CN111995685A - 一种靶向her2和pd-1的双特异性抗体及其应用 - Google Patents

一种靶向her2和pd-1的双特异性抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双功能抗体。该双功能抗体能够同时与人PD‑1抗原以及HER2抗原相结合、能够有效地抑制PD‑1和HER2与其相应的受体的结合、可以将T细胞特异性的靶向到HER2高表达的肿瘤组织中、激活T细胞，并产生抗肿瘤效应。本发明的双特异性抗体可应用于HER2阳性肿瘤的治疗。

Description

一种靶向HER2和PD-1的双特异性抗体及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫药物治疗领域。具体而言，本发明涉及到含有靶向PD-1分子的融合蛋白。更具体的涉及靶向HER2和PD-1的双特异性抗体以及其作为抗肿瘤药物的应用。
背景技术
双特异性抗体被定义为含有两个特异性抗原结合位点的人工抗体，其特点是将两个特异性抗体连接，这可以产生亲本单抗不具备的功能。现在进入临床实验中的双特异性抗体增多，且大部分集中在肿瘤治疗领域。根据双特异性抗体的治疗机制可以将其分为3种类型：(1)免疫细胞的招募和激活。将特定的免疫细胞(T细胞或NK细胞)重定向至肿瘤细胞并增强对肿瘤的杀伤力；(2)受体的共刺激或抑制。可以同时阻断两种不同通路而发挥独特的或重叠的功能；(3)促进蛋白复合物的形成。
程序性死亡受体1(PD-1)表达在成熟的T细胞、B细胞、单核细胞树突细胞等，其相应配体PD-L1、PD-L2则表达与巨噬细胞、上皮细胞等细胞表面。正常情况下，PD-1/PD-L1结合后抑制T细胞活化所需基因及细胞因子的转录和翻译，发挥负向调控T细胞活性的作用。在肿瘤微环境中肿瘤细胞利用PD-1/PD-L1通路抑制T细胞免疫活性，从而产生免疫逃逸并持续生长。靶向PD-1的抗体可以识别PD-1抗原并阻断PD-1/PD-L1通路，激活T细胞，并产生抗肿瘤效果。靶向免疫检查点的抗PD-1抗体因其具有适应症广泛且改善肿瘤免疫环境的特点而备受关注。比起其他的免疫增强方法如CTLA-4抑制剂，PD-1抑制剂有更好的客观反应率和更少的免疫相关不良反应，但是仍有许多患者药物治疗无效。
人表皮生长因子受体2(HER2)是重要肿瘤相关抗原，在乳腺癌和胃癌等癌症中过表达。靶向HER2的曲妥珠单抗(赫赛汀，US005821337A)虽然明显改善了适应症的临床结果，但是耐药性也十分明显。在一项针对HER2抗体耐药的乳腺癌患者的I/II期临床试验中，HER2抗体与PD-1抗体联合给药效果明显。
因此，在抑制HER2信号的基础上阻断PD-1/PD-L1通路，可以激活T细胞，增强免疫，更有效的杀伤HER2阳性细胞并且降低耐药性出现几率。
目前已有靶向HER2和PD-1的双特异性抗体公开，如CN109021110和WO2019153200A1。但是都采用的非对称结构的异源二聚体形式，对于单靶点双特异性抗体为单价抗体，且在生产过程中有重新组装的双特异性抗体的步骤将降低收率。在实际的生产和临床应用上仍需要进一步开发具有更优越性能的产品。
因此，本领域迫切需要开发一种结构稳定、特异性佳，并且具有优异的抗肿瘤效果的靶向HER2和PD-1的双特异性抗体。
发明内容
本发明的目的就是提供一种结构稳定、特异性佳，并且具有优异的抗肿瘤效果的靶向HER2和PD-1的双特异性抗体。
本发明提供了一种对称构型的四价双特异性抗体及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括：
(a)抗HER2抗体；和
(b)与所述抗HER2抗体相连接的抗PD-1抗体的单链可变区(single-chain FV,ScFv)。
在另一优选例中，所述抗HER2抗体和所述抗PD-1抗体的ScFv通过接头序列相连。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv连接至所述抗HER2抗体的选自下组的区域：重链可变区、重链恒定区，或其组合。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv连接至所述抗HER2抗体的重链恒定区的末端。
在另一优选例中，所述抗HER2抗体是人源化的。
在另一优选例中，所述PD-1抗体的ScFv是人源化的。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体是同源二聚体。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体是四价抗体。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体由抗HER2抗体和抗PD-1抗体的ScFv融合而成，且具有相互对称的两对肽链，每对肽链含有轻链L链和重链H链，所有的肽链均由二硫键相连，其中任意一对肽链从N端到C端具有式I所示的H链和L链的结构：
Figure BDA0002474829610000031
其中，
VH代表抗HER2抗体的重链可变区；
VL代表HER2抗体的轻链可变区；
CH1、CH2和CH3分别代表抗HER2抗体的重链恒定区CH1、CH2和CH3；
CL代表抗HER2抗体的轻链恒定区；
ScFv代表抗PD-1抗体的ScFv；
L为接头序列；
“～”代表二硫键；
“-”代表肽键；
其中，所述双特异性抗体具有同时结合HER2和结合PD-1的活性。
在另一优选例中，所述接头序列的氨基酸序列为(G4S)n或其变体，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，优选地，n＝4。
在另一优选例中，所述(G4S)n的变体包括：将所述序列中性能相近或相似的氨基酸进行取代所获得的(G4S)n接头序列的变体，如将一个或多个S分别突变为T；或者在所述序列中插入1-3个氨基酸。
在另一优选例中，所述接头序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。
在另一优选例中，所述接头序列的氨基酸序列可以是其他柔性序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:51或52所示。
在另一优选例中，所述接头序列的氨基酸序列还可以是刚性序列，例如(EA3K)n，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，优选地，n＝4。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv包括抗PD-1的重链可变区和抗PD-1的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv还包括位于抗PD-1抗体的重链可变区和抗PD-1抗体的轻链可变区之间的用于连接所述重链可变区和轻链可变区的连接肽。
在另一优选例中，所述连接肽的氨基酸序列为(G4S)n，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，优选地，n＝4。
在另一优选例中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv中，所述的抗PD-1抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15或17所示，或与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15或17所示的序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性；并且所述抗PD-1抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16或18所示，或与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16或18所示的序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv中，所述的抗PD-1抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、9或17所示，或与SEQ ID NO:3、9或17所示的序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性；并且所述抗PD-1抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、10或18所示，或与SEQ ID NO:4、10或18所示的序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv中，所述的抗PD-1抗体的重链可变区的氨基酸序列中，具有基于SEQ ID NO:9的选自下组的突变：第44位氨基酸残基被突变为Cys、第89位氨基酸残基突变为Thr、第100位氨基酸残基突变为Cys、第108位氨基酸残基突变为Thr，或其组合。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv中，所述的抗PD-1抗体的重链可变区的氨基酸序列中，具有基于SEQ ID NO:10的以下突变：第100位氨基酸残基突变为Cys。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv中，所述的抗PD-1抗体的重链可变区的氨基酸序列中，具有基于SEQ ID NO:3的以下突变：第44位氨基酸残基被突变为Cys。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv中，所述的抗PD-1抗体的重链可变区的氨基酸序列中，具有基于SEQ ID NO:4的选自下组的突变：第9位氨基酸残基被突变为Ala、第10位氨基酸残基被突变为Phe、第100位氨基酸残基突变为Cys，或其组合。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv中，所述的抗PD-1抗体的重链可变区的氨基酸序列中，具有基于SEQ ID NO:17的以下突变：第44位氨基酸残基被突变为Cys。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv中，所述的抗PD-1抗体的重链可变区的氨基酸序列中，具有基于SEQ ID NO:18的选自下组的突变：第9位氨基酸残基被突变为Ala、第10位氨基酸残基被突变为Phe、第100位氨基酸残基突变为Cys，或其组合。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:20-28所示，或与SEQ ID NO:20-28的序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。
在另一优选例中，所述抗PD-1抗体的ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
在另一优选例中，所述抗HER2抗体的重链恒定区CH1、CH2和CH3、以及轻链恒定区CL均来源于人IgG1或IgG4，优选为人IgG4。
在另一优选例中，所述式I中的VH-CH1-CH2-CH3区段的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，或与SEQ ID NO:29的序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。
在另一优选例中，所述式I中的VL-CL区段的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，或与SEQ ID NO:30的序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。
在另一优选例中，所述双特异性抗体的H链具有如SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38或39所示的氨基酸序列；并且所述双特异性抗体的L链具有如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述双特异性抗体还含有(优选偶联有)可检测标记物、靶向标记、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述双特异性抗体偶联有肿瘤靶向标记偶联物。
在另一优选例中，本发明所述双特异性抗体还包括所述抗体的活性片段和/或衍生物，所述衍生物含有所述双特异性抗体的活性片段和/或所述衍生物保留了70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的抗HER2和/或抗PD-1活性。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的双特异性抗体。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有如SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、47、48或49所示的编码所述双特异性抗体的H链的序列；并且具有如SEQ ID NO:40所示的编码所述双特异性抗体的L链的序列。
在另一优选例中，所述的多核苷酸中，编码H链的多核苷酸和编码L链的多核苷酸的比例为1:2至3:1，优选地为2:1。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体同时含有如本发明第二方面所述多核苷酸中的所有多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体分别含有如本发明第二方面所述的编码H链的多核苷酸和编码L链的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体为表达载体。
在另一优选例中，所述载体包括质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的双特异性抗体的方法，包括步骤：
(i)在合适的条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，获得含有如本发明第一方面所述双特异性抗体的混合物；
(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离，从而获得如本发明第一方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述纯化可以通过蛋白A亲和柱纯化分离获得目标抗体。
在另一优选例中，所述经过纯化分离后的目标抗体纯度大于95％，大于96％、大于97％、大于98％、大于99％，优选为100％。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(I)如本发明第一方面所述的双特异性抗体；和
(II)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物中还含有抗肿瘤剂。
在另一优选例中，所述药物组合物为单元剂型。
在另一优选例中，所述抗肿瘤剂包含紫杉醇、多柔比星、环磷酰胺、阿西替尼、乐伐替尼、或派姆单抗，喜树碱衍生物或Auristatin E及其类似物。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂可以与所述双特异性抗体单独存在于独立的包装内，或所述抗肿瘤剂可以与所述双特异性抗体偶联。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型。
在另一优选例中，所述的胃肠外给药剂型包括静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射、颅内注射、或腔内注射。
在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
(a)如本发明第一方面所述的双特异性抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒，或其它活性物质。
在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的双特异性抗体或如本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备治疗肿瘤的药物组合物。
在另一优选例中，所述肿瘤包括实体肿瘤、淋巴瘤和/或白血病。
在另一优选例中，所述实体瘤包括恶性肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤或实体瘤选自下组：卵巢癌、结直肠癌、恶性黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、肾癌、头颈鳞癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、或其组合。
在本发明的第九方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：向需要的对象施用安全有效量的如本发明第一方面所述的抗体、或如本发明第六方面所述的药物组合物、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了ELISA法检测的抗PD-1单抗阻断PD-1/PD-L1的效果。
图2显示了ELISA法检测的抗PD-1单抗与PD-1抗原的结合。
图3显示了BLI法检测的抗PD-1单抗T16#的亲和力。
图4显示了ELISA法检测的抗PD-1单抗T16#光照前后与PD-1抗原的结合。
图5显示了双特异性抗体的结构示意图。其中，A图为抗PD-1/HER2双特异性抗体结构示意图；B图为抗HER2/PD-1双特异性抗体结构示意图。
图6显示了双特异性抗体与细胞的结合。其中，A图为双特异性抗体与CHO/PD-1细胞的结合；B图为双特异性抗体与NCI-N87细胞的结合。
图7显示了BATDA法检测的抗HER2/PD-1双特异性抗体对T细胞的ADCC作用。
图8显示了SE-HPLC测定的抗HER2/PD-1双特异性抗体的纯度。
图9显示了DSF法测定的抗HER2/PD-1双特异性抗体的热稳定性。
图10显示了ELISA法测定的抗HER2/PD-1双特异性抗体与抗原的结合。其中，A图为抗HER2/PD-1双特异性抗体与抗原PD-1的结合；B图为抗HER2/PD-1双特异性抗体与抗原HER2的结合。
图11显示了流式细胞术测定的抗HER2/PD-1双特异性抗体与细胞的结合。其中，A图为抗HER2/PD-1双特异性抗体与CHO/PD-1细胞的结合；B图为抗HER2/PD-1双特异性抗体与HER2阳性肿瘤细胞的结合。
图12显示了ELISA法测定的抗HER2/PD-1双特异性抗体同时结合抗原PD-1和HER2结合。
图13显示了流式细胞术测定的抗HER2/PD-1双特异性抗体对CHO/PD-1细胞和NCI-N87细胞的拉近。
图14显示了HTRF测定的抗HER2/PD-1双特异性抗体对PD-1/PD-L1通路的阻断。
图15显示了MLR检测的抗HER2/PD-1双特异性抗体对T细胞的活化。
图16显示了CCK8法检测的抗HER2/PD-1双特异性抗体对NCI-N87细胞的抑制。
图17显示了抗HER2/PD-1双特异性抗体对皮下移植胃癌NCI-N87肿瘤的裸鼠模型的疗效。
图18显示了抗HER2/PD-1双特异性抗体对皮下移植EMT-6/HER2肿瘤的人源PD-1敲入小鼠模型的疗效。
图19显示了抗HER2/PD-1双特异性抗体对皮下移植胃癌NCI-N87肿瘤NCG的小鼠模型的疗效。
图20显示了实施例13中小鼠模型实验中的生存曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种能够同时靶向HER2和PD-1的双特异性抗体，其由抗HER2抗体和抗PD-1抗体的ScFv串联而成。本发明的双特异性抗体属于同源二聚体。实验结果表明，本发明的双特异性抗体的稳定性好、对抗原PD-1和HER2均具有较高的亲和力、能够有效地阻断PD-1/PD-L1通路、能够有效活化T细胞，从而有效地抑制肿瘤。因此，本发明的双特异性抗体可以被开发为一种疗效优越的抗肿瘤药物。在此基础上完成了本发明。
术语
通常，“抗体”也称为“免疫球蛋白“其可以是天然或常规的抗体，其中两条重链通过二硫键彼此连接且每条重链与轻链通过二硫键连接。存在两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。存在五种主要的重链种类(或同型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每种链包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，重链可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区都决定对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定区(CH)赋予重要的生物性质如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性取决于抗体结合位点和抗原决定区间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高度可变或框架区(FR)的残基影响整体结构域结构且进而影响结合位点。互补决定区或CDR指共同限定结合亲和力和天然免疫球蛋白结合位点天然Fv区的特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个CDR，分另称为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。常规抗体抗原结合位点因此包括六个CDR，包含来自每个重链和轻链v区的CDR集合。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈b-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIHPubl.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“框架区(FR)”指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，术语″人框架区″是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”指针对特定抗原的具有单一氨基酸组成的抗体分子，且不应理解为需要通过任何特定方法产生该抗体。单克隆抗体可由B细胞或杂交瘤的单一克隆产生，但还可为重组的，即通过蛋白工程产生。
如本文所用，术语“抗原”或“靶抗原”指能够由抗体或抗体样结合蛋白所结合的分子或分子的部分。该术语进一步指能够用于动物以产生能够与该抗原的表位结合的抗体的分子或分子的部分。靶抗原可具有一个或多个表位。对于每种由抗体或由抗体样结合蛋白识别的靶抗原，抗体样结合蛋白能够与识别靶抗原的完整抗体竞争。
如本文所用，术语“接头”、“连接肽”、“衔接物”可互换使用，是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。合适的接头实例包括单甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)残基，接头中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。
双特异性抗体
如本文所用，术语“双特异性抗体”、“双功能抗体”“本发明抗体”、“本发明双抗”、“双抗”、“双功能融合抗体”可互换使用，是指本发明第一方面所述的可同时靶向HER2和PD-1的抗HER2/PD-1双特异性抗体。
在一优选的实施方式中，所述的双特异性抗体由抗HER2抗体和抗PD-1抗体的ScFv融合而成，且具有相互对称的两对肽链，每对肽链含有轻链L链和重链H链，所有的肽链均由二硫键相连，其中任意一对肽链从N端到C端具有式I所示的H链和L链的结构：
Figure BDA0002474829610000111
其中，
VH代表抗HER2抗体的重链可变区；
VL代表HER2抗体的轻链可变区；
CH1、CH2分辨代表抗HER2抗体的重链恒定区CH1和CH2；
CL代表抗HER2抗体的轻链恒定区；
ScFv代表抗PD-1抗体的ScFv；
L为无或接头序列；
“～”代表二硫键；
“-”代表肽键；
其中，所述双特异性抗体具有同时结合HER2和结合PD-1的活性。
优选地，所述双特异性抗体的H链具有如SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38或39所示的氨基酸序列；并且所述双特异性抗体的L链具有如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
本发明双抗不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明双抗指具有抗HER2以及抗PD-1活性的、包括两条上述式I结构的抗体。该术语还包括具有与本发明双抗相同功能的、包括两条上述式I结构的抗体的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明双抗的活性片段和活性衍生物。
该双抗的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“本发明双抗的保守性变异体”指与本发明双抗的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
编码核酸和表达载体
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明的核酸(以及核酸组合)可用于在合适的表达系统产生本发明的重组抗体。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC、0.1％SDS、60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺、0.1％小牛血清/0.1％Ficoll、42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌；链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的双抗可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.肿瘤治疗剂(例如，顺铂)或任何形式的抗肿瘤药物等。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射(如腹膜内)、颅内注射、或腔内注射。
本发明的药物组合物可直接用于结合HER2或PD-1抗原分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单域抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
1)本发明优化了双特异性抗体的稳定性。
2)本发明提供的双特异性抗体对抗原PD-1和HER2均具有较高的亲和力。
3)本发明提供的双特异性抗体能够有效地阻断PD-1/PD-L1通路。
4)本发明提供的双特异性抗体能够有效活化T细胞。
5)本发明可以特异性的拉近HER2阳性肿瘤细胞与活化T细胞的距离。
6)本发明提供的双特异性抗体与单独的PD-1或HER2抗体相比可以更有效地抑制HER2阳性肿瘤生长。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：抗PD-1抗体的人源化
抗PD-1人鼠嵌合抗体，其可变区(SEQ ID NO:1和2)来自于杂交瘤筛选获得，恒定区来自于人源抗体IgG。嵌合抗体需要进行人源化，也就是将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，目的是有效降低抗体在临床使用中的免疫源性。根据序列合成CDR区引物，与人源抗体的多样的可变区框架组合成VH和VL。应用PCR和DNA重组技术构建到带有CH1或者Ck载体上，电转到大肠杆菌中构建人源化Fab噬菌体库。测定噬菌体库滴度后，用抗原人源PD-1蛋白进行多轮的吸附-洗脱-扩增，特异性噬菌体抗体被富集。挑选克隆进行ELISA检测与抗原PD-1的结合并测定可变区序列，选择其中8个活性较高的抗原结合表位，分别是T1#、T4#、T8#、T16#、T68#、T77#、T79#和T82#，可变区的序列分别为SEQ ID NO:2-18。
实施例2：比较抗PD-1抗体
将人源化PD-1抗体的可变区序列与人源IgG恒定区连接并构建质粒，经过瞬时转染细胞表达蛋白，使用高效液相排阻液相色谱(SE-HPLC)检测纯度。分子水平比较8个抗PD-1抗体与抗原PD-1的结合与阻断PD-1和PD-L1的能力。ELISA法测定抗体的阻断活性，操作为：在96孔板底部包被抗原PD-1蛋白，向其中加入梯度稀释的抗PD-1抗体，再加入生物素化的PD-L1，当HRP-Streptavidin结合生物素后用TMB显色，最后计算抗体的抑制率(如图1)。ELISA法测定抗体的结合活性，操作为：在96孔板底部包被protein A蛋白，向其中加入抗PD-1抗体，然后加入度稀释的生物素化的抗原PD-1蛋白，当HRP-Streptavidin结合生物素后用TMB显色，最后计算EC50(如图2)。BLI法测定抗体的结合活性，操作为：将抗PD-1抗体固定在protein A探针上，先是与梯度稀释的抗原PD-1结合，然后浸入到空白缓冲液中解离，用软件计算平衡解离常数KD值(如图3)，KD值越小抗体的结合活性越好。光稳定性实验是将抗体暴露在光下不低于120万lux和近紫外线能量不低于200瓦时/平方米的光线下，比较光照对样品活性影响如图4所示。这8个抗PD-1抗体中T1#、T16#和T82#的纯度、活性以及稳定性较好。
实施例3：双特异性抗体的克隆和表达
以IgG-scFv构型构建2个靶向HER2和PD-1的双特异性抗体(如图5)。一个是将靶向PD-1的IgG抗体和靶向HER2单链抗体用衔接物(SEQ ID NO:19)连接，构成抗PD-1/HER2双特异性抗体。另一个是将靶向HER2的IgG抗体和靶向PD-1单链抗体用衔接物(SEQ ID NO:10)连接，构成抗HER2/PD-1双特异性抗体。单链抗体scFv是将亲本抗体(如抗PD-1抗体或者抗HER2抗体)的VH和VL用(G4S)4链连接形成。构建质粒并表达纯化抗体。如图6所示，流式细胞术检测到抗HER2/PD-1双特异性抗体中靶向PD-1的scFv的对抗原的亲和力明显降低；抗PD-1/HER2双特异性抗体中靶向HER2的scFv的对抗原几乎不结合。
选取抗PD-1抗体可变区构建单链抗体，链接在抗HER2抗体的C端参照IgG-scFv构型(如图5B)构建抗HER2/PD-1双特异性抗体。考虑到虽然IgG1亚型可以增加抗体对HER2阳性肿瘤的杀伤，但是也要考虑到对表达PD-1的T细胞损伤。表达IgG1和IgG4两种抗HER2/PD-1双特异性抗体，用BATD法检测抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，实验结果如图7所示。抗HER2/PD-1双特异性抗体IgG4更有利于药物的安全性。
因为附加scFv使得抗体不稳定，且容易产生聚集。现有多种方法进行scFv序列的优化，目的是提高双特异性抗体的稳定性。例如，scFv的VH44和VL100突变为半胱氨酸形成scFv链间二硫键；DS软件模拟scFv空间结构后，预测有聚集趋势的氨基酸位点并进行突变；对比抗PD-1抗体可变区序列寻找优化位点。利用同源重组技术将合成的scFv序列与靶向HER2的IgG序列(SEQ ID NO:29)连接为双特异性抗体重链，与轻链(SEQ ID NO:30)共转染HEK293蛋白表达系统，获得如表1所示抗体。
表1.HER2/PD-1双特异性抗体
Figure BDA0002474829610000181
Figure BDA0002474829610000191
实施例4：双特异性抗体的纯化
将重链和轻链采用瞬时转染或者稳定转染的方案转染哺乳动物细胞如HEK293。细胞培养液高速离心后，利用亲和填料protein A可与抗HER2/PD-1双特异性抗体的Fc结合的特性纯化蛋白。纯化后的蛋白置于超滤浓缩管中(标准截留分子量为50KDa)，将溶液置换为PBS，pH7.2。
高效液相排阻液相色谱(SE-HPLC)检测纯度。将蛋白溶液稀释至1mg/ml后，上样20μL，使用高效液相排阻液相色谱柱MAbPacTM SEC-1(7.8mm×300mm，Thermo FisherScientific)检测。流动相为pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液，含有150mM氯化钠。流速为0.6ml/min，并使用280nm紫外检测器获得信号值。如图8所示，主峰为双特异性抗体的单体。
另外，经检测，HER2/PD-1T16#、HER2/PD-1T16#s-s、HER2/PD-1T16#89T、HER2/PD-1T16#108T、HER2/PD-1T16#89&108T、HER2/PD-1T1#s-s、HER2/PD-1T82#s-s、HER2/PD-1T1#AF、HER2/PD-1T82#AF的纯度值分别为86.38％、92.82％、91.92％、92.49％、92.11％、84.04％、90.03％、84.10％和90.00％。
实施例5：比较双特异性抗体的稳定性
差式扫描荧光(DSF)是检测在温度逐渐升高时蛋白与荧光染料宝石橙蛋白染色剂(SYPRO orange)结合量的变化曲线。利用荧光定量PCR仪程序性升温并测定荧光值，从而判断蛋白的结构变化。从天然状态到变形状态的中点温度为熔化温度(Tm值)，Tm值在一定条件下将蛋白质的稳定性进行量化。具体操作为：将蛋白样品用PBS稀释到终浓度为2μM与250×宝石橙蛋白染色剂，体积按照24:1混合。放置在qPCR仪中从25℃至95℃程序性升温，数据处理后获得Tm值如图9所示。HER2/PD-1T16#、HER2/PD-1T16#s-s、HER2/PD-1T16#89T、HER2/PD-1T16#108T、HER2/PD-1T16#89&108T、HER2/PD-1T1#s-s、HER2/PD-1T82#s-s、HER2/PD-1T1#AF、HER2/PD-1T82#AF的Tm值分别为62.70℃、63.90℃、63.75℃、63.90℃、63.90℃、62.70℃、60.30℃、64.65℃、60.60℃。
本次加速试验是考察抗体在高温下的纯度和聚集体变化。放置条件为60℃条件加热1小时，使用SE-HPLC测定加热后纯度变化，以及使用ANS染料判断加热后的聚集体变化情况。
从结果可知，scFv增加链间二硫键后抗体的稳定性更好；scFv的轻链9位和10位突变为Ala和Phe其稳定性更好，如HER2/PD-1T1#AF和HER2/PD-1T82#AF。
体外活性评价
实施例6：双特异性抗体与靶点结合
酶联吸附免疫(ELISA)检测抗体与抗原结合。检测流程如下：pH7.2的PBS稀释抗原重组人HER2蛋白(近岸蛋白，货号：CP69)或者重组人PD-1蛋白(近岸蛋白，货号：CX91)至50nM，50μL/孔包被96孔板，37℃孵育1.5小时。PBS清洗3次。封闭液200μL/孔封闭96孔板，37℃放置1.5小时。PBS清洗3次。加入用封闭液梯度稀释的抗体，包括双特异性抗体和对照抗体，50μL/孔室温孵育1小时。PBST清洗3次。加入用封闭液1:2000稀释的HRP Goat AntiHuman IgG，50μL/孔室温孵育1小时。PBST清洗3次。加入TMB溶液50μL/孔，室温孵育5分钟后加入50μL/孔的2M硫酸终止反应。酶标仪读取450nm波长的吸光度值。如图10所示，抗HER2/PD-1双特异性抗体对抗原PD-1(A)和HER2(B)有较高的亲和力。
流式细胞术(FCM)检测抗体分别与CHO/PD-1稳转株细胞和HER2高表达的癌症细胞结合。1×106个细胞被收集，PBS清洗2次。加入1μg抗体至终体系500μL，孵育30分钟。PBS清洗2次。加入1μg PE anti-human IgG Fc Antibody至终体系500μL，避光孵育15分钟。流式细胞仪读取荧光强度。如图11所示，抗HER2/PD-1双特异性抗体与表达PD-1抗原的CHO/PD-1细胞以及表达HER2抗原的NCI-N87和SK-BR-3有结合。
实施例7：双特异性抗体与靶点同时结合
酶联吸附免疫(ELISA)检测抗体与2个抗原同时结合。pH7.2的PBS稀释抗原重组人HER2蛋白至1μg/mL，50μL/孔包被96孔板，37℃孵育1.5小时。PBS清洗3次。封闭液200μL/孔封闭96孔板，37℃放置1.5小时。PBS清洗3次。加入用封闭液梯度稀释的抗体，包括双特异性抗体和对照抗体，50μL/孔室温孵育1小时。PBST清洗3次。加入被生物素标记的PD-1蛋白，用封闭液稀释至0.5μg/mL，50μL/孔室温孵育1小时。PBST清洗3次。加入用封闭液1:2000稀释的streptavidin HRP，50μL/孔室温孵育1小时。PBST清洗3次。加入TMB溶液50μL/孔，室温孵育5分钟后加入50μL/孔的2M硫酸终止反应。酶标仪读取450nm波长的吸光度值。如图12所示，抗HER2/PD-1双特异性抗体可同时结合抗原HER2和PD-1，而抗PD-1单抗和抗HER2单抗不能同时结合。
流式细胞术(FCM)检测抗HER2/PD-1双特异性抗体与CHO/PD-1稳转株细胞和HER2高表达的NCI-N87细胞表面的抗原同时结合。CFSE染料标记NCI-N87细胞。方法参考说明书，如下：PBS重悬NCI-N87细胞，在PBS清洗2次后将细胞密度调整为1×106个/mL。加入CFSE染料至终浓度1μM，混匀后37℃避光孵育10分钟。1000rpm离心5分钟，收集细胞。预冷的完全培养基(含有10％的FBS)重悬细胞，冰上孵育5分钟。完全培养基清洗3次。Proliferation 670染料标记CHO/PD-1细胞。方法参考说明书，如下：PBS重悬CHO/PD-1细胞，在PBS清洗2次后将细胞密度调整为1×106个/mL。加入Proliferation 670染料至终浓度5μM，混匀后37℃避光孵育10分钟。1000rpm离心5分钟，收集细胞。预冷的完全培养基(含有10％的FBS)重悬细胞，冰上孵育5分钟。完全培养基清洗3次。标记后，两组细胞分别用预冷的PBS(含有1％FBS)清洗细胞2次，至细胞密度为5×106个/mL。将NCI-N87细胞和CHO/PD-1细胞按1:1混合。取混合后细胞100μl并加入抗体50nM，用PBS(含有1％FBS)补足终体积至200μL。4℃混合孵育30分钟。预冷的PBS(含有1％FBS)清洗细胞2次后，用500μL预冷的PBS(含有1％FBS)重悬细胞，用流式细胞仪检测荧光强度。如图13所示，抗HER2/PD-1双特异性抗体将CHO/PD-1稳转株细胞和HER2高表达的NCI-N87细胞拉近。
实施例8：双特异性抗体对PD-1/PD-L1通路的阻断
均相时间分辨荧光技术(HTRF)检测抗HER2/PD-1双特异性抗体对PD-1/PD-L1通路的阻断作用。带有不同标签的Tag1-PD-L1和Tag2-PD-1蛋白各4μL，并加入2μL梯度稀释的抗体。室温孵育15分钟后加入10μL标签抗体溶液，其中anti-Tag1-Eu3+和anti-Tag2-XL665按照1:1混合后。室温孵育2小时后，读取665nm和620nm波长处荧光值。采用665nm/620nm×104计算数据。如图14所示，抗HER2/PD-1双特异性抗体中抗PD-1的scFv部分仍能较好的阻断PD-1/PD-L1通路。
实施例9：双特异性抗体对T细胞的活化
淋巴细胞混合反应(MLR)检测抗HER2/PD-1双特异性抗体对T细胞的活化。人树突状细胞(DC)得获得：使用CD14磁珠分选PBMC细胞，分选获得的CD14+单核细胞经过500ng/mLIL-4和500ng/mL GM-CSF刺激5天。每2天半量换液一次，并补足细胞因子。加入30ng/mLTNF-α、300ng/mL IL-1β、300ng/mL IL-6、3ug/mL PGE2，共刺激2天，诱导DC成熟。T细胞的获取：CD4磁珠分选PBMC细胞，此PBMC细胞与DC获取的PBMC细胞来源不同。将1×105个CD4+T细胞与1×104个DC细胞接种于96孔板中，分组设置对照及加药组，加入抗体后混合培养5天。此模型中细胞因子IFN-γ的释放代表T细胞的活化，使用ELISA试剂盒测试上清液中IFN-γ含量。如图15所示，抗HER2/PD-1双特异性抗体显示与阳性抗体相当的IFN-γ释放，证明其可活化T细胞。
实施例10：双特异性抗体抑制HER2阳性肿瘤细胞生长
CCK8检测加入抗体对肿瘤细胞的生长抑制。取生长状态良好的对数生长期细胞，铺板中置于细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后加入梯度稀释的抗体培养72小时。更换新鲜培养基每孔加入20μL的CCK8检测液，置于培养箱中继续培养2小时，酶标仪测定450nm处的吸光度值。按公式计算生长抑制率＝[(对照组-实验组)/对照组]×100％，以浓度为横坐标，生长抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制率柱状图。结果如图16所示。
体内药效评价
实施例11：双特异性抗体对皮下移植胃癌NCI-N87肿瘤的裸鼠模型的疗效。
实验所用裸鼠为雌性BALB/c(Charles river)。每只小鼠腋下皮下接种5×106个HER2高表达的NCI-N87细胞，分为阴性对照组，阳性对照组(曲妥珠单抗)和样品组(抗HER2/PD-1双抗)，每组10只老鼠。给药浓度为50nmol/kg，即对照组给药浓度为7.5mg/kg和双抗为10mg/kg，给药方式为腹腔给药。每周给药2次并测量瘤体积。肿瘤体积的计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝长边(mm)×短边(mm)2/2。如图17所示，抗HER2/PD-1双特异性抗体可明显抑制HER2阳性肿瘤生长，且与曲妥珠单抗相当。
实施例12：双特异性抗体对皮下移植肿瘤的人源PD-1敲入小鼠模型的疗效
将人源HER2序列慢病毒转入EMT-6细胞中，获得EMT-6/HER2稳转细胞株。流式细胞术确定EMT-6/HER2细胞过表达HER2。在EMT-6/HER2细胞移植瘤小鼠模型中，靶向HER2曲妥珠单抗是无法抑制肿瘤生长的，即此模型不可评价抗HER2抗体。但HER2的过表达利于增加肿瘤的免疫原性。
实验所用小鼠为雌性PD-1敲入的BALB/c(集萃药康)。每只小鼠腋下皮下接种5×105个EMT-6/HER2细胞，分为阴性对照组，阳性对照组(派姆单抗)和样品组(抗HER2/PD-1双抗)，每组7只老鼠。给药浓度为50nmol/kg，即对照组给药浓度为7.5mg/kg和双抗为10mg/kg，给药方式为腹腔给药。每周给药2次。称重并测量瘤体积。肿瘤体积的计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝长边(mm)×短边(mm)2/2。如图18所示，抗HER2/PD-1双特异性抗体的可抑制EMT-6/HER2肿瘤生长，且与帕姆单抗相当。
实施例13：双特异性抗体对皮下移植胃癌NCI-N87肿瘤NCG的小鼠模型的疗效
实验所用NCG鼠(集萃药康)为雌性，6-8周。每只小鼠腋下皮下接种5×106个NCI-N87细胞，分为8只/组。第七天在同一位置注射人PBMC(妙通生物)5×105个细胞，实现免疫人源化。然后腹腔给药，给药浓度为50nmol/kg，即对照抗体给药浓度为7.5mg/kg、双抗为10mg/kg以及两药联用为每个抗体各7.5mg/kg，共给药6次。称重并测量瘤体积，肿瘤体积的计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝长边(mm)×短边(mm)2/2。如图19、图20所示，抗HER2/PD-1双特异性抗体与抗HER2单抗和抗PD-1单抗药物联用相当的抑制肿瘤的效果，抗HER2/PD-1双抗安全性可能优于两抗体联用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
厦门大学
<120> 一种靶向HER2和PD-1的双特异性抗体及其应用
<130> P2020-0631
<160> 52
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
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195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
210 215 220
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 21
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Gly Gly Gly Ala Arg Thr His Tyr Pro Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Ile Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr Thr Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly Asp Lys Val Asn Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe Met
165 170 175
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Arg Ser Ala Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
210 215 220
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 22
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Gly Gly Gly Ala Arg Thr His Tyr Pro Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Ile Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr Thr Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly Asp Lys Val Asn Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe Met
165 170 175
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Arg Ser Ala Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
210 215 220
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 23
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Gly Gly Gly Ala Arg Thr His Tyr Pro Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Ile Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr Thr Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly Asp Lys Val Asn Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe Met
165 170 175
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Arg Ser Ala Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
210 215 220
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 24
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Gly Gly Gly Ala Arg Thr His Tyr Pro Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Ile Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr Thr Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly Asp Lys Val Asn Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe Met
165 170 175
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Arg Ser Ala Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
210 215 220
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 25
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Phe
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Gly Gly Gly Gly Arg Thr His Tyr Pro Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Gly Thr Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe Met
165 170 175
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Arg Ser Ala Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
210 215 220
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 26
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Gly Gly Gly Gly Arg Thr His Tyr Pro Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe Met
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His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
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Arg Ser Ala Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 27
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Phe
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Gly Gly Gly Gly Arg Thr His Tyr Pro Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Gly Thr Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe Met
165 170 175
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Arg Ser Ala Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
210 215 220
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 28
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Gly Gly Gly Gly Arg Thr His Tyr Pro Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe Met
165 170 175
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Arg Ser Ala Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 29
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
450 455 460
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
465 470 475 480
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Asp Met
485 490 495
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe
500 505 510
Ile Gly Gly Gly Gly Ala Arg Thr His Tyr Pro Asp Ala Val Lys Gly
515 520 525
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
530 535 540
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
545 550 555 560
His Gly Ile Gly Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
565 570 575
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser
595 600 605
Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly Asp Lys Val Asn Ile Ser Cys
610 615 620
Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Ser Phe Met His Trp
625 630 635 640
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser
645 650 655
Ala Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
660 665 670
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val
675 680 685
Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Phe Gly Gly
690 695 700
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
705 710
<210> 32
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
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355 360 365
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<400> 37
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Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
705 710
<210> 38
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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485 490 495
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515 520 525
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser
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690 695 700
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<210> 39
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
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1 5 10 15
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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275 280 285
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<210> 40
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
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<210> 41
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
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<210> 42
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
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<210> 43
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc caggaggctc tctgagactg 60
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tccggtggcg gtggatctgg gggaggtggc tcgggaggag gtggttcagg cggcggaggc 1800
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aacatcagct gcagggccag taagagcgtg gacaactacg gatactcttt catgcactgg 1920
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<210> 44
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc caggaggctc tctgagactg 60
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cttcaaatga atagtctgag agctgaggat accgctgtgt actattgttc tagatggggc 300
ggagacggct tctatgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac ggtttctagt 360
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tggaactcag gagcactgac cagcggagtg cacacctttc ctgctgttct gcagtcctcc 540
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ggagtggagg tgcacaacgc taagaccaag ccaagagagg agcagtttaa tagcacatac 900
cgggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacgggaa ggagtacaag 960
tgtaaggtga gcaacaaggg cttaccatcc agcattgaga agaccatttc caaggccaag 1020
gggcagccgc gggagcccca ggtgtacacc ctgccaccta gccaggagga gatgaccaag 1080
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gacgggagct tcttcctgta ctcccggctg accgtggata agagccgctg gcaggagggc 1260
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ctgagcctga gccctggcaa gggcggagga ggcagcggag gcggcggcac cggcggggga 1380
ggctctgagg tgcagctggt ggagtccggc gggggcctgg tgaagcctgg aggctctctg 1440
cgcctgtcct gcgccgcctc aggctttacc tttagccggt ttgacatgag ctgggtgagg 1500
caggcccctg gcaagtgcct ggagtgggtg ggcttcatcg gcggcggggg cgcccggaca 1560
cactaccccg acgccgtgaa gggccggttc accatcagcc gcgataatag caagaatacc 1620
ctgtacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg ccctgtacta ctgcgcccgc 1680
cacggcatcg gcaccggcgc catggattac tggggccagg ggaccaccgt gaccgtgagc 1740
tccggtggcg gtggatctgg gggaggtggc tcgggaggag gtggttcagg cggcggaggc 1800
agtgagacca ccctgaccca gagccccgcc ttcatgagcg ccacccctgg cgacaaggtg 1860
aacatcagct gcagggccag taagagcgtg gacaactacg gatactcttt catgcactgg 1920
taccagcaga agccaggcca ggccccccgc ctgctgatct ataggtccgc caacctggcc 1980
agcggcgtgc ccgataggtt tagcggcagc ggctctggca ccgatttcac cctgaagatt 2040
agcagggtgg aggccgagga tgtgggcgtt tattactgcc agcagagcaa cgaggaccca 2100
accttcggct gcggcacaaa gctggagatc aagtaa 2136
<210> 45
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc caggaggctc tctgagactg 60
agctgtgctg ctagcggctt taatattaag gatacttata ttcattgggt gagacaggcc 120
cctggcaaag gtctggaatg ggtcgctaga atctatccaa ctaatggcta tactagatat 180
gctgactccg tgaaaggaag gtttacaatc agtgccgaca cctctaaaaa caccgcctac 240
cttcaaatga atagtctgag agctgaggat accgctgtgt actattgttc tagatggggc 300
ggagacggct tctatgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac ggtttctagt 360
gctagtacta aaggtccttc agtgtttcct ttagcaccat gcagtagatc aacttctgag 420
agcaccgctg ctttaggctg tttagtgaaa gattatttcc ctgaacccgt gactgtgtca 480
tggaactcag gagcactgac cagcggagtg cacacctttc ctgctgttct gcagtcctcc 540
ggcctgtaca gcctgagctc tgtggtgacc gtgccctcca gctctctggg caccaagacc 600
tacacctgca acgtggacca taagccctct aacacaaagg tggacaaaag agtggagagc 660
aagtacggcc ctccttgccc accctgcccc gcacctgagt ttctgggggg ccctagcgtg 720
tttctgtttc cacccaagcc caaggacaca ctgatgatca gcaggacccc cgaggtgacc 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggac cccgaggtgc agtttaattg gtacgtggac 840
ggagtggagg tgcacaacgc taagaccaag ccaagagagg agcagtttaa tagcacatac 900
cgggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacgggaa ggagtacaag 960
tgtaaggtga gcaacaaggg cttaccatcc agcattgaga agaccatttc caaggccaag 1020
gggcagccgc gggagcccca ggtgtacacc ctgccaccta gccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttttacc ccagcgacat cgcagtggag 1140
tgggagagca acggccagcc tgagaataac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 1200
gacgggagct tcttcctgta ctcccggctg accgtggata agagccgctg gcaggagggc 1260
aacgtgttta gctgcagcgt gatgcacgag gccttgcaca accactacac tcagaagtcc 1320
ctgagcctga gccctggcaa gggcggagga ggcagcggag gcggcggcac cggcggggga 1380
ggctctgagg tgcagctggt ggagtccggc gggggcctgg tgaagcctgg aggctctctg 1440
cgcctgtcct gcgccgcctc aggctttacc tttagccggt ttgacatgag ctgggtgagg 1500
caggcccctg gcaagtgcct ggagtgggtg ggcttcatcg gcggcggggg cgcccggaca 1560
cactaccccg acgccgtgaa gggccggttc accatcagcc gcgataatag caagaatacc 1620
ctgtacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg ccacctacta ctgcgcccgc 1680
cacggcatcg gcaccggcgc catggattac tggggccagg ggaccaccgt gaccgtgagc 1740
tccggtggcg gtggatctgg gggaggtggc tcgggaggag gtggttcagg cggcggaggc 1800
agtgagacca ccctgaccca gagccccgcc ttcatgagcg ccacccctgg cgacaaggtg 1860
aacatcagct gcagggccag taagagcgtg gacaactacg gatactcttt catgcactgg 1920
taccagcaga agccaggcca ggccccccgc ctgctgatct ataggtccgc caacctggcc 1980
agcggcgtgc ccgataggtt tagcggcagc ggctctggca ccgatttcac cctgaagatt 2040
agcagggtgg aggccgagga tgtgggcgtt tattactgcc agcagagcaa cgaggaccca 2100
accttcggct gcggcacaaa gctggagatc aagtaa 2136
<210> 46
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc caggaggctc tctgagactg 60
agctgtgctg ctagcggctt taatattaag gatacttata ttcattgggt gagacaggcc 120
cctggcaaag gtctggaatg ggtcgctaga atctatccaa ctaatggcta tactagatat 180
gctgactccg tgaaaggaag gtttacaatc agtgccgaca cctctaaaaa caccgcctac 240
cttcaaatga atagtctgag agctgaggat accgctgtgt actattgttc tagatggggc 300
ggagacggct tctatgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac ggtttctagt 360
gctagtacta aaggtccttc agtgtttcct ttagcaccat gcagtagatc aacttctgag 420
agcaccgctg ctttaggctg tttagtgaaa gattatttcc ctgaacccgt gactgtgtca 480
tggaactcag gagcactgac cagcggagtg cacacctttc ctgctgttct gcagtcctcc 540
ggcctgtaca gcctgagctc tgtggtgacc gtgccctcca gctctctggg caccaagacc 600
tacacctgca acgtggacca taagccctct aacacaaagg tggacaaaag agtggagagc 660
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tttctgtttc cacccaagcc caaggacaca ctgatgatca gcaggacccc cgaggtgacc 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggac cccgaggtgc agtttaattg gtacgtggac 840
ggagtggagg tgcacaacgc taagaccaag ccaagagagg agcagtttaa tagcacatac 900
cgggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacgggaa ggagtacaag 960
tgtaaggtga gcaacaaggg cttaccatcc agcattgaga agaccatttc caaggccaag 1020
gggcagccgc gggagcccca ggtgtacacc ctgccaccta gccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttttacc ccagcgacat cgcagtggag 1140
tgggagagca acggccagcc tgagaataac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 1200
gacgggagct tcttcctgta ctcccggctg accgtggata agagccgctg gcaggagggc 1260
aacgtgttta gctgcagcgt gatgcacgag gccttgcaca accactacac tcagaagtcc 1320
ctgagcctga gccctggcaa gggcggagga ggcagcggag gcggcggcac cggcggggga 1380
ggctctgagg tgcagctggt gcagtctggc gccgaagtga aaaaaccagg cgaaagcctg 1440
aaaatttctt gtaagggcag cggatattct tttacaagat ttgatatgag ctgggtgaga 1500
caggctcctg gaaaatgtct ggaatgggtg ggctttattg gcggcggagg cggcagaaca 1560
cattatcctg atgctgtgaa aggcagattt acaattagta gagataatag caaaaatacg 1620
ctgtatctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgcgaag 1680
cacggcaccg gcaccggcgc catggactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 1740
agcggtggcg gtggatctgg gggaggtggc tcgggaggag gtggttcagg cggcggaggc 1800
agtgagatcg tgctgaccca gagccccggc accctgagcc tgagcccagg cgagagagcc 1860
accctgagct gccgggccag caagagcgtg gacaactacg gctacagctt catgcactgg 1920
taccagcaga agcctggcca ggcccccaga ctgctgatct acagaagcgc caacctggcc 1980
agcggcgtgc ccagccggtt ctccggcagc ggcagcggca ccgactttac cctgaccatc 2040
aacagcctgg aagctgaaga cgccgccact tactactgcc agcagtcaaa tgaagatcca 2100
accttcggtt gcggcacaaa ggtggagatc aagtaa 2136
<210> 47
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc caggaggctc tctgagactg 60
agctgtgctg ctagcggctt taatattaag gatacttata ttcattgggt gagacaggcc 120
cctggcaaag gtctggaatg ggtcgctaga atctatccaa ctaatggcta tactagatat 180
gctgactccg tgaaaggaag gtttacaatc agtgccgaca cctctaaaaa caccgcctac 240
cttcaaatga atagtctgag agctgaggat accgctgtgt actattgttc tagatggggc 300
ggagacggct tctatgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac ggtttctagt 360
gctagtacta aaggtccttc agtgtttcct ttagcaccat gcagtagatc aacttctgag 420
agcaccgctg ctttaggctg tttagtgaaa gattatttcc ctgaacccgt gactgtgtca 480
tggaactcag gagcactgac cagcggagtg cacacctttc ctgctgttct gcagtcctcc 540
ggcctgtaca gcctgagctc tgtggtgacc gtgccctcca gctctctggg caccaagacc 600
tacacctgca acgtggacca taagccctct aacacaaagg tggacaaaag agtggagagc 660
aagtacggcc ctccttgccc accctgcccc gcacctgagt ttctgggggg ccctagcgtg 720
tttctgtttc cacccaagcc caaggacaca ctgatgatca gcaggacccc cgaggtgacc 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggac cccgaggtgc agtttaattg gtacgtggac 840
ggagtggagg tgcacaacgc taagaccaag ccaagagagg agcagtttaa tagcacatac 900
cgggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacgggaa ggagtacaag 960
tgtaaggtga gcaacaaggg cttaccatcc agcattgaga agaccatttc caaggccaag 1020
gggcagccgc gggagcccca ggtgtacacc ctgccaccta gccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttttacc ccagcgacat cgcagtggag 1140
tgggagagca acggccagcc tgagaataac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 1200
gacgggagct tcttcctgta ctcccggctg accgtggata agagccgctg gcaggagggc 1260
aacgtgttta gctgcagcgt gatgcacgag gccttgcaca accactacac tcagaagtcc 1320
ctgagcctga gccctggcaa gggcggagga ggcagcggag gcggcggcac cggcggggga 1380
ggctctgagg tgcagctcgt ggagagcggc ggcggcctgg tgaagcccgg cggcagcctg 1440
agactgagct gcgccgccag cggcttcacc ttcagcaggt tcgacatgag ctgggtgaga 1500
caggcccccg gcaagtgcct ggagtggatg ggcttcatcg ggggcggcgg cggccggacc 1560
cactaccctg acgccgtgaa gggcagattc accatcagcc gggacaacag caagaacacc 1620
ctgtacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 1680
cacggcaccg gcaccggcgc catggactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc 1740
tccggtggcg gtggatctgg gggaggtggc tcgggaggag gtggttcagg cggcggaggc 1800
agtgacatcc agatgaccca gagcccctcc accctgagcg cctctgtggg agatagagtg 1860
acaattagct gtagagcctc taaatctgtg gataattacg gatatagttt tatgcactgg 1920
taccagcaga aacctggaca ggctcctaga ctgctgattt atagatcagc taatctggct 1980
tctggagtgc ctgatagatt tagtggctct ggatccggaa ctgatttcac tctgacaatt 2040
tctagtctcc aggctgagga tgtggctgtg tattactgtc agcagagcaa tgaggatcct 2100
acatttggat gtggcacaaa gctggagatc aagtaa 2136
<210> 48
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc caggaggctc tctgagactg 60
agctgtgctg ctagcggctt taatattaag gatacttata ttcattgggt gagacaggcc 120
cctggcaaag gtctggaatg ggtcgctaga atctatccaa ctaatggcta tactagatat 180
gctgactccg tgaaaggaag gtttacaatc agtgccgaca cctctaaaaa caccgcctac 240
cttcaaatga atagtctgag agctgaggat accgctgtgt actattgttc tagatggggc 300
ggagacggct tctatgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac ggtttctagt 360
gctagtacta aaggtccttc agtgtttcct ttagcaccat gcagtagatc aacttctgag 420
agcaccgctg ctttaggctg tttagtgaaa gattatttcc ctgaacccgt gactgtgtca 480
tggaactcag gagcactgac cagcggagtg cacacctttc ctgctgttct gcagtcctcc 540
ggcctgtaca gcctgagctc tgtggtgacc gtgccctcca gctctctggg caccaagacc 600
tacacctgca acgtggacca taagccctct aacacaaagg tggacaaaag agtggagagc 660
aagtacggcc ctccttgccc accctgcccc gcacctgagt ttctgggggg ccctagcgtg 720
tttctgtttc cacccaagcc caaggacaca ctgatgatca gcaggacccc cgaggtgacc 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggac cccgaggtgc agtttaattg gtacgtggac 840
ggagtggagg tgcacaacgc taagaccaag ccaagagagg agcagtttaa tagcacatac 900
cgggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacgggaa ggagtacaag 960
tgtaaggtga gcaacaaggg cttaccatcc agcattgaga agaccatttc caaggccaag 1020
gggcagccgc gggagcccca ggtgtacacc ctgccaccta gccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttttacc ccagcgacat cgcagtggag 1140
tgggagagca acggccagcc tgagaataac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 1200
gacgggagct tcttcctgta ctcccggctg accgtggata agagccgctg gcaggagggc 1260
aacgtgttta gctgcagcgt gatgcacgag gccttgcaca accactacac tcagaagtcc 1320
ctgagcctga gccctggcaa gggcggagga ggcagcggag gcggcggcac cggcggggga 1380
ggctctgagg tgcagctggt gcagtctggc gccgaagtga aaaaaccagg cgaaagcctg 1440
aaaatttctt gtaagggcag cggatattct tttacaagat ttgatatgag ctgggtgaga 1500
caggctcctg gaaaatgtct ggaatgggtg ggctttattg gcggcggagg cggcagaaca 1560
cattatcctg atgctgtgaa aggcagattt acaattagta gagataatag caaaaatacg 1620
ctgtatctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgcgaag 1680
cacggcaccg gcaccggcgc catggactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 1740
agcggtggcg gtggatctgg gggaggtggc tcgggaggag gtggttcagg cggcggaggc 1800
agtgagatcg tgctgaccca gagccccgcc tttctgagcc tgagcccagg cgagagagcc 1860
accctgagct gccgggccag caagagcgtg gacaactacg gctacagctt catgcactgg 1920
taccagcaga agcctggcca ggcccccaga ctgctgatct acagaagcgc caacctggcc 1980
agcggcgtgc ccagccggtt ctccggcagc ggcagcggca ccgactttac cctgaccatc 2040
aacagcctgg aagctgaaga cgccgccact tactactgcc agcagtcaaa tgaagatcca 2100
accttcggtt gcggcacaaa ggtggagatc aagtaa 2136
<210> 49
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc caggaggctc tctgagactg 60
agctgtgctg ctagcggctt taatattaag gatacttata ttcattgggt gagacaggcc 120
cctggcaaag gtctggaatg ggtcgctaga atctatccaa ctaatggcta tactagatat 180
gctgactccg tgaaaggaag gtttacaatc agtgccgaca cctctaaaaa caccgcctac 240
cttcaaatga atagtctgag agctgaggat accgctgtgt actattgttc tagatggggc 300
ggagacggct tctatgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac ggtttctagt 360
gctagtacta aaggtccttc agtgtttcct ttagcaccat gcagtagatc aacttctgag 420
agcaccgctg ctttaggctg tttagtgaaa gattatttcc ctgaacccgt gactgtgtca 480
tggaactcag gagcactgac cagcggagtg cacacctttc ctgctgttct gcagtcctcc 540
ggcctgtaca gcctgagctc tgtggtgacc gtgccctcca gctctctggg caccaagacc 600
tacacctgca acgtggacca taagccctct aacacaaagg tggacaaaag agtggagagc 660
aagtacggcc ctccttgccc accctgcccc gcacctgagt ttctgggggg ccctagcgtg 720
tttctgtttc cacccaagcc caaggacaca ctgatgatca gcaggacccc cgaggtgacc 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggac cccgaggtgc agtttaattg gtacgtggac 840
ggagtggagg tgcacaacgc taagaccaag ccaagagagg agcagtttaa tagcacatac 900
cgggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacgggaa ggagtacaag 960
tgtaaggtga gcaacaaggg cttaccatcc agcattgaga agaccatttc caaggccaag 1020
gggcagccgc gggagcccca ggtgtacacc ctgccaccta gccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttttacc ccagcgacat cgcagtggag 1140
tgggagagca acggccagcc tgagaataac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 1200
gacgggagct tcttcctgta ctcccggctg accgtggata agagccgctg gcaggagggc 1260
aacgtgttta gctgcagcgt gatgcacgag gccttgcaca accactacac tcagaagtcc 1320
ctgagcctga gccctggcaa gggcggagga ggcagcggag gcggcggcac cggcggggga 1380
ggctctgagg tgcagctcgt ggagagcggc ggcggcctgg tgaagcccgg cggcagcctg 1440
agactgagct gcgccgccag cggcttcacc ttcagcaggt tcgacatgag ctgggtgaga 1500
caggcccccg gcaagtgcct ggagtggatg ggcttcatcg ggggcggcgg cggccggacc 1560
cactaccctg acgccgtgaa gggcagattc accatcagcc gggacaacag caagaacacc 1620
ctgtacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 1680
cacggcaccg gcaccggcgc catggactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc 1740
tccggtggcg gtggatctgg gggaggtggc tcgggaggag gtggttcagg cggcggaggc 1800
agtgacatcc agatgaccca gagccccgcc tttctgagcg cctctgtggg agatagagtg 1860
acaattagct gtagagcctc taaatctgtg gataattacg gatatagttt tatgcactgg 1920
taccagcaga aacctggaca ggctcctaga ctgctgattt atagatcagc taatctggct 1980
tctggagtgc ctgatagatt tagtggctct ggatccggaa ctgatttcac tctgacaatt 2040
tctagtctcc aggctgagga tgtggctgtg tattactgtc agcagagcaa tgaggatcct 2100
acatttggat gtggcacaaa gctggagatc aagtaa 2136
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10

Claims (10)

1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括：
(a)抗HER2抗体；和
(b)与所述抗HER2抗体相连接的抗PD-1抗体的单链可变区(single-chain FV,ScFv)。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体由抗HER2抗体和抗PD-1抗体的ScFv融合而成，且具有相互对称的两对肽链，每对肽链含有轻链L链和重链H链，所有的肽链均由二硫键相连，其中任意一对肽链从N端到C端具有式I所示的H链和L链的结构：
Figure FDA0002474829600000011
其中，
VH代表抗HER2抗体的重链可变区；
VL代表HER2抗体的轻链可变区；
CH1、CH2和CH3分别代表抗HER2抗体的重链恒定区CH1、CH2和CH3；
CL代表抗HER2抗体的轻链恒定区；
ScFv代表抗PD-1抗体的ScFv；
L为接头序列；
“～”代表二硫键；
“-”代表肽键；
其中，所述双特异性抗体具有同时结合HER2和结合PD-1的活性。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的H链具有如SEQID NO:31、32、33、34、35、36、37、38或39所示的氨基酸序列；并且所述双特异性抗体的L链具有如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的双特异性抗体。
5.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种制备如权利要求1所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)在合适的条件下，培养如权利要求6所述的宿主细胞，获得含有如权利要求1所述双特异性抗体的混合物；
(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离，从而获得如权利要求1所述的抗体。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(I)如权利要求1所述的双特异性抗体；和
(II)药学上可接受的载体。
9.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：
(a)如权利要求1所述的双特异性抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
10.如权利要求1所述的双特异性抗体或如权利要求9所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物组合物。
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