重链，所述重链和轻链可以是同源的或是异源的。
在另一优选例中，所述重链从N端到C端包含选自以下组的结构：
(a)VHA-CH1-CH2-CH3-L2-scFvB；
(b)VHB-CH1-CH2-CH3-L2-scFvA；
(c)scFvB-L2-VHA-CH1-CH2-CH3；
(d)scFvA-L2-VHB-CH1-CH2-CH3；
(e)VHA-CH1-L2-scFvB；
(f)VHA-CH1；
(g)VHA-CH1-L2-scFvB-L3-VHA-CH1；
(h)VHA-CH1-L2-VHA-CH1-L3-scFvB；
(i)VHA-CH1-CH2-CH3；和
(j)VHA-CH1-L2-scFvB-CH2-CH3；
其中，
scFvA代表结合人MUC17的scFv；scFvB代表结合人CD3的scFv；
L1、L2、L3独立地为键或肽接头。
在另一优选例中，所述轻链从N端到C端包含选自以下组的结构：
(k)VLA-CL；
(l)VLB-CL；
(m)VLA-CL-L2-scFvB；
(n)VLA-CL-L2-scFvB-L3-VLA-CL；
(o)VLA-CL-L2-VLA-CL-L3-scFvB；和
(p)scFvB-L2-VLA-CL；
其中，L2、L3独立地为键或肽接头。
在另一优选例中，所述第一抗原结合功能域scFvA包含可变区VH和可变区VL，并且VH与VL直接连接或通过肽接头连接。
在另一优选例中，所述第一抗原结合功能域scFvA为抗MUC17 scFv1，其VH和VL通过肽接头L1连接，从N端到C端具有VL-L1-VH的结构，其中“-”代表肽键。
在另一优选例中，所述第一抗原结合功能域scFvA为抗MUC17 scFv2，其VH和VL通过肽接头L1连接，从N端到C端具有VH-L1-VL的结构，其中“-”代表肽键。
在另一优选例中，所述第二抗原结合功能域scFvB包含可变区VH和可变区VL，并且VH与VL直接连接或通过肽接头连接。
在另一优选例中，所述第二抗原结合功能域scFvB为抗CD3 scFv1，其VH和VL通过肽接头L1连接，从N端到C端具有VL-L1-VH的结构，其中“-”代表肽键。
在另一优选例中，所述第二抗原结合功能域scFvB为抗CD3 scFv2，其VH和VL通过肽接头L1连接，从N端到C端具有VH-L1-VL的结构，其中“-”代表肽键。
在另一优选例中，所述肽接头L1的序列为(G4S)n，n为整数；较佳地，n为1-6的整数；优选地，n为4。
在另一优选例中，所述双特异性抗体选自下组的结构：
(A)包含2条重链(a)，和2条轻链(k)；
(B)包含2条重链(c)，和2条轻链(k)；
(C)包含2条重链(b)，和2条轻链(l)；
(D)包含2条重链(d)，和2条轻链(l)；
(E)包含1条重链(e)，和1条轻链(k)；
(F)包含1条重链(f)，和1条轻链(m)
(G)包含1条重链(g)，和2条轻链(k)；
(H)包含1条重链(h)，和2条轻链(k)；
(I)包含2条重链(f)，和1条轻链(n)；
(J)包含2条重链(f)，和1条轻链(o)；
(K)包含2条重链(i)，和2条轻链(p)；
(L)包含2条重链(i)，和2条轻链(m)；
(M)包含2条重链(j)，和2条轻链(k)；
(N)包含1条重链(a)，1条重链(i)，和2条轻链(k)，所述重链(a)的CH3区包含杵结构修饰，所述重链(i)的CH3区包含臼结构修饰；
(O)包含1条重链(c)，1条重链(i)，和2条轻链(k)，所述重链(c)的CH3区包含杵结构修饰，所述重链(i)的CH3区包含臼结构修饰；和
(P)包含1条重链(j)，1条重链(i)，和2条轻链(k)，所述重链(j)的CH3区包含杵结构修饰，所述重链(i)的CH3区包含臼结构修饰。
在另一优选例中，所述结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、和6所示；和LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8、9和10所示。
在另一优选例中，所述结合人MUC17抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：3所示的VH。
在另一优选例中，所述结合人MUC17抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：7所示的VL。
在另一优选例中，所述抗MUC17 scFv1的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
在另一优选例中，所述抗MUC17 scFv2的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
在另一优选例中，所述抗MUC17抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示。
在另一优选例中，所述抗MUC17抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示。
在另一优选例中，所述结合人CD3的抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：12、13、和14所示；和LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16、17和18所示。
在另一优选例中，所述结合人CD3的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：11所示的VH。
在另一优选例中，所述结合人CD3的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：15所示的VL。
在另一优选例中，所述抗CD3 scFv1的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
在另一优选例中，所述抗CD3 scFv2的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
在另一优选例中，所述抗CD3抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：47所示，
在另一优选例中，所述抗CD3抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4，所述轻链恒定区选自κ(Kappa)或λ(Lambda)链。
在另一优选例中，所述重链恒定区选自IgG1，所述轻链恒定区选自κ链；优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO：24所示。
在另一优选例中，所述重链恒定区和/或轻链恒定区包含突变的氨基酸；优选地，所述IgG4重链恒定区包含S228P突变。
在另一优选例中，所述双特异性抗体选自下组：
(1)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(2)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(3)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(4)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(5)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；
(6)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；
(7)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；
(8)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；
(9)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(10)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(11)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示；
(12)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：39所示；
(13)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(14)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(15)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(16)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；和
(17)将(1)-(16)中任一项的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同时抗MUC17活性和抗CD3活性的由(1)-(16)中任一项衍生的多肽。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包括所述双特异性抗体的活性片段和/或衍生物，其中，所述活性片段和/或所述衍生物保留了所述双特异性抗体的70-100％(如70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的抗MUC17活性和70-100％的抗CD3活性。
在另一优选例中，所述双特异性抗体的衍生物具有与本发明双特异性抗体至少85％的序列同一性。
在另一优选例中，所述双特异性抗体的衍生物是本发明双特异性抗体经过一个或几个氨基酸缺失、插入和/或取代后并保持至少85％的同一性的序列。
在另一优选例中，所述双特异性抗体的衍生物具有与本发明双特异性抗体至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述的取代为保守性取代。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码如本发明的第一个方面所述的双特异性抗体。
在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明的第二方面所述的多核苷酸分子。
在另一优选例中，所述表达载体为病毒或质粒，较佳地为噬菌体或者噬菌粒。
在另一优选例中，所述表达载体选自下组：pcDNA3.4，pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR，pTT5，pDHFF，pGM-CSF或pCHO 1.0，较佳地为pTT5。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明的第三方面所述的表达载体。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：COS、CHO、293F、293E、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地为E.coli TG1、BL21(DE3)细胞(表达单链抗体或Fab抗体)或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。
在另一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞，优选CHO细胞、293F或293E细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种如本发明的第一方面所述的双特异性抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如本发明的第四方面所述的宿主细胞，从而表达结合人MUC17和CD3的双特异性抗体；
(b)分离并纯化步骤(a)所述的双特异性抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的如本发明的第一方面所述的双特异性抗体；可选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。
在本发明的第七方面，提供了一种如本发明的第一方面所述的双特异性抗体、或如本发明的第六方面所述的药物组合物在制备癌症或肿瘤的药物中的用途。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤选自：胰腺癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、小肠癌、胃肠癌、胃癌、食管癌、胃食管癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、腺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、胶质母细胞瘤、甲状腺癌、膀胱癌、宫颈癌、血癌、皮肤癌、上皮癌、脑癌、中枢神经系统癌或其组合。
在本发明的第八方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
(a)如本发明的第一方面所述的双特异性抗体
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)。
在另一优选例中，所述免疫偶联物包括抗体-药物偶联物(ADC)。
在另一优选例中，所述免疫偶联物用于制备治疗癌症或肿瘤的药物组合物。
在本发明的第九方面，提供了一种治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本发明的第一方面所述的双特异性抗体、如本发明的第六方面所述的药物组合物、或如本发明的第八方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中，所述方法还包括和其它的抗肿瘤药联合给药。
附图说明
图1A-1P显示了抗MUC17/CD3双特异性抗体的结构示意图，图1A显示了CM1/2的结构示意图；图1B显示了CM3/4的结构示意图；图1C显示了CM5/6的结构示意图；图1D显示了CM7/8的结构示意图；图1E显示了CM9/10的结构示意图；图1F显示了CM11/12的结构示意图；图1G显示了CM13/14的结构示意图；图1H显示了CM15/16的结构示意图；图1I-1P显示了结构(I)-(P)的结构示意图。
图2显示了ELISA检测抗MUC17/CD3双特异性抗体与MUC17抗原的结合。
图3显示了ELISA检测抗MUC17/CD3双特异性抗体与CD3抗原的结合。
图4显示了FACS检测抗MUC17/CD3双特异性抗体与细胞LS174T的结合。
图5A-5B显示了抗MUC17/CD3双特异性抗体阻断T细胞上的CD3-TCR复合物的活性。
图6显示了抗MUC17/CD3双特异性抗体激活CD3+T细胞杀伤LS174T细胞的活性，“CD3+T细胞”表示表达CD3分子的T细胞。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种靶向人MUC17和CD3的双特异性抗体。具体地，本发明开发的结合人MUC17和CD3的双特异性抗体，包含结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段和结合人CD3的抗体或其抗原结合片段，其能够保持两端抗体的活性，能够同时结合T细胞表面CD3分子和肿瘤细胞上的MUC17蛋白。特别地，本发明的双特异性抗体能够阻断T细胞上的CD3-TCR复合物的活性，能够激活CD3+T细胞，并使激活的T细胞和肿瘤细胞交联，进而更有效地杀伤肿瘤细胞。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
本发明中，术语“抗体(Antibody，缩写Ab)”和“免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，缩写IgG)”是有相同结构特征的异四聚体蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成，每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型(isotype)的重链间的二硫键数目不同，每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端由可变区(VH)，其后是恒定区，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成，每条轻链的一端由可变区(VL)，另一端有恒定区，轻链恒定区包括一个结构域CL；轻链的恒定区与重链的恒定区的CH1结构域配对，轻链的可变区与重链的可变区配对，恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等，重链恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型；轻链恒定区包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗体的重链和轻链通过重链的CH1结构域和轻链的CL结构域之间的二硫键共价连接在一起，抗体的两条重链通过铰链区之间形成的多肽间二硫键共价连接在一起。
本发明中，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤细胞的培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明中，术语“双特异性抗体(双抗、bispecific antibody或BsAb)”是指能同时特异性结合两种抗原(靶点)或两种表位的抗体分子。根据对称性，双特异性抗体可以分为结构对称的和不对称的分子。根据结合位点的多少，双特异性抗体可以分为二价、三价、四价和多价分子。
本发明中，术语“抗原结合片段”是指能够与人MUC17或CD3特异性结合的抗体的片段。本发明的抗原结合片段的非限制性例子包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fv片段、单链抗体(scFv)、单域抗体(sdAb)等。Fab片段是用木瓜蛋白酶消化抗体裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段，Fab段由抗体的重链的VH和CH1以及轻链的VL和CL结构域组成。F(ab’)2片段是用胃蛋白酶消化抗体产生的片段，F(ab’)2片段具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合Fab’部分。Fv片段是由抗体的重链可变区和轻链可变区紧密非共价关联的二聚物组成。单链抗体(scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽接头(linker)连接而成的抗体。单域抗体(sdAb)又称为纳米抗体(nanobody)或重链抗体，仅由重链构成，其抗原结合区仅是一个通过铰链区与Fc区连接的单结构域。
本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。
如本文所用，术语“框架区(FR)”指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，术语“人框架区”是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。
本发明中，术语“L”(如L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7)在不同的结构中，可以独立代表不存在、键或肽接头。术语“肽接头”是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基，或用于将第一抗原结合功能域和第二抗原结合功能域、第一抗原结合功能域和第一抗原结合功能域、或第二抗原结合功能域和第二抗原结合功能域进行连接的一个或多个氨基酸残基。在本发明中，优选的肽接头是指肽接头L1和L2-L7，其中L1连接单链抗体(scFv)的VH和VL，而L2-L7用于将第一抗原结合功能域和第二抗原结合功能域、第一抗原结合功能域和第一抗原结合功能域、或第二抗原结合功能域和第二抗原结合功能域进行连接。合适的接头实例包括单甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)残基，接头中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。在本发明的发明内容或实施方案中，当描述抗体结构时，不同的L(如L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7)仅用于示意性的表示结构中不同连接位置的肽接头，对L的结构没有限定作用。相同结构中的不同L或不同结构中的L可以相同或不同。
本发明中，术语“杵臼结构(knob-into-hole)修饰”是指抗体的Fc结构域包含氨基酸突变，这样的突变使两个Fc多肽单体之间形成杵臼结构配对。例如一个Fc多肽单体中的CH3结构域中合适位点的氨基酸被相对较大的氨基酸残基取代，形成杵结构；另一个Fc多肽单体中的CH3结构域中相应位置的氨基酸被相对较小的氨基酸残基取代，形成臼结构。
本发明中，术语“抗”、“结合”、“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。通常，抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更小的平衡解离常数(KD)结合该抗原。本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。例如，使用表面等离子体共振术(Surface Plasmon Resonance，缩写SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。
本发明中，术语“表位”是指与抗体特异性结合的多肽决定簇。本发明的表位是抗原中被抗体结合的区域。
双特异性抗体
本发明的双特异性抗体(双抗、抗MUC17/CD3双特异性抗体、结合人MUC17和CD3的双特异性抗体、或anti-MUC17×CD3 BsAb)为一种能同时与人MUC17和CD3特异结合的双特异性抗体，其包含结合人MUC17抗体或其抗原结合片段，和结合人CD3抗体或其抗原结合片段，以及，任选地，Fc结构域。所述的抗原结合片段的结构可以选自下组：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fab’片段；(iv)Fv片段；或(v)单链Fv(scFv)。
本发明的双特异性抗体可以为二聚体、三聚体或多聚体，优选为同源或异源二聚体。本发明的双特异性抗体中抗MUC17或抗CD3的抗体部分可以包括一个或多个抗体或其抗原结合片段，较佳地，1、2、3、4、5、6个。
本领域中，抗体的结合区通常均含有一条轻链可变区和一条重链可变区，每一个可变区均含有3个CDR结构域。抗体的重链和轻链的CDR结构域分别称为HCDR和LCDR。因此，常规抗体抗原结合位点包含六个CDR，包括分别来自重链和轻链V区的CDR集合。
在本发明中，本发明双特异性抗体的还包括其保守性变异体，指与本发明双特异性抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
在构建本发明的双特异性抗体时，与该双特异性抗体的化学和物理稳定性相关的问题也得到了解决，诸如表达物理稳定的分子、增加热和盐依赖的稳定性、降低聚集、增加在高浓度下的溶解度以及维持分别针对两种抗原MUC17和CD3的亲和力等。
编码核酸和表达载体
本发明另一方面提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码上述所述的结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段、所述的结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、或所述的双特异性抗体。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明所述多核苷酸分子的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地包括以下制备方法：通过基因克隆技术例如PCR方法等，获得编码上述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该抗体或其抗原结合片段基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明另一方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述的多核苷酸分子。
其中所述表达载体为本领域常规的表达载体，是指包含适当的调控序列，例如启动子序列、终止子序列、多腺苷酰化序列、增强子序列、标记基因和/或序列以及其他适当的序列的表达载体。所述表达载体可以是病毒或质粒，如适当的噬菌体或者噬菌粒，更多技术细节请参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等编著。本发明所述表达载体较佳地为pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.4，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR，pTT5，pDHFF，pGM-CSF或pCHO 1.0，更佳地为pTT5。
本发明另外提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的表达载体。
本发明所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的多核苷酸可被有效表达即可。其中所述宿主细胞包括原核表达细胞和真核表达细胞，所述宿主细胞较佳地包括：COS、CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese H amster Ovary)、293E、293F、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地为E.coli TG1、BL21(DE3)细胞(表达单链抗体或Fab抗体)或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。将前述表达载体转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
作为优选的方案，所述宿主细胞是真核细胞。优选CHO细胞、293F或293E细胞。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明另一方面提供了能与MUC17和CD3特异结合的双特异性抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达能与MUC17和CD3特异结合的双特异性抗体；
(b)分离并纯化步骤(a)所述的的双特异性抗体。
本发明所述的宿主细胞的培养方法、所述抗体的分离和纯化方法为本领域常规方法，具体操作方法请参考相应的细胞培养技术手册以及抗体分离纯化技术手册。本发明中公开的抗MUC17/CD3双特异性抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达能与MUC17和CD3特异结合的双特异性抗体；分离和纯化所述的双特异性抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的双特异性抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的双特异性抗体。本发明的发明人对所得抗MUC17/CD3双特异性抗体进行了检测实验，实验结果表明该抗MUC17/CD3双特异性抗体能够很好地与靶细胞和抗原结合，具有较高的亲和力。
药物组合物
本发明的另一方面提供了一种组合物，所述组合物包含上述的能与MUC17和CD3特异性结合的双特异性抗体，和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。优选地，所述的组合物是药物组合物。
本发明提供的双特异性抗体，可以和药学上可接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明的双特异性抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为4-8，较佳地pH约为5-8，优选地pH约为5-7或6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射(如腹膜内)、颅内注射、或腔内注射。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。所述双特异性抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂。
本发明中，术语“药物组合物”是指本发明的双特异性抗体，和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗体的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的双特异性抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的双特异性抗体还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的双特异性抗体或其免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
应用
本发明另一方面提供了上述能与MUC17和CD3特异结合的双特异性抗体、或上述药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防、诊断、或治疗癌症或肿瘤。
本发明所称的用于治疗癌症或肿瘤的药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，进一步还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。
本发明所述的药物所针对的肿瘤较佳地包括但不限于：胰腺癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、小肠癌、胃肠癌、胃癌、食管癌、胃食管癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、腺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、胶质母细胞瘤、甲状腺癌、膀胱癌、宫颈癌、血癌、皮肤癌、上皮癌、脑癌、中枢神经系统癌或其组合。
本发明的双特异性抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。本发明的双特异性抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药以达到更加有效治疗肿瘤的目的。
本发明的主要优点包括
(1)本发明提供的结合人MUC17和CD3的双特异性抗体，能够特异性识别和结合表达MUC17的肿瘤细胞和表达CD3分子的T细胞，激活T细胞，并使激活的T细胞和肿瘤细胞交联，更有效杀伤肿瘤细胞；
(2)本发明提供的结合人MUC17和CD3的双特异性抗体，能够阻断T细胞上CD3-TCR复合物的活性。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
以下实施例中时使用的实验材料和来源以及试剂的配置方法具体说明如下。
实验试剂与材料：
小鼠骨髓瘤细胞SP2/0：购自ATCC，货号CRL-1581；
Balb/c小鼠：购自上海灵畅生物科技有限公司；
LS174T细胞：ATCC，货号CL-188TM；
羊抗鼠二抗：购自博奥龙免疫技术有限公司，货号BF03001-1ML；
羊抗人PE荧光二抗：购自Jackson，货号109-115-098；
96孔酶标板：购自costar，货号9018；
HRP标记的羊抗人Fc抗体：购自sigma，货号A0170；
PBS缓冲液：上海源培生物科技有限公司，货号B320KJ；
牛血清白蛋白(BSA)：购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A600332-0100；
PBST：PBS+0.05％Tween 20；
TMB：购自BD公司，货号555214；
RPMI 1640Medium：购自Gibco公司，货号61870127；
FBS：购自Gibco，货号10099；
Penicillin-streptomycin(青霉素-链霉素)：购自Gibco公司，货号15140122；
胎牛血清：购自Gibco公司，货号10091-148；
polyethylene glycol solution(PEG)：购自sigma公司，货号P7181；
Hybridoma-SFM：购自life technologies，货号12045-076；
HAT：购自Gibco，货号21060017；
Human CD3 epsilon&CD3 delta Heterodimer Protein：购自Acrobiosystems，货号CDD-H52W1；
CD3+T cells：购自塞笠生物，货号XFB-CD3T-10A；
Figure BDA0003401759570000201
Luminescent Cell Viability Assay：购自Promega，货号G7573。
以下实施例中使用的实验仪器说明如下：
PCR仪：购自BioRad，货号C1000 Touch Thermal Cycler；
Beckman Coulter CytoFLEX流式细胞仪：购自Beckman公司；
SpectraMax M5酶标仪：购自Molecular Devices公司。
实施例1.人源化抗MUC17抗体和人源化抗CD3抗体的制备
1.人源化抗MUC17抗体的制备
a.抗原免疫小鼠
用哺乳动物细胞293E表达的人MUC17-His蛋白(根据UniProtKB提供的序列Q685J3取氨基酸aa4131-4390段序列，在其N端加上信号肽序列，C末端加上His标签，通过EcoRI和HindIII两个酶切位点分别构建到表达载体中，转染HEK-293E细胞表达并纯化获得，表达纯化后纯度>95％)常规免疫Balb/c小鼠。第1天，可溶性人MUC17-His蛋白与弗氏完全佐剂乳化后，对Balb/c小鼠进行皮下多点注射(人MUC17-His 100μg/鼠/0.5mL)；第14天，可溶性人MUC17-His蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后，对Balb/c小鼠进行皮下注射(人MUC17-His 50μg/鼠/0.5mL)；在第28天，可溶性人MUC17-His蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后，对Balb/c小鼠进行皮下注射(人MUC17-His 50μg/鼠/0.5mL)；三周后可溶性人MUC17-His蛋白，50μg/小鼠/0.2mL，腹腔内注射激发，3-4天后，取小鼠脾脏进行融合实验。
b.杂交瘤细胞的制备和筛选
在小鼠末次免疫后3-4天，使用常规的杂交瘤技术方案，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行PEG融合。融合后的细胞在完全培养基中悬浮均匀，完全培养基为将RPMI1640-GLUMAX加入1％Penicillin-streptomycin，20％FBS(胎牛血清)，1×HAT组成的培养基。融合后的细胞按3×104个细胞/200μL/孔，共铺于60块96孔培养板中培养。7-12天后，收获上清液，通过间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)筛选人MUC17结合活性阳性的杂交瘤孔。
其中，ELISA方法筛选人MUC17结合活性阳性的杂交瘤孔的方法如下：将MUC17-Fc(根据UniProtKB提供的序列Q685J3取氨基酸aa4131-4390段序列，在其N端加上信号肽序列，C末端加上Fc标签，通过EcoRI和HindIII两个酶切位点分别构建到表达载体中，转染HEK-293E细胞表达并纯化获得)以PBS缓冲液稀释至1μg/mL，100μL/孔加入板中，4℃培养过夜。次日甩掉上清，加入5％脱脂奶粉37℃封闭2小时，PBST洗板3次待用。将收取的杂交瘤上清液依次加入封闭后的板中，100μL/孔，37℃放置1小时。PBST洗板3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃放置30分钟；PBST洗板3次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μL的TMB，室温(20±5℃)避光放置5分钟；每孔加入50μL 2M H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析待测抗体与靶抗原MUC17结合能力。通过筛选共计拿到杂交瘤细胞株。将含血清完全培养基中扩增筛选获得的杂交瘤细胞株，离心换液至无血清培养液Hybridoma-SFM培养基，使细胞密度为1～2×107/mL，在8％CO2、37℃条件下培养1周，离心获取培养上清，通过Protein G亲和层析进行纯化，得到抗人MUC17单克隆抗体蛋白。检测亲和力，筛选亲和力高的蛋白(命名为27A3)进行抗体人源化。
c.抗MUC17抗体的人源化
本实施例通过分子生物学的相关方法获取杂交瘤的重链可变区和轻链可变区，并进一步构建人源化抗体。
通过Trizol提取杂交瘤细胞的RNA并进行mRNA反转录获取cDNA，随后以cDNA为模板，分别用鼠源抗体的重链和轻链简并引物(《Antibody Engineering》Volume 1，Editedby Roland Kontermann and Stefan Dübel，组合引物的序列来自第323页)进行PCR，对所获得的PCR产物进行测序并通过Kabat数据库分析，确定所获得的序列为鼠源抗体的可变区序列。其序列信息见表6。
对所得的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列进行分析，依据Kabat规则分别确定鼠源抗体27A3的3个抗原互补决定区(CDR)和4个框架区(FR)。27A3的重链可变区序列如SEQ ID NO：45所示，HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5和6所示；27A3的轻链可变区序列如SEQ ID NO：46所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列分别如SEQID NO：8、9和10所示。
鼠抗27A3单克隆抗体的人源化过程如下：
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/，将鼠源27A3的VH与人IgG胚系序列进行同源性比较，选择IGHV1-46*01为重链CDR移植模板，将27A3的重链CDR移植入IGHV1-46*01骨架区，并在HCDR3之后加入WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：52)作为第四个框架区，获得CDR移植重链可变区序列。同样地，将27A3的轻链可变区与人IgG胚系序列同源性比较，选择IGKV4-1*01为轻链CDR移植模板，将27A3的轻链CDR移植入IGKV4-1*01的骨架区，并在LCDR3之后加入FGAGTKLELR(SEQ ID NO：53)作为第四个框架区，获得CDR移植轻链可变区序列。在CDR移植可变区的基础上，对一些氨基酸位点进行突变。在进行突变时，将氨基酸序列进行Kabat编码，位点的位置由Kabat码指示。
优选的，对于CDR移植重链可变区，将48位M突变为I，将第67位的V突变为A，将第69位的M突变为L，将第71位的R突变为V，将第73位的T突变为K，将第78位的V突变为A，将第93位的A突变为S。对于CDR移植轻链可变区，将第43位的P突变为S。得到人源化27A3的重链可变区(SEQ ID NO：3)与轻链可变区(SEQ ID NO：7)。将回复突变的可变区序列再与人IgG1(SEQ ID NO：23)及Kappa链恒定区(SEQ ID NO：24)重组，获得27A3人源化抗体(hu-27A3)的重链全长(SEQ ID NO：44)和轻链全长(SEQ ID NO：29)。分别将hu-27A3的重链和轻链基因序列链接至pTT5表达载体，转染HEK-293E细胞，Protein A亲和纯化获取人源化抗体。0.22μM的滤膜无菌过滤后放于4℃备用。
2.鼠源抗人CD3单克隆抗体的来源和人源化
鼠源抗人CD3单克隆抗体(简称SP34)的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别来自于US8236308B2中的SEQ ID NO：2和4，分别对应于本发明的SEQ ID NO：48和49。
对SP34的VH和VL序列进行分析，依据Kabat规则分别确定SP34的CDR区和框架区。SP34的HCDR1-HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：12-14所示，LCDR1-LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：16-18所示。
SP34单克隆抗体的人源化过程如下：
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/，将鼠源SP34的VH与人IgG胚系序列进行同源性比较，选择IGHV3-23*04为重链CDR移植模板，将SP34的重链CDR移植入IGHV3-23*04骨架区，并在HCDR3之后加入WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：50)作为第四个框架区，获得CDR移植重链可变区序列。同样地，将SP34的轻链可变区与人IgG胚系序列同源性比较，选择IGLV7-46*01为轻链CDR移植模板，将SP34的轻链CDR移植入IGLV7-46*01的骨架区，并在LCDR3之后加入FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：51)作为第四个框架区，获得CDR移植轻链可变区序列。在CDR移植可变区的基础上，对一些氨基酸位点进行突变。在进行突变时，将氨基酸序列进行Kabat编码，位点的位置由Kabat码指示。
优选的，对于CDR移植重链可变区，将第49位的S突变为A，将第73位的N突变为D，将第93位的A突变为V，将第94位的K突变为R。对于CDR移植轻链可变区，将第36位的F突变为V，第46位的T突变为G，第49位的Y突变为G，第57位的W突变为G，第58位的T突变为V。
上述带有回复突变位点的重链和轻链可变区分别定义为SP34人源化重链可变区和轻链可变区(SEQ ID NO：11和15)。
由上海生工生物工程有限公司合成编码上述人源化的重链和轻链可变区的DNA。将合成的人源化重链可变区与人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：23)的编码基因相连，获得全长的人源化重链基因，命名为huSP34-IgG1(SEQ ID NO：47)；将人源化轻链可变区与人Kappa链恒定区(SEQ ID NO：24)的编码基因相连，获得全长的人源化轻链基因，命名为huSP34-LC(SEQ ID NO：34)。
实施例2.抗MUC17和CD3双特异性抗体的制备
1.抗MUC17和CD3双特异性抗体的构建
选择抗MUC17的人源化单克隆抗体hu-27A3(或称作hu27A3)与抗CD3单抗huSP34(或称作hu-SP34)的序列构建抗MUC17和CD3双特异性抗体(anti-MUC17×CD3 BsAb)CM1～16和结构(I)-(P)。
采用hu-27A3的IgG与抗CD3单抗的scFv串联的方式，构建了双特异抗体CM1～4；采用抗CD3单抗的IgG与hu-27A3的scFv串联的方式构建了双特异抗体CM5～8；采用hu-27A3的Fab片段与抗CD3单抗的scFv串联的方式，构建了双特异性抗体CD9～16。CM1～16的分子结构示意图见图1A-1P，具体结构及氨基酸序列如表1所示。其中CM1/2结构示意图见图1A；CM3/4结构示意图见图1B；CM5/6结构示意图见图1C；CM7/8结构示意图见图1D；CM9/10结构示意图见图1E；CM11/12结构示意图见图1F；CM13/14结构示意图见图1G；CM15/16结构示意图见图1H。其他结构(I)-(P)结构示意图见图1I-1P。
scFv的VH与VL的连接序列为4个GGGGS，命名为L1(SEQ ID NO：1)；scFv与IgG1的连接序列为3个GGGGS，命名为L2(SEQ ID NO：2)。
抗CD3抗体huSP34的VH氨基端序列如SEQ ID NO：11所示，VL氨基酸序列如SEQ IDNO：15所示。
抗CD3抗体的scFv1连接顺序从N端到C端为VL-L1-VH，huSP34 scFv1的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示；
抗CD3抗体的scFv2连接顺序从N端到C端为VH-L1-VL，huSP34 scFv2的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示；
CM1重链的连接顺序从N端到C端为hu27A3 IgG1-L2-huSP34 scFv1，氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；
CM2重链的连接顺序从N端到C端为hu27A3 IgG1-L2-huSP34 scFv2，氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示；
CM3重链的连接顺序从N端到C端为huSP34 scFv2-L2-hu27A3 gG1，氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；
CM4重链的连接顺序从N端到C端为huSP34 scFv1-L2-hu27A3 IgG1，氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示；
CM1～4的轻链与hu-27A3的轻链相同，氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示。
抗MUC17抗体hu27A3的VH氨基端序列如SEQ ID NO：3所示，VL氨基酸序列如SEQ IDNO：7所示。
hu-27A3的scFv1连接顺序从N端到C端为VL-L1-VH，hu27A3 scFv1的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示；
hu-27A3的scFv2连接顺序从N端到C端为VH-L1-VL，hu27A3 scFv2氨基端序列如SEQ ID NO：22所示；
CM5重链的连接顺序从N端到C端为huSP34 IgG1-L2-hu27A3 scFv1，氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示；
CM6重链的连接顺序从N端到C端为huSP34 IgG1-L2-hu27A3 scFv2，氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；
CM7重链的连接顺序从N端到C端为hu27A3 scFv2-L2-huSP34 IgG1，氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示；
CM8重链的连接顺序从N端到C端为hu27A3 scFv1-L2-huSP34 IgG1，氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示；
CM5～8的轻链与anti-CD3单克隆抗体huSP34的轻链相同，氨基酸序列如SEQ IDNO：34所示。
CM9：hu27A3的Fab重链与huSP34的scFv1用L2串联，氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示；另一条链为hu27A3的轻链，氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
CM10：hu27A3的Fab重链与huSP34的scFv2用L2串联，氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示；另一条链为hu27A3的轻链，氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
CM11：hu27A3的Fab轻链与huSP34的scFv1用L2串联，氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示；另一条链为hu27A3的Fab重链，氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示；
CM12：hu27A3的Fab轻链与huSP34的scFv2用linker2串联，氨基酸序列如SEQ IDNO：39所示；另一条链为hu27A3的Fab重链，氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示；
CM13：hu27A3的Fab重链与huSP34的scFv1用L2串联，再与hu27A3的Fab重链用L2串联，氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示；另一条链为hu27A3的轻链，氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
CM14：hu27A3的Fab重链与huSP34的scFv2用L2串联，再与hu27A3的Fab重链用L2串联，氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示；另一条链为hu27A3的轻链，氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
CM15：hu27A3的Fab重链用L2串联后，再与huSP34的scFv1用L2串联，氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示；另一条链为hu27A3的轻链，氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
CM16：hu27A3的Fab重链用L2串联后，再与huSP34的scFv2用L2串联，氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示；另一条链为hu27A3的轻链，氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
结构(I)：hu27A3的Fab轻链与huSP34的scFv1或scFv2串联，再与hu27A3的Fab轻链串联；另一条链为hu27A3的重链；
结构(J)：两条hu27A3的Fab轻链串联后，再与huSP34的scFv1或scFv2串联；另一条链为hu27A3的重链；
结构(K)：hu27A3的轻链的N端与huSP34的scFv1或scFv2串联；另一条链为hu27A3的重链；
结构(L)：hu27A3的轻链的C端与huSP34的scFv1或scFv2串联；另一条链为hu27A3的重链；
结构(M)：huSP34的scFv1或scFv2连接在hu27A3的重链Fab片段和Fc结构域之间；另一条链为hu27A3的轻链；
以下结构(N)、(O)和(P)为不对称结构。
将hu27A3的重链进行Knob-into-hole点突变：
Knob链：将hu27A3的重链恒定区的354位S突变为C，366位T突变为W；
Hole链：将hu27A3的重链恒定区的349位Y突变为C，366位T突变为S，368位L突变为A，407位Y突变为V。将Hole链的435及436位HY突变为RF。
结构(N)：huSP34的scFv1或scFv2连接在hu27A3的knob重链的C端，另一条链为hu27A3的hole重链；另一条链为hu27A3的轻链；
结构(O)：huSP34的scFv1或scFv2连接在hu27A3的knob重链的N端，另一条链为hu27A3的hole重链；另一条链为hu27A3的轻链；
结构(P)：huSP34的scFv1或scFv2连接在hu27A3的knob重链的Fab片段和Fc结构域之间，另一条链为hu27A3的hole重链；另一条链为hu27A3的轻链。
表1.Anti-MUC17×CD3 BsAb结构
Figure BDA0003401759570000271
Figure BDA0003401759570000281
2.anti-MUC17×CD3 BsAb的表达与纯化
将双特异性抗体的重链和轻链的DNA片段分别亚克隆到pTT5载体中，提取重组质粒共转染293E细胞。细胞培养5-7天后，将培养液通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤取上清，用Protein A亲和层析柱纯化。Fab双抗用Protein L亲和层析柱纯化。用含有100mM柠檬酸，pH3.5的洗脱液一步洗脱蛋白，回收目标样品并透析至pH7.4的PBS。0.22μM的滤膜无菌过滤后放于4℃备用。
实施例3.ELISA测定anti-MUC17×CD3 BsAb对抗原的亲和力
1.anti-MUC17×CD3 BsAb与MUC17抗原的亲和力检测
为了检测anti-MUC17×CD3 BsAb与MUC17的亲和力，用pH7.4的PBS缓冲液将MUC17-ECD-His蛋白(根据UniProtKB提供的序列Q685J3，并在其N端加上信号肽序列，C末端加上6×His标签，通过EcoRI和HindIII两个酶切位点分别构建到表达载体中，转染HEK-293E细胞表达并纯化获得)稀释至500ng/mL，然后100μL/孔加入ELISA板中；4℃孵育过夜；次日用PBST洗板两次；每孔加入PBST+1％BSA进行封闭，37℃封闭1小时；用PBST洗板两次；然后加入用PBS+1％BSA梯度稀释的待检测抗体，起始浓度为100nM，逐级3倍稀释11个梯度。37℃孵育1小时；PBST洗板两次，加入二抗HRP标记的羊抗人Fc抗体，37℃再孵育40分钟；PBST洗板三次，加入100μL/孔的TMB，室温孵育5分钟；加入50μL/孔的2M H2SO4终止液终止底物反应。用酶标仪450nm处读取OD值，GraphPad Prism进行数据分析，作图并计算EC50。
实验结果如图2所示，EC50值见表2，hu-27A3的EC50是0.0893nM，除CM5的亲和力较差，其他7个克隆与hu-27A3相比无明显差异。
表2.ELISA检测anti-MUC17×CD3 BsAb与MUC17的结合
Figure BDA0003401759570000282
2.anti-MUC17×CD3 BsAb与CD3抗原的亲和力检测
为了检测anti-MUC17×CD3 BsAb与CD3的亲和力，用pH7.4的PBS缓冲液将HumanCD3 epsilon&CD3 delta Heterodimer蛋白稀释至50ng/mL，然后100μL/孔加入ELISA板中；以下方法参考实施例3.1。酶标仪450nm处读取OD值，GraphPad Prism进行数据分析，作图并计算EC50。
实验结果如图3所示，EC50值见表3。除CM1和CM2的亲和力稍差，其他CM3～8与阳性对照huSP34相差不大。
表3.ELISA检测anti-MUC17×CD3 BsAb与CD3的结合
Figure BDA0003401759570000291
实施例4.检测anti-MUC17×CD3 BsAb对靶细胞LS174T细胞的亲和力
用FACS的方法测定双特异抗体对结直肠癌LS174T细胞的结合能力。具体方法如下：
收集对数生长期的LS174T细胞，离心去除细胞培养液，用PBS缓冲液洗2遍；计数并用1％BSA-PBS缓冲液稀释至2×106细胞/mL，100μL/孔铺96孔板；待测抗体起始浓度100nM，逐级3倍稀释11个梯度，加入到上述96孔板中，4℃孵育1小时；300g离心5分钟，弃上清，用1％BSA-PBS缓冲液洗涤3遍，按1:500比例稀释PE标记的羊抗人Fc，4℃孵育1小时；1％BSA缓冲液洗涤3遍，再用1％BSA-PBS缓冲液重悬，200μL/孔，使用Beckman Coulter CytoFLEX流式细胞仪读板。所得数据用GraphPad Prism9进行拟合分析，作图并计算EC50。
实验结果如图4所示，EC50值见表4。除了CM5、CM6与LS174T细胞的亲和力较差外，其他6个克隆与阳性对照hu-27A3相比无明显差异。
表4.FACS检测anti-MUC17×CD3 BsAb与细胞LS174T的结合
Figure BDA0003401759570000292
实施例5.检测anti-MUC17×CD3 BsAb阻断T细胞上CD3-TCR复合物的活性
采用Promega的PD1效应细胞来检测anti-MUC17×CD3 BsAb的抗CD3抗体的活性。
Promega的PD1效应细胞为Jurkat T细胞，其表面表达CD3及TCR形成复合物，并且有一个荧光报告基因。抗CD3抗体可以阻断效应细胞上的CD3-TCR复合物，激发荧光报告基因。
实验方法如下：
1.取对数生长期PD1效应细胞，密度在1.4～2×106/mL，活率在95％以上，轻轻吹散成单个细胞，然后180g离心10分钟，弃上清，加用assay buffer(90％RPMI1640+10％FBS)重悬为细胞密度4×106/mL。用多道移液器50μL/孔加入白色底透96孔板中。
2.加入抗体：待检用assay buffer稀释成3×工作浓度，然后逐级4倍稀释，共9个梯度，本实验抗体工作浓度100nM起始。25μL/孔加入白色96孔板。放于37℃，5％CO2培养箱中培养6小时。
3.加Bio-Glo试剂显色读板：培养箱中取出96孔板，平衡至室温，用不透光膜封住96孔板底部。加入75μL/孔Bio-Glo试剂。室温孵育约10分钟后，用Spectramax i3读取luminescence。
4.数据分析：所有数据均为复孔，所得数值用GraphPad Prism9软件拟合分析，获得EC50等数据。
实验结果如图5A-5B所示，Top及EC50值见表5A-5B。由EC50值可知，CM1～4四个克隆的活性均弱于阳性对照huSP34。CM5、CM6的活性与阳性对照SP34相比无明显差异。而CM7、CM8的活性明显优于阳性对照huSP34。
表5A.anti-MUC17×CD3 BsAb阻断T细胞上的CD3-TCR复合物的活性
Sample CM1 CM2 CM3 CM4 huSP34
Top 28254 54400 28356 23984 43135
HillSlope 1.38 1.527 1.161 0.9524 1.422
EC50(nM) 4.949 4.802 1.761 3.175 0.7297
表5B.anti-MUC17×CD3 BsAb阻断T细胞上的CD3-TCR复合物的活性
Sample CM5 CM6 CM7 CM8 huSP34
Top 42262 45767 80547 76685 43461
HillSlope 1.335 1.645 1.805 1.721 1.459
EC50(nM) 0.6461 1.112 1.414 1.168 0.6243
实施例6.anti-MUC17×CD3 BsAb激活CD3+T细胞杀伤LS174T细胞的活性
表达CD3分子的T细胞(CD3+T细胞)与贴壁的抗CD3抗体共孵育，CD3+T细胞被激活，可以杀伤肿瘤细胞。本实验用结直肠癌LS174T细胞铺96孔板，加入anti-MUC17×CD3 BsAb共孵育，然后加CD3+T细胞共培养，这样CD3+T细胞被激活后可以杀伤LS174T细胞。
实验条件与步骤如下：
1.取对数生长期的LS174T细胞铺96孔板，5000个/100μL/孔。放于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。
2.加入抗体及CD3+T细胞：稀释抗CD3抗体及anti-MUC17×CD3 BsAb，按4×工作浓度即800nM起始逐级四倍稀释8个梯度，50μL/孔加入96孔细胞培养板中，抗体终浓度为200nM；CD3+T细胞，2.5×104个/50μL/孔加入96孔板中。放于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时。
3.显色读板：培养箱中取出96孔板，吸弃150μl/孔的上清，加入50μL/孔cellTiter Glo试剂。室温孵育约5分钟后，用Spectramax i3读取luminescence。
4.数据分析：所得数值用GraphPad Prism软件拟合分析，获得IC50等数据。
实验结果如图6所示，检测样品CM2的IC50为0.28nM，CM7的IC50为0.28nM，但CM7的平台比CM2低，所以其杀伤活性稍优于CM2。而抗CD3抗体huSP34无明显杀伤作用，可能由于huSP34抗体不能使LS174T细胞被固定的原因。
综上所述，本发明提供的双特异性抗体anti-MUC17×CD3 BsAb，能够与细胞表面表达MUC17的LS174T细胞结合，能够发挥抗CD3抗体的作用激活T细胞。综合筛选结果，已构建的克隆CM7、CM8的活性较好。
总之，anti-MUC17×CD3 BsAb通过抗MUC17抗体靶向肿瘤细胞，同时发挥抗CD3抗体激活T细胞的作用；并且此双特异性抗体可以使激活的T细胞与肿瘤细胞交联，进而更有效的杀伤肿瘤细胞；抗体的Fc端还可以结合NK受体杀伤肿瘤。
表6.抗体序列表
Figure BDA0003401759570000311
/>
Figure BDA0003401759570000321
/>
Figure BDA0003401759570000331
/>
Figure BDA0003401759570000341
/>
Figure BDA0003401759570000351
/>
Figure BDA0003401759570000361
/>
Figure BDA0003401759570000371
/>
Figure BDA0003401759570000381
/>
Figure BDA0003401759570000391
/>
Figure BDA0003401759570000401
/>
序列表
<110> 丹生医药技术（上海）有限公司
<120> 抗MUC17/CD3双特异性抗体、其制备方法及用途
<160> 53
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Asp
1 5 10
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Arg
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Gln His Tyr Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 11
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 19
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr
145 150 155 160
Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp
225 230 235 240
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 20
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly
145 150 155 160
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
165 170 175
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
180 185 190
Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly
210 215 220
Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
225 230 235 240
Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 21
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ile Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg
180 185 190
Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
195 200 205
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe
225 230 235 240
Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
245 250
<210> 22
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys
165 170 175
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
180 185 190
Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
210 215 220
Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Phe
225 230 235 240
Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg
245 250
<210> 23
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 25
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly
465 470 475 480
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
485 490 495
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
500 505 510
Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
515 520 525
Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly
530 535 540
Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
545 550 555 560
Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
580 585 590
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
595 600 605
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn
610 615 620
Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
625 630 635 640
Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr
645 650 655
Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys
660 665 670
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
675 680 685
Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser
690 695 700
Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
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20 25 30
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Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
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Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser
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<400> 27
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<211> 719
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<400> 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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<210> 31
<211> 723
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<400> 31
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Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
675 680 685
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
690 695 700
Gln Gln His Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
705 710 715 720
Glu Leu Arg
<210> 32
<211> 723
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys
165 170 175
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
180 185 190
Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
210 215 220
Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Phe
225 230 235 240
Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
260 265 270
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
275 280 285
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp
290 295 300
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg
305 310 315 320
Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp
325 330 335
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
340 345 350
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
355 360 365
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
370 375 380
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
385 390 395 400
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
405 410 415
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
420 425 430
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
435 440 445
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
450 455 460
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
465 470 475 480
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
485 490 495
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
500 505 510
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
515 520 525
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
530 535 540
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
545 550 555 560
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
565 570 575
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
580 585 590
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
595 600 605
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
610 615 620
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
625 630 635 640
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
645 650 655
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
660 665 670
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
675 680 685
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
690 695 700
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
705 710 715 720
Pro Gly Lys
<210> 33
<211> 723
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ile Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg
180 185 190
Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
195 200 205
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe
225 230 235 240
Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
260 265 270
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
275 280 285
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp
290 295 300
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg
305 310 315 320
Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp
325 330 335
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
340 345 350
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
355 360 365
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
370 375 380
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
385 390 395 400
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
405 410 415
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
420 425 430
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
435 440 445
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
450 455 460
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
465 470 475 480
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
485 490 495
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
500 505 510
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
515 520 525
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
530 535 540
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
545 550 555 560
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
565 570 575
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
580 585 590
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
595 600 605
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
610 615 620
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
625 630 635 640
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
645 650 655
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
660 665 670
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
675 680 685
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
690 695 700
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
705 710 715 720
Pro Gly Lys
<210> 34
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 35
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys
225
<210> 36
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
245 250 255
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
260 265 270
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
275 280 285
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
290 295 300
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
305 310 315 320
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
325 330 335
Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly
340 345 350
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
355 360 365
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
370 375 380
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr
385 390 395 400
Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
405 410 415
Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala
420 425 430
Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn
435 440 445
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
450 455 460
Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp
465 470 475 480
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
485 490
<210> 37
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
245 250 255
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
260 265 270
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
275 280 285
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
290 295 300
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
305 310 315 320
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
325 330 335
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
340 345 350
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly
385 390 395 400
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
405 410 415
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
420 425 430
Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
435 440 445
Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly
450 455 460
Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
465 470 475 480
Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
485 490
<210> 38
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr
225 230 235 240
Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
245 250 255
Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
260 265 270
Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr
275 280 285
Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu
290 295 300
Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu
305 310 315 320
Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly
325 330 335
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
340 345 350
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
355 360 365
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
370 375 380
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp
385 390 395 400
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg
405 410 415
Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp
420 425 430
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
435 440 445
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
450 455 460
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
465 470 475 480
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
485
<210> 39
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
225 230 235 240
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val
260 265 270
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser
275 280 285
Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg
290 295 300
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
305 310 315 320
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His
325 330 335
Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
340 345 350
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val
370 375 380
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
385 390 395 400
Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
405 410 415
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
420 425 430
Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
435 440 445
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp
450 455 460
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe
465 470 475 480
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
485
<210> 40
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
245 250 255
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
260 265 270
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly
340 345 350
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
355 360 365
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
370 375 380
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr
385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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580 585 590
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595 600 605
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675 680 685
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690 695 700
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<211> 719
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
340 345 350
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Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
435 440 445
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450 455 460
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<210> 42
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr
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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
370 375 380
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr
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<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Met Ser His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
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Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
325 330 335
Ser Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln
340 345 350
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
355 360 365
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
370 375 380
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
385 390 395 400
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
405 410 415
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
435 440 445
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
485 490 495
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580 585 590
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595 600 605
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
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165 170 175
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180 185 190
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
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<210> 45
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
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20 25 30
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180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 48
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
<210> 49
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg
1 5 10

Claims (21)

1.一种结合人MUC17和CD3的双特异性抗体，其特征在于，包括：
(a)第一抗原结合功能域，和
(b)第二抗原结合功能域，
以及，任选的，还包含(c)Fc结构域；
其中，所述第一抗原结合功能域为结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段；和/或
所述第二抗原结合功能域为结合人CD3的抗体或其抗原结合片段。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述抗原结合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fv片段或单链Fv(scFv)片段。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含单体或单体形成的二聚体，所述二聚可以是同源或异源二聚体，所述单体从N端到C端包含选自下组的结构：
Figure FDA0003401759560000011
其中，
A1、A2、A3、A4、A5各自独立地为无或与人MUC17结合的抗原结合片段，且至少一个不为无；
B1、B2、B3、B4、B5各自独立地为无或与人CD3结合的抗原结合片段，且至少一个不为无；
VLA代表结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
VHA代表结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段的重链可变区；
VLB代表结合人CD3的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
VHB代表结合人CD3的抗体或其抗原结合片段的重链可变区；
CL代表轻链恒定区；CH代表重链恒定区；
L2、L3、L4、L5、L6、L7各自独立地为无或键或肽接头；
“～”代表二硫键或共价键；“-”代表肽键；
其中，所述双特异性抗体具有同时结合人MUC17以及结合人CD3的活性。
4.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含选自以下组的结构：
(a)结构Ⅰa或Ⅰb的单体形成的同源二聚体；
(b)结构Ⅰa和结构Ⅱ的单体形成的异源二聚体；
(c)结构Ⅲ的单体；
(d)结构Ⅳ的单体；和
(e)结构Ⅴ的单体。
5.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含轻链和重链，所述重链和轻链可以是同源的或是异源的。
6.如权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述重链从N端到C端包含选自以下组的结构：
(a)VHA-CH1-CH2-CH3-L2-scFvB；
(b)VHB-CH1-CH2-CH3-L2-scFvA；
(c)scFvB-L2-VHA-CH1-CH2-CH3；
(d)scFvA-L2-VHB-CH1-CH2-CH3；
(e)VHA-CH1-L2-scFvB；
(f)VHA-CH1；
(g)VHA-CH1-L2-scFvB-L3-VHA-CH1；
(h)VHA-CH1-L2-VHA-CH1-L3-scFvB；
(i)VHA-CH1-CH2-CH3；和
(j)VHA-CH1-L2-scFvB-CH2-CH3；
其中，
scFvA代表结合人MUC17的scFv；scFvB代表结合人CD3的scFv；
L1、L2、L3独立地为键或肽接头。
7.如权利要求5-6中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述轻链从N端到C端包含选自以下组的结构：
(k)VLA-CL；
(l)VLB-CL；
(m)VLA-CL-L2-scFvB；
(n)VLA-CL-L2-scFvB-L3-VLA-CL；
(o)VLA-CL-L2-VLA-CL-L3-scFvB；和
(p)scFvB-L2-VLA-CL；
其中，L2、L3独立地为键或肽接头。
8.如权利要求所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体选自下组的结构：
(A)包含2条重链(a)，和2条轻链(k)；
(B)包含2条重链(c)，和2条轻链(k)；
(C)包含2条重链(b)，和2条轻链(l)；
(D)包含2条重链(d)，和2条轻链(l)；
(E)包含1条重链(e)，和1条轻链(k)；
(F)包含1条重链(f)，和1条轻链(m)
(G)包含1条重链(g)，和2条轻链(k)；
(H)包含1条重链(h)，和2条轻链(k)；
(I)包含2条重链(f)，和1条轻链(n)；
(J)包含2条重链(f)，和1条轻链(o)；
(K)包含2条重链(i)，和2条轻链(p)；
(L)包含2条重链(i)，和2条轻链(m)；
(M)包含2条重链(j)，和2条轻链(k)；
(N)包含1条重链(a)，1条重链(i)，和2条轻链(k)，所述重链(a)的CH3区包含杵结构修饰，所述重链(i)的CH3区包含臼结构修饰；
(O)包含1条重链(c)，1条重链(i)，和2条轻链(k)，所述重链(c)的CH3区包含杵结构修饰，所述重链(i)的CH3区包含臼结构修饰；和
(P)包含1条重链(j)，1条重链(i)，和2条轻链(k)，所述重链(j)的CH3区包含杵结构修饰，所述重链(i)的CH3区包含臼结构修饰。
9.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：4、5、和6所示；和LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8、9和10所示。
10.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述结合人CD3的抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：12、13、和14所示；和LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16、17和18所示。
11.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述结合人MUC17的抗体或其抗原结合片段的重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；和/或所述结合人CD3的抗体或其抗原结合片段的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
12.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体选自下组：
(1)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(2)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(3)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(4)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(5)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；
(6)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；
(7)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；
(8)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；
(9)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(10)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(11)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示；
(12)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：39所示；
(13)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(14)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(15)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
(16)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；和
(17)将(1)-(16)中任一项的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同时抗MUC17活性和抗CD3活性的由(1)-(16)中任一项衍生的多肽。
13.一种分离的多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码如权利要求1-12中任一项所述的双特异性抗体。
14.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求13所述的多核苷酸分子。
15.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求14所述的表达载体。
16.一种如权利要求1-12中任一项所述的的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如权利要求15所述的宿主细胞，从而表达结合人MUC17和CD3的双特异性抗体；
(b)分离并纯化步骤(a)所述的双特异性抗体。
17.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的如权利要求1-12中任一项所述的双特异性抗体；可选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，其还包含一种或多种另外的治疗剂。
19.如权利要求1-12中任一项所述的双特异性抗体、或如权利要求17或18所述的药物组合物在制备癌症或肿瘤的药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述癌症或肿瘤选自：胰腺癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、小肠癌、胃肠癌、胃癌、食管癌、胃食管癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、腺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、胶质母细胞瘤、甲状腺癌、膀胱癌、宫颈癌、血癌、皮肤癌、上皮癌、脑癌、中枢神经系统癌或其组合。
21.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：
(a)如权利要求1-12中任一项所述的双特异性抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
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