CN118126178A - 抗pd-1-ctla-4双特异性抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明提供抗PD‑1‑CTLA‑4双特异性抗体及其用途。本发明进一步提供编码所述抗PD‑1‑CTLA‑4双特异性抗体的多核苷酸和表达载体以及产生所述抗PD‑1‑CTLA‑4双特异性抗体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明提供抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体及其用途。本发明进一步提供编码所述抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体的多核苷酸和表达载体以及产生所述抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体的方法。
背景技术
PD-1(programmed death 1，程序性死亡受体1)，也称CD279，是一种属于免疫球蛋白(Ig)超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白。PD-1由胞外IgV-样结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成。PD-1作为适应性和先天性免疫反应中的重要抑制分子，在活化T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞等细胞表面均有表达。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。
PD-1的主要配体为PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，其中PD-L1在介导肿瘤细胞逃逸过程中扮演着重要作用，其高表达于肿瘤细胞和一些抗原递呈细胞。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞上的PD-L1与免疫细胞(特别是T细胞)上的PD-1结合，通过刺激PD-1信号通路而直接抑制免疫细胞(特别是T细胞)的抗肿瘤反应，导致肿瘤细胞的免疫逃逸。通过阻断PD-1与PD-L1的相互作用，可以有效恢复T细胞对肿瘤的杀伤功能。近年来特异性阻断PD-1/PD-L1的抗体药物取得了医学界为之震惊的治疗效果，并且具有治疗多种类型肿瘤的潜力。
现有技术中存在多种抗PD-1抗体，参见例如WO2004056875A1、WO2016106159A1、WO2018129714A1和WO2019152571，并且已经有上市抗体药物用于癌症治疗并且正测试其他适应症。但仍需研发新的特异性识别PD-1的单克隆抗体，尤其与当前已知抗PD-1抗体存在不同活性的抗体，使其具有更低的毒副作用和更佳的临床药效。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4或CTLA4)，又称CD152，是一种白细胞分化抗原。作为免疫球蛋白超家族成员中的一种跨膜蛋白，CTLA-4主要表达于活化的T淋巴细胞和B细胞表面。此外，在耗竭的T细胞上通常也有表达。已发现CTLA-4在许多癌症组织中过表达，特别是实体瘤，例如黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、肝癌和乳腺癌。CTLA-4在活化的T淋巴细胞表面过表达可促进肿瘤侵袭，并且常常与不良预后相关。
CTLA-4和T细胞表面的共刺激分子CD28高度同源。它们均可与表达于抗原呈递细胞表面的配体CD80(B7-1)或CD86(B7-2)相结合，但CTLA-4拥有比CD28更高的亲和力来竞争结合CD80和CD86。CTLA-4与CD80(B7-1)或CD86(B7-2)结合后形成的CTLA-4/CD80和/或CTLA-4/CD86复合物负向调节T细胞受体信号传导，导致T细胞活化的下调、抗肿瘤免疫活性的抑制和肿瘤的免疫逃逸。
现有技术中存在靶向PD-1和CTLA-4的双特异性抗体，参见例如WO2014209804A1和WO2021023117A1。仍需研发新的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，以满足临床需求。
发明内容
在一方面，本发明提供一种抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:14所示HCDR1序列、SEQID NO:8所示HCDR2序列和SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:15所示LCDR1序列、SEQ ID NO:11所示LCDR2序列和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16所示LCDR3序列。
在一具体实施方案中，所述重链可变区和所述轻链可变区包含选自(1)-(9)中任一项的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列：(1)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；(2)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和SEQ ID NO:13所示LCDR3序列；(3)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ IDNO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；(4)SEQ ID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ IDNO:11所示LCDR2序列；和SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；(5)SEQID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；(6)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和SEQ ID NO:16所示LCDR3序列；(7)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ IDNO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和SEQ ID NO:16所示LCDR3序列；(8)SEQ ID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ IDNO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ IDNO:11所示LCDR2序列；和SEQ IDNO:16所示LCDR3序列；(9)SEQ ID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和SEQ ID NO:16所示LCDR3序列。
在又一实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和/或轻链恒定区。在一具体实施方案中，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和/或所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供一种抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，其包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分包含本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述第二抗原结合部分包含特异性结合CTLA-4的免疫球蛋白单可变结构域。在一实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域包含SEQ ID NO:44所示CDR1序列、SEQ IDNO:45所示CDR2序列和SEQ ID NO:46所示CDR3序列。在一实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
本发明还提供一种多核苷酸，其编码本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体。
本发明还提供一种表达载体，其包含本发明的多核苷酸。
本发明进一步提供一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或表达载体。
本发明还提供一种产生本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体的方法，其包括：
(I)在合适条件下培养本发明的宿主细胞以表达所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，以及
(II)从宿主细胞或其培养物分离所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体。
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，以及药学上可接受的载剂；并且任选地包含选自以下的一个或多个治疗剂：抗GITR激动剂抗体、抗CD40激动剂抗体、抗OX40激动剂抗体、抗4-1BB激动剂抗体、STING激动剂、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG-3抗体、抗VISTA抗体、抗TIGIT抗体、抗TIM-3抗体、VEGFR抑制剂、EGFR抑制剂、FGFR抑制剂、抗VEGF抗体和抗VEGFR抗体。
本发明还提供本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体或者药物组合物在制备用于增强免疫激活或者治疗癌症或感染性疾病的药物中的用途。
在一实施方案中，所述癌症选自肺癌、肝癌、胰腺癌、唾液腺癌、头颈癌、皮肤癌、上皮细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤、默克尔细胞癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、胆管癌、肛门癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、血管瘤、软组织肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、畸胎瘤、精原细胞瘤、胚胎性癌、绒毛膜癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、巨细胞瘤、膀胱癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、室管膜瘤、视网膜母细胞瘤、间皮瘤、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。
在一实施方案中，所述感染性疾病选自与病毒、细菌、真菌和寄生虫感染相关的疾病。
附图说明
图1A-1D显示了通过ELISA分析的候选抗PD-1抗体在蛋白水平的抗原结合活性；图1A显示了D1、D1-VH1VL1、D1-VH1VL2和D1-VH2VL1与PD-1-His的结合活性；图1B显示了D1、D1-VH2VL2、D1-VH2VL3、D1-VH3VL2和D1-VH3VL3与PD-1-His的结合活性；图1C显示了D2、D2-VH1VL1、D2-VH1VL2和D2-VH2VL1与PD-1-His的结合活性；图1D显示了D2、D2-VH2VL2、D2-VH2VL3、D2-VH3VL2和D2-VH3VL3与PD-1-His的结合活性。
图2A-2B显示了通过FACS分析的候选抗PD-1抗体在细胞水平的抗原结合活性；图2A显示了D1、D1-VH1VL1、D1-VH1VL2、D1-VH2VL1、D1-VH2VL2、D1-VH2VL3、D1-VH3VL2和D1-VH3VL3与huPD-1-Jurkat细胞的结合活性；图2B显示了D2、D2-VH1VL1、D2-VH1VL2、D2-VH2VL1、D2-VH2VL2、D2-VH2VL3、D2-VH3VL2和D2-VH3VL3与huPD-1-Jurkat细胞的结合活性。
图3A-3B显示了通过FACS分析的候选抗PD-1抗体的PD-1/PD-L1阻断活性；图3A显示了D1、D1-VH1VL1、D1-VH1VL2、D1-VH2VL1、D1-VH2VL2、D1-VH2VL3、D1-VH3VL2和D1-VH3VL3的PD-1/PD-L1的阻断活性；图3B显示了D2、D2-VH1VL1、D2-VH1VL2、D2-VH2VL1、D2-VH2VL2、D2-VH2VL3、D2-VH3VL2和D2-VH3VL3的PD-1/PD-L1的阻断活性。
图4A显示了候选抗PD-1抗体(D1和D2)在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中刺激IL-2的结果；图4B显示了候选抗PD-1抗体(D1和D2)在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中刺激IFN-γ分泌的结果。
图5A-5D显示了候选抗PD-1抗体的荧光素酶报告基因试验测试结果；图5A显示了D1、D1-VH1VL1、D1-VH1VL2和D1-VH2VL1的荧光素酶报告基因测试结果；图5B显示了D1-VH2VL2、D1-VH2VL3和D1-VH3VL3的荧光素酶报告基因测试结果；图5C显示了D2、D2-VH1VL1、D2-VH1VL2和D2-VH2VL1的荧光素酶报告基因测试结果；图5D显示了D2-VH2VL2、D2-VH2VL3、D2-VH3VL2和D2-VH3VL3的荧光素酶报告基因测试结果。
图6显示了候选双特异性抗体的构型。
图7A-7B显示了通过ELISA分析的候选双特异性抗体在蛋白水平的抗原结合活性；图7A显示了BsAb1、BsAb2、BsAb3和BsAb4与PD-1-His的结合活性；图7B显示了BsAb1、BsAb2、BsAb3和BsAb4与CTLA-4-his的结合活性。
图8A-8B显示了通过FACS分析的候选双特异性抗体在细胞水平的抗原结合活性；图8A显示了BsAb1、BsAb2、BsAb3和BsAb4与huPD-1-Jurkat细胞的结合活性；图8B显示了BsAb1、BsAb2、BsAb3和BsAb4与huCTLA4-CHO-S细胞的结合活性。
图9A-9B显示了通过FACS分析的候选双特异性抗体的阻断活性；图9A显示了阻断huCD80-mFc的活性；图9B显示了阻断huCD86-mFc的活性。
图10A-10B显示了候选双特异性抗体的荧光素酶报告基因试验测试结果；图10A显示了BsAb1和BsAb2的荧光素酶报告基因试验测试结果；图10B显示了BsAb3和BsAb4的荧光素酶报告基因试验测试结果。
图11A-11B显示了候选双特异性抗体在混合淋巴细胞反应试验中刺激IFN-γ分泌的结果；图11A显示了BsAb2在混合淋巴细胞反应试验中刺激IFN-γ分泌的结果；图11B显示了BsAb4在混合淋巴细胞反应试验中刺激IFN-γ分泌的结果。
图12A显示了候选双特异性抗体在小鼠皮下移植瘤模型中对肿瘤生长的抑制作用；图12B显示了30天时小鼠的肿瘤体积。
具体实施方式
定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，表述“包括”、“包含”、“含有”和“具有”是开放式的，表示包括所列举的元素、步骤或组分但不排除其他未列举的元素、步骤或组分。表述“由……组成”不包括未指定的任何元素、步骤或组分。表述“基本上由……组成”是指范围限于指定的元素、步骤或组分，加上不显著影响要求保护的主题的基本和新颖性质的任选存在的元素、步骤或组分。应当理解，表述“基本上由……组成”和“由……组成”涵盖在表述“包括”的含义之内。
如本文所用，“抗体”指免疫球蛋白或其片段，其通过至少一个抗原结合位点特异性结合抗原表位。术语“抗体”包括多特异性抗体(例如双特异性抗体)、全人源抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单域抗体以及抗原结合片段。抗体的定义涵盖单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是合成的(例如通过化学偶联或生物偶联产生的)、酶促处理得到的或重组产生的。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)。
如本文所用，“抗原结合片段”指全长抗体的部分，其少于全长，但是至少包含全长抗体的部分可变区(例如包含一个或多个CDR和/或一个或多个抗原结合位点)，并因此保留全长抗体的至少部分特异性结合抗原的能力。抗原结合片段的实例包括但不限于sdAb(例如重链抗体的可变结构域)、Fv、scFv、dsFv、scdsFv、Fab、scFab、Fab'、F(ab')2、双抗体、Fd和Fd'片段以及其他片段(例如包含修饰的片段)。
如本文所用，“全长抗体”通常包含四条多肽：两条重链(HC)和两条轻链(LC)。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。每条重链包含重链可变区(VH)以及重链恒定区(CH)。轻链可变区和重链可变区各自可以包含三个高度可变的“互补决定区(CDR)”和四个相对保守的“框架区(FR)”，并且从N端至C端以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的次序连接。在本文中，轻链可变区的CDR(CDRL或LCDR)可以称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链可变区的CDR(CDRH或HCDR)可以称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如本文所用，“免疫球蛋白单可变结构域”或者“单可变结构域”是指具有抗原结合活性的单个可变区(可变结构域)。不同于常规抗体中由一对VH和VL组成功能性抗原结合单位，单可变结构域可以独自形成功能性抗原结合单位。单可变结构域可以衍生自天然存在的无轻链抗体，例如骆驼科动物(如骆驼和羊驼)的重链抗体的可变结构域(variabledomain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)和鲨鱼的新抗原受体的单可变结构域(IgNAR variable single-domain，VNAR)，也可以从全长抗体中筛选得到，例如人抗体中具有抗原结合活性的轻链可变结构域和重链可变结构域。VHH通常包含三个高度可变的“互补决定区(CDR)”和四个相对保守的“框架区(FR)”，并且从N端至C端以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的次序连接。
如本文所用，“单域抗体(sdAb)”或“纳米抗体”是指包含单个免疫球蛋白可变结构域作为功能性抗原结合单位的抗体。与通常包含两条重链和两条轻链的全长抗体不同，单域抗体通常包含由单可变结构域和无CH1的重链恒定区组成的单个肽链，分子量仅为15kDa左右。
如本文所用，术语“仅有重链的抗体(Heavy-chain-only antibody)”和“重链抗体(Heavy-chain antibody)”可互换使用，并且以其最广泛的意义存在，是指缺乏常规抗体轻链的抗体，其仅包含一个VHH以及无CH1的重链恒定区(例如Fc片段)。
在本发明中，CDR的氨基酸序列均是按照AbM定义规则所示出的(本发明的权利要求中也是按照AbM定义规则所示出的序列)。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(参见例如Chothia,C.et al.,Nature,342,877-883(1989)；和Al-Lazikani,B.et al.,J.Mol.Biol.,273,927-948(1997))、基于抗体序列可变性的Kabat(参见例如Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)、AbM(Martin,A.C.R.andJ.Allen(2007)“Bioinformatics tools for antibody engineering,”in S.Dübel(ed.),Handbook of Therapeutic Antibodies.Weinheim:Wiley-VCH Verlag,pp.95–118)、Contact(MacCallum,R.M.et al.,(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)、IMGT(Lefranc,M.-P.,2011(6),IMGT,the International ImMunoGeneTics Information System ColdSpring Harb Protoc.；和Lefranc,M.-P.et al.,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本发明的权利要求中请求保护的范围是基于AbM定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR的定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。
因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
如本文所用，术语“框架区”和“构架区”可以互换使用。如本文中所使用的，术语“框架区”、“构架区”或“FR”残基是指抗体可变区中除了如上定义的CDR序列以外的那些氨基酸残基。
通常认为，由一个VH和一个VL通过非共价作用构成的“Fv”片段为包含抗原结合位点的最小的抗原结合片段。但是单可变结构域(单域抗体)也具有抗原结合能力。可以通过肽接头将VH和VL连接来获得“单链Fv(scFv)”。通过向Fv或scFv中引入二硫键可以分别获得“二硫键稳定的Fv(dsFv)”或“单链二硫键稳定的Fv(scdsFv或dsscFv)”。
如本文所用，“Fab”包含一个完整的抗体轻链(VL-CL)和抗体重链可变区和一个重链恒定区(VH-CH1，也称为Fd)。用肽接头将“Fab”中的CL和CH1连接可以获得单链“Fab(scFab)”。“F(ab')2”基本上包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段。“Fab'”为F(ab')2的一半，其可以通过还原F(ab')2铰链区的二硫键获得。
如本文所用，“嵌合抗体”指这样的抗体，其中的一部分(例如CDR、FR、可变区、恒定区或其组合)与衍生自特定物种的抗体中相应序列相同或同源，剩余的部分与衍生自另一物种的抗体中相应序列相同或同源。在本发明的一些实施方案中，嵌合抗体包含衍生自非人物种(例如小鼠)的可变区以及衍生自不同物种(例如人)的恒定区。嵌合抗体还可指对至少两种不同抗原具有特异性的多特异性抗体。嵌合抗体可以通过抗体工程化产生。抗体工程化的方法是本领域技术人员公知的。特别地，可以通过DNA重组技术生成嵌合抗体(例如参加Sambrook,J.,et al.(1989).Molecular cloning:a laboratory manual,2nded.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y)。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指非人抗体经修饰以增加与人抗体的序列同源性的抗体。人源化抗体通常保留其所源自的非人抗体的抗原结合能力并且对于人体具有较低的免疫原性。人源化抗体可以通过抗体工程化改造任何非人物种抗体或其中包含非人物种来源序列的抗体(例如嵌合抗体)来获得。非人物种例如可以包括小鼠、大鼠、兔、羊驼、鲨鱼或非人灵长类动物。由非人抗体获得人源化抗体的技术是本领域技术人员熟知的。例如，将非人抗体(例如鼠源抗体)的CDR序列移植到人抗体框架区中。在某些情况下，为了保持人源化抗体的抗原结合能力和/或稳定性，可以在人抗体框架区中保留非人抗体(例如鼠源抗体)框架序列的关键氨基酸残基，即进行“回复突变”(参见，例如Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81(21):6851-6855；Neuberger et al.(1984)Nature 312:604-608)。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指能够特异性结合两种或更多种(例如3、4、5或6种)不同抗原表位的抗体。多特异性抗体可以例如是双特异性、三特异性或四特异性抗体，其分别能够特异性结合2、3或4种抗原表位。多特异性抗体可以是多价(例如二价、三价或四价)抗体，即其具有多个抗原结合位点。多特异性抗体可以例如是嵌合抗体、人源化抗体、scFab、F(ab')2或双抗体。利用感兴趣的抗体或抗原结合片段构建多特异性抗体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如WO 93/08829；Suresh et al.,(1986)Methods inEnzymology,121:210；和Traunecker et al.,(1991)EMBO,10:3655-3659)。可以利用本领域已知的各种技术产生和分离多特异性抗体。例如，可以通过重组DNA技术获得编码多特异性抗体的多核苷酸，任选地将所述多核苷酸克隆入表达载体，然后用所述多核苷酸或表达载体转化宿主细胞，在合适的条件下培养转化的宿主细胞以允许所述多核苷酸或表达载体表达，最后从宿主细胞或培养基中分离和纯化多特异性抗体。还可以分别获得多特异性抗体的各个部分，然后通过酶促或化学偶联技术任选地通过接头将各个部分偶联获得多特异性抗体。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指能够特异性结合位于相同或不同抗原上的两个不同抗原表位的抗体。双特异性抗体可以是多价抗体。在一些实施方案中，本发明的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体是四价抗体。
如本文所用，术语“抗原表位”或“抗原决定簇”表示抗原中与抗体的抗原结合位点特异性结合的区域。抗原表位通常由抗原的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且通常具有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。
如本文所用，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指一群高度均一且针对同一抗原表位的抗体分子。单克隆抗体是除可能自发出现的自然突变外，完全相同的一群抗体分子。与单克隆抗体不同，多克隆抗体通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用杂交瘤技术或重组DNA技术获得。在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体是单克隆抗体。
如本文所用，氨基酸序列的“百分比(％)序列相同性”、“序列相同性”具有本领域公认的定义，其指通过序列比对(例如通过人工检视或可公知的算法)确定的两个多肽序列之间相同的百分比。可以使用本领域技术人员已知的方法确定，例如使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、Clustal Omega和FASTA软件。
可以修饰多肽(例如抗体的CDR区、框架区和恒定区)，例如进行一个或多个氨基酸的取代、添加和/或缺失，而不改变多肽的功能。取代优选为氨基酸的保守取代。合适的保守取代是本领域技术人员熟知的。此外，可以使用本领域已知的方法修饰抗体来改变其性能，例如改变抗体糖基化修饰的类型，改变形成链间二硫键的能力，或者为抗体缀合物的制备提供活性基团。这类修饰的抗体也涵盖在本发明的抗体的范围之内。
“亲和力”或“结合亲和力”用来衡量抗体和抗原之间通过非共价作用相互结合的强度。“亲和力”的大小通常可以报告为平衡解离常数KD或EC50。KD可以通过测量平衡缔合常数(ka)和平衡解离常数(kd)来计算：KD＝kd/ka。可以用本领域已知的常规技术测定亲和力，例如生物膜干涉技术(可以采用例如ForteBio Octet或Gator检测系统)、表面等离子共振法、酶联免疫测定(ELISA)或流式细胞术(FACS)等。EC50是指能引起50％最大效应的浓度。
如本文所用，表述“分离的”是指物质(例如多核苷酸或多肽)与其存在的来源或环境是分离的，即基本上不包含其他任何成分。本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体或者编码其的多核苷酸可以是分离的。
在本文中，术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换用于表示包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物。多核苷酸可以包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
在本文中，“载体”是用于将外源多核苷酸导入宿主细胞的媒介，当载体转化入适当的宿主细胞时，外源多核苷酸得以扩增或表达。如本文所用，载体的定义涵盖质粒、线性化质粒、病毒载体、粘粒、噬菌体载体、噬菌粒、人工染色体(例如，酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体)等。病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体和杆状病毒载体等。如本文所用，“表达载体”指能够表达感兴趣多肽的载体。表达载体通常可以包含编码感兴趣多肽的多核苷酸序列和与其可操作地连接的调控序列(如启动子和核糖体结合位点)。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制或扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达多核苷酸或载体所编码的多肽。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，真菌细胞例如酵母细胞或曲霉属、昆虫细胞(如S2果蝇细胞或Sf9)以及动物细胞(如成纤维细胞、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、NSO细胞或HEK293细胞)。
如本文所用，术语“治疗”指对疾病/症状的改善，例如使疾病/症状减轻或消失、防止或减缓疾病/症状的发生、进展和/或恶化。
如本文所用，“有效量”意指活性物质(例如本发明抗体或药物组合物)针对组织、系统、动物、哺乳动物或人诱发的生物或医学反应或期望治疗效应的量。因此，“有效量”可以是防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或症状(例如癌症)所需的量。本领域技术人员可以根据例如受试者的年龄、身体状况、性别、症状的严重程度、特定组合物或给药途径等因素来确定有效量。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)。
如本文所用，哺乳动物的实例包括但不限于人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、羊、羊驼、狗、猫等。如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，受试者是患者，例如癌症患者。
抗PD-1抗体或其抗原结合片段
在一方面，本发明提供一种抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其特异性识别并结合PD-1。
如本文所用，术语“PD-1”是指程序性死亡受体1。在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段特异性结合人PD-1(示例性氨基酸序列示于Uniprot ID：Q15116)。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:14所示HCDR1序列、SEQ ID NO:8所示HCDR2序列和SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:15所示LCDR1序列、SEQ ID NO:11所示LCDR2序列和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQID NO:16所示LCDR3序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区和所述轻链可变区包含选自(1)-(9)中任一项的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列：
(1)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；
(2)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:13所示LCDR3序列；
(3)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；
(4)SEQ ID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；
(5)SEQ ID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；
(6)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:16所示LCDR3序列；
(7)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:16所示LCDR3序列；
(8)SEQ ID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:16所示LCDR3序列；
(9)SEQ ID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:16所示LCDR3序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区包含：
(1)SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26的氨基酸序列；或者
(2)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQIDNO:21、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26相比具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。优选地，所述氨基酸的取代、添加和/或缺失不发生在CDR区。
在一些实施方案中，所述轻链可变区包含：
(1)SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列；或者
(2)与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQIDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29相比具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。优选地，所述氨基酸的取代、添加和/或缺失不发生在CDR区。
在一些实施方案中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26的氨基酸序列；所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区选自(1)-(16)中任一项：
(1)重链可变区，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列；
(2)重链可变区，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列；
(3)重链可变区，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列；
(4)重链可变区，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列；
(5)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列；
(6)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列；
(7)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列；
(8)重链可变区，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列；
(9)重链可变区，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列；
(10)重链可变区，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQIDNO:27的氨基酸序列；
(11)重链可变区，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQIDNO:28的氨基酸序列；
(12)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQIDNO:27的氨基酸序列；
(13)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQIDNO:28的氨基酸序列；
(14)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQIDNO:29的氨基酸序列；
(15)重链可变区，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQIDNO:28的氨基酸序列；
(16)重链可变区，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQIDNO:29的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体、人源化抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv(dsFv)、双抗体或双特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
重链恒定区和轻链恒定区可以各自独立地衍生自任何物种的免疫球蛋白的重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区可以衍生自任何亚型(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白的重链恒定区或其组合。轻链恒定区可以衍生自λ(Lambda)轻链或κ(Kappa)轻链恒定区。
在一些实施方案中，重链恒定区为人IgG(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)的重链恒定区(例如Fc区或CH1-铰链区-CH2-CH3)。在一实施方案中，重链恒定区为人IgG4重链恒定区。在一实施方案中，人IgG4重链恒定区包含S228P突变(也称为IgG4SP；EU编号)。在进一步的实施方案中，人IgG4重链恒定区还包含以下一个或多个突变：F234A、L235A、D265S和D265A(EU编号)。在一实施方案中，重链恒定区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一优选实施方案中，轻链恒定区为人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区。在一实施方案中，轻链恒定区包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列。
在一实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和轻链恒定区，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；并且所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体
在另一方面，本发明提供一种抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，其包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分包含本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述第二抗原结合部分包含特异性结合CTLA-4的免疫球蛋白单可变结构域。在一实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域包含SEQ ID NO:44所示CDR1序列、SEQ IDNO:45所示CDR2序列和SEQ ID NO:46所示CDR3序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构是人源化的。在一实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在一实施方案中，第一抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其分别包含如上所述本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一实施方案中，第一抗原结合部分包含如上所述本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体包含两个第一抗原结合部分和两个第二抗原结合部分，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自独立地相同或不同。
第一抗原结合部分和第二抗原结合部分可以任选地通过接头连接。在一些实施方案中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分不通过接头连接。在另一些实施方案中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分通过接头连接，例如肽接头或化学键。优选地，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分通过肽接头连接。示例性的肽接头可以包括但不限于聚甘氨酸(G)、聚丙氨酸(A)、聚丝氨酸(S)或其组合，例如GGAS、GGGS、GGGSG或者(G4S)n，其中n为1-20的整数。在一实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区。在一具体实施方案中，本发明的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区，所述第一抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区分别融合至所述重链恒定区和所述轻链恒定区的N端，所述第二抗原结合部分的免疫球蛋白单可变结构域任选地通过接头融合至所述重链可变区的N端、所述轻链可变区的N端、所述重链恒定区的C端和/或所述轻链恒定区的C端。
重链恒定区和轻链恒定区可以各自独立地衍生自任何物种的免疫球蛋白的重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区可以衍生自任何亚型(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白的重链恒定区或其组合。轻链恒定区可以衍生自λ(Lambda)轻链或κ(Kappa)轻链恒定区。
在一些实施方案中，重链恒定区为人IgG(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)的重链恒定区(例如Fc区或CH1-铰链区-CH2-CH3)。在一实施方案中，重链恒定区为人IgG1重链恒定区。在一实施方案中，人IgG1重链恒定区包含以下一个或多个突变：L234A、L235A和G237A(EU编号)。在一实施方案中，重链恒定区包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
在一些实施方案中，轻链恒定区为人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区。在一实施方案中，轻链恒定区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体包含第一多肽和第二多肽，其中
所述第一多肽从N端至C端具有如下结构：
VH-CH-Linker-VHH，
所述第二多肽从N端至C端具有如下结构：
VL-CL，
其中
VH和VL为如上所述第一抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区；
VHH为如上所述第二抗原结合部分的免疫球蛋白单可变结构域；
CH和CL分别为如上所述重链恒定区和轻链恒定区；
Linker为接头。
在一具体实施方案中，所述抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽和所述第二多肽选自(1)-(4)中任一项：
(1)第一多肽，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
(2)第一多肽，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
(3)第一多肽，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；以及
(4)第一多肽，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
可以使用本领域已知的方法制备和生产抗体或其抗原结合片段。这类方法可以包括例如，从噬菌体展示文库、酵母展示文库、永生化的B细胞(例如，小鼠B细胞杂交瘤细胞或EBV永生化的B细胞)制备和分离抗体或抗原结合片段的编码核酸。还可以用免疫动物的方法，例如用抗原或编码抗原的DNA免疫动物(例如人源化小鼠)，然后从免疫后的动物分离表达抗体的B细胞。还可以从免疫动物或人体中分离或者采用化学合成的方法制备编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，然后利用多核苷酸构建表达抗体或抗原结合片段的表达载体。
本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体可以与一个或多个化学部分缀合，用于提供一个或多个益处，例如延长在受试者体内的半衰期、减少副作用、提高稳定性和便于检测。例如，如上所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体可以直接或间接(例如通过接头，例如本文所描述的)与选自以下的一个或多个化学部分缀合：放射性同位素、聚合物(例如聚乙二醇)、血清白蛋白、生物素、链霉亲和素、胶体金、化学发光标记、生物发光标记和荧光基团。用于将化学部分缀合至抗体和抗原结合片段的方法是本领域众所周知的。
多核苷酸、载体和宿主细胞
在另一方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体。
本发明的多核苷酸可以利用本领域已知的方法获得。例如，本发明的多核苷酸可以分离自人体、噬菌体展示文库、酵母展示文库、免疫动物、永生化的细胞(例如，小鼠B细胞杂交瘤细胞、EBV介导的永生化B细胞)或者化学合成。多核苷酸可以针对用于表达的宿主细胞进行密码子优化。
在又一方面，本发明还提供包含本发明的多核苷酸的表达载体。表达载体可以进一步包含额外的多核苷酸序列，例如转录调控序列和抗生素抗性基因。
本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或表达载体。可以采用本领域已知的各种方法将本发明的多核苷酸或表达载体导入合适的宿主细胞中。这类方法包括但不限于病毒转导、脂质体转染、电穿孔和磷酸钙转染等。在优选的实施方案中，宿主细胞用于表达本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体。宿主细胞的实例包括但不限于原核细胞(例如细菌，例如大肠杆菌)和真核细胞(例如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞)。适合于抗体表达的哺乳动物宿主细胞包括但不限于骨髓瘤细胞、HeLa细胞、HEK细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和其他适于表达抗体的哺乳动物细胞。
本发明还提供一种产生本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：
(I)在合适条件下培养本发明宿主细胞以表达本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，以及
(II)从宿主细胞或其培养物分离所述抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供一种产生本发明的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体的方法，其包括：
(I)在合适条件下培养本发明宿主细胞以表达本发明的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，以及
(II)从宿主细胞或其培养物分离所述抗体或其抗原结合片段。
药物组合物
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，以及药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物进一步包含选自以下的一个或多个治疗剂：抗GITR激动剂抗体、抗CD40激动剂抗体、抗OX40激动剂抗体、抗4-1BB激动剂抗体、STING激动剂、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗VISTA抗体、抗TIGIT抗体、抗TIM-3抗体、VEGFR抑制剂、EGFR抑制剂、FGFR抑制剂、抗VEGF抗体和抗VEGFR抗体。在一实施方案中，所述药物组合物包含本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和选自以下的一个或多个治疗剂：抗GITR激动剂抗体、抗CD40激动剂抗体、抗OX40激动剂抗体、抗4-1BB激动剂抗体、STING激动剂、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗VISTA抗体、抗TIGIT抗体、抗TIM-3抗体、VEGFR抑制剂、EGFR抑制剂、FGFR抑制剂、抗VEGF抗体和抗VEGFR抗体；以及药学上可接受的载剂。
药学上可接受的载剂可以包括但不限于：稀释剂、粘合剂和胶粘剂、润滑剂、崩解剂、防腐剂、媒介物、分散剂、助流剂、甜味剂、包衣、赋形剂、防腐剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚、柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等)、增溶剂、胶凝剂、软化剂、溶剂(例如，水、酒精、乙酸和糖浆)、缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、组氨酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如非离子表面活性剂，例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆或聚乙二醇)、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂(例如海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖)、吸收延迟剂、螯合剂和乳化剂。
本文提供的药物组合物可以为多种剂型，包括但不限于固体、半固体、液体、粉末或冻干形式。优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。
本文提供的药物组合物可以通过多种途径给药。给药途径包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌肉内或腔内)、局部(例如瘤内)、硬膜外或粘膜(例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部)。给药方法可以为例如注射或输注。
作为一般性指导，本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体的给药剂量范围可以为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受试者体重。例如，给药剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重，10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短后期给药间隔加长。选择的剂量水平取决于多种因素，包括但不限于：药物代谢动力学因素、给药途径、给药时间、治疗程序、治疗的持续时间、与其他治疗剂的联用情况和受试者状况(例如年龄、性别、体重、健康状况和病史)。
治疗
不希望受任何理论束缚，本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段可以特异性结合PD-1并阻断PD-1/PD-L1介导的免疫抑制信号，从而增强免疫激活，为有此需要的受试者(例如癌症患者或感染性疾病患者)提供益处，例如增强受试者中的抗肿瘤免疫应答或抗病毒免疫应答。
本发明的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体通过特异性结合PD-1和CTLA-4阻断PD-1/PD-L1和CTLA-4/CD80或CTLA-4/CD86介导的免疫抑制信号，从而增强有需要的受试者(例如癌症患者或感染性疾病患者)中的免疫激活，例如增强受试者中的抗肿瘤免疫应答或抗病毒免疫应答。
如本文所用，“免疫激活”是指经刺激或诱导的免疫效应细胞(例如T细胞)的活性状态，包括但不限于细胞增殖、细胞因子(例如干扰素-α、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)和白介素-12(IL-12))的分泌或信号传导途径的启动等。
在一总的方面，本发明提供本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体或者药物组合在制备用于增强免疫激活或者治疗癌症或感染性疾病的药物中的用途。
本发明提供本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体或者药物组合，用于增强免疫激活或者治疗癌症或感染性疾病。
本发明还提供一种在有需要的受试者中增强免疫激活或者治疗癌症或感染性疾病的方法，包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体或者药物组合物，任选地与其他治疗剂或治疗手段结合。
如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症可以为实体瘤或血液癌。癌症可以包括原发癌和转移癌。癌症的非限制性实例包括肺癌(例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、肝癌(例如肝细胞癌)、胰腺癌、唾液腺癌、头颈癌(例如头颈部鳞状细胞癌)、皮肤癌、上皮细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤、默克尔细胞癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、胆管癌、肛门癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌(例如肾细胞癌、肾盂癌和肾上腺癌)、血管瘤、软组织肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、畸胎瘤、精原细胞瘤、胚胎性癌、绒毛膜癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、巨细胞瘤、膀胱癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、室管膜瘤、视网膜母细胞瘤、间皮瘤、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。在一优选实施方案中，所述癌症为上皮细胞癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、尿路上皮癌、结直肠癌(特别是微卫星不稳定或错配修复缺陷的结直肠癌)、胃癌、鼻咽癌、甲状腺癌、食管癌、子宫内膜癌、乳腺癌、宫颈癌、肝细胞癌、默克尔细胞癌、肾细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌或胃癌。
如本文所用，术语“感染性疾病”包括但不限于病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染相关的疾病。在一实施方案中，所述感染性疾病选自与病毒、细菌、真菌和寄生虫感染相关的疾病。在一实施方案中，所述感染性疾病选自与以下病毒的感染相关的疾病：人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒、疱疹病毒(例如水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒3型、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒7型、人疱疹病毒8型、单纯疱疹病毒(包括HSV-1和HSV-2)和巨细胞病毒(CMV)和Epstein–Barr(EB)病毒)、腺病毒、流感病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、人类嗜T细胞(HTLV)病毒、虫媒病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒和John Cunningham(JC)病毒。
本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体或者药物组合物可以在联合治疗中施用，例如与放疗、化疗、手术和其他治疗剂联合施用。对于癌症的治疗，本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体或者药物组合物可以与选自以下的一种或多种治疗剂联合施用：化疗剂、免疫激活剂和血管生成抑制剂。在一实施方案中，化疗剂选自环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、白消安、氮芥、苯丁酸氮芥、环己硝脲、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、顺铂(DDP)、卡铂(CBP)、奥沙利铂(OXA)、甲氨蝶呤(MTX)、6-巯基嘌呤(6-MP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷、吉西他滨、长春新碱、长春地辛、喜树碱、伊立替康、拓扑替康、卢比替康、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、紫杉烷、多西他赛、紫杉醇脂质体、放线菌素D、伊达比星、多柔比星、表柔比星、丝裂霉素、博来霉素和阿霉素。在一实施方案中，免疫激活剂选自抗GITR激动剂抗体、抗CD40激动剂抗体、抗OX40激动剂抗体、抗4-1BB激动剂抗体、STING激动剂和免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG-3抗体、抗VISTA抗体、抗TIGIT抗体和抗TIM-3抗体)。在一实施方案中，血管生成抑制剂选自受体酪氨酸激酶抑制剂(例如FGFR、EGFR和VEGFR的抑制剂)、抗VEGF抗体(例如Bevacizumab)、抗VEGFR抗体(例如Ramucirumab)、VEGFR的小分子抑制剂和VEGF抑制性融合蛋白(例如aflibercept)。
试剂盒
本发明还提供试剂盒，其包含本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体或者药物组合物，以及使用说明。试剂盒还可以包含合适的容器，例如安瓿瓶。在一些实施方案中，试剂盒还包括给药的装置。试剂盒还可以包含标签，其用于表明试剂盒内容物的预期用途和/或使用方法。术语“标签”包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。
有益效果
本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段实现以下有益效果中的至少一个：
(1)特异性结合PD-1；
(2)阻断PD-1与PD-L1的结合；和
(3)增加免疫细胞激活。
本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段可以是人源化抗体，因此具有低的免疫原性。
本发明的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体实现以下有益效果中的至少一个：
(1)特异性结合PD-1和CTLA-4；
(2)阻断PD-1与PD-L1的结合；
(3)阻断CTLA-4与CD80或CD86结合；和
(4)增加免疫细胞激活。
实施例
通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书进行。
实施例1抗PD-1单克隆抗体的制备
1.1鼠源抗PD-1抗体的生成
用人PD-1-Fc蛋白(UNIPROT:Q15116，人PD-1表达胞外区域(ECD)的氨基酸的羧基端融合人IgG1 Fc)，免疫5只Balb/C小鼠(购自维通利华)，测量免疫后小鼠血清均与PD-1结合阳性。分离所述经免疫的小鼠脾脏中的B淋巴细胞，提取RNA反转录得cDNA、扩增抗体可变区序列，经克隆和电转的方法构建小鼠免疫的噬菌体展示文库。采用PD-1-Fc对上述噬菌体展示文库进行淘洗富集，经ELISA结合试验、huPD-1-Jurkat细胞(表达人PD-1的重组载体质粒通过电转倒入Jurkat细胞制得)结合实验和PD-1/PD-L1阻断实验，测序分析，筛选得到两株既可以结合huPD-1-Jurkat细胞又可以阻断PD-1/PD-L1结合的克隆。命名为克隆huD1(重链可变区和轻链可变区序列分别示于SEQ ID NO:17和18)和huD2(重链可变区和轻链可变区序列分别示于SEQ IDNO:19和20)。
1.2鼠源抗体的人源化
根据PD-1蛋白的三维晶体结构以及实施例1.1获得的鼠源抗体huD1和huD2的序列，通过计算机结构模拟及数据库序列分析，对抗体可变区的框架区表面进行修饰，使其人源化，人源性达到90％以上，同时保留原始亲和力的功能。
鼠源抗体huD1经人源化后得到人源化抗体D1-huVH1-huVL1、D1-huVH1-huVL2、D1-huVH2-huVL1、D1-huVH2-huVL2、D1-huVH2-huVL3、D1-huVH3-huVL2和D1-huVH3-huVL3。鼠源抗体huD2经人源化后得到人源化抗体D2-huVH1-huVL1、D2-huVH1-huVL2、D2-huVH2-huVL1、D2-huVH2-huVL2、D2-huVH2-huVL3、D2-huVH3-huVL2和D2-huVH3-huVL3。本发明的示例性抗体的重链互补决定区(HCDR1-3)和轻链互补决定区(LCDR1-3)以及重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列(SEQ ID NO)示于表1。
表1
| 抗体名称 | HCDR1 | HCDR2 | HCDR3 | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 | VH | VL |
| huD1/D1 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 17 | 18 |
| huD2/D2 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 13 | 19 | 20 |
| D1-huVH1-huVL1/D1-VH1VL1 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 21 | 22 |
| D1-huVH1-huVL2/D1-VH1VL2 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 21 | 23 |
| D1-huVH2-huVL1/D1-VH2VL1 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 24 | 22 |
| D1-huVH2-huVL2/D1-VH2VL2 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 24 | 23 |
| D1-huVH2-huVL3/D1-VH2VL3 | 7 | 8 | 9 | 15 | 11 | 12 | 24 | 25 |
| D1-huVH3-huVL2/D1-VH3VL2 | 14 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 26 | 23 |
| D1-huVH3-huVL3/D1-VH3VL3 | 14 | 8 | 9 | 15 | 11 | 12 | 26 | 25 |
| D2-huVH1-huVL1/D2-VH1VL1 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 16 | 21 | 27 |
| D2-huVH1-huVL2/D2-VH1VL2 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 16 | 21 | 28 |
| D2-huVH2-huVL1/D2-VH2VL1 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 16 | 24 | 27 |
| D2-huVH2-huVL2/D2-VH2VL2 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 16 | 24 | 28 |
| D2-huVH2-huVL3/D2-VH2VL3 | 7 | 8 | 9 | 15 | 11 | 16 | 24 | 29 |
| D2-huVH3-huVL2/D2-VH3VL2 | 14 | 8 | 9 | 10 | 11 | 16 | 26 | 28 |
| D2-huVH3-huVL3/D2-VH3VL3 | 14 | 8 | 9 | 15 | 11 | 16 | 26 | 29 |
实施例2抗PD-1单克隆抗体的构建、表达和纯化以及理化性质检测
使用包含S228P(EU编号)突变的IgG4重链恒定区(SEQ ID NO:30)和人κ轻链恒定区(序列示于SEQ ID NO:31)构建嵌合抗体D1、D2，以及嵌合人源化抗体D1-VH1VL1、D1-VH1VL2、D1-VH2VL1、D1-VH2VL2、D1-VH2VL3、D1-VH3VL2、D1-VH3VL3、D2-VH1VL1、D2-VH1VL2、D2-VH2VL1、D2-VH2VL2、D2-VH2VL3、D2-VH3VL2和D2-VH3VL3(其分别为对应的huD1、huD2、D1-huVH1-huVL1、D1-huVH1-huVL2、D1-huVH2-huVL1、D1-huVH2-huVL2、D1-huVH2-huVL3、D1-huVH3-huVL2、D1-huVH3-huVL3、D2-huVH1-huVL1、D2-huVH1-huVL2、D2-huVH2-huVL1、D2-huVH2-huVL2、D2-huVH2-huVL3、D2-huVH3-huVL2和D2-huVH3-huVL3与所述IgG4重链恒定区(SEQ ID NO:30)和人κ轻链恒定区(序列示于SEQ ID NO:31)嵌合的抗体，可变区序列如表1所示)。
抗体经过CHO细胞(购自Gibco A29127)瞬时转染表达。将抗体序列克隆到真核表达载体pcDNA3.4中，制备质粒，转染CHO细胞，细胞培养6-7天后，将培养液通过高速离心后，通过Protein A/G亲和层析柱进行亲和纯化。通过超微量分光光度计测定抗体浓度，然后用SDS-PAGE和SEC-HPLC对其进行质量鉴定后用于后续的药效学研究。
SDS-PAGE和SEC-HPLC测试结果如表2所示：SDS-PAGE结果显示候选抗体的纯度均大于95％；SEC-HPLC按照面积归一法计算样品中高分子量聚集体、抗体单体和低分子量片段的百分比,结果表明所有候选抗体的单体纯度均大于99％。
本发明中采用的阳性对照抗体Pembrolizumab单抗(SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4)，阳性对照抗体Ipilimumab单抗及抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体BiAb004(WO2021023117A1)采用上述同样方法表达纯化。
表2
| 抗体名称 | 蛋白分子量 | 等电点 | 消光系数 | SDS-PAGE(％) | SEC-HPLC(％) |
| D1 | 144.48 | 7.52 | 1.51 | >95.0 | 100.00 |
| D1-VH1VL1 | 144.04 | 8.17 | 1.51 | >95.0 | 99.49 |
| D1-VH1VL2 | 144.06 | 8.3 | 1.53 | >95.0 | 99.24 |
| D1-VH2VL1 | 143.74 | 7.99 | 1.51 | >95.0 | 100.00 |
| D1-VH2VL2 | 143.74 | 8.17 | 1.53 | >95.0 | 99.26 |
| D1-VH2VL3 | 143.74 | 8.17 | 1.53 | >95.0 | 99.45 |
| D1-VH3VL2 | 143.78 | 8.17 | 1.53 | >95.0 | 100.00 |
| D1-VH3VL3 | 143.76 | 8.17 | 1.53 | >95.0 | 100.00 |
| D2 | 144.28 | 7.79 | 1.43 | >95.0 | 100.00 |
| D2-VH1VL1 | 144.1 | 8.17 | 1.51 | >95.0 | 99.49 |
| D2-VH1VL2 | 144.1 | 8.3 | 1.53 | >95.0 | 100.00 |
| D2-VH2VL1 | 143.8 | 7.99 | 1.51 | >95.0 | 100.00 |
| D2-VH2VL2 | 143.8 | 8.17 | 1.53 | >95.0 | 99.21 |
| D2-VH2VL3 | 143.78 | 8.17 | 1.53 | >95.0 | 100.00 |
| D2-VH3VL2 | 143.82 | 8.17 | 1.53 | >95.0 | 99.27 |
| D2-VH3VL3 | 143.82 | 8.17 | 1.53 | >95.0 | 99.27 |
实施例3基于ELISA方法测定候选抗PD-1抗体在蛋白水平的抗原结合活性
在96孔ELISA板上包被PD-1-His(UNIPROT:Q15116，人PD-1表达胞外区域(ECD)的氨基酸的羧基端融合His标签)，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h；用PBST洗板3次后，加入不同浓度的待测抗体孵育1h。之后，用PBST清洗3次后加入二抗抗人Fc-HRP(abcam，ab79225)并孵育1h。孵育完成后，用PBST洗板六次，加入TMB显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)读取OD450值。
测定结果如图1A-1D所示，候选抗体均以高亲和力结合PD-1，并且结合活性与Pembrolizumab相当。
实施例4基于FACS方法测定候选抗PD-1抗体在细胞水平的抗原结合活性和PD-1/PD-L1阻断活性
4.1抗原结合活性
为测定候选PD-1抗体的细胞结合特异性，采用流式细胞术法测定抗PD-1抗体与huPD-1-Jurkat的结合活性，采用阳性抗体Pembrolizumab作为对照。具体方法如下：
将指数生长期的huPD-1-Jurkat细胞加入96孔圆底板中，离心去上清。向对应孔中加入梯度稀释的候选抗体稀释液，将细胞混匀并孵育1h。将孵育后的细胞混合液离心去上清，向对应孔中加入FACS缓冲液并重悬细胞；加入PE标记的anti-human-IgG-Fc流式抗体，将细胞混匀并孵育30min。随后，通过FACS缓冲液洗涤。最后，通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)上机检测。
结果如图2A-2B和表3所示，候选抗体均以高亲和力结合表达在细胞表面的PD-1，并且结合活性与Pembrolizumab相当。
4.2 PD-1/PD-L1阻断活性
为测定候选PD-1抗体的PD-1/PD-L1阻断活性，采用流式细胞术测量候选抗体在细胞水平上阻断人PD-1与PD-L1结合的能力。
将指数生长期的huPD-1-Jurkat细胞加入96孔圆底板中，离心去上清。向对应孔中加入梯度稀释的候选抗体稀释液，孵育1h，洗涤后加入100μL huPD-L1-mFc(UNIPROT:Q9NZQ7，表达胞外区域(ECD)的氨基酸的羧基端融合鼠Fc片段)，孵育1h后，加入PE标记的羊抗鼠Fc二抗；将细胞混匀并孵育1h。随后，通过FACS缓冲液洗涤。最后，通过流式细胞仪上机检测。
结果如图3A-3B和表3显示，候选抗体均显著阻断huPD-L1-mFc在huPD-1-Jurkat细胞上的结合，并且阻断活性与Pembrolizumab相当。
表3
| 抗体名称 | 抗原结合活性(EC50μg/mL) | 阻断活性(IC50μg/mL) |
| D1 | 0.05982 | 0.0405 |
| D1-VH1VL1 | 0.0652 | 0.05406 |
| D1-VH1VL2 | 0.05054 | 0.03497 |
| D1-VH2VL1 | 0.0626 | 0.05081 |
| D1-VH2VL2 | 0.05457 | 0.04033 |
| D1-VH2VL3 | 0.05883 | 0.04242 |
| D1-VH3VL2 | 0.05456 | 0.04813 |
| D1-VH3VL3 | 0.05708 | 0.04883 |
| Pembrolizumab | 0.04776 | 0.03546 |
| D2 | 0.06294 | 0.05156 |
| D2-VH1VL1 | 0.06928 | 0.05157 |
| D2-VH1VL2 | 0.05928 | 0.04449 |
| D2-VH2VL1 | 0.07179 | 0.05235 |
| D2-VH2VL2 | 0.06339 | 0.04593 |
| D2-VH2VL3 | 0.0656 | 0.04933 |
| D2-VH3VL2 | 0.06575 | 0.04527 |
| D2-VH3VL3 | 0.06156 | 0.03909 |
| Pembrolizumab | 0.04241 | 0.03546 |
实施例5候选抗PD-1抗体的体外生物学活性验证
5.1混合淋巴细胞反应(MLR)试验
PD-1/PD-L1信号通路在免疫调节、肿瘤细胞免疫逃逸过程中发挥重要作用，阻断PD-1/PD-L1的免疫抑制信号从而使被抑制的T细胞激活，促进细胞因子分泌是抗PD-1抗体发挥其免疫激活作用的关键。本实验测试了候选抗体D1和D2在体外混合淋巴细胞反应体系中刺激细胞因子分泌的能力。
具体方法如下：MLR实验采用同种异体来源的T细胞和树突状细胞(DC)进行混合，利用DC细胞抗原提呈能力刺激T细胞分泌IL-2和IFN-γ。将单核细胞在体外使用细胞因子GM-CSF和IL-4进行诱导分化成树突状细胞，随后加入同种异体的T细胞进行混合培养5天后，检测细胞上清中的IL-2和IFN-γ的分泌水平。在96孔板中按10:1和100:1的比例混合T细胞和DC，加入梯度稀释的待测抗体，混合反应5天后，用IL-2检测试剂盒定量检测上清IL-2含量，用IFN-γ检测试剂盒定量检测上清IFN-γ的含量。
IL-2和IFN-γ的分泌量分别示于图4A和4B。从图4A-4B可以看出，与Pembrolizumab相比，候选抗体D1和D2在混合淋巴细胞反应中增加活化T细胞的IL-2和IFNg分泌，具有相等的效力。
5.2荧光素酶报告基因试验
本实施例采用由表达PD-1和NFAT荧光素酶的Jurkat效应细胞(Jurkat-PD-1-NFAT)，表达CD3L(anti-CD3-scFv)和PD-L1的CHO细胞(CD3L-PD-L1-CHO)组成的荧光素酶报告基因系统，测定候选抗体的体外生物学活性。当共培养这两种细胞株时，Jurkat-PD-1-NFAT细胞上的PD-1与其CD3L-PD-L1-CHO细胞上的配体PD-L1结合后可抑制NFAT控制的报告基因表达；而抗PD-1抗体可阻断PD-1/PD-L1信号通路，激活TCR并介导NFAT控制报告基因表达。(参见例如Wang Let al.,J Pharm Biomed Anal.2017Oct 25；145:447-453)。
在96孔细胞培养板中依次加入Jurkat-PD-1-NFAT细胞(1×105/孔)和CD3L-PD-L1-CHO细胞(2×104/孔)。在上述细胞培养板中加入稀释后的PD-1抗体，37℃静置培养5-6h后，加入荧光素酶检测试剂，使用多功能酶标仪测定化学发光值。
结果如图5A-5D和表4显示，候选抗体均均能有效阻断PD-1/PD-L1间的作用，刺激T细胞活化，激活荧光素酶报告基因的表达，表明本发明的抗PD-1抗体表现出优异的免疫激活活性。
表4
实施例6抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体的构建
本实施例描述了基于本发明的抗PD-1抗体制备的示例性抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体。设计并构建了4种构建体BsAb1、BsAb2、BsAb3和BsAb4，对应的氨基酸序列见表5。
示例性抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体包含特异性结合PD-1和CTLA-4的抗原结合部分，其中结合PD-1的抗原结合部分来自D1-VH2VL3(重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示)和D2-VH3VL3(重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29所示)；结合CTLA-4的抗原结合部分包含免疫球蛋白单可变结构域VHHCTLA-4，氨基酸序列来自纳米抗体SY23-7(VHH氨基酸序列如SEQ IDNO:34所示)和SY23-12(VHH氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示)。SY23-7和SY23-12的VHH是通过在亲本VHH(氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；参见CN113121689A中人源化抗CTLA-4纳米抗体NB25B-17-H1)的FR3中引入点突变获得，具有改进的抗原结合特异性。
示例性双特异性抗体的构型如图6所示：其含有两条相同的第一多肽链以及两条相同的第二多肽链，所述第一多肽链从N末端到C末端包含本发明的抗PD-1抗体的VH结构域、IgG1重链恒定区(L234A/L235A/G237A突变)(示例性氨基酸序列示于SEQ ID NO:47)、接头(示例性氨基酸序列示于SEQ ID NO:37)和VHHCTLA-4；所述第二多肽链从N末端到C末端包含本发明的抗PD-1抗体的VL结构域和抗体κ轻链CL结构域(示例性氨基酸序列示于SEQ IDNO:31)。
表5
| 抗体名称 | 第一多肽链氨基酸序列 | 第二多肽链氨基酸序列 |
| BsAb1 | SEQ ID NO:38 | SEQ ID NO:39 |
| BsAb2 | SEQ ID NO:40 | SEQ ID NO:39 |
| BsAb3 | SEQ ID NO:41 | SEQ ID NO:42 |
| BsAb4 | SEQ ID NO:43 | SEQ ID NO:42 |
实施例7抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体的表达、纯化和理化性质分析
将抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体的第一多肽链和第二多肽链的核苷酸序列分别克隆到pcDNA3.4上，构建了真核表达载体。提取重组质粒，共转染CHO真核细胞进行蛋白表达并通过proteinA结合纯化。抗体表达和纯化、浓度测定、SDS-PAGE鉴定和SEC-HPLC单体纯度鉴定分析的具体方法参见实施例2。检测结果如表6所示。
SDS-PAGE结果显示，候选双特异性抗体和参考品IPI非还原胶的条带均符合预期大小且纯度都在95％左右；SEC-HPLC结果显示，所有双特异性抗体的纯度均大于98％。
表6
实施例8抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体在蛋白水平的抗原结合活性
本实施例采用ELISA方法检测了候选双特异性抗体对人PD-1ECD重组蛋白PD-1-His和人CTLA-4重组蛋白CTLA-4-his(恺佧生物，CTL-HM141)的结合活性，实验方法参见实施例3。试验结果如图7A-7B所示。
图7A显示候选双特异性抗体均以高亲和力结合PD-1，并且结合活性略强于阳性对照Pembrolizumab；图7B显示候选双特异性抗体均可以结合CTLA-4，结合活性弱于阳性对照抗体Ipilimumab。
实施例9抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体在细胞水平的抗原结合活性
本实施例采用FACS方法检测了候选双特异性抗体对过表达人PD-1抗原的Jurkat细胞(huPD-1-Jurkat)和过表达人CTLA-4(GenBank：NP_005205.2)的CHO-S细胞(huCTLA4-CHO-S)的结合活性，实验方法参见实施例4.1。试验结果如图8A-8B和表7所示。
图8A显示各候选双特异性抗体在huPD-1-Jurkat细胞上均有较强结合，结合活性与Pembrolizumab相当，并且强于双特异性对照抗体BiAb004；图8B显示各候选双特异性抗体在huCTLA4-CHO-S细胞上均正常结合，结合活性弱于抗CTLA-4单抗(SY23-7和SY23-12)和对照抗体Ipilimumab，但是强于双特异性对照抗体BiAb004。
表7
| 抗体名称 | huPD-1-Jurkat EC50(nM) | huCTLA4-CHO-S EC50(nM) |
| BsAb1 | 0.162 | 1.095 |
| BsAb2 | 0.158 | 1.36 |
| BsAb3 | 0.165 | 1.728 |
| BsAb4 | 0.188 | 1.291 |
| BiAb004 | 0.236 | 3.461 |
| D2-VH3VL3 | 0.133 | NA |
| D1-VH2VL3 | 0.125 | NA |
| Pembrolizumab | 0.100 | NA |
| SY23-7 | NA | 1.758 |
| SY23-12 | NA | 1.889 |
| Ipilimumab | NA | 1.332 |
NA：表示未检出。
实施例10候选双特异性抗体的阻断活性
为测定候选双特异抗体对CTLA-4/CD80及CTLA-4/CD86的阻断活性，采用流式细胞术测量候选抗体在过人CTLA-4抗原的CHO-S细胞(huCTLA4-CHO-S)上的阻断能力。
将指数生长期的huCTLA4-CHO-S细胞低速离心去上清。加入梯度稀释的候选抗体稀释液，孵育1h，洗涤后加入100μL huCD80-mFc(三优自制，人CD80(UNIPROT:P33681)的胞外区域的羧基端融合有鼠Fc片段)或huCD86-mFc(三优自制，人CD86(UNIPROT：P42081)的胞外区域的羧基端融合有鼠Fc片段)，孵育1h后，加入PE标记的羊抗鼠Fc二抗；将细胞混匀并孵育1h。随后，通过FACS缓冲液洗涤。最后，通过流式细胞仪上机检测。
结果如图9A-9B和表8所示，各候选双特异性抗体在huCTLA4-CHO-S细胞上均有阻断作用，阻断活性与对照抗体Ipilimumab相当，且显著强于双特异性对照抗体BiAb004。
表8
| 抗体名称 | huCD80-mFc IC50(nM) | huCD86-mFc IC50(nM) |
| BsAb1 | 2.144 | 7.925 |
| BsAb2 | 2.02 | 8.011 |
| BsAb3 | 2.422 | 9.399 |
| BsAb4 | 2.266 | 9.227 |
| BiAb004 | N/A | 2.787 |
| SY23-7 | 1.683 | 6.764 |
| SY23-12 | 1.646 | 7.215 |
| Ipilimumab | 2.993 | 9.398 |
实施例11抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体的荧光素酶报告基因试验
本实施例通过荧光素酶报告基因试验检测了候选双特异性抗体通过阻断PD-1/PD-L1信号通路激活免疫的能力，实验方法参见实施例5.2。
结果如图10A-10B所示，各候选双特异性抗体均表现出较强的激活荧光素酶报告基因信号的作用，激活活性与抗PD-1单抗Pembrolizumab相当，并且稍强于双特异性对照抗体BiAb004。
实施例12抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体的混合淋巴细胞反应(MLR)试验
本实施例检测了候选双特异性抗体(BsAb2和BsAb4)在体外混合淋巴细胞反应体系中刺激细胞因子分泌的能力，实验方法参见实施例5.1。
试验结果如图11A-11B所示，双特异性抗体BsAb2和BsAb4均可有效激活T细胞免疫反应，激活效果与Pembrolizumab和BiAb004相当。
实施例13抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体在MC38小鼠肿瘤模型中的药效验证
为了确认候选抗体分子在体内抑制肿瘤生长的活性，本实施例所使用的肿瘤细胞为小鼠结肠癌细胞MC38细胞系，实验动物为6-8周龄雌性的基于C57BL/6背景的hPD-1/hCTLA-4双人源化小鼠(南模生物)，具体方法如下：
以3×106个MC38细胞/每只小鼠进行右侧背部皮下注射(第0天)，然后进行随机分组(每组5只小鼠)：分别是PBS处理组、Ipilimumab(IPI)和Pembrolizumab(图12A和图12B以及以下内容中也将其简称为K)联合给药组、阳性双特异性抗体AK104(也称BiAb004)给药组、以及双特异性抗体BsAb2给药组。每个给药组分别设置中、低剂量，其中双特异性抗体BsAb2给药组还设置了高剂量组(3mpk)。待肿瘤长至100mm3，即按预定方案开始给药，每周给药两次，腹腔注射(i.p.)，共给药3周。随时观察和记录肿瘤长(mm)和宽(mm)，计算其肿瘤体积(V)，计算方式为：V＝(长×宽2)/2。
结果如图12A和图12B以及表9所示，所有给药组相对于PBS处理组均呈现出肿瘤生长抑制作用。其中双特异性抗体BsAb2在中(1mpk)、低(0.2mpk)剂量给药组均表现出显著优于对照阳性双抗AK104(也称BiAb004)的抑瘤效果，并且该候选分子在高剂量组(3mpk)的小鼠中也展现出肿瘤完全缓解的趋势；此外，在该模型中，低剂量双特异性抗体BsAb2也表现出略优于Ipilimumab和Pembrolizumab联用组的抑瘤效果。
表9
本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本公开的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。
序列表
Claims (19)
1.一种抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中
所述重链可变区包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:14所示HCDR1序列、SEQ ID NO:8所示HCDR2序列和SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；
所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15所示LCDR1序列、SEQ ID NO:11所示LCDR2序列和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16所示LCDR3序列。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区包含选自(1)-(9)中任一项的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列：
(1)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；
(2)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:13所示LCDR3序列；
(3)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；
(4)SEQ ID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；
(5)SEQ ID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:12所示LCDR3序列；
(6)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:16所示LCDR3序列；
(7)SEQ ID NO:7所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:16所示LCDR3序列；
(8)SEQ ID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:10所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:16所示LCDR3序列；
(9)SEQ ID NO:14所示HCDR1序列；SEQ ID NO:8所示HCDR2序列；SEQ ID NO:9所示HCDR3序列；SEQ ID NO:15所示LCDR1序列；SEQ ID NO:11所示LCDR2序列；和
SEQ ID NO:16所示LCDR3序列。
3.权利要求1或2的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含：
(1)SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26的氨基酸序列；或者
(2)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含：
(1)SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列；或者
(2)与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列。
5.权利要求2的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区和轻链可变区选自(1)-(16)中任一项：
(1)重链可变区，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(2)重链可变区，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(3)重链可变区，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(4)重链可变区，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(5)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(6)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(7)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
(8)重链可变区，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(9)重链可变区，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
(10)重链可变区，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID
NO:27的氨基酸序列；
(11)重链可变区，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID
NO:28的氨基酸序列；
(12)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ ID
NO:27的氨基酸序列；
(13)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列；
(14)重链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列；
(15)重链可变区，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列；
(16)重链可变区，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；轻链可变区，其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列。
6.权利要求1-5中任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其为嵌合抗体、人源化抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv(dsFv)、双抗体或双特异性抗体。
7.权利要求1-6中任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区；
优选地，所述重链恒定区为人IgG4重链恒定区和/或所述轻链恒定区为人κ或者λ轻链恒定区；
更优选地，所述人IgG4重链恒定区包含S228P突变；
最优选地，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和/或所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
8.一种抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，其包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分包含权利要求1-5中任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述第二抗原结合部分包含特异性结合CTLA-4的免疫球蛋白单可变结构域。
9.权利要求8的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含SEQ ID NO:44所示CDR1序列、SEQ ID NO:45所示CDR2序列和SEQ ID NO:46所示CDR3序列；
优选地，所述免疫球蛋白单可变结构域包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
10.权利要求8或9的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，其进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区；
优选地，所述重链恒定区为人IgG1重链恒定区和/或所述轻链恒定区为人κ或者λ轻链恒定区；
更优选地，所述人IgG1重链恒定区包含以下一个或多个突变：L234A、L235A和G237A(EU编号)；
最优选地，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和/或所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
11.权利要求8的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，其包含第一多肽和第二多肽，其中
所述第一多肽从N端至C端具有如下结构：
VH-CH-Linker-VHH，
所述第二多肽从N端至C端具有如下结构：
VL-CL，
其中
VH和VL分别为如权利要求1-5中任一项所定义的重链可变区和轻链可变区；
VHH为如权利要求9中所定义的免疫球蛋白单可变结构域；
CH和CL分别为如权利要求10中所定义的重链恒定区和轻链恒定区；
Linker为接头。
12.权利要求11的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，其中所述第一多肽和所述第二多肽选自(1)-(4)中任一项：
(1)第一多肽，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
(2)第一多肽，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
(3)第一多肽，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；以及
(4)第一多肽，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
13.一种多核苷酸，其编码权利要求1-7中任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者权利要求8-12中任一项的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体。
14.一种表达载体，其包含权利要求13的多核苷酸。
15.一种宿主细胞，其包含权利要求13的多核苷酸或权利要求14的表达载体。
16.一种产生权利要求1-7中任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者权利要求8-12中任一项的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体的方法，其包括：
(Ⅰ)在合适条件下培养权利要求10的宿主细胞以表达所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，以及
(Ⅱ)从宿主细胞或其培养物分离所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或者权利要求8-12中任一项的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体，以及药学上可接受的载剂；并且任选地包含选自以下的一个或多个治疗剂：抗GITR激动剂抗体、抗CD40激动剂抗体、抗OX40激动剂抗体、抗4-1BB激动剂抗体、STING激动剂、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG-3抗体、抗VISTA抗体、抗TIGIT抗体、抗TIM-3抗体、VEGFR抑制剂、EGFR抑制剂、FGFR抑制剂、抗VEGF抗体和抗VEGFR抗体。
18.权利要求1-7中任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段、权利要求8-12中任一项的抗PD-1-CTLA-4双特异性抗体或者权利要求17的药物组合物在制备用于增强免疫激活或者治疗癌症或感染性疾病的药物中的用途。
19.权利要求18的用途，其中
所述癌症选自肺癌、肝癌、胰腺癌、唾液腺癌、头颈癌、皮肤癌、上皮细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤、默克尔细胞癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、胆管癌、肛门癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、血管瘤、软组织肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、畸胎瘤、精原细胞瘤、胚胎性癌、绒毛膜癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、巨细胞瘤、膀胱癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、室管膜瘤、视网膜母细胞瘤、间皮瘤、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤；或者所述感染性疾病选自与病毒、细菌、真菌和寄生虫感染相关的疾病。
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