TW202146446A - 一種抗pd-l1和egfr的四價雙特異性抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了一種抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體。本發明的四價雙特異性抗體不需要進行Fc修飾，不會產生錯配問題，製備方法簡便，具有與單抗相似甚至更優的生物學活性和理化性質。

Description

一種抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體
本發明涉及抗體領域，更具體地，本發明揭示了一種抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體。
人程式性細胞死亡受體-1 (PD-1)是一種有288個胺基酸的I型膜蛋白，是已知的主要免疫檢查點(Immune Checkpoint)之一(Blanket al , 2005, Cancer Immunotherapy, 54:307-314)。PD-1表現在已經活化的T淋巴細胞，它與配體PD-L1 (程式性細胞死亡受體-配體1，programmed cell death-Ligand 1)和PD-L2 (程式性細胞死亡受體-配體2，programmed cell death-Ligand 2)結合可以抑制T淋巴細胞的活性及相關的體內細胞免疫反應。PD-L2主要表現在巨噬細胞和樹突狀細胞，而PD-L1則廣泛表現於B、T淋巴細胞及周邊細胞如微血管上皮細胞，肺、肝、心等組織細胞中。大量研究表明，PD-1和PD-L1的相互作用不但是維持體內免疫系統平衡所必須，也是導致PD-L1表現陽性腫瘤細胞規避免疫監視的主要機制和原因。透過阻斷癌細胞對PD-1/PD-L1訊息途徑的負調控，活化免疫系統，能夠促進T細胞相關的腫瘤特異性細胞免疫反應，從而打開了一扇新的腫瘤治療方法的大門--腫瘤免疫療法。
PD-1 (由基因Pdcd1編碼)爲與CD28和CTLA-4有關的免疫球蛋白超家族成員。研究成果顯示，當PD-1與其配體(PD-L1和/或PD-L2)結合時會負調節抗原受體訊息傳遞。目前已弄清鼠PD-1結構以及小鼠PD-1與人PD-L1的共結晶結構(Zhang，X.等，Immunity 20：337-347 (2004)；Lin等，Proc .Natl. Acad. Sci. USA 105：3011-6 (2008))。PD-1及類似的家族成員爲I型跨膜糖蛋白，其含有負責配體結合的Ig可變型(V-型)結構域和負責結合訊息傳遞分子的細胞質尾部。PD-1細胞質尾部含有兩個基於酪胺酸的訊息傳遞模體ITIM(免疫受體酪胺酸抑制作用模體)和ITSM(免疫受體酪胺酸轉換作用模體)。
PD-1在腫瘤的免疫逃脫機制中起到了重要的作用。腫瘤免疫療法，即利用人體自身的免疫系統抵禦癌症，是一種突破性的腫瘤治療方法，但是腫瘤微環境可保護腫瘤細胞免受有效的免疫破壞，因此如何打破腫瘤微環境成爲抗腫瘤研究的重點。現有研究成果已確定了PD-1在腫瘤微環境中的作用：PD-L1在許多小鼠和人腫瘤中表現(並在大多數PD-L1陰性腫瘤細胞株中可由IFN-γ誘導)，並被推定爲媒介腫瘤免疫逃脫的重要標的(Iwai Y.等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99：12293-12297 (2002)；Strome S.E.等，Cancer Res. ，63：6501-6505 (2003))。透過免疫組織化學評估活組織檢查，已經在人的很多原發性腫瘤中發現PD-1 (在腫瘤浸潤淋巴細胞上)和/或PD-L1在腫瘤細胞上的表現。這樣的組織包括肺癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、結腸癌、神經膠質瘤、膀胱癌、乳腺癌、腎癌、食道癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌、尿道上皮細胞癌和胰腺癌以及頭頸腫瘤等。由此可見，阻斷PD-1/PD-L1的相互作用可以提高腫瘤特異性T細胞的免疫活性，有助於免疫系統清除腫瘤細胞，因此PD-L1成爲開發腫瘤免疫治療藥物的熱門標的。
表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)廣泛分布於哺乳動物上皮細胞、纖維母細胞、膠質細胞、角質細胞等細胞表面，EGFR訊息途徑對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發揮重要的作用。EGFR的突變或異常表現在腫瘤的生長、發展中扮演著重要作用。抗EGFR單株抗體藥物具有阻滯腫瘤細胞周期進程、加速腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、抑制腫瘤浸潤和轉移、增強放化療效果等功能，作用機理清晰，因而在癌症治療方面備受關注。以EGFR爲標的的抗腫瘤治療已成爲癌症研究中十分活躍的領域之一，並且取得了巨大的進展。但是以EGFR爲標的的抗腫瘤治療依然還存在很多缺陷等著去完善。
雙特異性抗體正在逐步成爲一類新的治療性抗體，可以用於治療各種發炎性疾病、癌症和其它疾病。雖然最近報導了大量新的雙特異性抗體的構造形式，然而，生產雙特異性抗體的主要技術難點在於獲得正確配對的分子。目前現有的雙特異性抗體的形式均存在錯配的問題，因此會產生一種或多種錯配導致的副產物或者聚集體，從而影響目的雙特異性抗體的產率、純度和理化穩定性，進而影響雙特異性抗體在體內的安全性和有效性。
本領域迫切需要開發具有優良的用於治療癌症等疾病的雙特異性抗體。
爲了解决上述技術問題，本發明提供了一種抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體及其應用。
因此，本發明的第一個目的在於提供一種抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體。
本發明的第二個目的在於提供一種編碼所述的四價雙特異性抗體的分離的核苷酸。
本發明的第三個目的在於提供一種包含所述的核苷酸的表現載體。
本發明的第四個目的在於提供一種包含所述的表現載體的宿主細胞。
本發明的第五個目的在於提供所述的四價雙特異性抗體的製備方法。
本發明的第六個目的在於提供包含所述的四價雙特異性抗體的藥物組成物。
本發明的第七個目的在於提供所述的四價雙特異性抗體或所述的藥物組成物在製備治療癌症的藥物中的用途。
本發明的第八個目的在於提供所述的四價雙特異性抗體或所述的藥物組成物用於治療癌症的方法。爲了達到上述目的，本發明提供了以下技術方案：
本發明的第一個方面提供了一種抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體，包含： (a)  兩條多肽鏈，所述多肽鏈從N末端到C末端包含VH-PDL1-CH1-接頭-VH-EGFR-CH1-CH2-CH3或VH-EGFR-CH1-接頭-VH-PDL1-CH1-CH2-CH3，其中，所述VH-PDL1爲結合PD-L1的重鏈可變區，所述VH-EGFR爲結合EGFR的重鏈可變區，所述CH1爲重鏈恆定區的第一結構域，所述CH2爲重鏈恆定區的第二結構域，所述CH3爲重鏈恆定區的第三結構域；和 (b)  四條共同輕鏈，所述共同輕鏈從N末端到C末端包含VL-CL，其中，所述VL爲輕鏈可變區，所述CL爲輕鏈恆定區，所述多肽鏈的VH-PDL1-CH1和所述VH-EGFR-CH1分別與所述共同輕鏈的VL-CL配對，所述VH-PDL1和所述VL形成PD-L1抗原結合位址，所述VH-EGFR與所述VL形成EGFR結合位址；其中，所述的每個共同輕鏈具有如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述的重鏈的CH1區選自人IgG1的CH1結構域或人IgG4的CH1結構域。
在另一優選例中，所述的結合PD-L1的重鏈可變區VH-PDL1如SEQ ID No: 1所示； 所述的結合EGFR的重鏈可變區VH-EGFR如SEQ ID No: 9所示。
在另一優選例中，每個所述的多肽鏈的胺基酸序列相同。
本發明的第二個方面提供了一種抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體，包含兩條多肽鏈和四條共同輕鏈，其中，所述多肽鏈具有如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，所述共同輕鏈具有如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
本發明的第三個方面提供了一種分離的核苷酸，所述的核苷酸編碼所述的四價雙特異性抗體。
在另一優選例中，所述的核苷酸編碼所述多肽鏈和所述共同輕鏈，其中，編碼所述多肽鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示，編碼所述共同輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
本發明的第四個方面提供了一種表現載體，所述的表現載體含有如上所述的核苷酸。
本發明的第五個方面提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有如上所述的表現載體。
本發明的第六個方面提供了所述的四價雙特異性抗體的製備方法，所述方法包含以下步驟： (a)  在表現條件下，培養如上所述的宿主細胞，從而表現所述的四價雙特異性抗體； (b)  分離並純化(a)所述的四價雙特異性抗體。
本發明的第七個方面提供了一種藥物組成物，所述藥物組成物含有如上所述的四價雙特異性抗體和藥學上可接受的載劑。在另一優選例中，所述藥物組成物中還含有抗腫瘤劑。
在另一優選例中，所述藥物組成物中還含有抗腫瘤劑。
在另一優選例中，所述藥物組成物爲單位劑型。
在另一優選例中，所述的抗腫瘤劑可以與所述雙特異性抗體單獨存在於獨立的包裝內，或所述抗腫瘤劑可以與所述雙特異性抗體偶聯。
在另一優選例中，所述藥物組成物的劑型包括胃腸給藥劑型或胃腸外給藥劑型。
在另一優選例中，所述的胃腸外給藥劑型包括靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射、顱內注射、或腔內注射。
本發明的第八個方面提供了如上所述的四價雙特異性抗體、或其免疫偶聯物、或如上所述的藥物組成物在製備治療癌症的藥物中的用途。
在另一優選例中，所述癌症選自由以下組成的組：黑素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤及其它贅生性惡性疾病等。
本發明的第九個方面提供了一種治療癌症的方法，包括向有需要的受試者施用如上所述的四價雙特異性抗體、或其免疫偶聯物、或如上所述的藥物組成物。
在另一優選例中，所述癌症選自由以下組成的組：黑素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤及其它贅生性惡性疾病等。
本發明的第十個方面提供了一種免疫偶聯物，所述免疫偶聯物包括： (a)  如本發明中第一方面所述的四價雙特異性抗體；和 (b)  選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、或酶。
在另一優選例中，所述偶聯物部分選自：螢光或發光標記物、放射性標記物、MRI(核磁共振成像)或CT(電腦X射線斷層掃描技術)造影劑、或能夠產生可檢測產物的酶、放射性核種、生物毒素、細胞激素(如IL-2等)。
在另一優選例中，所述的免疫偶聯物包括抗體－藥物偶聯物(ADC)。
在另一優選例中，所述的免疫偶聯物用於製備治療腫瘤的藥物組成物。
有益效果：本發明提供了一種抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體。本發明的四價雙特異性抗體不需要進行Fc修飾，不會產生錯配問題，製備方法簡便，具有與單抗相似甚至更優的生物學活性和理化性質。
具體實施方式
本發明人透過廣泛而深入的研究，經過大量的篩選，成功獲得一種抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體。具體地，本發明的雙特異性抗體具有“共同輕鏈”，其包含抗PD-L1抗體的輕鏈可變區和人Kappa鏈恆定區。本發明人意外發現，“共同輕鏈”與Cetuximab抗體重鏈形成的雜合抗體居然能夠有效結合EGFR-ECD-hFc。此外，本發明的雙特異性抗體能夠有效抑制人類表皮癌細胞A431的增殖，並具有與單抗相似甚至更優的生物學活性和理化性質。在此基礎上完成了本發明。
發明中涉及的序列資訊總結在表1中。 表1、本發明的抗體的序列資訊
SEQ ID NO: 序列名稱
1 Anti-PDL1的重鏈可變區的胺基酸序列
2 Anti-PDL1的輕鏈可變區的胺基酸序列
3 人IgG1重鏈恆定區的胺基酸序列
4 Anti-PDL1的重鏈的胺基酸序列
5 Anti-PDL1的重鏈的核苷酸序列
6 人Kappa輕鏈恆定區的胺基酸序列
7 Anti-PDL1的輕鏈的胺基酸序列
8 Anti-PDL1的輕鏈的核苷酸序列
9 Cetuximab的重鏈可變區的胺基酸序列
10 Cetuximab的輕鏈可變區的胺基酸序列
11 連接子(GGGGSGGGGSGGGGS)
12 PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的胺基酸序列
13 PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的核苷酸序列
14 Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1的胺基酸序列
15 Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1的核苷酸序列
術語
本發明中，術語“抗體(Antibody，縮寫Ab)”和“免疫球蛋白G (Immunoglobulin G，縮寫IgG)”是有相同結構特徵的異四聚糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型(isotype)的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是恆定區，重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2、以及CH3構成。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區，輕鏈恆定區包括一個結構域CL；輕鏈的恆定區與重鏈恆定區的CH1結構域配對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區配對。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體依賴的細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重鏈恆定區包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型；輕鏈恆定區包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗體的重鏈和輕鏈透過重鏈的CH1結構域和輕鏈的CL結構域之間的二硫鍵共價連接在一起，抗體的兩條重鏈透過樞紐區之間形成的多肽間二硫鍵共價連接在一起。
本發明中，術語“雙特異性抗體(或雙抗)”是指能同時特異性結合兩種抗原(標的)或兩種表位的抗體分子。根據對稱性，雙特異性抗體可以分爲結構對稱的和不對稱的分子。根據結合位址的多少，雙特異性抗體可以分爲二價、三價、四價和多價分子。
本發明中，術語“單株抗體(單抗)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單株抗體高特異性地針對單個抗原位址。而且，與常規多株抗體製劑(通常是具有針對不同抗原决定簇的不同抗體的混合物)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個决定簇。除了它們的特異性外，單株抗體的好處還在於它們可以透過融合瘤培養來合成，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。
本發明中，術語“人源化”是指其CDR來源於非人物種(優選小鼠)抗體，抗體分子中殘餘的部分(包括框架區和恆定區)來源於人抗體。此外，框架區殘基可被改變以維持結合親和性。
本發明中，術語“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可將抗體裂解爲兩個完全相同的Fab段和一個Fc段。Fab段由抗體的重鏈的VH和CH1以及輕鏈的VL和CL結構域組成。Fc段即可結晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗體的CH2和CH3結構域組成。Fc段無抗原結合活性，是抗體與效應分子或細胞相互作用的部位。
本發明中，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分布在整個抗體可變區中。它集中於重鏈可變區和輕鏈可變區中稱爲互補决定區(complementarity-determining region, CDR)或高度變異區中的三個片段中。可變區中較守恆的部分稱爲框架區(frame region, FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情况下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR透過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669頁(1991))。
如本文所用，術語“框架區”(FR)指插入CDR間的胺基酸序列，即指在單一物種中不同的免疫球蛋白間相對守恆的免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各具有四個FR，分別稱爲FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相應地，輕鏈可變結構域可因此稱作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重鏈可變結構域可因此表示爲(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。優選地，本發明的FR是人抗體FR或其衍生物，所述人抗體FR的衍生物與天然存在的人抗體FR基本相同，即序列相同性達到85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
獲知CDR的胺基酸序列，本領域的技術人員可輕易確定框架區FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，術語“人框架區”是與天然存在的人抗體的框架區基本相同的(約85%或更多，具體地90%、95%、97%、99%或100%)框架區。
如本文所用，術語“接頭”或“連接子”是指插入免疫球蛋白結構域中爲輕鏈和重鏈的結構域提供足夠的可動性以折疊成交換雙重可變區免疫球蛋白的一個或多個胺基酸殘基。
在一具體實施例中，本發明的連接子將Anti-PDL1的重鏈可變區與人IgG4的CH1結構域相連，然後再透過連接子(優選人工連接子，在此使用的連接子是三個串聯的GGGGS，SEQ ID NO：11)連接Cetuximab的重鏈可變區。
合適的連接子實例包括單甘胺酸(Gly)、或絲胺酸(Ser)殘基，連接子中胺基酸殘基的標識和序列可隨著連接子中需要實現的次級結構要素的類型而變化。雙特異性抗體
本發明的雙特異性抗體是一種抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體，包括抗PD-L1抗體部分以及抗EGFR抗體部分。
優選地，本發明抗PD-L1抗體的序列如專利申請PCT/CN2020/090442中所述，本領域技術人員也可以透過本領域熟知的技術對本發明抗PD-L1抗體進行修飾或改造，例如添加、缺失和/或取代一個或幾個胺基酸殘基，從而進一步增加抗PD-L1的親和力或結構穩定性，並透過常規的測定方法獲得修飾或改造後的結果。
本發明中，術語“抗”、“結合”和“特異性結合”是指兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。通常，抗體以小於大約10-7 M，例如小於大約10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M或更小的平衡解離常數(KD)結合該抗原。本發明中，術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。例如，使用表面電漿共振術(Surface Plasmon Resonance，縮寫SPR)在BIACORE儀中測定抗體與抗原的結合親和力或使用ELISA測定抗體與抗原結合的相對親和力。
本發明中，術語“價”是指抗體分子中存在指定數量的抗原結合位址。優選的，本發明的雙特異性抗體具有四個抗原結合位址，是四價的。本發明中，抗原結合位址包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。
本發明中，術語“表位”是指與抗體特異性結合的多肽决定簇。本發明的表位是抗原中被抗體結合的區域。本發明中，術語“共同輕鏈”是指包含相同的輕鏈可變區和輕鏈恆定區的輕鏈，其能夠與結合第一抗原的第一抗體的重鏈配對，形成特異性結合第一抗原的結合位址，也能夠與結合第二抗原的第二抗體的重鏈配對，形成特異性結合第二抗原的結合位址。進一步的，共同輕鏈的輕鏈可變區與第一抗體的重鏈可變區形成第一抗原結合位址，共同輕鏈的輕鏈可變區與第二抗體的重鏈可變區形成第二抗原結合位址。
本發明的雙特異性抗體可以單獨使用，也可與可檢測標記物(爲診斷目的)、治療劑、或任何以上這些物質的組合結合或偶聯。編碼核酸和表現載體
本發明還提供了編碼上述抗體或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
本發明中，術語“表現載體”指攜帶表現盒用於表現特定目標蛋白或其他物質的載體，如質體、病毒載體(如腺病毒、反轉錄病毒)、噬菌體、酵母質體或其他載體。代表性的例子包括但並不限於：pTT5，pSECtag系列，pCGS3系列，pcDNA系列載體等，以及其它用於哺乳動物表現系統的載體等。表現載體中包括連接於合適的轉錄和轉譯調節序列的融合DNA序列。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其選殖入載體，再轉入細胞，然後透過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啓動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉形適當的宿主細胞，以使其能夠表現蛋白質。
本發明中，術語“宿主細胞”是指適用於表現上述表現載體的細胞，可以是真核細胞，如哺乳動物或昆蟲宿主細胞培養系統均可用於本發明的融合蛋白的表現，CHO (中國倉鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)，HEK293，COS，BHK以及上述細胞的衍生細胞均可適用於本發明。藥物組成物和應用
本發明還提供了一種組成物。優選地，所述的組成物是藥物組成物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白，以及藥學上可接受的載劑。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載劑介質中，其中pH通常約爲5-8，較佳地pH約爲6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組成物可以透過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射(如腹膜內)、顱內注射、或腔內注射。
本發明中，術語“藥物組成物”是指本發明的四價雙特異性抗體可以和藥學上可以接受的載劑一起組成藥物製劑組成物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明揭示的結合人PD-L1的抗體或其抗原結合片段或四價雙特異性抗體的胺基酸核心序列的構象完整性，同時還保護蛋白質的多官能基防止其降解(包括但不限於凝聚、脫胺或氧化)。
本發明的藥物組成物含有安全有效量(如0.001-99 wt%，較佳地0.01-90 wt%，更佳地0.1-80 wt%)的本發明上述的四價雙特異性抗體(或其偶聯物)以及藥學上可接受的載劑或賦形劑。這類載劑包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組成物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液透過常規方法進行製備。藥物組成物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約10微克/千克體重-約50毫克/千克體重。此外，本發明的四價雙特異性抗體還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組成物時，是將安全有效量的四價雙特異性抗體或其免疫偶聯物施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情况下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約10毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀况等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
下實施例中使用的蛋白表現和純化方法說明如下：將目的基因建構到表現載體pcDNA4中，利用PEI(Polyethylenimine)將建構好的表現載體或表現載體的組合轉入FreeStyle™ 293-F細胞(後文簡稱HEK293F，購自Thermo Fisher Scientific)中以表現抗體或重組蛋白，HEK293F細胞在Free Style 293 Expression Medium(購自Thermo Fisher Scientific)中培養5天後收取細胞上清液，然後用ProteinA親和層析或鎳親和層析純化抗體或重組蛋白。
以下實施例中使用的理化性質檢測方法說明如下： HPLC-SEC
抗體是高分子量蛋白質，具有高度複雜的二級和三級結構。由於轉譯後修飾、聚集和降解等變化，抗體在生物化學和生物物理特性方面是異質的。當透過分離技術分析雙特異性抗體時，通常會觀察到變體、聚集體和降解片段，它們的存在可能會損害安全性和有效性。在生產和儲存抗體的過程中容易出現聚集體、降解片段和不完整組裝的分子。本發明使用高效液相層析-粒徑篩析層析法(High-performance liquid chromatography–size exclusion chromatography, HPLC-SEC)檢測樣品中上述雜質的含量。聚集體的分子量要大於單體，因此相應峰的保留時間較短；降解片段或不完整組裝分子的分子量要小於單體，因此相應峰的保留時間較長。HPLC-SEC所用層析儀爲Dionex Ultimate 3000；流動相配製方法如下：取適量20mM磷酸二氫鈉母液，用20 mM磷酸氫二鈉調節PH至6.8±0.1；進樣量：20 µg；層析管柱爲TSK G3000SWXL，規格爲7.8×300 mm 5μm；流速0.5 ml/min，洗提時間30 min；管柱溫度25℃，樣品室溫度10℃；檢測波長214 nm。 CE-SDS
本發明使用CE-SDS (Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate)分析樣品中降解片段或不完整組裝的分子的含量。CE分爲非還原和還原兩種類型，用於前者的樣品在變性時不需要用還原劑DTT將分子內的二硫鍵破壞，而用於後者的樣品在變性時需要用還原劑DTT將分子內的二硫鍵破壞。非還原和還原CE-SDS分別記作NR-CE-SDS和R-CE-SDS。所用毛細管電泳儀爲ProteomeLabTM PA800 plus (Beckman Coulter)，配備UV 214 nm檢測器，毛細管型號爲Bare Fused-Silica Capillary，規格30.7 cm×50 μm，有效長度20.5 cm；其它相關試劑購自Beckman Coulter。儀器關鍵參數設置如下：毛細管和樣品室溫度爲20±2℃，分離電壓爲15 kV。
以下實施例、實驗例是對本發明進行進一步的說明，不應理解爲對本發明的限制。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於建構載體和質體的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質體的方法或將質體引入宿主細胞的方法。這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是衆所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniais, T. (1989) Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd  edition,  Cold spring Harbor Laboratory Press。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。實施例 1 抗 PD-L1 和 EGFR 的雙特異性抗體的建構 實施例 1.1 序列
Anti-PDL1是抗人PD-L1的人源化單抗，其重鏈可變區和輕鏈可變區序列(SEQ ID NO：1和2)來源於PCT/CN2020/090442。將合成的人源化重鏈可變區與人IgG1重鏈恆定區 (SEQ ID NO：3)相連，獲得全長的人源化重鏈基因，命名爲Anti-PDL1-HC (SEQ ID NO：4和5)；將人源化輕鏈可變區與人Kappa鏈恆定區 (SEQ ID NO：6)相連，獲得全長的人源化輕鏈基因，命名爲Anti-PDL1-LC (SEQ ID NO：7和8)。
從公開的文獻資料(Magdelaine-Beuzelin C, Kaas Q, Wehbi V, et al. Structure–function relationships of the variable domains of monoclonal antibodies approved for cancer treatment [J]. Critical reviews in oncology/hematology, 2007, 64(3): 210-225.)中獲得Cetuximab抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區序列(SEQ ID NO：9和10)。由上海生工生物工程有限公司合成編碼其重鏈可變區(Cetuximab-VH)和輕鏈可變區(Cetuximab-VL)的DNA。Cetuximab-VH和Cetuximab-VL分別與人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：3)和人Kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO：6)相連，建構成全長的Cetuximab抗體的重鏈和輕鏈基因，分別命名爲Cetuximab-HC和Cetuximab-LC。
Anti-PDL1的重鏈可變區的胺基酸序列(SEQ ID NO： 1) QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSS
Anti-PDL1的輕鏈可變區的胺基酸序列(SEQ ID NO： 2) EIVLTQSPDFLSVTPKEKVTITCRASQSIGTTIHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSVEAEDAATYYCQQSNSWPLTFGAGTKLEIK
人IgG1重鏈恆定區的胺基酸序列(SEQ ID NO： 3) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Anti-PDL1的重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO： 4) QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人Kappa輕鏈恆定區的胺基酸序列(SEQ ID NO： 6) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Anti-PDL1的輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO： 7) EIVLTQSPDFLSVTPKEKVTITCRASQSIGTTIHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSVEAEDAATYYCQQSNSWPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Cetuximab的重鏈可變區的胺基酸序列(SEQ ID NO： 9) QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA
Cetuximab的輕鏈可變區的胺基酸序列(SEQ ID NO： 10) DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK實施例 1.2 共同輕鏈的 選擇
用BLAST對Anti-PDL1輕鏈可變區與Cetuximab輕鏈可變區的胺基酸序列進行對比分析，結果顯示，兩者之間完全相同的胺基酸占比75% (Identities)，性質相似的胺基酸占比89% (Positives)。
將Cetuximab-HC和Cetuximab-LC的基因序列分別建構到pcDNA4表現載體中。將Anti-PDL1-HC、Anti-PDL1-LC、Cetuximab-HC和Cetuximab-LC的表現載體按照下述方式進行組合：Anti-PDL1-HC+Anti-PDL1-LC、Cetuximab-HC+ Cetuximab-LC、Anti-PDL1-HC+Cetuximab-LC和Cetuximab- HC+Anti-PDL1-LC，表現純化抗體，所得的抗體分別命名爲Anti-PDL1、Cetuximab、Anti-PDL1-HC+Cetuximab-LC和Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC。
PD-L1的胞外區編碼基因來源如WO2018/137576A1中所述。利用基因重組技術，在PD-L1的胞外區編碼基因末端連接多聚組胺酸編碼序列，然後將重組基因選殖到pcDNA4表現載體中，表現並純化重組蛋白，所得重組蛋白命名爲PD-L1-His。利用基因重組技術，在人EGFR的胞外區(序列來自NCBI，Accession：NP_005219)編碼基因末端連接人IgG1的Fc段編碼序列，然後將重組基因選殖到pcDNA4表現載體中，表現並純化重組蛋白，所得重組蛋白命名爲EGFR-ECD-hFc。用EGFR-ECD-hFc和PD-L1-His分別塗佈酵素標示盤，塗佈濃度分別爲40 ng/孔和10 ng/孔。用含有1%牛血清白蛋白的PBST (KH2 PO4 0.2 g，Na2 HPO4 •12H2 O 2.9 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Tween-20 0.5 ml，加純水至1L)封阻酵素標示盤。將待測抗體進行梯度稀釋，然後轉移到上述塗佈重組蛋白的酵素標示盤中，室溫培育半小時後洗盤；加入適當稀釋的HRP(Horseradish Peroxidase)標記的羊抗人抗體(Fab-specific，購自Sigma)，室溫培育半小時後洗盤；每孔加入100 μl以TMB爲基質的顯色液(基質顯色A液：醋酸鈉•三水 13.6 g，檸檬酸•一水 1.6 g，30%雙氧水 0.3 ml，純水 500 ml；基質顯色B液：乙二胺四乙酸二鈉0.2 g，檸檬酸•一水 0.95g，甘油50 ml，TMB 0.15 g溶於3 ml DMSO中，純水 500 ml；使用前A和B液等體積混勻)，室溫培育1~5 min；加50 μl終止液(2M H2 SO4 )終止反應；酵素標示讀取儀(SpectraMax 190)讀取OD450，用GraphPad Prism6進行作圖和資料分析，並計算EC50。
如圖2A所示，Anti-PDL1能夠有效結合PD-L1-His，EC50是0.0924 nM；而Cetuximab、Anti-PDL1-HC+Cetuximab- LC和Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC均不能結合PD-L1-His。如圖2B所示，Cetuximab和Cetuximab-HC +Anti-PDL1-LC均能有效結合EGFR-ECD-hFc，EC50爲0.2096 nM和0.2484 nM，而Anti-PDL1和Anti-PDL1-HC+Cetuximab-LC不能有效結合EGFR-ECD-hFc。在此選擇Anti-PDL1-LC(SEQ ID NO：7和8)作爲共同輕鏈建構雙特異性抗體。實施例 1.3 雙特異抗體的建構
將Anti-PDL1的重鏈可變區與人IgG4的CH1結構域相連，然後再透過人工連接子(在此使用的連接子是三個串聯的GGGGS，SEQ ID NO：11)連接Cetuximab的重鏈可變區，最後再連接人IgG1的重鏈恆定區(CH1+CH2+CH3)，透過此程序建構成的含有兩個重鏈可變區和兩個CH1結構域的長重鏈基因命名爲PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1 (SEQ ID NO：12和13)。相似地，將Cetuximab的重鏈可變區與人IgG4的CH1結構域相連，然後再透過人工連接子(在此使用的連接子是三個串聯的GGGGS，SEQ ID NO：11)連接Anti-PDL1的重鏈可變區，最後再連接人IgG1的重鏈恆定區(CH1+CH2+CH3)，透過此程序建構成的含有兩個重鏈可變區和兩個CH1結構域的長重鏈基因命名爲Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1 (SEQ ID NO：14和15)。
將上述序列分別建構到pcDNA4表現載體中，將PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1表現載體分別與Anti-PDL1-LC表現載體組合，表現純化抗體，所得的抗體分別命名爲PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab- PDL1-IgG1(爲簡明起見，此處只取重鏈的名字作爲抗體的名稱)。
PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的胺基酸序列如下所示(SEQ ID NO：12)： QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1的胺基酸序列如下所示(SEQ ID NO：14)： QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK實施例 2 ELISA 測定相對親和力
ELISA檢測方法參照實施例1.2中所述。
如圖3A所示，Anti-PDL1、PDL1-Fab-Cetuximab- IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1均能有效結合PD-L1-His，EC50分別是0.2177 nM、0.2003 nM和0.3356 nM。如圖3B所示，Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC、PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1均能有效結合EGFR-ECD-hFc，EC50分別是0.2253 nM、0.2388 nM和0.1852 nM。上述結果顯示，PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1既能夠結合PD-L1又能結合EGFR，這說明它們是雙特異性抗體。實施例 3 評估抑制 A431 細胞增殖的功能活性
A431 (ATCC® CRL-1555™)是人類表皮癌細胞株，過量表現野生型EGFR。抗EGFR抗體能夠在體外和體內抑制A431細胞的增殖。
本實施例評估上述抗體抑制A431細胞增殖的功能活性。方法如下：用DMEM將處於對數生長期的A431細胞洗2遍，1000 rpm離心5 min；用含1%胎牛血清的DMEM (胎牛血清和DMEM購自Gibco)將細胞重新懸浮到適當密度，接種到96孔盤中，104 個/150 μl/孔；然後在含1%胎牛血清的DMEM中將上述抗體進行梯度稀釋；將稀釋好的抗體加入上述接種A431細胞的96孔盤中，50 μl/孔；在37℃、5% CO2 細胞培養箱中培育3天；3天後每孔加入20 μl CCK-8 (購自Dojindo)溶液，在培養箱中繼續培育4小時；用酵素標示讀取儀讀取OD450；GraphPad Prism6進行資料分析，作圖並計算IC50。
如圖4所示，Cetuximab、Cetuximab-HC+Anti- PDL1-LC、PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab- PDL1-IgG1均能有效抑制A431細胞的增殖，IC50分別是0.6322 nM、0.5629 nM、0.7094 nM和0.9597 nM。實施例 4 Biacore 測定親和力
在此透過Biacore 8K (GE healthcare)檢測上述抗體與PD-L1或EGFR之間的親和力。在Biacore 8K上，使用偶聯有Protein A/G的晶片分別捕獲各種抗體，再將重組蛋白PD-L1-His(自製)或EGFR-His(帶有His標籤的EGFR重組蛋白，購自北京義翹神州)進樣，得到結合-解離曲線，用6M鹽酸胍再生緩衝液洗提後重複下一個循環；利用Biacore 8K Evaluation Software對資料進行分析。結果如表2所示。表 2-1. 對 PD-L1 的結合和解離動力學參數以及平衡解離常數
樣品名稱 Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD(M)
Anti-PDL1 1.39E+06 1.34E-03 9.66E-10
PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1 2.41E+06 1.56E-03 6.46E-10
Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1 1.55E+06 1.21E-03 7.79E-10
表 2-2. 對 EGFR 的結合和解離動力學參數以及平衡解離常數
樣品名稱 Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD(M)
Cetuximab 1.91E+06 1.18E-03 6.14E-10
Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC 1.57E+06 1.48E-03 9.46E-10
PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1 9.48E+05 1.35E-03 14.2E-10
Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1 1.63E+06 1.56E-03 9.57E-10
表2-1顯示，Anti-PDL1、PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1對PD-L1的結合常數(Kon )和解離常數(Koff )十分相近，平衡解離常數(KD)也基本相當，KD分別是9.66E-10、6.46E-10和7.79E-10。表2-2顯示，Cetuximab、Cetuximab-HC+Anti-PDL1-LC和Cetuximab-Fab-PDL1-IgG1對EGFR的結合常數(Kon )和解離常數(Koff )十分相近，平衡解離常數(KD)也基本相當，KD分別是6.14E-10、9.46E-10和9.57E-10；與前三者相比，PDL1-Fab- Cetuximab-IgG1對EGFR的平衡解離常數(KD)略大，爲14.2E-10。平衡解離常數(KD)與親和力高低成反比。實施例 5 物理化學性質的特徵 5.1 HPLC-SEC
圖5A表示Anti-PDL1的HPLC-SEC圖譜，其中存在2個明顯的峰，分別是Peak1和Peak2，占比分別爲0.2%和99.8% (主峰)。圖5B表示PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的HPLC-SEC圖譜，其中存在3個明顯的峰，分別是Peak1、Peak2和Peak3，占比分別爲0.3%、99.5% (主峰)和0.2%。Anti-PDL1和PDL1-Fab- Cetuximab-IgG1的主峰占比相近。5.2 CE-SDS
圖6A和圖6B分別表示Anti-PDL1的NR-CE-SDS和R-CE-SDS圖譜，圖6C和圖6D分別表示PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的NR-CE-SDS和R-CE-SDS圖譜。Anti-PDL1的NR-CE-SDS主峰Peak8占比98.11%，PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的NR-CE-SDS主峰Peak9占比97.14%。Anti-PDL1的R-CE-SDS主峰Peak5 (對應輕鏈)和Peak10 (對應重鏈)分別占比32.62%和63.55%，兩者峰面積之比爲1:1.95，兩者峰面積占比之和爲96.17%；PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的R-CE-SDS主峰Peak4 (對應輕鏈)和Peak11 (對應重鏈)分別占比38.27%和57.37%，兩者峰面積之比爲2:3.0，兩者峰面積占比之和爲95.64%。NR-CE-SDS中，Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的主峰占比十分相近；R-CE-SDS中，Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的輕鏈和重鏈的峰面積之比均符合預期，兩者的主峰占比之和十分相近。實施例 6 評估增強 MLR 的能力
本實施例中使用的混合淋巴細胞反應(Mixed Lymphocyte Reaction，MLR)的方法說明如下：用Histopaque(購自Sigma)從人血液中分離出周邊血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，縮寫PBMC)，然後透過貼壁法將PBMC中的單核細胞分離出來，然後用IL-4 (25 ng/ml)和GM-CSF (25 ng/ml)誘導單核細胞分化成樹突狀細胞。七天之後，消化收集上述誘導的樹突狀細胞。用上述方法從另外供體的血液中分離出PBMC，然後用MACS磁鐵和CD4 MicroBeads(購自Miltenyi biotec)從PBMC中分離CD4+T細胞。將誘導的樹突狀細胞(104 /孔)和分離出的CD4+T細胞(105 /孔)按比例混勻後接種到96孔盤中，每孔150 μl；數小時後，在上述96孔盤中加入50 μl梯度稀釋的抗體；將96孔盤置於37℃細胞培養箱中培育3天。上述實驗過程中使用AIM-V培養基(購自Thermo Fisher Scientific)培養細胞。然後按照標準操作流程檢測IL-2和IFN-γ的分泌。使用雙抗夾心ELISA檢測IL-2和IFN-γ的分泌(相關配對抗體購自BD Biosciences)。用酵素標示讀取儀(SpectraMax 190)讀取OD450，用GraphPad Prism6進行作圖並計算EC50。
A和B的結果來自同一份MLR實驗體。如圖7A所示，Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1均能有效刺激MLR分泌IL-2，它們的EC50分別是0.1578 nM和0.409 nM。另外，如圖7B所示，Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1均能有效刺激MLR分泌IFN-γ，它們的EC50分別是0.1369 nM和0.08084 nM。該結果顯示，Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的功能活性相當。其中同型對照抗體爲與標的無關的人IgG1抗體。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作爲參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作爲參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
圖1爲本發明的雙特異性抗體的結構示意圖，其中，VH-A表示Anti-PDL1或Cetuximab的重鏈可變區，VH-B表示Cetuximab或Anti-PDL1的重鏈可變區，VL表示共同輕鏈的輕鏈可變區，CH1、CH2和CH3是重鏈恆定區的三個結構域，CL是共同輕鏈的輕鏈恆定區，兩條重鏈之間的線段表示二硫鍵，重鏈和輕鏈之間的線段也表示二硫鍵，靠近多肽鏈N末端的CH1和VH-A之間的線段表示人工設計的連接子，靠近多肽鏈C末端的CH1和CH2之間的線段表示抗體天然的連接子和樞紐區(如果重鏈是人IgG4亞型，樞紐區會含有S228P點突變，根據EU編碼)。
圖2爲Cetuximab和Anti-PDL1及其雜合抗體的ELISA結果；其中，圖2A和圖2B爲分別用PD-L1-His和EGFR-ECD-hFc塗佈酵素標示盤。
圖3爲PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab- PDL1-IgG1的ELISA結果；其中，圖3A和圖3B爲分別用PD-L1-His和EGFR-ECD-hFc塗佈酵素標示盤。
圖4爲評估PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1和Cetuximab-Fab- PDL1-IgG1抑制A431細胞增殖的功能活性的結果。
圖5爲Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的HPLC-SEC圖譜；其中，圖5A表示Anti-PDL1的HPLC-SEC圖譜，圖5B表示PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的HPLC-SEC圖譜。
圖6爲Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的NR-CE-SDS和R-CE-SDS圖譜；其中，圖6A和圖6B分別表示Anti-PDL1的NR-CE-SDS和R-CE-SDS圖譜，圖6C和圖6D分別表示PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1的NR-CE-SDS和R-CE-SDS圖譜。
圖7爲評估Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1增強MLR的能力的結果；其中，圖7A表示Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1刺激MLR分泌IL-2的結果，圖7B表示Anti-PDL1和PDL1-Fab-Cetuximab-IgG1刺激MLR分泌IFN-γ的結果。

Claims (17)

  1. 抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體，其特徵在於，包含： (a)  兩條多肽鏈，所述多肽鏈從N末端到C末端包含VH-PDL1-CH1-接頭-VH-EGFR-CH1-CH2- CH3或VH-EGFR-CH1-接頭-VH-PDL1-CH1- CH2-CH3，其中，所述VH-PDL1爲結合PD-L1的重鏈可變區，所述VH-EGFR爲結合EGFR的重鏈可變區，所述CH1爲重鏈恆定區的第一結構域，所述CH2爲重鏈恆定區的第二結構域，所述CH3爲重鏈恆定區的第三結構域；和 (b)  四條共同輕鏈，所述共同輕鏈從N末端到C末端包含VL-CL，其中，所述VL爲輕鏈可變區，所述CL爲輕鏈恆定區，所述多肽鏈的VH-PDL1-CH1和所述VH-EGFR-CH1分別與所述共同輕鏈的VL-CL配對，所述VH-PDL1和所述VL形成PD-L1抗原結合位址，所述VH-EGFR與所述VL形成EGFR結合位址； 其中，所述的每個共同輕鏈具有如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述的四價雙特異性抗體，其特徵在於，所述的重鏈的CH1區選自人IgG1的CH1結構域或人IgG4的CH1結構域。
  3. 如請求項1所述的四價雙特異性抗體，其特徵在於，所述的結合PD-L1的重鏈可變區VH-PDL1如SEQ ID No: 1所示；所述的結合EGFR的重鏈可變區VH-EGFR如SEQ ID No: 9所示。
  4. 如請求項1所述的四價雙特異性抗體，其特徵在於，每個所述的多肽鏈的胺基酸序列相同。
  5. 抗PD-L1和EGFR的四價雙特異性抗體，其特徵在於，包含兩條多肽鏈和四條共同輕鏈，其中，所述多肽鏈具有如SEQ ID NO： 12或SEQ ID NO： 14所示的胺基酸序列，所述共同輕鏈具有如SEQ ID NO： 7所示的胺基酸序列。
  6. 一種分離的核苷酸，其特徵在於，所述的核苷酸編碼如請求項1-5任一所述的四價雙特異性抗體。
  7. 如請求項6所述的核苷酸，其特徵在於，所述的核苷酸編碼所述多肽鏈和所述共同輕鏈，其中，編碼所述多肽鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO： 13或SEQ ID NO： 15所示，編碼所述共同輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO： 8所示。
  8. 一種表現載體，其特徵在於，所述的表現載體含有如請求項6或7所述的核苷酸。
  9. 一種宿主細胞，其特徵在於，所述的宿主細胞含有如請求項8所述的表現載體。
  10. 如請求項1-5任一所述的四價雙特異性抗體的製備方法，其特徵在於，所述方法包含以下步驟： (a)  在表現條件下，培養如請求項9所述的宿主細胞，從而表現所述的四價雙特異性抗體； (b)  分離並純化(a)所述的四價雙特異性抗體。
  11. 一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物含有如請求項1-5任一所述的四價雙特異性抗體和藥學上可接受的載劑。
  12. 如請求項1-5任一所述的四價雙特異性抗體、或其免疫偶聯物、或如請求項11所述的藥物組成物在製備治療癌症的藥物中的用途。
  13. 如請求項12所述的用途，其特徵在於，所述癌症選自由以下組成的組：黑素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤及其它贅生性惡性疾病。
  14. 一種治療癌症的方法，其特徵在於，包括向有需要的受試者施用如請求項1-5任一所述的四價雙特異性抗體、或其免疫偶聯物、或如請求項11所述的藥物組成物。
  15. 如請求項14所述的方法，其特徵在於，所述癌症選自由以下組成的組：黑素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤及其它贅生性惡性疾病。
  16. 一種免疫偶聯物，其特徵在於，所述免疫偶聯物包括： (a)  如請求項1中所述的四價雙特異性抗體；和 (b)  選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、或酶。
  17. 如請求項16所述的免疫偶聯物的用途，其特徵在於，用於製備治療腫瘤的藥物組成物。
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