JP7165265B2 - Her2/pd1二重特異性抗体 - Google Patents
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Description
発現条件下で上記ホスト細胞を培養することにより、HER2及びPD1に特異的に結合しうる二重特異性抗体を発現するステップaと、
前記ステップaで発現した二重特異性抗体を分離、精製するステップbと、を含む。
CHO細胞:Thermo fisher社製、製品番号A29133
293E細胞:NRC biotechnology Research Institute社製
ヒト乳がん細胞BT474:中国科学院細胞バンクにより入手、カタログ番号TCHu143
PD-L1aAPC/CHO-K1細胞:Promega社製、製品番号J1252
CD4+T細胞:Allcells社製、製品番号LP180329
NK細胞:Allcells社製、製品番号PB012-C
Protein-Aチップ:ラベル番号29139131-AA、ロット番号10261132
SDラット:浙江維通利華実験動物技術社製、動物製造認定証SCXK(浙)2018-0001
ヒト胃がん細胞株NCI-N87:アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)により入手
BALB/cヌードマウス:上海霊暢バイオテック社製
MC38マウス大腸がん細胞株:上海和元バイオテック社製
ヒト化PD1を移植したマウスC57BJ/6J-PDCD1em1(Hpdcd1)/Smoc株:上海南方模式バイオテック社製、製品番号NM-KI-00015
PBMC:上海SAILYバイオテック社製、製品番号SLB-HP040A
HRP標識のマウス抗ヒトFab抗体:sigma社製、製品番号A0293
HRP標識のストレプトアビジン:BD Biosciences社製、製品番号554066
ヒツジ抗ヒトIgG-FITC:sigma社製、製品番号F4143
CD28抗体:Abcam社製、 製品番号ab213043
IL-2:R&D社製、製品番号202-IL
PBS:上海生工バイオテック社製、製品番号B548117
PBST:0.05%のTween 20を含むPBS
BSA:上海生工バイオテック社製、製品番号A60332
TMB:BD社製、製品番号555214
Bio-Glo:Promega社製、製品番号G7940
FBS:Gibco社製、製品番号10099
HBS-EP緩衝液:Life science社製、BR-1006-69
CellTiter-Glo:promega社製、製品番号G775B
HiTrap MabSelectSuReカラム:GE社製
Beckman Coulter CytoFLEXフローサイトメーター:Beckman社製
SpectraMax i3xプレートリーダー:MolecularDevices社製
SpectraMax M5プレートリーダー:MolecularDevices社製
MicroCal VP-Capillary示差走査熱量計(DSC):Malvern Panalytical社製
本発明では、HER2モノクローナル抗体のIgGとPD1モノクローナル抗体のscFvをタンデムに繋いでHER2/PD1二重特異性抗体aを構築した。
二重特異性抗体の重鎖および軽鎖のDNA断片をそれぞれpTT5ベクターに導入し、組換えプラスミドを得て両者を同時にCHO細胞及び/又は293E細胞に導入した。細胞を培養し、5~7日後に培養液を回収して高速遠心し、ミリポアメンブレンフィルタで減圧ろ過した後、HiTrap MabSelectSuReカラムに注入して100mMのクエン酸を含む溶出液(pH3.5)でタンパク質を溶出し、目的サンプルを回収してPBS(pH7.4)で透析した。HPLCを用いて精製済みのタンパク質を分析し、HER2/PD1二重特異性抗体a、bのHPLCクロマトグラムはそれぞれ図2A、2Bに示される通りであった。抗体分子は、均一な状態を呈し、純度が97%以上であった。そして、精製済みのHER2/PD1二重特異性抗体a、bにそれぞれ非還元性の電気泳動緩衝液を加え、SDS-PAGE電気泳動を行い、かつ精製済みのHER2/PD1二重特異性抗体a、bにそれぞれ還元性の電気泳動緩衝液を加え、沸騰するまで加熱処理してからSDS-PAGE電気泳動を行った。電気泳動の結果を図2Cに示し、二重特異性抗体全長の分子量理論値が199KDであった。
HER2抗原に対するHER2/PD1二重特異性抗体aおよびbの結合性を評価するため、PBS緩衝液(pH7.4)を用いてHER2-ECD-Hisタンパク質(三生国健薬業社製)を250ng/mLに希釈し、ELISAプレートの各ウェルに100μLずつ加えた。4℃で一晩静置し、翌日にPBSTでプレートを2回洗い流した。各ウェルに1%のBSAを含むPBSTを加え、37℃、1時間ブロッキングしてからPBSTでプレートを2回洗い流した。そして、測定用抗体試料及び陽性対照物であるHER2モノクローナル抗体を、1%のBSAを含むPBSで濃度100nMから段階的に3倍希釈して12段階の濃度勾配となるようにし、プレートに加えて37℃、1時間静置した。PBSTでプレートを2回洗い流し、HRP標識のマウス抗ヒトFab抗体を加えて37℃、40分間静置した。プレートをPBSTで3回洗い流し、軽く叩いて水滴を取り除き、各ウェルにTMBを100μL加えて室温(20±5℃)、暗所で5分間静置した。各ウェルに停止液として2MのH2SO4を50μL加えて基質反応を停止させ、プレートリーダーを用いて波長450nmでのOD値を読み取り、得られたデータをGraphPad Prism6で解析し、図を作成してEC50を算出した。実験結果は図3Aに示され、HER2/PD1二重特異性抗体a、bおよび陽性対照物であるHER2モノクローナル抗体とHER2抗原が結合する際のEC50がそれぞれ0.1975、0.2294及び0.221であり、HER2抗原に対して三者の結合性がほぼ同様であることが確認できた。
HER2が細胞表面で高いレベルで発現するヒト乳がん細胞BT474を標的細胞とし、0.5%のBSAを含むPBSで3回洗浄し、1回洗浄する度に300g、5分間遠心し、3回目の遠心後に上澄み液を捨てた。0.5%のBSAを含むPBSSで細胞を再懸濁し、細胞濃度が1×106個細胞/mLとなるようにし、96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ加えた。HER2/PD1二重特異性抗体a、bおよび陽性対照物であるHER2モノクローナル抗体を濃度400nMとなるように調製し、さらに、段階的に希釈して11段階の濃度勾配を形成し、96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ加えてBT474細胞と十分混ぜ合わせ、4℃で1時間静置した。細胞をPBSで2回洗浄することにより未結合状態の測定用抗体試料を取り除いた後、1g/mLのヒツジ抗ヒトIgG-FITCを100μL加えて細胞と4℃で30分間インキュベートし、300g、5分間遠心し、細胞をPBSで2回洗浄することにより未結合状態の二次抗体を取り除いた。そして、細胞を200μLのPBSで再懸濁し、Beckman Coulter CytoFLEXフローサイトメーターを用いて該細胞に対する二重特異性抗体の結合性を測定し、得られたデータをGraphPad Prism6ソフトで整理し、回帰解析を行った。実験結果は図4Aに示され、HER2/PD1二重特異性抗体a、bが何れも細胞表面に発現するHER2に特異的に結合することができ、HER2/PD1二重特異性抗体a、bおよび陽性対照物であるHER2モノクローナル抗体がBT474細胞に結合する際のEC50がそれぞれ1.64、5.669及び1.556であった。そのうち、HER2/PD1二重特異性抗体aおよび陽性対照物であるHER2モノクローナル抗体の結合性がほぼ同様であるが、HER2/PD1二重特異性抗体bは、陽性対照物であるHER2モノクローナル抗体に少々劣る結合性を示した。
ヒト乳がん細胞株BT474は、その細胞表面においてHER2抗原分子を発現し、体外でBT474細胞を培養するとき、細胞はHER2受容体を介して伝達される増殖シグナルに部分的に依存して増殖する。そして、培地にHER2抗体を加えると、細胞の増殖が阻害され、このときの抗体濃度と細胞増殖の阻害効果が一定の範囲内で用量効果関係を示すことが既に知られている。このとき、細胞増殖は、CCK-8(Cell Counting Kit-8)を用いる毒性実験によって測定することができ、用量反応曲線がS字型を呈するのが一般である。
対数増殖期にあるPD-L1 aAPC/CHO-K1細胞をパンクレアチンで消化して細胞を粘着状態から遊離させ、白色で且つ底部透明の96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ、1ウェル当たりに40000個細胞となるように播種し、37℃、5%のCO2インキュベータで一晩培養した。HER2/PD1二重特異性抗体a及びb、PD1モノクローナル抗体および同型の陰性対照物試料を、濃度600nMから段階的に3倍希釈して2×測定溶液を得た。そして、細胞密度が1.4~2×106個/mLであり、細胞生存率が95%以上であるPD1効果細胞をパンクレアチンで消化し、再懸濁して1.25×106個細胞/mLの細胞溶液を得た。1日前に予め準備したPD-L1 aAPC/CHO-K1細胞を取って上澄みを捨て、段階的に希釈した二重特異性抗体およびPD1モノクローナル抗体の測定溶液を40μL加え、さらに、同体積のPD1効果細胞を加えて37℃、5%のCO2インキュベータで6時間インキュベートした。各ウェルにBio-Glo測定試薬を80μL加えて室温、10分間静置し、spectramax i3を用いて発光量を測定した。
protein-A捕捉法を利用し、二重特異性抗体と抗原HER2-ECD-hisが結合する際の動態パラメータを測定した。具体的には、濃度が1μg/mLの二重特異性抗体をProtein-Aチップに固定し、さらに、1×HBS-EP緩衝液を用いて抗原HER2-ECD-hisを濃度50nMから段階的に2倍希釈することにより、6段階の濃度勾配を形成して抗体との結合実験に用いた。解離は、HBS-EP緩衝液を用いて行われた。
体重が約200gのSDラットを4組に分け、各組は4匹ずつであった。ラットに抗体2mgを尾静脈経由で注射することにより投与を行い、投与後の指定時点でマウス眼窩から採血し、血液が自然凝固するまで待ってから8000rpm/分間遠心して血清を回収した。
HER2/PD1二重特異性抗体が腫瘍細胞や、PD-1を発現するT細胞に結合し、さらに、抗体のFc部分がNK細胞に結合することができるため、NK細胞が抗体結合のCD4+T細胞に対して傷害力を保持できるかどうか、かつ抗体結合のBT474腫瘍細胞に対して傷害力を保持できるかどうかの問題について検討を行った。
2つの標的に対するHER2/PD1二重特異性抗体の相乗効果を細胞レベルで評価するに当たっては、腫瘍細胞がHER2抗原を発現し、HER2抗体で腫瘍細胞の増殖を抑制することができ、同時に細胞がPD-L1を発現し、T細胞におけるPD-1と結合できることが求められる。こうした構想に基づくと、PD1抗体はPD-1とPD-L1の結合を阻害し、T細胞に対する抑制作用を抹消し、腫瘍細胞に対して傷害効果を奏すると推定できる。ところが、上記一連の要求を満たす細胞株を得ることは容易でなく、代わりにレンチウイルスベクターを用いてPD-L1遺伝子をヒト胃がんNCI-N87細胞株に導入することによりN87-PDL1細胞を構築することにした。そして、N87-PDL1細胞の表面で高いレベルで発現するPD-L1についてはFACS法で確認した。
体外で培養したヒト胃がんNCI-N87細胞株を、無血清培地で濃度が5×107個細胞/mLになるように再懸濁させ、細胞懸液を100μL取って無菌条件下でヌードマウスの背部皮下に接種した。ノギスで移植腫瘍の長さと幅を計測して腫瘍体積を算出し、腫瘍が100~200mm3に成長するまで待ってからマウスをランダムで幾つかの組に分けた。
測定試料としてのHER2/PD1二重特異性抗体aの投与量を13mg/kgとし、陽性対照物であるPD1モノクローナル抗体の投与量を10mg/kgとし、ブランク組には同量の生理塩水を投与した。体外で培養したMC38マウス大腸がん細胞を濃度が1×107個細胞/mLになるように再懸濁させ、細胞懸液を100μL取って無菌条件下でヒト化PD1を移植したマウスの右脇皮下に接種した。ヒト化PD1を移植したマウスの移植腫瘍の直径をノギスで測定し、平均腫瘍体積が100~200mm3になるまで待ってからマウスをランダムで幾つかの組に分けた。PD1モノクローナル抗体やHER2/PD1二重特異性抗体aは、上述の投与量に従って投与し、ブランク組には同量の生理塩水を与え、腹腔経由で週に2回、3週間連続して投与を行った。
タンパク質構造に対する添加剤の影響などを含め、相互作用に関連する熱力学的パラメータを検討、評価するということは、製剤の最適化および開発に最も必要とされる作用機序関連の情報を提供することができる。そこで、試料および緩衝液を0.22μmのメンブレンフィルタで濾過した後、それぞれ400μLを取って96ウェルプレートに移し、MicroCal VP-Capillary DSCを用いて25℃~100℃の温度範囲、加熱速度120℃/1時間の条件下で走査した。
Claims (20)
- HER2及びPD1に特異的に結合しうる二重特異性抗体であって、
免疫グロブリン抗体IgG、および2つの同じ一本鎖可変領域断片scFvを含み、
前記一本鎖可変領域断片scFvは、それぞれ可変領域VHおよび可変領域VLを含み、
前記可変領域VHと前記可変領域VLは、ペプチドリンカーL1によって連結され、
前記一本鎖可変領域断片scFvは、それぞれペプチドリンカーL2を介して前記免疫グロブリン抗体IgGにタンデムに連結されており、
前記可変領域VHのアミノ酸配列は、配列番号13で表され、前記可変領域VLのアミノ酸配列は、配列番号14で表され、
前記免疫グロブリン抗体IgGは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、そのうち重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号15で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号16で表されることを特徴とする、二重特異性抗体。 - 前記ペプチドリンカーL1のアミノ酸配列は、配列番号17で表される、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 前記ペプチドリンカーL2のアミノ酸配列は、配列番号18で表される、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 前記一本鎖可変断片scFvは、VL-L1-VHの分子構成を有し、各一本鎖可変断片scFvのN末端は、ペプチドリンカーL2を介して前記免疫グロブリン抗体IgGの重鎖のC末端に連結される、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 前記一本鎖可変断片scFvのアミノ酸配列は、配列番号19で表される、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 前記二重特異性抗体は、重鎖のアミノ酸配列が配列番号20で表され、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号21で表される、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 請求項1~6の何れか1項に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
- 前記ヌクレオチド分子は、HER2及びPD1に特異的に結合しうる二重特異性抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号22で表され、軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号23で表される、請求項7に記載のヌクレオチド分子。
- 前記一本鎖可変断片scFvは、VH-L1-VLの分子構成を有し、各一本鎖可変断片scFvのC末端は、ペプチドリンカーL2を介して前記免疫グロブリン抗体IgGの重鎖のN末端に連結される、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 前記一本鎖可変断片scFvのアミノ酸配列は、配列番号24で表される、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 前記二重特異性抗体は、重鎖のアミノ酸配列が配列番号25で表され、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号21で表される、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 請求項9~11の何れか1項に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
- 前記ヌクレオチド分子は、HER2及びPD1に特異的に結合しうる二重特異性抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号26で表され、軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号23で表される、請求項12に記載のヌクレオチド分子。
- 請求項7、8、12又は13の何れか1項に記載のヌクレオチド分子を含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
- 前記発現ベクターは、pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFRおよびpTT5からなる群より選ばれる任意の1種である、請求項14に記載の発現ベクター。
- 請求項14に記載の発現ベクターを含んでなることを特徴とする、ホスト細胞。
- 前記ホスト細胞は、CHO細胞および293E細胞からなる群より選ばれる任意の1種である、請求項16に記載のホスト細胞。
- 請求項1~6および請求項9~11の何れか1項に記載のHER2及びPD1に特異的に結合しうる二重特異性抗体を製造する方法であって、
発現条件下で請求項16~17の何れか1項に記載のホスト細胞を培養することにより、HER2及びPD1に特異的に結合しうる二重特異性抗体を発現するステップaと、
前記ステップaで発現した二重特異性抗体を分離、精製するステップbと
を含むことを特徴とする、製造方法。 - 請求項1~6および請求項9~11の何れか1項に記載のHER2及びPD1に特異的に結合しうる二重特異性抗体と、
薬学的に許容可能な担体、希釈剤および賦形剤からなる群より選ばれる1種又は2種以上と
を含んでなることを特徴とする、組成物。 - 請求項1~6および請求項9~11の何れか1項に記載のHER2及びPD1に特異的に結合する二重特異性抗体又は請求項19に記載の薬物組成物の、癌または腫瘍を治療するための薬物。
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