CN109021110A - 抗Her2/PD-1双特异性抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗Her2/PD‑1双特异性抗体及其制备方法，属于生物技术领域。本发明提供的抗Her2/PD‑1双特异性抗体既能与Her2结合，还能与PD‑1相结合，其通过阻断Her2和/或PD‑1信号传导途径，有效地增强免疫反应，从而可能具有良好的增强抗肿瘤免疫反应的效果。

Description

抗Her2/PD-1双特异性抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及抗Her2/PD-1双特异性抗体及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
双特异性抗体(bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。
大量研究表明，肿瘤在形成过程中，可通过多重机制，逃避免疫系统的监视，我们将这一过程称之为肿瘤组织的免疫逃逸或免疫编辑。PD-1是T细胞表面的蛋白质，亦为被称作「免疫检查点」抑制剂的蛋白质之一。PD-1的正常功能是关闭作为阻止健康免疫系统攻击体内其他细胞的部分过程的T细胞介导免疫应答。PD-1附着到正常细胞或癌细胞表面上的某些蛋白质(被称为PD-1配体1(PD-L1)或PD-1配体2(PD-L2))时，T细胞会关闭其杀死细胞的能力。若干癌细胞产生大量的PD-L1和PD-L2以帮助该等癌细胞逃避T细胞攻击。抗PD-1抗体与PD-1结合并阻断其与PD-L1和PD-L2结合，从而令T细胞杀死癌细胞。
T细胞在肿瘤免疫的过程中处于核心地位，如果能调动体内的杀伤武器，将是非常有效且安全的治疗策略。总而言之，既要在体内激活原有自身的免疫系统反应，还要让已经调动的反应持续增强才是免疫治疗肿瘤的最好策略。
HER2是一种185kDa的细胞表面受体酪氨酸激酶(cell surfacereceptortyrosine kinase)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族的成员，所述家族包括四种不同的受体：EGFR/ErbB-l、HER2/ErbB-2、HER3/ErbB-3、和HER4/ErbB-4。所述EGFR家族的四种成员形成同二聚体和异二聚体，其中HER2是优选的且是其它ErbB受体的最强的二聚配偶体(Graus-Porta等人，Embo J 1997；16:1647-1655；Tao等人，J Cell Sci 2008；121:3207-3217)。HER2可以通过过表达或通过与其它可以由配体结合而激活的ErbB的异二聚化而激活(Riese和Stern,Bioessays l998；20:41-48)。对于HER2，还没有鉴定出配体。HER2活化导致受体磷酸化，其通过多种信号途径，如MAPK、磷酸肌醇3-激酶/AKT、JAK/STAT、和PKC，而触发下游的信号级联放大，其最终导致多种细胞功能的调节，如生长、存活、和分化(Huang等人，Expert Opin Biol Ther 2009；9:97-110)。
对HER2在肿瘤方面的关注很多集中在其在乳腺癌(breast cancer)中的作用，其中HER过表达在大约20％的病例中报道，且其与不良的预后有关联(Reese等人，Stem Cellsl997；15:1-8；Andrechek等人，Proc Natl Acad Sci U SA2000；97:3444-3449；和Slamon等人，Science l987；235:177-182)。除了乳腺癌以外，HER2表达还与其它人癌瘤种类关联，包括前列腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、食管癌、和头和颈的鱗状细胞癌(Garcia de Palazzo等人，Int J Biol Markers l993；8:233-239；Ross等人,Oncologist2003；8:307-325；Osman等人，J Urol 2005；174:2174-2177；Kapitanovic等人，Gastroenterology 1997；112:1103-1113；Turken等人，Neoplasma 2003；50:257-261；和Oshima等人，Int J Biol Markers 2001；16:250-254)。
通过联合使用抗PD-1单克隆抗体和抗Her2单克隆抗体，对于治疗癌症，增强自身免疫力有着十分广阔的前景。现有制备双特异性个抗体的方法仍存在大量同源二聚体(＞20％)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法。
本发明提供的一种表达生产Her2/PD-1双特异性抗体的方法，方法包括以下步骤：
(1)以pCHO1.0为表达载体，构建分别表达抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体的中华仓鼠卵巢细胞工程菌细胞株；
(2)培养所述工程菌细胞株，分别产抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体；
(3)将抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体组装，形成Her2/PD-1双特异性抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述抗Her2单克隆抗体的重链、轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述抗PD-1单克隆抗体的重链、轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)培养工程菌细胞株的方法，是将二级种子细胞按(1.0±0.3)×106个/ml的接种密度用基础培养基稀释至3L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L，设置搅拌转速为250～280r/min，pH设置为6.95±0.15，通过碳酸氢钠溶液和CO2调节pH；溶解氧设置为40±20％；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃；培养第5天降温至33.5±0.5℃；培养第14天收获；第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，加补料培养基A和补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，当葡萄糖浓度低于2.0～3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至4.0～5.0g/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)还包括对抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体进行纯化的过程，具体地，对工程菌的培养上清进行深层过滤去除细胞，收获澄清液，采用GE Mabselected Sure填料，亲和纯化抗Her2抗体和抗PD-1抗体。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)将纯化后的抗Her2抗体和抗PD-1抗体按照1：1比例混合，添加精氨酸和还原性谷胱甘肽至终浓度分别为10～200mM和60～140mM，用Tris调节pH至7.5～8.5，37℃孵育3～5小时。
所述种子培养基是CHO无血清培养基：CD CHO AGT 24.6g/L；所述基础培养基是Dynamis AGT 24.8g/L；所述葡萄糖浓缩液是葡萄糖200g/L；所述碳酸氢钠溶液是NaHCO390.7g/L。所述补料培养基A是CHO CD EfficientFeed A；所述补料培养基B是CHO CDEfficientFeed B。
本发明的有益效果：本发明提供的一种双特异性抗体的制备方法，与传统的双特异性抗体制备相比，该方法能够大幅降低同源二聚体的形成，所得双抗纯度可以达到96.3％，同源二聚体的比例只有不到3％。
附图说明
图1双特异性抗体表达示意图
图2抗Her2和抗PD-1单克隆抗体表达的细胞生长曲线
图3抗Her2和抗PD-1单克隆抗体表达的细胞活率曲线
图4抗Her2和抗PD-1单克隆抗体表达
图5抗Her2/PD-1双特异性抗体SEC-HPLC分析图谱
图6抗Her2/PD-1双特异性抗体与Her2结合力曲线
图7抗Her2/PD-1双特异性抗体与PD-1结合力曲线
具体实施方式
种子培养基是CHO无血清培养基：CD CHO AGT(Gibco)24.6g/L；基础培养基：Dynamis AGT(Gibco)24.8g/L；补料培养基A：CHO CD Feed A(GE)；补料培养基B：CHO CDFeed B(GE)。
葡萄糖浓缩液：葡萄糖200g/L；碳酸氢钠溶液：NaHCO3 90.7g/L。
实施例1抗Her2抗体和抗PD-1抗体表达载体的构建
全人源抗Her2单抗的全长基因(轻链和重链)序列采用Trastuzumab所公开的序列(IMGT INN 7637_H，INN7637_L)，重链见SEQ ID NO.1，轻链见SEQ ID NO.2。全人源抗PD-1单抗的Fab(轻链和重链)序列采用Pembrolizumab所公开的序列(IMGT INN 9798_H，INN9798_L)，重链见SEQ ID NO.3，轻链见SEQ ID NO.4，Fc采用Trastuzumab的Fc序列。对Trastuzumab和Pembrolizumab的Fc氨基酸铵序列进行电荷分析，并对CH3区域进行氨基酸改造，改造后的Trastuzumab重链氨基酸序列为SEQ ID NO.5，改造后的Pembrolizumab重链氨基酸序列为SEQ ID NO.6。通过氨基酸改造可以形成双特异性抗体，并降低双特异性抗体中同源二聚体的比例。
重链和轻链的碱基序列由苏州金唯智生物技术服务有限公司全基因合成，根据DNA序列分别设计引物用聚合酶链式反应扩增抗HER2单抗的轻链和重链，以及抗PD-1单抗的轻链和重链。
PCR均采用高保真DNA聚合酶(购自Takara公司的PrimeSTAIT HS DNAPolymerase)。扩增抗PD-1单抗轻、重链全长基因以及抗HER2轻、重链全长基因，反应条件按照DNA聚合酶生产商说明书合理设置：95℃20秒；55℃10秒，72℃1分/kb；30个循环。
将抗PD-1单抗的单抗轻、重链全长基因重组到pCHO 1.0载体上，将抗HER2轻、重链全长基因重组到另一pCHO 1.0载体上。具体地，以上PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后用于重作PCR的模板，重组PCR反应条件为：95℃20秒；55℃10秒，72℃2分；6个循环后再加入相应的引物；95℃20秒；55℃10秒，72℃1分/kb。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pCHO 1.0载体(购自Life Technologies公司)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO:5为抗HER2抗体重链的氨基酸序列；SEQ ID NO:2为抗HER2抗体轻链的氨基酸序列。SEQ ID NO:6为抗PD-1抗体重链的氨基酸序列；SEQ ID NO:4为抗PD-2抗体轻链的氨基酸序列。
实施例2.抗HER2抗体和抗PD-1抗体细胞株的构建
通过电转染试剂盒(AmaxaTM cell line NucleofectorTM Kit V)和单孔细胞电转染仪(NucleofectorTM 2b,Lonza)分别将抗PD-1抗体和抗Her2抗体表达质粒转入CHO-S宿主细胞中，得到分别表达抗PD-1抗体的CHO-S细胞和抗体Her2抗体的CHO-S细胞。
具体地，转染前24小时，以0.6×106个/ml的细胞密度将CHO-S细胞传代至新鲜配制的CD CHO(Gibco)培养基中，并置于37℃，8％CO2，130r/min摇床中培养。转染时，预热Nucleofector Kit和培养基，并按照Nucleofector solution：supplement为4.5:1配制800μl电转液，加入50μg质粒至电转液中，混匀。1000r/min、5min离心3×107个细胞，弃上清；用10ml PBS重悬细胞后离心5min，弃上清。将电转液和质粒两者的混悬液置于上述细胞中，重悬混匀。取质粒、细胞和电转液三者混悬液100μl于电转杯中，并快速转置于电转仪中，在电转仪界面选择U-024程序，进行电转染。迅速取出电转杯，加入500μl预热培养基，转移至含有30ml FortiCHO(Gibco)培养基的T75方瓶中，之后将方瓶移至37℃，8％CO2培养箱中静置培养。48小时后，取细胞悬液检测细胞密度和活率，细胞密度大于0.5×106个/ml，细胞活率大于60％。
将转染48小时后的细胞悬液离心重悬至T75方瓶。所用筛选培养基分别为含有10μg/mlPuro、100nmol/L MTX的FortiCHO培养基和20μg/ml Puro、200nmol/L MTX的FortiCHO培养基(表6)。将方瓶置于37℃，8％CO2的培养箱中静置培养。7天后开始每3～4天检测细胞活率，当细胞活率大于30％或细胞活率较最近一次检测有所增加时，将细胞以1×106个/ml的密度传代至125ml摇瓶，30ml/摇瓶。当细胞活率大于85％，细胞密度大于1×106个/ml时，加压筛选完成。
用FortiCHO培养基将细胞密度稀释至5个/ml用于96孔板铺板，200μl/孔，即按照1个细胞/孔进行铺板。在培养第17天时用Fortebio抗体浓度定量法检测上清内的抗体表达量，挑选表达量最高的克隆。
实施例3抗HER2抗体和抗PD-1抗体的分别表达
用基础培养基分别将抗Her2抗体和抗PD-1抗体的种子细胞按0.6×106个/ml的接种密度稀释到1个3L细胞培养反应器中，初始培养体积均为1L；设置搅拌转速均为250r/min；pH设置为7.00，DeadBand设置为0.10，关联碳酸氢钠溶液(NaHCO3 90.7g/L)和CO2进行调节；溶解氧设置为40％；1～4天培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至32.0℃；第14天收获。
(1)两个细胞反应器，均在第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，加补料培养基A和补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/L。图2为流加培养过程中的细胞生长密度，图3为流加培养过程中抗体的表达。最终培养上清液中抗PD-1抗体的浓度达到2.55g/L。上清中抗Her2抗体的浓度达到3.22g/L。
(2)两个细胞反应器，均在第4、6、8、10、12天用补料培养基进行补料，加补料培养基A和补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/L。最终培养上清液中抗PD-1抗体的浓度达到2.07g/L，上清液中抗Her2抗体的浓度达到2.97g/L。
(3)两个细胞反应器，均在第3、5、7天用补料培养基进行补料，加补料培养基A和补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/L。最终培养上清液中抗PD-1抗体的浓度达到1.84g/L，上清液中抗Her2抗体的浓度达到2.77g/L。
(4)两个细胞反应器，均在第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，加补料培养基A和补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH。最终培养上清液中抗PD-1抗体的浓度达到1.54g/L，上清液中抗Her2抗体的浓度达到2.05g/L。
(5)两个细胞反应器，均在第4、6、8、10、12天用补料培养基进行补料，加补料培养基A和补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.5g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/L。最终培养上清液中抗PD-1抗体的浓度达到2.26g/L，上清液中抗Her2抗体的浓度达到2.84g/L。
实施例4抗HER2/PD-1双特异性抗体的纯化和组装
对培养上清首先进行深层过滤(采用millipore的D0HC和X0HC)去除细胞，澄清收获液采用亲和纯化，采用GE Mabselected Sure填料，将分别纯化后的抗Her2抗体和抗PD-1抗体按照摩尔比例1：1比例混合，添加精氨酸和还原性谷胱甘肽至终浓度分别为10～200mM和60～140mM，用Tris调节pH至7.5～8.5，37℃孵育3～5小时。
调整纯化后的抗Her2抗体和抗PD-1抗体的混合比例，以及精氨酸、还原性谷胱甘肽的浓度，孵育后检测双特异性抗体的纯度。纯化的后的抗HER2/PD-1双特异性抗体经过SEC-HPLC分析，如图5所示。混合比例、精氨酸的浓度、还原性谷胱甘肽的浓度、孵育时间，以及所得双特异性抗体的纯度，均参见下表1。由表1数据可知，精氨酸对双特性抗体的纯度基本无影响，而谷胱甘肽和孵育时间对抗体纯度影响较大，最佳的范围精氨酸10～200mM，谷胱甘肽60～140mM，孵育时间为3～5小时。
表1
实施例5抗HER2/PD-1双特异性抗体的进一步纯化
组装后的抗HER2/PD-1双特异性抗体，采用阳离子交换层析进行进一步的纯化去除单体，样品处理用2％冰醋酸调节pH 5.0±0.1，采用Fractogel SO3(Milipore)填料，层析柱经过CIP后，用阳离子平衡液(50mM NaAC-HAC,pH5.0)冲洗5CV，待基线平稳后UV调零上样，上样保留时间8min，载量20～40g/L，上样完毕后用阳离子平衡液(50mM NaAC-HAC,pH5.0)冲洗5CV，用应阳离子洗脱液(50mM NaAC-HAC+180mM Nacl,pH5.0)进行洗脱，收集紫外280nm处主峰(吸收值≥200mAU时开始收集，峰下降时，吸收值≥200mAU时停止收集)，收集液用2mol/L Tris调节pH至5.50±0.10，0.22μm滤器过滤。纯化的后的抗HER2/PD-1双特异性抗体经过SEC-HPLC分析，双抗纯度可以达到96.3％，同源二聚体的比例只有不到3％。
实施例6抗HER2/PD-1双特异性抗体亲和力检测实验-ELISA法
重组蛋白HER2(购自R&D公司，以下同)和PD-1(购自R&D公司，以下同)用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释成2μg/ml，96孔酶标板每孔添加100μl上述稀释后的蛋白溶液，4℃于湿盒内过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗3次，每次3分钟；将不同稀释度的抗HER2抗体(根据实施例1中所述抗HER2抗体序列并按照实施例1和实施例2方法制备得到，以下同)、抗PD-1抗体(根据实施例1中所述抗PD-1抗体序列并按照实施例1和实施例2方法制备得到，以下同)以及抗HER2/PD-1双特异性抗体100μ1加于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时；然后用洗涤缓冲液洗涤，加辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgGl抗体(Fc特异，购自Sigma公司)于各反应孔中，37℃孵育1小时，洗涤；于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml显色，37℃放置10分钟；于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05ml终止反应；置酶标仪上(SpectraMax i3Multi Mode Platform，美国ΒΙ0-ΤΕK公司)测定450nm波长处测定吸光值。
实验结果如图6和图7所示。结果表明：抗HER2/PD-1双特异性抗体既可结合HER2，也可结合PD-1，且与抗HER2抗体和抗PD-I抗体相比，抗HER2/PD-1双特异性抗体对两种靶点的结合力并没有因结构的改造而减弱。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州塞恩塔生物技术有限公司
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 447
<212> PRT
<213> 人
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 4
<211> 218
<212> PRT
<213> 人
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 6
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450

Claims (9)

1.一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以pCHO1.0为表达载体，构建分别表达抗Her2单克隆抗体、表达抗PD-1单克隆抗体的中华仓鼠卵巢细胞工程菌细胞株；
(2)培养所述工程菌细胞株，分别产抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体；
(3)将抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体组装，形成Her2/PD-1双特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，所述抗Her2单克隆抗体的重链、轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，所述抗PD-1单克隆抗体的重链、轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，步骤(2)培养工程菌细胞株的方法，是将二级种子细胞按(1.0±0.3)×106个/ml的接种密度稀释至3L细胞培养反应器中，3L细胞培养反应器中装有1L的基础培养基，设置搅拌转速为250～280r/min，pH设置为6.95±0.15，通过碳酸氢钠溶液和CO2调节pH；溶解氧设置为40±20％；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃；培养第5天降温至33.5±0.5℃；培养第14天收获；第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补加补料培养基A和补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，当葡萄糖浓度低于2.0～3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至4.0～5.0g/L。
5.根据权利要求4所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，所述基础培养基是Dynamis AGT 24.8g/L；所述葡萄糖浓缩液是200g/L的葡萄糖溶液；所述补料培养基A是CHO CD EfficientFeed A；所述补料培养基B是CHO CDEfficientFeed B。
6.根据权利要求4所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，步骤(2)还包括对抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体进行纯化的过程，是将工程菌的培养上清进行深层过滤去除细胞，收获澄清液，采用GE MabselectedSure填料，亲和纯化抗Her2抗体和抗PD-1抗体。
7.根据权利要求1～6任一所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，步骤(3)将纯化后的抗Her2抗体和抗PD-1抗体按照1：1比例混合，添加精氨酸和还原性谷胱甘肽至终浓度分别为10～200mM和60～140mM，用Tris调节pH至7.5～8.5，37℃孵育3～5小时。
8.根据权利要求1～7任一所述方法制备得到的抗Her2/PD-1双特异性抗体。
9.权利要求8所述的抗Her2/PD-1双特异性抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
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