CN113967195A - 抗her2/pd1双特异性抗体冻干制剂及其制备方法 - Google Patents

抗her2/pd1双特异性抗体冻干制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗HER2/PD1双特异性抗体冻干制剂及其制备方法。本发明通过优化制剂配方及冻干工艺极大的改进了ScFv‑IgG C端融合类的双特异性抗体不稳定的缺陷，按照本发明的制剂配方和制备方法，通过本领域熟知的评价稳定性的方法，如在5±3℃下储存3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、36个月，检测的SEC纯度和IEC纯度应符合质量标准规定。

Description

抗HER2/PD1双特异性抗体冻干制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体地说，涉及一种抗HER2/PD1双特异性抗体冻干制剂及其制备方法。
背景技术
HER2(human epidermal growth factor receptor2)，具有受体酪氨酸蛋白激酶活性，是人表皮生长因子受体家族成员之一，只在成年人的少数正常组织中呈低水平表达。但研究表明，HER2在多种肿瘤中过表达，如在约30％的乳腺癌患者和16％的胃癌患者中均存在过度表达情况，HER2在肿瘤中的过表达可以显著促进肿瘤血管的新生、肿瘤的生长，并增强肿瘤的侵袭和转移能力，是这类患者预后较差的重要指征。
人程序性细胞死亡受体-1(PD-1)是由288个氨基酸组成的I型膜蛋白，胞外段为负责结合配体的Ig可变型(V-型)结构域，胞内段为负责结合信号转导分子的胞质尾区。PD-1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体，分别为ITIM(免疫受体酪氨酸抑制作用模体)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。PD-1表达在已经激活的T淋巴细胞表面，它与配体PD-L1(程序性死亡受体-配体1，programmed cell death-Ligand 1)和PD-L2(程序性死亡受体-配体2，programmed cell death-Ligand 2)结合可以抑制T淋巴细胞的活性及相关的体内细胞免疫反应。大量研究表明，PD-1和PD-L1的相互作用不仅维持了体内免疫系统的平衡，也是导致PD-L1表达阳性的肿瘤细胞规避免疫监视的主要机制。通过阻断PD-1/PD-L1信号通路，能够激活免疫系统，恢复T细胞的免疫杀伤功能。
双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是指能同时结合两个(或多个)不同抗原表位的抗体分子。与传统的单克隆抗体相比，双特异性抗体具有独特的作用机制：1)双特异性抗体可以同时结合2个或多个不同的抗原分子或相同分子的不同表位，而联合用药往往不具备这种效应。2)介导细胞间的相互作用，双特异性抗体可分别结合效应细胞和靶细胞上的两种抗原上，在效应细胞和靶细胞之间架起桥梁，促进细胞间的相互作用，例如介导免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此双特异性抗体具有传统单克隆抗体不具备的独特优势。
PCT专利申请WO2020/103629A1公开了一种自主研发的抗HER2/PD1双特异性抗体，系采用DNA重组技术在CHO细胞中表达的抗HER2/PD1双特异性抗体，由抗HER2的抗体分子在C端连接2个PD1的单链抗体组成(ScFv-IgG C端融合)。ScFv-IgG C端融合类的双特异性抗体由于C端ScFv在溶液状态下一伸一缩呈现呼吸链状态，非常容易导致分子聚集和沉淀；同时，伸缩时容易暴露内部氨基酸，导致氧化、脱氨发生，形成电荷异构体，稳定性较差。因此，需通过制剂优化提高稳定性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种抗HER2/PD1双特异性抗体冻干制剂及其制备方法。该冻干制剂由抗HER2/PD1双特异性抗体、缓冲液、蛋白保护剂、表面活性剂组成。该制备方法包括药液配制、药液分装、冷冻-干燥等流程。
为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面提供了一种抗HER2/PD1双特异性抗体冻干制剂，该冻干制剂包括抗HER2/PD1双特异性抗体、缓冲液、蛋白保护剂、表面活性剂。
其中，所述的抗HER2/PD1双特异性抗体的浓度为5-20mg/ml，所述的抗HER2/PD1双特异性抗体包含如SEQ ID NO：1所示的重链和如SEQ ID NO：2所示的轻链。优选的，所述的抗HER2/PD1双特异性抗体的浓度为10-15mg/ml，更优选的，所述的抗HER2/PD1双特异性抗体的浓度为10mg/ml。
其中，所述的缓冲液为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，所述的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液的浓度为10-20mM。优选的，所述的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液的浓度为10mM。
其中，所述的蛋白保护剂为海藻糖或蔗糖、盐酸精氨酸，所述的海藻糖或蔗糖的浓度为10-50mg/ml，所述的盐酸精氨酸的浓度为25-50mM。优选的，所述的蛋白保护剂为海藻糖和盐酸精氨酸，所述的海藻糖的浓度为50mg/ml，所述的盐酸精氨酸的浓度为50mM。
其中，所述的表面活性剂为聚山梨酯80或聚山梨酯20，所述的聚山梨酯80或聚山梨酯20的浓度为0.1-0.5mg/ml，优选的，所述的聚山梨酯80或聚山梨酯20的浓度为0.2-0.5mg/ml。优选的，所述的表面活性剂为聚山梨酯80，所述的聚山梨酯80的浓度为0.4±0.05mg/ml。
其中，所述的冻干制剂的pH为6.8±0.5。
本发明的第二个方面提供了所述的冻干制剂的制备方法，该制备方法包括药液配制、药液分装、冷冻-干燥等流程。
其中，所述的药液配制为原液或制剂的药液配制。所述的药液配制包括蛋白溶液的超滤浓缩换液工艺和稀释工艺。所述的超滤浓缩换液工艺包括以下步骤：首先向待超滤浓缩的蛋白溶液中添加蛋白保护剂并超滤浓缩，所述的蛋白保护剂为海藻糖或蔗糖、盐酸精氨酸，所述的海藻糖或蔗糖的浓度为10-50mg/ml，优选为10mg/ml，所述的盐酸精氨酸的浓度为25-50mM，优选为50mM；其次，对超滤浓缩后的蛋白溶液进行换液，换液溶液包含组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、蛋白保护剂，所述的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液的浓度为10-20mM，优选为10mM，所述的蛋白保护剂为海藻糖或蔗糖、盐酸精氨酸，所述的海藻糖或蔗糖的浓度为10-50mg/ml，优选为20mg/ml，所述的盐酸精氨酸的浓度为25-50mM，优选为50mM。所述的稀释工艺为向换液后的蛋白溶液中添加适量的缓冲液、蛋白保护剂、表面活性剂使得蛋白溶液达到本发明中第一个方面提供的冻干制剂的组分和用量。
其中，所述的药液分装剂量为5-160mg/瓶，优选的，所述的药液分装剂量为10-50mg/瓶，更优选的，所述的药液分装剂量为50mg/瓶。
其中，所述的冷冻-干燥包括预冻、主干燥、次干燥、终干燥的步骤，所述的预冻进箱温度为5℃，预冻温度为-40℃，预冻时间不低于3h；所述的主干燥温度为-20--12℃，时间为不低于21h，真空度为200-250μbar；所述的次干燥温度为-5-15℃，时间为不低于12.5h，真空度为100-250μbar；所述的终干燥温度为30℃，时间为不低于3.3h，真空度为20-60μbar。
有益效果：本发明通过优化制剂配方及冻干工艺极大的改进了ScFv-IgG C端融合类的双特异性抗体不稳定的缺陷，按照本发明的制剂配方和制备方法，通过本领域熟知的评价稳定性的方法，如在5±3℃下储存3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、36个月，检测的SEC纯度和IEC纯度应符合质量标准规定。
附图说明
图1为不同pH的条件下蛋白溶液的SEC纯度和IEC纯度的结果。
图2为蛋白保护剂对超滤浓缩换液的影响的结果。
图3为DOE结果分析。
图4为冻干配方优化结果。
图5为20191210冻干曲线。
图6为20191213冻干曲线。
图7为20200114冻干曲线。
图8为20200214冻干曲线。
图9为20200314冻干曲线。
具体实施方式
以下实施例中使用的蛋白样品来源自PCT专利申请WO2020/103629A1中公开的抗HER2/PD1双特异性抗体a，其重链和轻链氨基酸序列如下所示。
抗HER2/PD1双特异性抗体a的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：1)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSS
抗HER2/PD1双特异性抗体a的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
以下实施例中使用的检测方法说明如下：
SEC纯度、聚体检测方法：
流动相：200mM磷酸盐缓冲液，pH 6.8±0.1。经0.22μm滤膜过滤、超声脱气后使用。色谱柱：TSK G3000SWxl，7.8×300mm 5μm，TOSOH 08541。高效液相色谱仪：WatersAlliance e2695 2489紫外/可见光检测器，Dionex Ultimate 3000 VWD-3400(RS)Detector或其他适合配有紫外检测器的HPLC系统。
系统适用性样品：取参考品用流动相稀释浓度至5.0mg/ml，13000rpm离心10min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC样品盘。供试品：用流动相稀释供试品浓度至5.0mg/ml，13000rpm离心10min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC样品盘。色谱条件：柱温25±2℃；样品温度10±2℃；检测波长UV 280nm；进样体积20μL；流速0.5ml/min。
用色谱软件进行积分，峰面积归一化法计算各个峰的峰面积百分比。系统适用性可接受标准：6针系统适用性样品，聚体与单体的分离度均≥1.5，主峰的保留时间RSD≤1.0％，主峰峰面积RSD≤2.0％，且主峰的不对称性均≤2.0，理论塔板数均≥4000。供试品报告结果：样品的SEC纯度报告为单体主峰的峰面积百分比，聚体含量为聚体峰的峰面积百分比。
IEC纯度检测方法：
流动相A：20mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5±0.05。经0.22μm滤膜过滤、超声脱气后使用。流动相B：20mM磷酸盐缓冲液+200mM氯化钠，pH 6.5±0.05。经0.22μm滤膜过滤、超声脱气后使用。色谱柱：Propac WCX-10，4×250mm，Thermo Dionex 054993。高效液相色谱仪：Waters Alliance e2695，Dionex Ultimate 3000系列或其他适合配有紫外检测器的HPLC系统。
系统适用性样品：取参考品用流动相稀释浓度至1.0mg/ml，13000rpm离心10min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC样品盘。供试品：用流动相稀释供试品浓度至1.0mg/ml，13000rpm离心10min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC样品盘。色谱条件：柱温30±2℃；样品温度10±2℃；检测波长UV 214nm；进样体积20μL；流速1.0ml/min。流动相梯度如下：
Figure BDA0002596022480000061
纯度分析：用峰面积归一化法计算样品图谱上主峰、酸峰区和碱峰区的峰面积百分比。IEC纯度结果报告为主峰的峰面积百分比。
除特别注明外，以下实施例中使用的原料组分皆市售可得。
以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 pH对稳定性影响的考察
本实施例考察蛋白在pH5.0-7.0溶液中的稳定性。按照表1所示配制5批样品，放置5±3℃冰箱进行考察，于0、7、14、21天取样检测SEC纯度和IEC纯度。考察结果如表2和图1所示。
表1、不同pH考察条件
Figure BDA0002596022480000071
表2、不同pH考察结果
Figure BDA0002596022480000072
由图1的结果可知，IEC纯度的结果显示各组样品间差异不明显；SEC纯度的结果显示pH5.0和pH5.5的条件下斜率下降趋势明显大于pH6.0-7.0的条件下的斜率，因此优选的pH值范围为6.0-7.0，同时说明中性偏碱的酸碱度更有利于蛋白稳定。
实施例2盐酸精氨酸和海藻糖对超滤浓缩换液的影响的考察
本实施例分别考察在pH5.0和pH6.6的条件下，添加蛋白保护剂盐酸精氨酸(Arg.HCl)和海藻糖(TRE)对超滤浓缩换液的的影响，其中蛋白浓度范围为4-26mg/ml，缓冲液为20mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液(His)和20mM醋酸缓冲液(HAc)。超滤浓缩过程中每隔一段时间取样，检测蛋白浓度、SEC纯度、IEC纯度。考察结果如表3和图2所示。
表3、蛋白保护剂对超滤浓缩换液的稳定性的影响
Figure BDA0002596022480000081
Figure BDA0002596022480000091
由图2的结果可知，所有样品组中随着蛋白浓度增加，聚体均有增加的趋势。其中pH5.0的条件下的样品组的斜率变化最大，因此结果最差。在pH6.6的情况下，添加了盐酸精氨酸的样品组结果优于没有添加盐酸精氨酸的样品组，并且盐酸精氨酸添加用量25mM与50mM没有显示明显差异，因此盐酸精氨酸在超滤浓缩换液中的浓度可为25-50mM。另外，在添加盐酸精氨酸的基础上进一步添加海藻糖的样品组显示结果更优，其中，海藻糖添加用量10mg/ml和50mg/ml没有显示明显差异，因此海藻糖浓度可为10-50mg/ml。在盐酸精氨酸和海藻糖的保护下，优选的制剂蛋白浓度为5-20mg/ml，分装到2ml西林瓶至20ml西林瓶用于冻干制剂，分装体积1-8ml，可覆盖剂量为5-160mg。
实施例3盐酸精氨酸在冻干过程中的作用考察
本实施例考察盐酸精氨酸在冻干过程中的作用。分别按照表4配制3组样品，分装至2ml西林瓶，分装体积1ml，剂量15mg/瓶。按照表5所示的冻干工艺冻干，分别在预冻前、预冻后、冻干后检测SEC纯度，结果如表6所示。
表4、盐酸精氨酸考察条件
Figure BDA0002596022480000092
表5、冻干参数
Figure BDA0002596022480000093
Figure BDA0002596022480000101
表6、盐酸精氨酸考察结果
Figure BDA0002596022480000102
由表6的结果可知，随着盐酸精氨酸浓度的增加，在预冻和冻干过程中对蛋白的保护作用也增加，优选的盐酸精氨酸浓度为50mM。
实施例4 pH和聚山梨酯80对稳定性的影响考察
本实施例考察pH和聚山梨酯80对蛋白稳定性的影响。采用DOE设计进行考察，pH范围设定6.2-7.0，聚山梨酯80浓度设定0.1-0.5mg/ml，其他组分浓度如表7所示。样品配制后分装至2ml西林瓶，分装体积1ml，剂量15mg/瓶，液体状态分别放置40±2℃和5±3℃，于0、5、10、15天取样检测SEC纯度、IEC纯度、不溶性微粒。考察结果如表8和图3所示。
表7、DOE设计表
Figure BDA0002596022480000103
表8、DOE结果
Figure BDA0002596022480000111
Figure BDA0002596022480000121
将5±3℃下的SEC纯度斜率、40±2℃下的IEC纯度斜率、2μm颗粒、10μm颗粒进行DOE模型分析，结果如图3所示。DOE采用中心复合设计-效应面法，模型拟合为连续曲面，因此设定的试验参数范围可适当外推。由图3的结果可知，pH优选的范围为6.3-7.3，聚山梨酯80优选的浓度范围为0.1-0.5mg/ml。
实施例5冻干配方优化
本实施例在冻干条件下考察蛋白浓度、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、聚山梨酯80对蛋白的影响。分别按照表9配制5组样品，蛋白浓度10-15mg/ml，组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液浓度为10-20mM，聚山梨酯80浓度为0.2-0.4mg/ml。用2ml西林瓶分装1ml体积后(剂量10mg/瓶)冻干，放置40±2℃，于0、7、14、21、28天取样，检测SEC纯度和IEC纯度。考察结果如表10和图4所示。
表9、蛋白浓度、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、聚山梨酯80考察条件
Figure BDA0002596022480000122
表10、蛋白浓度、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、聚山梨酯80考察结果
Figure BDA0002596022480000123
Figure BDA0002596022480000131
由图4的结果可知，各样品组的SEC纯度和IEC纯度具有相似趋势，因此可以判断蛋白浓度10-15mg/ml，组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液浓度10-20mM，聚山梨酯80浓度0.2-0.4mg/ml均符合制剂配方要求。
实施例6药液配制
在批号为P2004的原液药液配制工序中，将待超滤浓缩换液的蛋白溶液(初始浓度为2.06mg/ml)添加适量海藻糖母液(含10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、50mM盐酸精氨酸、363mg/ml海藻糖，pH6.8±0.1)使溶液中海藻糖浓度为10mg/ml，采用超滤仪器进行超滤浓缩至蛋白浓度约15mg/ml，进行超滤换液，换液溶液为10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、20mg/ml的海藻糖、50mM的盐酸精氨酸，pH6.8±0.1。换液7个循环后，添加适量海藻糖母液(含10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、50mM盐酸精氨酸、363mg/ml海藻糖，pH6.8±0.1)使溶液中海藻糖浓度至50mg/ml，再添加适量聚山梨酯80母液(含10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、50mM盐酸精氨酸、50mg/ml海藻糖、20mg/ml聚山梨酯80，pH6.8±0.1)使溶液中聚山梨酯80的浓度至0.4-0.5mg/ml。再用制剂辅料溶液(含10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、50mM盐酸精氨酸、50mg/ml海藻糖、0.4mg/ml聚山梨酯80，pH6.8±0.1)稀释至蛋白浓度10.0-10.5mg/ml。
实施例7冻干工艺考察
分别按照表11进行考察各组制剂的冻干工艺，冻干曲线如图5-图9所示，其中温度单位为℃，时间单位为min，压力单位为μbar。
表11、冻干工艺考察
Figure BDA0002596022480000141
通过对冻干结果分析，20191210、20200214、20200314冻干效果较好。因此可知，优选的冻干参数为：预冻-40℃，不低于3h；主干燥温度-20--12℃，真空200-250μbar，时间不低于21h；次干燥温度-5℃-15℃，真空100-250μbar，时间不低于12.5h；终干燥温度30℃，真空20-60μbar，时间不低于3.3h。
实施例8稳定性考察
制备一批制剂，配方为蛋白10mg/ml、L-组氨酸1.34mg/ml、盐酸组氨酸0.28mg/ml、盐酸精氨酸10.53mg/ml(50mM)、海藻糖50mg/ml、聚山梨酯80 0.4±0.05mg/ml、pH6.8±0.5，采用20ml西林瓶，灌装体积5ml，剂量50mg/瓶。冻干工艺为如表12所示。冻干后样品放置5±3℃，分别每周取样检测SEC纯度和IEC纯度，结果如表13所示。
表12、冻干参数
程序 温度(℃) 压力(ubar) 时间(min)
装载 -5 / /
预冻 -40 / 5
预冻 -40 / 210
抽空 / 200 /
干燥 -15 200 60
干燥 -15 200 1680
干燥 0 200 60
干燥 0 200 750
干燥 15 100 30
干燥 15 100 180
干燥 30 60 30
干燥 30 60 60
干燥 30 20 150
表13、稳定性考察结果
时间(周，W) SEC纯度(％) IEC纯度(％)
0 93.49 34.82
1 93.56 35.46
2 93.83 38.23
3 93.86 38.57
4 93.57 38.35
5 93.67 37.23
6 93.60 37.17
7 93.50 \
8 94.25 36.99
由表13的结果可知，8周内制剂样品的SEC纯度和IEC纯度结果显示蛋白无发生降解，因此可知本发明的制剂配方和冻干工艺生产出来的药品具有非常好的稳定性。
序列表
<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司
<120> 抗HER2/PD1双特异性抗体冻干制剂及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 709
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
465 470 475 480
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn
485 490 495
Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
500 505 510
Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
515 520 525
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
530 535 540
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro
545 550 555 560
His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
565 570 575
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
580 585 590
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
595 600 605
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
610 615 620
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
625 630 635 640
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
645 650 655
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
660 665 670
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
675 680 685
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
690 695 700
Val Thr Val Ser Ser
705
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (10)

1.一种抗HER2/PD1双特异性抗体冻干制剂，其特征在于，所述的冻干制剂包括：抗HER2/PD1双特异性抗体、缓冲液、蛋白保护剂、表面活性剂；其中，所述的抗HER2/PD1双特异性抗体的浓度为5-20mg/ml，所述的抗HER2/PD1双特异性抗体包含如SEQ ID NO：1所示的重链和如SEQ ID NO：2所示的轻链；所述的缓冲液为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，所述的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液的浓度为10-20mM；所述的蛋白保护剂为海藻糖或蔗糖、盐酸精氨酸，所述的海藻糖或蔗糖的浓度为10-50mg/ml，所述的盐酸精氨酸的浓度为25-50mM；所述的表面活性剂为聚山梨酯80或聚山梨酯20，所述的聚山梨酯80或聚山梨酯20的浓度为0.1-0.5mg/ml，所述的冻干制剂的pH为6.8±0.5。
2.如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述的抗HER2/PD1双特异性抗体的浓度为10-15mg/ml，所述的聚山梨酯80或聚山梨酯20的浓度为0.2-0.5mg/ml。
3.如权利要求2所述的冻干制剂，其特征在于，所述的抗HER2/PD1双特异性抗体的浓度为10mg/ml，所述的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液的浓度为10mM，所述的蛋白保护剂为海藻糖和盐酸精氨酸，所述的海藻糖的浓度为50mg/ml，所述的盐酸精氨酸的浓度为50mM，所述的表面活性剂为聚山梨酯80，所述的聚山梨酯80的浓度为0.4±0.05mg/ml。
4.如权利要求1-3中任一项所述的冻干制剂的制备方法，其特征在于，包括药液配制、药液分装和冷冻-干燥的流程。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的药液配制为原液或制剂的药液配制，所述的药液配制包括蛋白溶液的超滤浓缩换液工艺和稀释工艺。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的超滤浓缩换液工艺包括以下步骤：
首先向待超滤浓缩的蛋白溶液中添加蛋白保护剂并超滤浓缩，所述的蛋白保护剂为海藻糖或蔗糖、盐酸精氨酸，所述的海藻糖或蔗糖的浓度为10-50mg/ml，优选为10mg/ml，所述的盐酸精氨酸的浓度为25-50mM，优选为50mM；
其次，对超滤浓缩后的蛋白溶液进行换液，换液溶液包含组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、蛋白保护剂，所述的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液的浓度为10-20mM，优选为10mM，所述的蛋白保护剂为海藻糖或蔗糖、盐酸精氨酸，所述的海藻糖或蔗糖的浓度为10-50mg/ml，优选为20mg/ml，所述的盐酸精氨酸的浓度为25-50mM，优选为50mM。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的稀释工艺为向换液后的蛋白溶液中添加适量的缓冲液、蛋白保护剂、表面活性剂使得蛋白溶液达到如权利要求1-3中任一项所述的冻干制剂的组分和用量。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的药液分装剂量为5-160mg/瓶，优选的，所述的药液分装剂量为10-50mg/瓶，更优选的，所述的药液分装剂量为50mg/瓶。
9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的冷冻-干燥包括预冻、主干燥、次干燥、终干燥的步骤；其中，所述的预冻进箱温度为5℃，预冻温度为-40℃，预冻时间不低于3h；所述的主干燥温度为-20--12℃，时间为不低于21h，真空度为200-250μbar；所述的次干燥温度为-5-15℃，时间为不低于12.5h，真空度为100-250μbar；所述的终干燥温度为30℃，时间为不低于3.3h，真空度为20-60μbar。
10.如权利要求1-3中任一项所述的冻干制剂用于制备治疗癌症或肿瘤的药物中的用途。
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