TW202229353A - 抗ｔｓｐａｎ８－抗ｃｄ３雙特異性抗體及抗ｔｓｐａｎ８抗體 - Google Patents

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山宿大介
堤剛
楠﨑佑子
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千脇史子
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Abstract

本發明之課題為提供可用於人類之治療或預防的抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體及抗TSPAN8抗體。 將由患者所分離之癌腹膜轉移細胞對產生人類單株抗體之小鼠誘發免疫，取得對於癌腹膜轉移細胞顯示出選擇性結合之16B11抗體及16B12抗體。此等之抗體，為結合於TSPAN8之胺基酸編號126~155之區域的抗TSPAN8抗體，對於表現於癌腹膜轉移細胞之TSPAN8顯示出強的結合活性。 進一步地，基於16B11之序列所製作的抗TSPAN8 (16B11)-抗CD3雙特異性抗體，於in vitro顯示出對表現TSPAN8之癌細胞的細胞傷害活性，於in vivo會延長對表現TSPAN8之癌細胞荷癌小鼠之抗腫瘤作用及腹膜轉移模式小鼠之存活期間。

Description

抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３雙特異性抗體及抗ＴＳＰＡＮ８抗體
本發明係關於有用於作為人類治療所用的醫藥組成物之有效成分的抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體及抗TSPAN8抗體。
轉移性胃癌，係指原發性胃癌浸潤至較肌層更深處，穿破包覆胃壁之漿膜，透過淋巴節或腹腔、進而血液或淋巴液轉移至各種臟器之狀態，於轉移性胃癌患者之半數以上之患者，可觀察到對腹腔之播種。於末期之患者中，已知有由腹膜轉移所引起的腹水累積為原因之腹部腫脹、持續性膨脹感、疼痛、嘔吐感、呼吸困難、失眠症及疲勞等症狀(World J.Gastroenterol.、2016、Vol.22、p.6829-6840、Int.J.Cancer、2010、Vol.127、p.2209-2221)。但是，胃癌腹膜轉移患者難以以手術完全治癒，胃癌腹膜轉移之標準療法的化學療法其有效性也不充分，因此此等患者之5年存活率為約2%，預後非常不佳，對胃癌腹膜轉移有效的治療法受到期望。又，腹膜轉移於以卵巢癌、大腸癌、胰臟癌等為原發的許多癌患者中亦有觀察到(Int.J.Adv.Res.、2016、Vol.4、p.735-748)，對此等患者之治療法亦尚未確立。
於癌治療用抗體之開發中，係進行以各種方法鑑定於癌細胞選擇性表現的腫瘤相關抗原(Tumor Associated Antigen；TAA)之嘗試。作為該方法之一，報告有將癌細胞對動物誘發免疫而製作抗體，取得結合於在癌細胞表現之TAA的抗體之方法(Biochem. Biophys. Res. Commun.、2018、Vol.505、p.181e-186、FEBS Open Bio、2017、Vol.7、p.627-635)。
四跨膜蛋白8(四穿膜蛋白-8；TSPAN8)係屬於四跨膜蛋白家族之貫通膜4次的蛋白質，具有小細胞外環狀域(small extracellular loop；SEL)與大細胞外環狀域(large extracellular loop；LEL)之2個細胞外環狀域區域及3個細胞質結構域，形成具有多種多樣之膜貫通蛋白質及細胞質蛋白質的分子簇作為支架蛋白質。已知TSPAN8對於細胞接著、細胞運動性、細胞之活化及增殖等有相關，於胃癌、胰臟、大腸癌、肝臟癌等觀察到高表現，有報告TSPAN8表現亢進與癌之進展或轉移的相關性等(非專利文獻1)。以使用抗TSPAN8抗體之癌的診斷或治療為目的之研究正在進行(專利文獻1~2，及非專利文獻1~2)。
分化抗原群3(Cluster of Differentiation 3；CD3)，為藉由於T細胞表面與T細胞受體(T cell receptor；TCR)形成複合體，而對T細胞傳達活化訊息之蛋白質。CD3為由gamma(γ)、delta(δ)、epsilon(ε)、zeta(ζ)及eta(η)鏈之5種次單元所成的複合體，各次單元係形成εγ、εδ、ζζ之3種二聚體。CD3在正常T細胞及腫瘤性T細胞均有表現，故作為T細胞之標記而被使用，又，報告有各種含有以癌治療為目的之各種抗TAA抗體與抗CD3抗體的雙特性抗體之作為醫藥品之應用(非專利文獻3)。
能夠以低抗體濃度得到癌細胞選擇性之細胞傷害活性的劃時代的方法，係報告有由各種抗體形式所成之雙特異性T細胞募集抗體(bispecific T-cell-recruiting antibodies)，該等抗體對T細胞媒介性免疫療法之效果正在被探討(非專利文獻4)。雙特異性T細胞募集抗體，為包含抗於癌細胞表面表現的TAA之抗體，與結合於T細胞之抗體的雙特異性抗體。結合於T細胞之抗體，多使用抗CD3抗體。含有抗TAA與抗CD3抗體之分子之雙特異性T細胞募集抗體，會拉近標的癌細胞與細胞毒性T細胞(Cytotoxic T Lymphocyte；CTL)之物理距離，藉由抗CD3抗體而活化CTL，藉由CTL之細胞傷害活性，來殺滅癌細胞(Redirected T Cell Cytotoxicity；RTCC)。抗CD3-抗上皮細胞接著分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule；EpCAM)雙特異性抗體之catumaxomab或抗CD3-抗CD19(Cluster of Differentiation 19)雙特異性抗體之blinatumomab，係已在臨床確認到效果(Int.J.Cancer、2010、Vol.127、p.2209-2221、N.Engl.J.Med.、2017、Vol.376、p.836-847)，目前也正進行抗各種TAA之雙特異性T細胞募集抗體的研究開發。但是，至今為止，抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體尚未為人所知。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開2012/010696號 [專利文獻2]國際公開2015/130115號 [非專利文獻]
[非專利文獻1] Biomolecules、(瑞士)、2020；10(3)：p.383 [非專利文獻2] Cancers、(瑞士)、2019；11(2)：p.179 [非專利文獻3] Pharmacology and Therapeutics、(英國)、2018；182：p.161-175 [非專利文獻4] mAbs、2017：9(2)：p.182-212
[發明所欲解決之課題]
本發明之課題，為提供可用於人類治療之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體及抗TSPAN8抗體。 [用以解決課題之手段]
本發明者等人，以創造對癌細胞選擇性之治療藥為目的，藉由將自患者分離之癌腹膜轉移細胞對產生人類單株抗體之小鼠誘發免疫而取得抗體之方法，取得抗TSPAN8抗體之16B11及16B12(實施例1)。該抗體相較於在正常細胞表現之TSPAN8而言，對於在癌腹膜轉移細胞表現之TSPAN8更強地結合(實施例1~5)。藉由16B11及16B12之抗原決定位解析，得知該抗體係辨識人類TSPAN8之由胺基酸編號126至155之胺基酸序列所成之區域作為抗原決定位、再者人類TSPAN8之第131號的蘇胺酸為與該抗體之結合所必須(實施例4)。又，製作出使16B11之Fc區域成為人類序列而得的完全人類抗體16B11.1(實施例3)，且發現該完全人類抗體對60As6-Luc/GFP細胞顯示細胞傷害活性(實施例6)。 進一步地，為了提高T細胞所致之抗原選擇性的抗腫瘤活性，係製作一種抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體(實施例7)，其包含抗CD3-scFv區域，該抗CD3-scFv區域包含由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域及由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，以及由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域。該雙特異性抗體，結合於TSPAN8及CD3(實施例8)，對在細胞表面表現TSPAN8之癌細胞顯示細胞傷害活性(實施例9、10、12-1、12-2)，確認到於in vivo會延長小鼠之存活期間，發揮抗腫瘤作用(實施例11及12-3)。
亦即本發明關於以下之[1]~[55]。 [1] 一種雙特異性抗體，其係結合於TSPAN8及CD3之雙特異性抗體，其包含 (a)由含有抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域之重鏈片段及含有抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域之輕鏈所成之抗TSPAN8抗體之Fab區域、 (b)包含抗CD3抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗CD3-scFv區域，以及 (c)由連結於(a)的Fab區域之重鏈片段的第一Fc多胜肽及連結於(b)的抗CD3-scFv區域之第二Fc多胜肽所成之Fc區域。 [2] 如[1]之雙特異性抗體，其中 抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3；或者 抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3。 [3] 如[1]之雙特異性抗體，其中 抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，係由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，係由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成；或者 抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，係由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，係由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成。 [4] 如[1]之雙特異性抗體，其中 抗TSPAN8抗體之Fab區域，係由：由序列編號6之胺基酸編號1至219之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號8之胺基酸序列所成之輕鏈所成；或者 抗TSPAN8抗體之Fab區域，係由：由序列編號10之胺基酸編號1至219之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號12之胺基酸序列所成之輕鏈所成。 [5] 如[1]~[4]中任一項之雙特異性抗體，其中抗CD3抗體之重鏈可變區域，包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3；抗CD3抗體之輕鏈可變區域，包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3。 [6] 如[1]~[4]中任一項之雙特異性抗體，其中抗CD3抗體之重鏈可變區域係由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成，抗CD3抗體之輕鏈可變區域係由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成。 [7] 如[1]~[4]中任一項之雙特異性抗體，其中抗CD3-scFv區域係由序列編號14之胺基酸編號1至254之胺基酸序列所成。 [8] 如[1]之雙特異性抗體，其中 該雙特異性抗體，包含：含有包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈；含有包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽；或者 該雙特異性抗體，包含：含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈；含有包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。 [9] 如[1]之雙特異性抗體，其中 該雙特異性抗體，包含：含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽；或者 該雙特異性抗體，包含：含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。 [10] 如[1]~[9]中任一項之雙特異性抗體，其包含含有LALA變異(L234A及L235A(此處，前述變異位置為人類Igγ1恆定區域中遵照EU索引的胺基酸位置))之Fc區域。 [11] 如[1]~[10]中任一項之雙特異性抗體，其包含含有N297G變異(此處，前述變異位置為人類Igγ1恆定區域中遵照EU索引的胺基酸位置)之Fc區域。 [12] 如[1]~[11]中任一項之雙特異性抗體，其包含含有Knobs into holes變異之Fc區域。 [13] 如[1]~[12]中任一項之雙特異性抗體，其包含含有LALA變異、N297G變異及Knobs into holes變異之Fc區域。 [14] 如[12]或[13]之雙特異性抗體，其中Knobs into holes變異，為形成Fc區域之1個Fc多胜肽中之T366W變異，以及形成Fc區域之另1個Fc多胜肽中之T366S、L368A及Y407V變異(此處，前述變異位置為人類Igγ1恆定區域中遵照EU索引的胺基酸位置)。 [15] 如[1]~[14]中任一項之雙特異性抗體，其含有第一Fc多胜肽係由序列編號6之235至451之胺基酸序列所成，第二Fc多胜肽係由序列編號14之270至486之胺基酸序列所成的Fc區域。 [16] 如[1]~[15]中任一項之雙特異性抗體，其中抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽係透過絞鏈區域連結，抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽係透過絞鏈區域連結。 [17] 如[1]之雙特異性抗體，其包含 由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈，及由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二多胜肽連結而得的多胜肽。 [18] 如[2]~[17]中任一項之雙特異性抗體，其係經轉譯後修飾。 [19] 如[18]之雙特異性抗體，其中轉譯後修飾，為重鏈可變區域N末端之焦麩胺醯化及/或重鏈C末端離胺酸缺失。 [20] 一種多核苷酸，其選自由下述(a)~(e)所成之群： (a)包含編碼含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (b)包含編碼含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (c)包含編碼含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (d)包含編碼含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (e)包含編碼含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。 [21] 一種多核苷酸，其選自由下述(a)~(c)所成之群： (a)包含編碼由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (b)包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (c)包含編碼由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。 [22] 一種表現載體，其包含如[20]或[21]之多核苷酸。 [23] 一種宿主細胞，其係經如[22]之表現載體轉形。 [24] 一種宿主細胞，其包含：包含編碼含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、包含編碼含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，以及包含編碼含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。 [25] 一種宿主細胞，其包含：包含編碼由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。 [26] 一種結合於TSPAN8及CD3之雙特異性抗體之生產方法，其包含培養如[23]~[25]中任一項之宿主細胞之步驟。 [27] 一種醫藥組成物，其含有如[1]~[19]中任一項之雙特異性抗體及藥學上容許之賦形劑。 [28] 如[1]~[19]中任一項之雙特異性抗體，其係使用於癌之治療。 [29] 如[27]之醫藥組成物，其係使用於癌之治療。 [30] 一種治療癌之方法，其包含將如[1]~[19]中任一項之雙特異性抗體之治療有效量投予至對象之步驟。 [31] 一種如[1]~[19]中任一項之雙特異性抗體之使用，其係用於製造用於癌之治療的醫藥組成物。 [32] 一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係選擇性地結合於表現人類TSPAN8之癌細胞。 [33] 一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其結合於存在於序列編號2之胺基酸編號126至155之人類TSPAN8區域的至少1個之胺基酸。 [34] 如[33]之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其結合於存在於前述人類TSPAN8區域的至少序列編號2之胺基酸編號131之胺基酸。 [35] 一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係由下述(a)及(b)中選擇： (a)含有包含由序列編號4之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號4之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域，以及包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段； (b)含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域，以及包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段。 [36] 如[35]之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係由下述(a)及(b)中選擇： (a)含有由序列編號4之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域，及由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段； (b)含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域，及由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段。 [37] 如[35]之抗TSPAN8抗體，其係由下述(a)及(b)中選擇： (a)包含由序列編號4之胺基酸序列所成之重鏈及由序列編號8之胺基酸序列所成之輕鏈的抗TSPAN8抗體； (b)包含由序列編號10之胺基酸序列所成之重鏈及由序列編號12之胺基酸序列所成之輕鏈的抗TSPAN8抗體。 [38] 一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與如[33]~[37]中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段競爭對於表現人類TSPAN8之癌細胞的結合。 [39] 如[32]~[38]中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與抗T細胞或NK細胞之表面抗原的抗體或其抗原結合片段連結。 [40] 如[39]之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其中T細胞之表面抗原為CD3。 [41] 如[40]之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其中對於T細胞之表面抗原的抗原結合片段為抗CD3抗體之scFv。 [42] 如[32]~[41]中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係經轉譯後修飾。 [43] 如[42]之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其中轉譯後修飾，為重鏈可變區域N末端之焦麩胺醯化及/或重鏈C末端離胺酸缺失。 [44]一種如[32]~[43]中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之融合體或複合體，或於細胞表面表現如[32]~[43]中任一項之抗TSPAN8或其抗原結合片段之細胞。 [45] 一種多核苷酸，其係選自由下述(a)~(d)所成之群： (a)包含編碼由序列編號4之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸、 (b)包含編碼由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸、 (c)包含編碼由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸、 (d)包含編碼由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。 [46] 一種多核苷酸，其係選自由下述(a)~(d)所成之群： (a)包含編碼由序列編號4之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (b)包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (c)包含編碼由序列編號10之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (d)包含編碼由序列編號12之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。 [47] 一種表現載體，其包含如[45]或[46]之多核苷酸。 [48] 一種宿主細胞，其係經如[47]之表現載體轉形。 [49] 一種宿主細胞，其係由下述(a)或(b)中選擇： (a)含有包含編碼如[45]之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼如[45]之抗體之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸的宿主細胞； (b)含有包含編碼如[46]之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼如[46]之抗體之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的宿主細胞。 [50] 一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之生產方法，其包含培養如[48]或[49]之宿主細胞之步驟。 [51] 如[32]~[43]中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，或如[44]之融合體、複合體或細胞，其係使用於癌之治療。 [52] 一種醫藥組成物，其含有如[32]~[43]中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，或如[44]之融合體、複合體或細胞，且進一步含有藥學上容許之賦形劑。 [53] 如[52]之醫藥組成物，其係使用於癌之治療。 [54] 一種治療癌之方法，其包含將如[32]~[43]中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之治療有效量投予至對象之步驟，或將如[44]之融合體、複合體或細胞之治療有效量投予至對象之步驟。 [55] 一種如[32]~[43]中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之使用，或如[44]之融合體、複合體或細胞之使用，其係用於製造用於癌之治療的醫藥組成物。 [發明之效果]
本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，結合於癌抗原TSPAN8與T細胞表面分子CD3兩者，藉由拉近癌細胞與T細胞之物理距離，而增強T細胞所致之癌細胞殺滅作用。又，本發明之抗TSPAN8抗體，藉由結合於TSPAN8，具有殺滅癌細胞之效果。本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體及抗TSPAN8抗體，或含有前述抗體之醫藥組成物，可使用於癌之治療。
以下詳述本發明。
＜定義＞ 本說明書之用語，於以下只要無特別定義，係以該技術領域中具有通常知識者一般所使用之意義使用。
抗體(或免疫球蛋白)，係指由具有單一序列之重鏈2條，與具有單一序列之輕鏈2條所成的具有左右對稱Y字型之結構的4條鏈結構所成之糖蛋白質。抗體中存在有IgG、IgM、IgA、IgD及IgE之5個類型。抗體分子之基本結構係各類型共通，分子量5萬~7萬之重鏈2條與2萬~3萬之輕鏈2條係以雙硫鍵及非共價鍵而鍵結，形成由分子量15萬~19萬之Y字型4條鏈結構所成之抗體分子。重鏈通常係由包含約440個胺基酸的多胜肽鏈所成，各類型具有特徴性結構，對應於IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，分別稱為Igγ、Igμ、Igα、Igδ、Igε。進一步地，IgG中存在有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之次類型，分別對應的重鏈係稱為Igγ1、Igγ2、Igγ3、Igγ4。輕鏈係由包含通常約220個胺基酸的多胜肽鏈所成，已知有L型與K型2種，分別稱為Igλ、Igκ。前述2種之輕鏈，與不管何種之重鏈均可成對。
抗體分子之鏈內雙硫鍵，重鏈中存在有4個(Igμ、Igε中有5個)、輕鏈中存在有2個，每100~110殘基之胺基酸，係形成1個環狀域。該等之立體結構在各環狀域間係類似，稱為結構單位或結構域。在重鏈、輕鏈皆將位於N末端之結構域稱為可變區域，即使是由同種動物之同一類型(或次類型)所產生之抗體，亦具有多樣之胺基酸序列，已知係與抗體與抗原之結合特異性結合相關。較可變區域更下游之C末端側的結構域之胺基酸序列，在每個各類型或次類型係大致一定，而稱為恆定區域。由重鏈N末端朝向C末端係具有重鏈可變區域(VH)及重鏈恆定區域(CH)。CH係進一步由N末端側起分為CH1結構域、CH2結構域，及CH3結構域之3個結構域。輕鏈由N末端朝向C末端係具有輕鏈可變區域(VL)及輕鏈恆定區域(CL)。
存在於VH及VL之3個互補性決定區域(CDR)之胺基酸序列其變化非常地大，係對可變區域之可變性做出貢獻。CDR為於重鏈與輕鏈之N末端各自以CDR1、CDR2、CDR3之順序存在的約由5~10個胺基酸殘基所成之區域，而形成抗原結合部位。另一方面，可變區域之CDR以外的部分係稱為框架區域(FR)，由FR1~4所成，胺基酸序列之變化較少。
將抗體以蛋白質分解酵素之木瓜酶進行處理時，可得到3個抗體片段。N末端側之2個片段稱為Fab(抗原結合片段、Fragment, antigen binding)區域。本說明書中「Fab區域」係指由重鏈之VH與CH1結構域及輕鏈(VL與CL)所成之區域，以該Fab區域所構成的尖端部分之抗原結合部位與抗原結合。本說明書中，「重鏈片段」係指由構成Fab區域之重鏈之VH與CH1結構域所成之片段。 又，C末端側之片段係稱為Fc(可結晶化片段、Fragment, crystallizable)區域。本說明書中，「Fc多胜肽」，係指由重鏈之CH2結構域及CH3結構域所成之多胜肽，「Fc區域」係指由2個Fc多胜肽所成之複合體。 重鏈片段與Fc多胜肽係以稱為絞鏈區域之部分而連結。又，抗體之2條重鏈係於絞鏈區域以雙硫鍵而鍵結。
本說明書中「抗原」係以一般所用之意義使用，特別是作為表示抗體、抗原結合片段等之抗原結合蛋白質可特異性結合之分子或分子之一部分的用語使用。抗原可為蛋白質、核酸等之分子。1個抗原亦可能有具有可與不同抗體等相互作用之1個或其以上之抗原決定位的情況。
本說明書中「抗原決定位」或「抗原決定基」，意指抗原結合蛋白質會辨識而結合之抗原的特定結構單位，其包含可藉由抗體或T細胞受體等之抗原結合蛋白質結合的所有決定基。抗原決定位之決定基，可包含胺基酸、糖側鏈、磷氧基(phosphoryl)或磺醯基等之分子的具化學活性之表面基，可具有特異性三維結構之特徴及/或特異性之電荷性特長。抗原為蛋白質時，包含與抗體等直接接觸的特定之胺基酸。一般而言，對特定之標的抗原具特異性的抗體，係於蛋白質及/或高分子之複雜的混合物中，優先辨識標的抗原上之抗原決定位。抗原決定位，多為由可接觸於表面之胺基酸殘基及/或糖側鏈所成的情況，通常係由6~10個之胺基酸或5~8個之單糖的序列所成。抗原決定位可能具有特有之3維結構特性與特有之電荷特性。抗原決定位，可包含與結合直接相關的胺基酸殘基，與不與結合直接相關的其他胺基酸殘基。抗原結合蛋白質所結合的抗原決定位之鑑定，例如可使用質譜分析法(例如氫-氘交換質譜分析(Hydrogen/Deuterium eXchange Mass Spectrometry；HDX-MS)、丙胺酸掃描變異誘發法、結晶解析法、胜肽競爭法等之所屬技術領域中具有通常知識者眾所週知的方法來鑑定。
本說明書中「競爭」或「進行競爭」，係指將2種以上之抗體同時或連續地添加至反應液中時，一方之抗體會妨礙另一方之抗體對抗原的結合，藉以使另一方之抗體對抗原的結合能力降低。
本說明書中「抗原結合片段」，係指包含具有源自抗體之抗原結合活性的至少1個多胜肽鏈之分子。代表的抗原結合片段，可列舉單鏈可變區域片段(scFv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’) 2片段。scFv係由以連結基(linker)連結之VH與VL所構成的一價之抗原結合片段。Fab片段係由包含輕鏈與重鏈之VH、CH1結構域的片段所構成的一價之抗原結合片段。Fab’片段係由包含輕鏈、重鏈之VH、CH1結構域與絞鏈區域之一部分的片段所構成的一價之抗原結合片段，該絞鏈區域之部分包含構成重鏈間S-S鍵結之半胱胺酸殘基。F(ab’) 2片段係Fab’片段以雙硫鍵連結之二價分子。一價意指包含1個抗原結合部位、二價意指包含2個抗原結合部位。 本說明書中「scFv區域」，係指含有包含以連結基連結之VH與VL的一價之抗原結合片段的區域。
單臂(One-armed)抗體亦為抗原結合片段之一種，具有包含1個Fab區域及1個Fc區域，且該Fab區域之重鏈片段連結於該Fc區域之2個Fc多胜肽中的1個之結構。於1個實施形態中，單臂抗體包含1個重鏈(VH、CH1結構域、絞鏈區域、Fc多胜肽(CH2結構域及CH3結構域))、1個輕鏈(VL及CL)，及Fc多胜肽。
本說明書中「多重特異性抗體」，係指可特異性結合於2個以上之不同抗原的抗體，依所結合之抗原數，例如稱為雙特異性抗體、三特異性抗體。多重特異性抗體，包含可分別結合於不同抗原之2個以上之抗體及/或抗原結合片段之複合體，本說明書中所使用之「抗體」，只要前後文上未特別限制，係包含多重特異性抗體者。
本說明書中「雙特異性抗體」係指可特異性結合於2個不同抗原的抗體。「抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體」，意指具有對TSPAN8之結合活性及對CD3之結合活性的雙特異性抗體。
本說明書中「人類抗體」，表示具有人類免疫球蛋白胺基酸序列之抗體。本說明書中「人類化抗體」，表示CDR以外之胺基酸殘基之一部分、大部分或全部，經源自人類免疫球蛋白分子之胺基酸殘基取代的抗體。人類化之方法不特別限制，例如可參照美國專利第5225539號、美國專利第6180370號等製作人類化抗體。
本說明書中所使用的抗體之胺基酸殘基編號，可藉由指定Kabat編號或EU索引(Kabat等人、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed, 1991, NIH Publication No.91-3242)，遵照該等之編號系統而規定。
本說明書中，「第一」或「第二」之用語，係在部分之各種類存在有2種以上時，為了方便上進行區別而使用。如此之用語之使用，只要非明確敘述，則不意圖賦予特定之順序或意義。
本說明書中，「連結」或「經連結」，意指複數之成分(例如Fab區域及Fc多胜肽)，直接或透過一個或複數之仲介物(例如胜肽連結基)進行結合。本說明書中「胜肽連結基」意指用以連結可變區域間，可藉由基因工程而導入的1個以上之任意之胺基酸殘基。本發明所使用之胜肽連結基之長度不特別限定，所屬技術領域中具有通常知識者可依目的適當選擇。
本說明書中，「同一性」意指使用EMBOSS Needle(Nucleic Acids Res.、2015、Vol.43、pW580-W584)，藉由預設準備之參數而得到的Identity值。前述參數係如以下所述。 Gap Open Penalty = 10 Gap Extend Penalty = 0.5 Matrix = EBLOSUM62 End Gap Penalty = false
本說明書中，「對象」意指以該預防或治療為必要之人類或其他動物。於一態樣中，係以該預防或治療為必要之人類。
＜本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體＞ 本發明提供以下所示之結合於TSPAN8及CD3之雙特異性抗體(亦稱為「抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體」)： 一種雙特異性抗體，其係結合於TSPAN8及CD3之雙特異性抗體，其包含 (a)由含有抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域之重鏈片段及含有抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域之輕鏈所成之抗TSPAN8抗體之Fab區域、 (b)包含抗CD3抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗CD3-scFv區域，以及 (c)由連結於(a)的Fab區域之重鏈片段的第一Fc多胜肽及連結於(b)的抗CD3-scFv區域之第二Fc多胜肽所成之Fc區域。
本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，具有包含第一抗體之1個Fab區域、第二抗體之scFv區域，及1個Fc區域之結構。如此結構之抗體，亦稱為「開瓶器(Bottle-opener)型抗體」(國際公開2014/110601號)。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，為人類抗體或人類化抗體。
本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，作為Fab區域，含有抗TSPAN8抗體Fab區域，其係由含有抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域之重鏈片段，及含有抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域之輕鏈所成。
於1個實施形態中，抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3。
於1個實施形態中，抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3。
於1個實施形態中，抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，係由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，係由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成。
於1個實施形態中，抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，係由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，係由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成。
作為抗TSPAN8抗體Fab區域之重鏈片段之CH1結構域其來源的重鏈恆定區域，係Igγ、Igμ、Igα、Igδ或Igε之任意恆定區域均可選擇。作為Igγ，例如可由Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4中選擇。於1個實施形態中，抗TSPAN8抗體Fab區域之重鏈片段，包含源自人類Igγ1恆定區域之CH1結構域。
作為抗TSPAN8抗體Fab區域之輕鏈之CL，係Igλ或Igκ之任意恆定區域均可選擇。於1個實施形態中，抗TSPAN8抗體Fab區域，包含Igκ恆定區域之CL。於1個實施形態中，抗TSPAN8抗體Fab區域之輕鏈，包含人類Igκ恆定區域之CL。
於1個實施形態中，抗TSPAN8抗體Fab區域，係自由序列編號6之胺基酸編號1至219之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號8之胺基酸序列所成之輕鏈所成。於1個實施形態中，抗TSPAN8抗體Fab區域，係自由序列編號10之胺基酸編號1至219之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號12之胺基酸序列所成之輕鏈所成。
本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，含有包含抗CD3抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗CD3-scFv區域，作為scFv區域。本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體中，亦可使用基於該領域公知之抗CD3-scFv區域或該領域公知之抗CD3抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域的序列資訊所製作的抗CD3抗體之scFv區域。公知之抗CD3抗體，已知有OKT3、UTCH1、L2K、TR66等之殖株，該等之序列係作為雙特異性抗體使用(Pharmacol.Ther.、2018、Vol.182、p.161-175)。
於1個實施形態中，抗CD3抗體之重鏈可變區域，包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3，抗CD3抗體之輕鏈可變區域，包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3。
於1個實施形態中，抗CD3抗體之重鏈可變區域，係由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成，抗CD3抗體之輕鏈可變區域，係由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成。
抗CD3-scFv區域中，連結抗CD3抗體之重鏈可變區域與輕鏈可變區域之胜肽連結基的種類及長度不特別限定，所屬技術領域中具有通常知識者可適當選擇，較佳的長度為5個胺基酸以上(上限不特別限定，通常為30個胺基酸以下、較佳為20個胺基酸以下)、特佳為15個胺基酸。胜肽連結基，例如可使用甘胺酸-絲胺酸連結基(GS連結基)，或甘胺酸-離胺酸-脯胺酸-甘胺酸-絲胺酸連結基(GKPGS連結基)。如此之連結基例如可列舉以下者。 Ser Gly-Ser Gly-Gly-Ser Ser-Gly-Gly Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號15) Ser-Gly-Gly-Gly (序列編號16) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號17) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (序列編號18) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號19) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (序列編號20) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號21) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (序列編號22) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n Gly-Lys-Pro-Gly-Ser (序列編號23) (Gly-Lys-Pro-Gly-Ser)n 上述n表示1以上之整數。胜肽連結基之長度或序列，可依目的由所屬技術領域中具有通常知識者適當選擇。
於1個實施形態中，抗CD3-scFv區域，係由序列編號14之胺基酸編號1至254之胺基酸序列所成。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：含有包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈；含有包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈；以及含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈；含有包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈；以及含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。
本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體中，構成Fc區域之第一Fc多胜肽及第二Fc多胜肽其來源的重鏈恆定區域，係Igγ、Igμ、Igα、Igδ或Igε之任意恆定區域均可選擇。作為Igγ，例如可由Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4選擇。於1個實施形態中，第一Fc多胜肽及第二Fc多胜肽，為源自人類Igγ1恆定區域之Fc多胜肽。
本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體中之Fc區域，亦可包含會降低抗體依賴性細胞傷害活性(ADCC)或補體依賴性傷害活性(CDC)之變異。L234A，係指人類Igγ1恆定區域中依照EU索引之胺基酸234位之白胺酸取代為丙胺酸。L235A，係指人類Igγ1恆定區域中依照EU索引之胺基酸235位之白胺酸取代為丙胺酸。人類Igγ1恆定區域L234A及L235A之胺基酸變異係稱為「LALA變異」。已知該變異會降低抗體之抗體依賴性細胞傷害活性或補體依賴性傷害活性(Mol.Immunol.、1992、Vol.29、p.633-639；J.Immunol.、2000、Vol.164、p.4178-4184)。
本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體中之Fc區域，亦可進一步包含基於其他公知技術之變異。例如，Fc區域亦可包含N297G變異(Protein cell、2018、Vol.9 、p.63-73)或基於Knobs into holes技術之變異(以下亦稱為「Knobs into holes變異」)。Knobs into holes技術，為藉由將一方之重鏈之CH3區域所存在的胺基酸側鏈取代為更大之側鏈(knob；突起)，將另一方之重鏈之CH3區域所存在的胺基酸側鏈取代為更小之側鏈(hole；空隙)，而將突起配置於空隙內，促進重鏈之異二聚體化，而可有效率地取得目標之異二聚體化抗體分子的技術(Nature、1994、Vol.372、p.379-383；Nature Biotech.、1998、Vol.16、p.677-681；J.Mol.Biol.、1997、Vol.270、p.26-35；Proc.Natl.Acad.Sci.USA、2013、Vol.110、p.E2987-E2996)。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，含有包含L234A及L235A之胺基酸變異(LALA變異)的Fc區域。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，含有包含N297G變異的Fc區域。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，含有包含Knobs into holes變異的Fc區域。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，含有包含L234A及L235A之胺基酸變異(LALA變異)、N297G變異，及Knobs into holes變異中1個以上之變異的Fc區域。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，含有包含L234A及L235A之胺基酸變異(LALA變異)、N297G變異，及Knobs into holes變異的Fc區域。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體中所含的Knobs into holes變異，為形成其Fc區域之1個Fc多胜肽中的T366W變異，以及形成其Fc區域之另1個Fc多胜肽中的T366S、L368A及Y407V變異(參照國際公開1998/050431號)。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含自由序列編號6之胺基酸編號235至451之胺基酸序列所成之第一Fc多胜肽及由序列編號14之胺基酸編號270至486之胺基酸序列所成之第二Fc多胜肽所成之Fc區域。
再者，本說明書中，LALA變異、N297G變異、Knobs into holes變異等之胺基酸變異的記載，為基於人類Igγ1恆定區域中遵照EU索引之胺基酸位置者。例如，如前所述，L234A係指人類Igγ1恆定區域中遵照EU索引之胺基酸234位的白胺酸取代為丙胺酸。
本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體中，含有抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域之重鏈片段與Fc多胜肽(第一Fc多胜肽)，亦可透過絞鏈區域而連結，構成抗TSPAN8抗體之重鏈。 又，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體中，抗CD3-scFv區域與Fc多胜肽(第二Fc多胜肽)，亦可透過絞鏈區域連結。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：含有抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域之重鏈片段與第一Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的多胜肽。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：含有抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域之重鏈片段與第一Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈，及抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的多胜肽。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：含有包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈；含有包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈；以及含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的多胜肽。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈；含有包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈；以及含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的多胜肽。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的多胜肽。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的多胜肽。
於1個實施形態中，含有抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈，係由序列編號6或10之胺基酸序列所成。於1個實施形態中，含有抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈，係由序列編號6之胺基酸序列所成。於1個實施形態中，抗TSPAN8抗體之輕鏈，係由序列編號8或12之胺基酸序列所成。於1個實施形態中，抗TSPAN8抗體之輕鏈，係由序列編號8之胺基酸序列所成。於1個實施形態中，抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽透過絞鏈區域連結而得的多胜肽，係由序列編號14之胺基酸序列所成。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：含有由序列編號6或10之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段、由序列編號8或12之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈及第一Fc多胜肽經連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈，以及由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，包含：含有由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段、由序列編號8或12之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈及第一Fc多胜肽經連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈，以及由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，為包含由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈，及由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽之雙特異性抗體。
本說明書中「轉譯後修飾」，係指使抗體於細胞內表現時，抗體於轉譯後受到修飾。轉譯後修飾之例子，可列舉重鏈N末端之麩醯胺或麩胺酸之焦麩胺醯化、醣基化、氧化、脫醯胺化、糖化等之修飾，或重鏈C末端之離胺酸經羧基肽酶切斷所致之離胺酸缺失。已知各種抗體中，會產生如此之轉譯後修飾(J.Pharm.Sci.、2008、Vol.97、p.2426-2447)。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，亦可經轉譯後修飾。於1個實施形態中，轉譯後修飾為重鏈可變區域N末端之焦麩胺醯化及/或重鏈C末端離胺酸缺失。於該領域已知N末端之焦麩胺醯化或C末端離胺酸缺失所致之轉譯後修飾對抗體之活性不造成影響(Analytical Biochemistry、2006、Vol.348、p.24-39)。
本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，係結合於人類TSPAN8(基因編號：NM_004616.2)及人類CD3εδ複合蛋白(CD3ε基因編號：NM_000733.3、CD3δ基因編號：NM_000732.4或NM_001040651.1)。是否結合於人類TSPAN8及人類CD3εδ複合蛋白，可使用公知之結合活性測定方法確認。測定結合活性之方法，例如可列舉Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)法、流式細胞儀分析法等之方法。使用ELISA法時，例如可使用實施例8記載之方法，使用流式細胞儀分析法時，例如可使用實施例1記載之方法。
本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，可基於本說明書揭示之抗TSPAN8抗體及抗CD3-scFv區域之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之序列資訊等，使用該領域中公知之方法由所屬技術領域中具有通常知識者來製作。又，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之抗CD3-scFv區域，可基於公知之抗CD3抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之序列資訊等，使用該領域中公知之方法由所屬技術領域中具有通常知識者來製作。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，為人類化抗體或人類抗體。人類化抗體之製作時，亦可使用所屬技術領域中具有通常知識者所週知之方法，適當導入回復突變(Bioinformatics、2015、Vol.31、p.434-435)。本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體雖不特別限定，例如可遵照後述＜生產本發明之雙特異性抗體之方法及藉由該方法所生產之本發明之雙特異性抗體＞所記載的方法而製造。
＜本發明之雙特異性抗體之多核苷酸＞ 又，本發明提供可使用於生產本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體的以下之多核苷酸(亦稱為「本發明之雙特異性抗體之多核苷酸」)。 (1)包含編碼包含抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (2)包含編碼抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (3)包含編碼含有包含抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽之多胜肽的多胜肽之鹼基序列的多核苷酸。
於上述(1)之多核苷酸之1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之多核苷酸，為由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(1)之多核苷酸之1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之多核苷酸，為由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(1)之多核苷酸之1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之多核苷酸，為包含編碼由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(2)之多核苷酸之1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之多核苷酸，為由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(2)之多核苷酸之1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之多核苷酸，為由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(2)之多核苷酸之1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之多核苷酸，為包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(3)之多核苷酸之1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之多核苷酸，為以下之多核苷酸： 包含編碼含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，以及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽之鹼基序列的多核苷酸。
於上述(3)之多核苷酸之1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之多核苷酸，為以下之多核苷酸： 包含編碼含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(3)之多核苷酸之1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之多核苷酸，為包含編碼由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
本發明之雙特異性抗體之多核苷酸，可基於其鹼基序列，使用該領域中公知之方法，由所屬技術領域中具有通常知識者來製作。例如，本發明之雙特異性抗體之多核苷酸，可利用該領域中公知之基因合成方法來合成。如此之基因合成方法，可使用國際公開編號90/07861號記載之抗體基因之合成方法等之所屬技術領域中具有通常知識者所公知的各種方法。
＜本發明之雙特異性抗體之表現載體＞ 又，本發明提供包含以下(1)~(3)記載的本發明之雙特異性抗體之多核苷酸的表現載體(亦稱為「本發明之雙特異性抗體之表現載體」)。此等之多核苷酸，可分別包含於不同之載體中，或亦可為複數之多核苷酸包含於1個載體中。 (1)包含編碼抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (2)包含編碼抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (3)包含編碼抗CD3-scFv區域與包含第二Fc多胜肽之多胜肽經連結而得的多胜肽之鹼基序列的多核苷酸。
於包含上述(1)之多核苷酸的本發明之雙特異性抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(1)之多核苷酸的本發明之雙特異性抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(1)之多核苷酸的本發明之雙特異性抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體包含：包含編碼由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(2)之多核苷酸的本發明之雙特異性抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(2)之多核苷酸的本發明之雙特異性抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(2)之多核苷酸的本發明之雙特異性抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體包含：包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(3)之多核苷酸的本發明之雙特異性抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含以下之多核苷酸： 包含編碼含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，以及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽之鹼基序列的多核苷酸。
於包含上述(3)之多核苷酸的本發明之雙特異性抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含以下之多核苷酸： 包含編碼含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(3)之多核苷酸的本發明之雙特異性抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體包含：包含編碼由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之表現載體，為包含由以下(a)~(e)中選擇之1個以上數目的多核苷酸之表現載體： (a)包含編碼含有包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (c)包含編碼含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。 (d)包含編碼含有包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。 (e)包含編碼含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，以及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之表現載體，為包含由以下(a)~(e)中選擇之1個以上數目的多核苷酸之表現載體： (a)包含編碼含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (c)包含編碼含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。 (d)包含編碼含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。 (e)包含編碼含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之表現載體，為包含由以下(a)~(c)中選擇之1個以上數目的多核苷酸之表現載體： (a)包含編碼由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (c)包含編碼由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
本發明之雙特異性抗體之表現載體，只要係可於真核細胞(例如動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母)及/或原核細胞(例如大腸菌)等各種宿主細胞中產生本發明之多核苷酸者，則不特別限制。如此之表現載體，例如可列舉質體載體、病毒載體等。質體載體例如可使用pcDNA系列(Thermo Fisher Scientific公司)、pALTER(註冊商標)-MAX(Promega)、pHEK293 Ultra Expression Vector (Takara Bio公司)、pEE6.4或pEE12.4(Lonza Biologics公司)等。病毒載體例如可使用慢病毒、腺病毒、反轉錄病毒、腺相關病毒。例如，為了對細胞導入本發明之多核苷酸而使用慢病毒時，該慢病毒，可使用pLVSIN-CMV/EF1α載體(Takara Bio公司)、pLenti載體(Thermo Fisher Scientific公司)等。於1個實施形態中，本發明之雙特異性抗體之表現載體所使用的載體，為pcDNA TM3.4-TOPO(註冊商標)(Thermo Fisher Scientific公司)及pcDNA TM3.1(Thermo Fisher Scientific公司)。
本發明之雙特異性抗體之表現載體，可包含以可運作的方式連結於本發明之雙特異性抗體之多核苷酸之啟動子。用以於動物細胞表現本發明之雙特異性抗體之多核苷酸的啟動子，例如可列舉CMV、RSV、SV40等之源自病毒之啟動子、肌動蛋白啟動子、EF(elongation factor)1α啟動子、熱休克啟動子等。用以於細菌(例如大腸桿菌屬菌)表現本發明之雙特異性抗體之多核苷酸的啟動子，例如可列舉trp啟動子、lac啟動子、λPL啟動子、tac啟動子等。用以於酵母表現本發明之雙特異性抗體之多核苷酸的啟動子，例如可列舉GAL1啟動子、GAL10啟動子、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。
使用動物細胞、昆蟲細胞或酵母作為宿主細胞時，本發明之雙特異性抗體之表現載體，可包含起始密碼子及終止密碼子。此時，亦可包含增強子序列、編碼本發明之抗體或其重鏈或輕鏈之基因的5’側及3’側之非轉譯區域、分泌訊息序列、剪接接合部、多腺苷酸化部位，或可複製之單位等。使用大腸菌作為宿主細胞時，本發明之表現載體，可包含起始密碼子、終止密碼子、終止子區域，及可複製之單位。本發明之表現載體，亦可依目的，包含通常使用的藥劑選擇標記基因(例如四環黴素抗性基因、安比西林抗性基因、康黴素抗性基因、新黴素抗性基因、二氫葉酸還原酵素基因)。
＜本發明之經轉形之宿主細胞＞ 又，本發明提供經本發明之雙特異性抗體之表現載體轉形之宿主細胞(亦稱為「本發明之經轉形之宿主細胞」)。本發明之經轉形之宿主細胞，可藉由本發明之雙特異性抗體之表現載體所致之轉形，而包含以下(1)~(3)的本發明之雙特異性抗體之多核苷酸的1個或複數之多核苷酸，於1個實施形態中，本發明之經轉形之宿主細胞，包含以下(1)~(3)之多核苷酸全部： (1)包含編碼抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (2)包含編碼抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (3)包含編碼抗CD3-scFv區域與包含第二Fc多胜肽之多胜肽經連結而得的多胜肽之鹼基序列的多核苷酸。
作為被轉形的宿主細胞，只要為適合所使用之表現載體，經該表現載體轉形，而可表現抗體或融合體者，則不特別限定。作為被轉形的宿主細胞，例如可列舉於本發明之技術領域中通常使用的習知細胞或經人工建構的細胞等各種細胞(例如動物細胞(例如CHO-K1細胞、ExpiCHO-S(註冊商標)細胞、CHOK1SV細胞、CHO-DG44細胞、HEK293細胞、NS0細胞)、昆蟲細胞(例如Sf9)、細菌(大腸桿菌屬菌等)、酵母(酵母菌屬、畢赤酵母菌屬等)等)。於1個實施形態中，本發明之宿主細胞為CHO-K1細胞，或ExpiCHO-S細胞。
使宿主細胞轉形之方法不特別限定，例如可使用磷酸鈣法、電穿孔法，或脂質轉染(lipofection)法等之所屬技術領域中具有通常知識者一般所使用的方法。
經轉形之宿主細胞的選別，可由所屬技術領域中具有通常知識者一般所使用的方法來進行。選別方法當中，例如可使用利用了藥劑選擇標記基因與四環黴素、安比西林、新黴素或潮黴素等藥劑之藥劑選擇法，或極限稀釋法、單一細胞分選法，或群落拾取法等之細胞分離法。
於包含上述(1)之多核苷酸的本發明之經轉形之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(1)之多核苷酸的本發明之經轉形之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(1)之多核苷酸的本發明之經轉形之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞包含：包含編碼由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(2)之多核苷酸的本發明之經轉形之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(2)之多核苷酸的本發明之經轉形之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(2)之多核苷酸的本發明之經轉形之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞包含：包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(3)之多核苷酸的本發明之經轉形之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含以下之多核苷酸： 包含編碼含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，以及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽之鹼基序列的多核苷酸。
於包含上述(3)之多核苷酸的本發明之經轉形之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含以下之多核苷酸： 包含編碼含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域、由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽之鹼基序列的多核苷酸。
於包含上述(3)之多核苷酸的本發明之經轉形之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞包含：包含編碼由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽之鹼基序列的多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之經轉形之宿主細胞，為包含由以下(a)~(e)中選擇的1個以上之多核苷酸的宿主細胞： (a)包含編碼含有包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼含有包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (c)包含編碼含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (d)包含編碼含有包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (e)包含編碼含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，以及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之經轉形之宿主細胞，為包含由以下(a)~(e)中選擇的1個以上之多核苷酸的宿主細胞： (a)包含編碼含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (b)包含編碼含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (c)包含編碼含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (d)包含編碼含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (e)包含編碼含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽之鹼基序列的多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之經轉形之宿主細胞，為包含由以下(a)~(c)中選擇的多核苷酸之宿主細胞： (a)包含編碼由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (c)包含編碼由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之經轉形之宿主細胞，包含：包含編碼由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼由序列編號14之胺基酸序列所成之多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
＜生產本發明之雙特異性抗體之方法＞ 又，本發明提供生產本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之方法(亦稱為「本發明之生產方法」)。本發明之生產方法中，可包含培養＜本發明之經轉形之宿主細胞＞中記載的經轉形之宿主細胞，於該細胞或該培養上清液中使該抗體表現之步驟、將該抗體回收、分離、純化之方法等，只要會生產本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，則不限定於此等之方法。
本發明之經轉形之宿主細胞之培養可藉由公知之方法進行。培養條件例如溫度、培養基之pH及培養時間，可由所屬技術領域中具有通常知識者適當選擇。宿主細胞為動物細胞時，培養基例如可使用含約5~20%之胎牛血清的MEM培養基(Science、1959、Vol.130、p.432-437)、DMEM培養基(Virol.、1959、Vol.8、p.396)、RPMI-1640培養基(J.Am.Med.Assoc.、1967、Vol.199、p.519)、199培養基(Exp.Biol.Med.、1950、Vol.73、p.1-8)等。培養基之pH例如為約6~8，培養係依需要一邊通氣或攪拌，一邊於通常約30~40℃進行約15~336小時。宿主細胞為昆蟲細胞時，培養基例如可使用含胎牛血清之Grace’s培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1985、Vol.82、p.8404)等。培養基之pH例如為約5~8，培養係依需要一邊通氣或攪拌，一邊於通常約20~40℃進行約15~100小時。宿主細胞為大腸菌或酵母時，培養基例如係以含有營養源之液體培養基為適當。營養培養基，例如含有經轉形之宿主細胞之生育所必要的碳源、無機氮源或有機氮源。碳源例如可列舉葡萄糖、葡聚糖、可溶性澱粉、蔗糖等，無機氮源或有機氮源例如可列舉銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米浸液、蛋白腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯萃取液等。亦可依期望含有其他營養素(例如無機鹽(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類)、抗生素(例如四環黴素、新黴素、安比西林、康黴素)等。培養基之pH，例如為約5~8。宿主細胞為大腸菌時，培養基例如可使用LB培養基、M9培養基(Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、Vol.3、A2.2)等。培養係依需要一邊通氣或攪拌，一邊通常於約14~43℃進行約3~24小時。宿主細胞為酵母時，培養基例如可使用Burkholder最小培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1980、Vol.77、p.4505)等。培養係依需要一邊通氣或攪拌，一邊通常於約20~35℃進行約14~144小時。藉由如上述之培養，可表現本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體。
本發明之生產方法，於培養本發明之經轉形之宿主細胞，使抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體表現之步驟以外，可進一步包含由該經轉形之宿主細胞將抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體予以回收、分離或純化之步驟。分離或純化方法，例如可列舉鹽析、溶劑沈澱法等之利用溶解度之方法；透析、超微過濾、凝膠過濾等之利用分子量之差的方法；離子交換層析、羥基磷灰石層析等之利用電荷之方法；親和性層析等之利用特異親和性之方法；逆相高速液體層析等之利用疏水性之差的方法；等電點電泳等之利用等電點之差的方法等。於1個實施形態中，分泌於培養上清液中的抗體，可藉由各種層析，例如使用蛋白質A管柱或蛋白質G管柱之管柱層析而純化。
本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體中，亦包含藉由本發明之生產方法所生產之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體。
＜本發明之雙特異性抗體之醫藥組成物等＞ 本發明之醫藥組成物中，包含含有本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體及藥學上容許之賦形劑的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物，可使用該領域中通常所用的賦形劑亦即藥劑用賦形劑或藥劑用載體等，藉由通常使用的方法而調製。此等醫藥組成物之劑型的例子，例如可列舉注射劑、點滴用劑等之非經口劑，可藉由靜脈內投予、皮下投予、腹腔內投予等而投予。製劑化時，可於藥學上容許之範圍，使用因應此等劑型的賦形劑、載體、添加劑等。
本發明之醫藥組成物中，可包含本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之轉譯後修飾體。例如，本發明亦包含一種醫藥組成物，其含有受到C末端離胺酸之缺失或N末端之焦麩胺醯化的兩方或一方之抗體等。
於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物，為含有由以下(a)及(b)中選擇的本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體及/或該抗體之轉譯後修飾體的醫藥組成物： (a)一種雙特異性抗體，其包含：含有包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈；含有包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈；以及含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽； (b)一種雙特異性抗體，其包含：含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈；含有包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈；以及含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。
於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物，為含有由以下(a)及(b)中選擇的本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體及/或該抗體之轉譯後修飾體的醫藥組成物： (a)一種雙特異性抗體，其包含：含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽； (b)一種雙特異性抗體，其包含：含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。
於1個實施形態中，本發明之醫藥組成物，為含有：包含由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈，及由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體及/或該抗體之轉譯後修飾體的醫藥組成物。
於製劑化時之本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體、抗TSPAN8抗體之添加量，係依患者之症狀程度或年齡、所使用之製劑之劑型，或抗體之結合力價等而異，例如可使用0.001mg/kg~100mg/kg左右。
＜本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之醫藥用途＞ 本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，及含有該等之醫藥組成物，可使用於癌之治療。又，本發明中，包含一種治療癌之方法，其包含將本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之治療有效量投予至對象之步驟。又，本發明中，包含本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體，其係使用於癌之治療。又，本發明中，包含本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之使用，其係用於製造癌之治療用醫藥組成物。本發明之治療對象之癌不特別限定，例如可列舉各種腹膜轉移癌、胃癌、肺癌、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞淋巴瘤等之血液癌、骨髓增生不良症候群、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、中皮瘤、皮膚癌、皮膚T細胞淋巴瘤、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、陰道癌、頸部癌、頭頸部癌、子宮癌、子宮頸癌、肝臟癌、膽囊癌、膽管癌、腎臟癌、胰臟癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、睪丸癌、卵巢癌、腦腫瘤等之固體癌，以及骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織及造血組織之癌，此外可列舉軟骨肉瘤、Ewing氏肉瘤、惡性血管內皮瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤等之肉瘤，或膠母細胞瘤、多形性膠母細胞瘤、肝母細胞瘤、髓母細胞瘤、腎母細胞瘤、神經母細胞瘤、胰母細胞瘤、胸膜肺母細胞瘤、網膜母細胞瘤等之母細胞瘤等。
＜本發明之抗TSPAN8抗體＞ 又，本發明提供以下所說明之抗人類TSPAN8之新穎抗TSPAN8抗體或其結合片段。藉由本發明所提供之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段亦統稱為「本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段」。
本發明提供選擇性地結合於表現人類TSPAN8之癌細胞的抗TSPAN8抗體或其結合片段。
本說明書中，「選擇性地結合於表現人類TSPAN8之癌細胞」，係指將某抗TSPAN8抗體，與市售抗TSPAN8抗體(TAL69、REA443等)或與市售抗TSPAN8抗體顯示相同之結合輪廓的抗TSPAN8抗體(例如9F6、18C10等)比較結合活性時，相較於市售抗體等而言，對於表現人類TSPAN8之癌細胞中表現之TSPAN8的結合強度，為3倍以上、較佳為5倍以上、更佳為10倍以上，且對於正常細胞所表現之TSPAN8的結合強度為1/3以下、較佳為1/5以下、更佳為1/10以下。抗體對細胞之結合強度，例如可使用實施例1所示之流式細胞儀分析法所得之MFI(Mean Fluorescence Intensity)值，或由各抗體之MFI減去各Isotype MFI算出之ΔMFI值而算出。又，抗體對細胞之結合強度，亦可藉由使用癌細胞與正常細胞之ELISA法等所屬技術領域中具有通常知識者通常可使用之方法而測定及算出。 此處，表現人類TSPAN8之癌細胞，係指由癌患者分離之表現人類TSPAN8之癌細胞，可使用實施例1-1記載之源自患者之癌腹膜轉移細胞，以及可由American Type Culture Collection(ATCC)等之細胞庫等獲得之癌細胞株。作為癌細胞株，例如可使用以實施例1-1記載之方法由患者腹水所建構之細胞株，此外可使用AGS、KATOIII、SNU5、SNU16、SNU520、ANU719、NCI-N87、HT-29、LoVo、GP2d、AsPC-1、OE19、Li-7Hs746、NUGC-4、OCUM1、MNK45等之表現TSPAN8之細胞株。又，正常細胞係指源自正常組織之細胞，可使用實施例1-5所用之源自患者之腹膜間皮細胞，以及實施例1-3所用之人類末梢血單核細胞、實施例1-3所用之培養腹膜間皮細胞等之市售的初代培養細胞或細胞株。於1個實施形態中，正常細胞係表現TSPAN8。於1個實施形態中，表現TSPAN8之正常細胞為源自患者之腹膜間皮細胞及實施例1-3所用之培養腹膜間皮細胞。於1個實施形態中，正常細胞為不表現TSPAN8之細胞。於1個實施形態中，不表現TSPAN8之正常細胞為實施例1-3所用之人類末梢血單核細胞。
又，本發明提供辨識TSPAN8蛋白質之一部分作為抗原決定位的抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段。於1個實施形態中，該抗原決定位為由TSPAN8之LEL區域中所含的胺基酸序列所成之結構單位。於1個實施形態中，該抗原決定位為由序列編號2之126至155之胺基酸序列表示之TSPAN8蛋白質之一部分區域所成之結構單位。於1個實施形態中，該抗原決定位為由序列編號2之126至155之胺基酸序列表示之TSPAN8蛋白質之一部分區域中所含的1或2個以上之胺基酸序列所成之結構單位。於1個實施形態中，該抗原決定位為至少包含序列編號2之胺基酸編號131的結構單位。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，結合於存在於序列編號2之胺基酸編號126至155之人類TSPAN8區域的至少1個之胺基酸。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，結合於存在於序列編號2之胺基酸編號126至155之人類TSPAN8之區域的至少1個之胺基酸，且選擇性地結合於表現人類TSPAN8之癌細胞。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，結合於存在於序列編號2之胺基酸編號126至155之人類TSPAN8區域的至少序列編號2之胺基酸編號131之胺基酸。於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，結合於存在於序列編號2之胺基酸編號126至155之人類TSPAN8區域的至少序列編號2之胺基酸編號131之胺基酸，且選擇性地結合於表現人類TSPAN8之癌細胞。
抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，是否結合於存在於序列編號2之胺基酸編號126至155之人類TSPAN8區域之胺基酸(例如序列編號2之胺基酸編號131之胺基酸)，可使用本案實施例4-1及4-2記載之抗原決定位鑑定方法來確認。
又，本發明提供以下(a)及(b)所示之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段： (a)含有包含由序列編號4之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號4之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域，以及包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段； (b)含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域，以及包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，為由以下(a)及(b)中選擇的抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段： (a)含有由序列編號4之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域，及由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段； (b)含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域，及由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段或其抗原結合片段。
作為本發明之抗TSPAN8抗體之重鏈恆定區域，係Igγ、Igμ、Igα、Igδ或Igε之任意恆定區域均可選擇。作為Igγ，例如可由Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4中選擇。於1個實施形態中，重鏈恆定區域為Igγ1恆定區域，例如為人類Igγ1恆定區域。又，本發明之抗TSPAN8抗體之重鏈恆定區域，為了降低ADCC或CDC，亦可包含LALA變異等之胺基酸變異。作為本發明之抗TSPAN8抗體之輕鏈恆定區域，係Igλ或Igκ之任意恆定區域均可選擇。於1個實施形態中，輕鏈恆定區域為Igκ恆定區域，例如為人類Igκ恆定區域。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體之抗原結合片段，為scFv、Fab、Fab’、F(ab’) 2，或單臂抗體。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體，為由以下(a)及(b)中選擇的抗TSPAN8抗體： (a)包含由序列編號4之胺基酸序列所成之重鏈及由序列編號8之胺基酸序列所成之輕鏈的抗TSPAN8抗體； (b)包含由序列編號10之胺基酸序列所成之重鏈及由序列編號12之胺基酸序列所成之輕鏈的抗TSPAN8抗體。
又，本發明提供以下(a)~(d)所示之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段(將此等亦特別統稱為「本發明之競爭抗TSPAN8抗體」)： (a)一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與含有由序列編號4之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域及由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體競爭對表現人類TSPAN8之癌細胞之結合； (b)一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域及由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體競爭對表現人類TSPAN8之癌細胞之結合； (c)一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與含有由序列編號34之胺基酸序列所成之重鏈可變區域及由序列編號36之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體競爭對表現人類TSPAN8之癌細胞之結合； (d)一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與含有由序列編號35之胺基酸序列所成之重鏈可變區域及由序列編號37之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體競爭對表現人類TSPAN8之癌細胞之結合。
本發明之競爭抗TSPAN8抗體，例如可藉由以表現人類TSPAN8之細胞為抗原，使用公知之抗體製作技術取得抗人類TSPAN8之抗體，並對於所得之抗體進行與競爭對象之抗TSPAN8抗體在關於對表現人類TSPAN8之細胞的結合上的競爭試驗，而由所屬技術領域中具有通常知識者取得。作為競爭試驗，可使用流式細胞儀分析法等所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，例如可使用利用實施例4-3記載的表現人類TSPAN8之癌細胞的競爭試驗。競爭試驗所使用之表現人類TSPAN8之癌細胞，可使用前述之各種細胞。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，為由下述(a)及(b)之任一者中選擇的抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段： (a)一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與含有由序列編號4之胺基酸序列所成之重鏈與由序列編號8之胺基酸序列所成之輕鏈的抗TSPAN8抗體競爭對表現人類TSPAN8之癌細胞之結合、 (b)一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與含有由序列編號10之胺基酸序列所成之重鏈與由序列編號12之胺基酸序列所成之輕鏈的抗TSPAN8抗體競爭對表現人類TSPAN8之癌細胞之結合。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，為由下述(c)及(d)之任一者中選擇的抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段： (c)一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與含有由序列編號34之胺基酸序列所成之重鏈可變區域與由序列編號36之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體競爭對表現人類TSPAN8之癌細胞之結合、 (d)一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與含有由序列編號35之胺基酸序列所成之重鏈可變區域及由序列編號37之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體競爭對表現人類TSPAN8之癌細胞之結合。
＜本發明之其他雙特異性抗體＞ 本發明提供包含與抗T細胞或天生殺手(Natural Killer；NK)細胞之表面抗原的抗體或其抗原結合片段連結的本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段的雙特異性抗體。該雙特異性抗體之形狀不特別限定，例如可採取非專利文獻3或4記載之各種形狀的抗體等所屬技術領域中具有通常知識者一般而言可使用的形狀。
又，本發明提供以下之雙特異性抗體： 一種雙特異性抗體，其係 結合於TSPAN8及T細胞或NK細胞之表面抗原的雙特異性抗體，其係由 (a)由含有本發明之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域之重鏈片段及含有本發明之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域之輕鏈所成之抗TSPAN8抗體之Fab區域、 (b)含有抗T細胞或NK細胞之表面抗原的抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域的抗T細胞或NK細胞之表面抗原的抗體之scFv區域，及 (c)由連結於(a)的Fab區域之重鏈片段的第一Fc多胜肽及連結於(b)的scFv區域之第二Fc多胜肽所成之Fc區域 所成。
本發明之其他雙特異性抗體，為所屬技術領域中具有通常知識者可使用非專利文獻4記載之方法或以＜本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體＞之記載為參考，而使用一般的方法製作。抗T細胞或NK細胞之表面抗原的抗體，至今為止已知有許多抗體(Current Opinion in Biotechnology、2020、Vol.65、p.9-16)，可使用此等抗體之序列資訊。關於本發明之其他雙特異性抗體之實施態樣，除了使用抗CD3抗體之scFv區域以外，係如＜本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體＞所記載。又，本發明之其他雙特異性抗體亦可使用於癌之治療。
於1個實施形態中，本發明之其他雙特異性抗體之抗T細胞或NK細胞之表面抗原的抗體或其抗原結合片段，為抗T細胞或NK細胞之表面抗原的抗體或其抗原結合片段。於1個實施形態中，為抗該T細胞或NK細胞之表面抗原的抗體或其抗原結合片段、抗CD3抗體、抗CD137抗體、抗PD-1(Programmed cell Death - 1)抗體、抗PD-L1 (Programmed cell Death 1- Ligand 1)抗體、抗TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)抗體、抗CD16抗體、抗NKG2D(Natural Killer Group 2, member D)抗體，或該等抗原結合片段。於1個實施形態中，該抗T細胞或NK細胞之抗體或其抗原結合片段，為抗CD3抗體或其抗原結合片段。於1個實施形態中，該抗CD3抗體之抗原結合片段，為抗CD3抗體之scFv。
＜於細胞表面表現本發明之融合體、複合體及本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段的細胞＞ 又，本發明提供連結有TSPAN8以外之其他蛋白質(包含抗體)或多胜肽的本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段(亦稱為「本發明之融合體」)。用於本發明之融合體的蛋白質或多胜肽不特別限定，例如可使用各種抗體、細胞激素、趨化介素、人類血清白蛋白、各種標籤胜肽、人工螺旋模體(helix motif)胜肽、麥芽糖結合蛋白質、麩胱甘肽S轉移酶、其他之可促進多聚體化之胜肽或蛋白質等。於本發明之融合體之1個實施形態中，蛋白質或多胜肽，係連結於本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段。於1個實施形態中，用於本發明之融合體之蛋白質或多胜肽，例如可為抗顆粒球、天生殺手T(Natural Killer T；NKT)細胞等之免疫細胞、樹狀細胞、巨噬細胞等之血球細胞之表面抗原的抗體或其抗原結合片段，或各種介白素(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15)等之活化免疫細胞之多胜肽。此時，用於本發明之融合體之蛋白質或多胜肽，可直接連結於本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，又，亦可透過任意之連結基(例如胜肽連結基)連結。
又，本發明提供結合有糖質、脂質、金屬(包含放射性同位素)、有機化合物(包含毒素、近紅外螢光色素、鉗合劑)等(亦稱為「修飾劑」)的本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段(亦稱為「本發明之複合體」)。本說明書中，「修飾劑」係指於抗體或其抗原結合片段上直接或透過連結基等結合的非胜肽性之物質。用於本發明之複合體的修飾劑不特別限定，例如可列舉聚乙二醇、糖鏈、磷脂質、放射線同位素(例如鋯-89( 89Zr)、釔-90( 90Y)、銦-111( 111In)、砈-211( 211At)、錒-225( 225Ac))、有機化合物、毒素、近紅外螢光色素(例如IRDye(註冊商標))、鉗合劑等。用於該複合體之修飾劑，可直接鍵結於本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，又，亦可透過任意之連結基而結合。於1個實施形態中，本發明之複合體，為抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之藥物複合體(抗體Drug Conjugate；ADC)。用於ADC之藥物及連結基，係所屬技術領域中具有通常知識者可由一般所用的藥劑及連結基中選定。於1個實施形態中，本發明之複合體，為於抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段上結合放射線同位素之放射性同位素標識抗體。
又，本發明提供於細胞表面表現本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之細胞(例如Chimeric antigen receptor-T cell；CAR-T細胞)。如此之細胞，可使用編碼本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之多核苷酸，由所屬技術領域中具有通常知識者進行製作。表現本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之細胞，可使用各種免疫細胞(T細胞、NK細胞、NKT細胞等)。
本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段、本發明之融合體、本發明之複合體，及於細胞表面表現本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之細胞，係結合於人類TSPAN8(基因編號：NM_004616.2)。對人類TSPAN8之結合，可使用公知之結合活性測定方法來確認。測定結合活性之方法，例如可列舉ELISA法、流式細胞儀分析法等之方法。使用ELISA法時，例如可使用實施例8記載之方法，使用流式細胞儀分析法時，例如可使用實施例1記載之方法。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段、本發明之融合體，及複合體以及於細胞表面表現本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之細胞中的抗體或抗原結合片段部分，亦可經轉譯後修飾。於1個實施形態中，轉譯後修飾，為重鏈可變區域N末端之焦麩胺醯化及/或重鏈C末端離胺酸缺失。
本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段、本發明之融合體，及本發明之複合體以及於細胞表面表現本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之細胞，可基於本說明書揭示的本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之VH及VL之序列資訊、使用於本發明之融合體的其他胜肽或蛋白質(例如抗體)、用於本發明之複合體的修飾劑之資訊，使用該領域中公知之方法，由所屬技術領域中具有通常知識者進行製作。本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段不特別限定，例如可遵照＜生產本發明之雙特異性抗體之方法＞項目所記載的方法進行生產。
＜本發明之抗TSPAN8抗體之多核苷酸、表現載體、宿主細胞，及生產方法＞ 又，本發明提供以下(1)~(4)之多核苷酸： (1)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸、 (2)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸、 (3)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (4)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(1)之多核苷酸之1個實施形態中，包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，為由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼包含由序列編號4之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號4之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(1)之多核苷酸之1個實施形態中，包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，為由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號4之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(2)之多核苷酸之1個實施形態中，包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，為由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(2)之多核苷酸之1個實施形態中，包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，為由以下之(a)或(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(3)之多核苷酸之1個實施形態中，包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸，為由以下之(a)或(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於上述(4)之多核苷酸之1個實施形態中，包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，為由以下之(a)或(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號8所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號12所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
本項之多核苷酸，可基於其鹼基序列，使用該領域中公知之方法，由所屬技術領域中具有通常知識者來製作。
又，本發明提供包含以下(1)~(4)之多核苷酸中1個或複數之多核苷酸的表現載體(亦稱為「本發明之抗TSPAN8抗體之表現載體」)。1個表現載體中可各含1個各自之多核苷酸、亦可包含複數個。 (1)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸、 (2)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸、 (3)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (4)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(1)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼包含由序列編號4之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號4之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的多核苷酸。
於包含上述(1)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號4之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(2)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(2)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(3)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(4)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體之表現載體的1個實施形態中，該表現載體，包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號8所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號12所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體之表現載體，為包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸表現載體： (a)包含編碼包含由序列編號4之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號4之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體之表現載體，為包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸表現載體： (a)包含編碼由序列編號4之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體之表現載體，為包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸表現載體： (a)包含編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼由序列編號8所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼由序列編號12所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
本項之表現載體，可根據前述＜本發明之雙特異性抗體之表現載體＞記載之方法，由所屬技術領域中具有通常知識者進行製作。
又，本發明提供經包含以下(1)~(4)之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞(亦稱為「本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞」)。本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞，藉由本發明之抗TSPAN8抗體之表現載體所致之轉形，可各包含1個以下(1)~(4)之各自的多核苷酸、亦可包含複數個。 (1)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸 (2)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸、 (3)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (4)包含編碼本發明之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(1)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼包含由序列編號4之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號4之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(1)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號4之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(2)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含由以下之(a)及(b)中選擇的多核苷酸： (a)包含編碼包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(2)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(3)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於包含上述(4)之多核苷酸的本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞的1個實施形態中，該宿主細胞，包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸： (a)包含編碼由序列編號8所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號12所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞，包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸： (a)包含編碼包含由序列編號4之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號4之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞，為包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸之宿主細胞： (a)包含編碼由序列編號4之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
於1個實施形態中，本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞，為包含由以下(a)或(b)中選擇之多核苷酸之宿主細胞： (a)包含編碼由序列編號4所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼由序列編號8所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸； (b)包含編碼由序列編號10所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼由序列編號12所示之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
本項所記載之宿主細胞，可根據前述＜本發明之經轉形之宿主細胞＞所記載之方法，由所屬技術領域中具有通常知識者進行製作。
進一步地，本發明提供包含培養本發明之抗TSPAN8抗體用之宿主細胞之步驟的抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之生產方法。本方法可根據前述＜生產本發明之雙特異性抗體之方法＞，由所屬技術領域中具有通常知識者實施。
＜本發明之抗TSPAN8抗體等之醫藥用途＞ 又，本發明提供含有於細胞表面表現本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段、本發明之融合體、本發明之複合體及本發明之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段的細胞(以下於本項中統稱為「本發明之抗TSPAN8抗體等」)，以及藥學上容許之賦形劑之醫藥組成物。該醫藥組成物可使用於癌之治療。又，本發明提供包含將本發明之抗TSPAN8抗體等之治療有效量投予至對象之步驟的治療癌之方法、使用於癌之治療的本發明之抗TSPAN8抗體等、用於製造癌之治療用醫藥組成物的本發明之抗TSPAN8抗體等之使用。本發明之抗TSPAN8抗體等之醫藥用途，可根據前述＜本發明之雙特異性抗體之醫藥組成物等＞之記載，由所屬技術領域中具有通常知識者實施。作為本發明之抗TSPAN8抗體等之醫藥用途之治療對象之癌，可列舉前述＜本發明之雙特異性抗體之醫藥組成物等＞中記載之癌。
＜本發明之抗CD3抗體＞ 又，本發明提供以下所示之抗CD3抗體或其抗原結合片段： 一種抗CD3抗體或其抗原結合片段，其含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域，以及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域。
於1個實施形態中，本發明之抗CD3抗體或其抗原結合片段，為含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗CD3抗體或其抗原結合片段。
於1個實施形態中，本發明之抗CD3抗體之抗原結合片段為scFv。於1個實施形態中，本發明之抗CD3抗體之抗原結合片段，為含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗CD3抗體scFv。於1個實施形態中，本發明之抗CD3抗體之抗原結合片段，為由序列編號14之胺基酸編號1至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體scFv。
本發明之抗CD3抗體或其抗原結合片段，可參照＜本發明之抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體＞等之本說明書中之記載，由所屬技術領域中具有通常知識者進行製作。本發明之抗CD3抗體或其抗原結合片段，可使用公知之結合活性測定方法確認。本發明之抗CD3抗體或其抗原結合片段，例如可使用於癌之治療中所使用的與抗腫瘤抗原之抗體的雙特異性抗體。
為了對本發明更加得到理解，於此提供參照之特定實施例，但此等係以例示為目的者，不限定本發明。 [實施例]
[實施例1：選擇性結合於在癌腹膜轉移細胞表現之抗原的抗體之取得] [實施例1-1：源自患者之癌腹膜轉移細胞之取得] 源自患者之癌腹膜轉移細胞之取得係由以下方法進行。源自患者之癌腹膜轉移細胞取得，係根據千脇史子、佐佐木博己所著文獻「腹膜轉移癌(胃、胰臟、卵巢癌等)細胞株之建構」(佐佐木博己編『利用源自患者之癌模式的癌研究實踐導覽』羊土公司、2019年、p.28-37)所記載之方法進行。將由患者所採取之腹水分注於ProteoSave(註冊商標)SS 50mL離心管(Sumitomo Bakelite公司、MS-52550、以下稱「50mL離心管」)，於室溫、430×g下離心3分鐘。去除上清液後，對沈澱添加溶血緩衝液，於室溫進行10~20分鐘溶血。溶血緩衝液係將含0.75% 氯化銨之17mM Tris-HCL(pH7.65)以孔徑0.22μm之濾器過濾而調製。離心後去除上清液，添加Dulbecco PBS(-)(日水製藥公司、05913、以下「PBS(-)」)50mL將細胞洗淨。之後，於室溫以430×g離心3分鐘將細胞回收。將回收之腹水中之全部細胞再懸浮於含10% FBS(Thermo Fisher Scientific公司、10270-106)、×1 抗生素-抗黴劑(Thermo Fisher Scientific公司、15240062)之RPMI-1640(含有L-麩醯胺)培養基(富士軟片和光純藥公司、189-02025)(以下將添加FBS等後之培養基稱「RPMI-1640培養基」)。於100mm經膠原蛋白被覆的培養皿(以下稱「培養皿」)(IWAKI公司、4020-010)中各播種細胞5×10 6~1×10 7個/10mL，於37℃、5% CO 2培養箱中培養。 腹水中之細胞中係存在有接著系細胞與懸浮系細胞。接著系細胞中不僅癌細胞，亦包含癌細胞以外之細胞(纖維母細胞、腹膜間皮細胞等)。利用癌細胞以外之細胞較癌細胞在更短時間剝離的性質，將此等之細胞由腹水中之全部細胞分離。具體而言，將經培養前述腹水中之全部細胞的培養皿以PBS(-)洗淨後，藉由以0.05%胰蛋白酶-EDTA(Thermo Fisher Scientific公司、15400054)2mL進行數分鐘處理，將癌細胞以外之細胞剝離。經剝離之細胞中所含有的癌細胞以外之細胞，係以新的培養皿持續培養，於實施例1-5中使用。 去除癌細胞以外之細胞後，使癌細胞增殖至培養皿面積之80%滿左右後，重複進行將全部細胞之1/2對新的培養皿繼代之作業，將繼代5次以上者稱為接著系癌細胞。針對懸浮系細胞，係由培養皿將培養上清液5mL與RPMI-1640培養基5mL對新的100mm培養皿播種而繼代，將繼代5次以上者稱為懸浮系癌細胞。將源自患者1人之癌腹膜轉移細胞在含有接著系癌細胞與懸浮系癌細胞兩方的狀態下增殖的情況時，將該等稱為混合系癌細胞。 本說明書中，係將以上述方法由患者採取的腹水中所分離之接著系癌細胞、懸浮系癌細胞或混合系癌細胞總稱為「癌腹膜轉移細胞」。將所取得之12種細胞(NSC-7C、NSC-9C、NSC-10C、NSC-14C、NSC-15CF、NSC-16C、NSC-20C、NSC-22C、NSC-24C、NSC-32C、NSC-34C及NSC-35C-1(以下亦稱為「12種癌腹膜轉移細胞」))用於之後的探討。
[實施例1-2：抗胃癌抗原抗體產生融合瘤之製作] 使用人類單株抗體開發技術「VelocImmune」(VelocImmune(註冊商標)抗體technology；Regeneron(美國專利6596541號))小鼠，取得結合於癌腹膜轉移細胞之抗胃癌抗原抗體。 實施例1-1中取得之癌腹膜轉移細胞當中，將NSC-10C、NSC-35C-1、NSC-24C、NSC-7C、NSC-14C、NSC-34C每次分為3種細胞並混合，懸浮於TiterMax(註冊商標)Gold ADJUVANT(MERCK公司、T2684)或PBS(-)，調製癌腹膜轉移細胞懸浮液。將該懸浮液對VelocImmune小鼠誘發免疫，遵照常規方法製作融合瘤。以自動挑選裝置分離融合瘤之單群落，取得單株化融合瘤細胞(以下稱「殖株」)。將分離之殖株於37℃、8% CO 2培養箱中培養，將培養4日後之上清液回收到96孔盤，用於以下的實驗。
[實施例1-3：選擇性結合於癌腹膜轉移細胞之抗胃癌抗原抗體之選別] 1.抗胃癌抗原抗體對癌腹膜轉移細胞及EpCAM表現細胞之結合確認 實施例1-2所得之殖株之細胞上清液中含有抗體(以下稱「殖株上清液中所含的抗體」)。 首先，以流式細胞儀分析法測定殖株上清液中所含的抗體與實施例1-1所取得之12種癌腹膜轉移細胞之結合，選擇會產生對癌腹膜轉移細胞強烈結合的抗體之殖株。流式細胞儀分析係使用BV421山羊抗小鼠Ig(Becton, Dickinson and Company公司、563846)。接著，為了除外提供結合於癌抗原EpCAM之抗體的殖株，係測定殖株上清液中所含的抗體與人類EpCAM-Myc-DDK表現CHO-K1細胞之結合。人類EpCAM-Myc-DDK表現CHO-K1細胞，係藉由將EPCAM(Myc-DDK-tagged)-人類上皮細胞黏著分子(EPCAM)(ORIGENE公司、RC201989)對CHO-K1細胞(ATCC、CCL-61)轉染而製作。以流式細胞儀分析法測定該細胞與殖株上清液中所含的抗體之結合。流式細胞儀分析法，係使用BV421 山羊抗小鼠Ig。為了選擇提供對EpCAM表現細胞不顯示結合活性之上清液的殖株，係將結合於該細胞之殖株除外。作為陽性控制組，係使用CD326(EpCAM) Monoclonal 抗體(1B7)(eBioscience公司、14-9326)。 藉由上述實驗，係選定提供對12種癌腹膜轉移細胞中之10種以上結合，且不結合於人類EpCAM之抗體的殖株。
2.抗體對人類末梢血單核細胞之結合確認 進一步地，為了選擇會提供選擇性結合於癌腹膜轉移細胞之抗體的殖株，係除外會提供結合於人類末梢血單核細胞之抗體的殖株。 人類末梢血單核細胞與各殖株所提供之抗體的結合測定，係使用流式細胞儀分析法。作為源自人類末梢血之單核細胞，係使用源自周邊血之人類單核球細胞(hMNC-PB)，混合樣本，超純(PromoCell公司、C-12908)。流式細胞儀分析法係使用PE山羊抗小鼠Ig(複數吸附，Multiple Adsorption)(Becton, Dickinson and Company公司、550589、以下稱「PE山羊抗小鼠Ig」)、BV421小鼠抗人類CD3(Becton, Dickinson and Company公司、562426)、APC小鼠抗人類CD14(Becton, Dickinson and Company公司、555399)、BB515小鼠抗人類CD19(Becton, Dickinson and Company公司、564456)。
3.自融合瘤上清液純化抗體 將實施例1-3之1.及2.之步驟中選擇的殖株以CD融合瘤培養基(Thermo Fisher Scientific公司、11279023)培養。使用MabSelectSuRe(GE Healthcare公司、17-5438-02)，由培養上清液純化抗體(以下稱「純化抗體」)。抗體之純化係遵照常規方法。
4.純化抗體對培養人類腹膜間皮細胞之結合 為了選擇會選擇性結合於癌腹膜轉移細胞之抗體，係由實施例1-3之3.所得之純化抗體將結合於培養人類腹膜間皮細胞之抗體除外。作為培養人類腹膜間皮細胞係使用人類間皮細胞Human Mesothelial Cells(Zenbio公司、MES-F、Lot.MESM012916B)(本說明書中稱為「培養人類腹膜間皮細胞」)，以間皮細胞成長培養基(Zenbio公司、MSO-1)培養。純化抗體與培養人類腹膜間皮細胞之結合測定，係使用流式細胞儀分析法。流式細胞儀分析法係使用PE山羊抗小鼠Ig。選擇不結合於培養人類腹膜間皮細胞或顯示弱結合的抗體，取得14種純化抗體(以下稱「14種純化抗體」)。
[實施例1-4：所取得之抗體所辨識的抗原分子候選物之鑑定] 對14種純化抗體進行抗原候選物分子之鑑定。作為鑑定方法之例子，係詳述16B11、16B12及21F7中之抗原候選物分子之鑑定方法。 作為本實驗中之控制組抗體，係使用對癌腹膜轉移細胞之結合形態與16B11相異之5D3、9A1、21A3。 製作NSC-15CF細胞之細胞破碎液。於細胞破碎液中添加16B11、16B12、21F7及控制組抗體3種(5D3、9A1、21A3)中任1種抗體。進一步添加Dynabeads 蛋白質G (Life Technologies公司、10003D)進行攪拌及洗淨。將結合於Dynabeads 蛋白質G之蛋白質使用胰蛋白酶/LysC(Promega公司、V5072)進行消化，得到胜肽混合物。將含有胜肽混合物之溶液使用UltiMate 3000 RSnano(Thermo Fisher Scientific公司)及Orbitrap Fusion(Thermo Fisher Scientific公司)進行LC-MS/MS測定。將所得之LC-MS/MS數據使用Progenesis QI for Proteomics(Waters公司)及Mascot(Matrix Science公司)之軟體進行比較定量解析及胜肽/蛋白質鑑定，鑑定結合蛋白質。將16B11、16B12或21F7之數據分別與控制組抗體之數據進行比較，鑑定出TSPAN8作為16B11及21F7之抗原候選物分子。本實驗中無法鑑定出16B12之抗原候選物分子。 對於5B7、9F6、12C12、13A9、15D1、18C10及19E4亦使用與上述相同之方法進行實驗，鑑定出TSPAN8作為抗原候選物分子。控制組抗體係使用5D3、9A1、21A3以及24C7。16B12雖未進行到抗原候選物分子之鑑定，但由於在實施例1-3中顯示出與16B11相同之結合輪廓，因此推定TSPAN8為抗原候選物進行其後之探討。 進一步地，為了特定出抗原，係進行對人類TSPAN8-Myc-DDK表現CHO-K1細胞之結合實驗。人類TSPAN8-Myc-DDK表現CHO-K1細胞，係藉由對CHO-K1細胞轉染TSPAN8(Myc-DDK-tagged)-人類四穿膜蛋白8(TSPAN8) (ORIGENE公司、RC202694)(序列編號2)而製作。結果，確認到16B11、16B12、5B7、9F6、12C12、13A9、15D1、18C10、19E4、21F7之10種抗體(亦稱為「10種抗TSPAN8抗體」)會結合於人類TSPAN8-Myc-DDK表現CHO-K1細胞，辨識TSPAN8作為抗原。
[實施例1-5：抗TSPAN8抗體對各種細胞之結合活性之確認] 1.對癌腹膜轉移細胞之結合活性之確認及數據化 藉由流式細胞儀分析法測定由胃癌患者腹水分離之7種癌腹膜轉移細胞(KM-291-As、KM-555-As、KM-556-As、P-249-As、KM-568-As、KM-570-As及KM-577-As)與4種抗TSPAN8抗體之結合。 KM-291-As係由患者之腹水使用與實施例1-1相同之方法調製。所調製之KM-291-As中，含有多量之表現CD45之血球系細胞，因此為了濃縮癌細胞，係將CD45表現細胞以管柱去除。詳而言之，係將含5×10 7個細胞之細胞懸浮液，使用CD45 MicroBeads，人類(Miltenyi Biotec公司、130-045-801)，遵照常規方法通過Pre-Separation Columns (30μm)(Miltenyi Biotec公司、130-041-407)與Separation Columns(Miltenyi Biotec公司、130-042-401)(以下稱「Column」)。將管柱通過液回收到50mL離心管進行離心分離。對沈澱添加緩衝液 10mL使細胞再懸浮。由該細胞懸浮液中分取5×10 6個細胞至1.5mL微管(WATSON公司、131-7155C)，藉由離心分離而得到沈澱。對沈澱添加含2% FBS、100μg/mL盤尼西林-鏈黴素(Thermo Fisher Scientific公司、15140-122)之PBS(FCM緩衝液)950μL，調製細胞懸浮液。添加FcR Blocking Reagent 50μL，於冰中反應10分鐘。將該反應液對7支1.5mL微管各分注100μL，由以下方法進行細胞之染色。對7支中3支之微管各添加小鼠IgG1-PE抗體(Miltenyi Biotec公司、130-092-212)5μL，接著將經Alexa Fluor647標識之控制組抗體對各微管各添加2.5μL，作為同型控制組。作為控制組抗體，係使用小鼠IgG2a同型控制組(Becton, Dickinson and Company公司、558053)、小鼠IgG2b同型控制組(Becton, Dickinson and Company公司、558713)、小鼠IgG3同型控制組(Becton, Dickinson and Company公司、560803)之任一者。剩下4支微管中各添加CD326(EpCAM)-PE(Miltenyi Biotec公司、130-091-253)5μL，進一步將16B11、16B12、9F6、18C10於微管中分別各添加2.5μL(0.25μg/管)將細胞染色，作為4種之評價抗體樣品。各微管係於添加抗體後於冰中反應30分鐘。添加FCM緩衝液1mL進行離心分離，對所得之沈澱添加FCM緩衝液500μL使細胞再懸浮。添加7-AAD(Becton, Dickinson and Company公司、559925)5μL，將全部量移至5mL附蓋細胞過濾器圓底聚苯乙烯管(CORNING公司、352235)，使用FACSVerse流式細胞儀(Becton, Dickinson and Company公司)進行測定。數據取得係使用BD FACSuite軟體(Becton, Dickinson and Company公司)。 KM-555-As、KM-556-As、P-249-As、KM-568-As、KM-570-As、KM-577-As之調製亦以與KM-291-As之調製相同方法進行。與KM-555-As、KM-556-As之結合測定中，評價抗體樣品係使用16B11、9F6及18C10。與P-249-As之結合測定中，評價抗體樣品係使用16B11及市售抗TSPAN8抗體TSPAN8 抗體，抗人類REAfinity(130-106-855、Miltenyi公司、本說明書中稱「REA443」))。與KM-568-As、KM-570-As、KM-577-As之結合測定中，評價抗體樣品係使用16B11、9F6、18C10及REA443。於全部的實驗中，係使用同型控制組抗體，小鼠IgG1(130-113-196, Miltenyi公司)作為同型控制組。又，細胞之染色係使用IgG2a-VioBlue抗體(Miltenyi Biotec公司、130-113-277)及CD326(EpCAM)-VioBlue抗體(Miltenyi Biotec公司、131-113-266)。 各癌腹膜轉移細胞之以流式細胞儀分析之測定結果的解析，係使用BD FACSuite軟體進行。詳而言之，係以FSC-A(lin)/SSC-A(log)作圖，將所得之細胞集團予以圈選(gate)，再度以FSC-W(lin)/FSC-A(lin)展開，僅將Singlet集團圈選而製成子集合來進行解析。KM-291-As細胞之測定結果的解析中，係將子集合以PE(log)/Alexa Fluor647 (log)展開。KM-555-As、KM-556-As、P-249-As、KM-568-As、KM-570-As、KM-577-As之測定結果的解析中，係以VioBlue(log)/Alexa Fluor647(log)展開而使用其數據。就各樣品而言係對於1×10 4個細胞子集合取得數據。將所取得之fcs檔案以FlowJo(Becton, Dickinson and Company公司)進行解析，製成Alexa Fluor647之直方圖。對於同型與各評價抗體，分別算出陽性集團之Alexa Fluor647之MFI，由各抗體之MFI減去各同型MFI而算出 ΔMFI(表1)。 作為所得之直方圖之例子，係將顯示與KM-291-As之結合測定中之16B11及16B12以及與KM-555-As及KM-556-As之結合測定中之16B11、9F6、18C10的結合之直方圖分別示於圖1-1至圖1-3。
2.對培養人類腹膜間皮細胞之結合活性之確認及數據化 測定於實施例1-4鑑定之10種抗TSPAN8抗體與培養人類腹膜間皮細胞之結合活性。培養人類腹膜間皮細胞，其為正常細胞。 藉由流式細胞儀分析法測定實施例1-3所得之10種抗TSPAN8抗體及市售抗TSPAN8抗體之經純化的抗人類TSPAN8 抗體(BioLegend公司、363702 Clone TAL69、本說明書中稱為「TAL69」)對培養人類腹膜間皮細胞之結合。作為2次抗體係使用PE山羊抗小鼠Ig。所得之直方圖示於圖2-1及圖2-2。又，藉由將流式細胞儀分析之結果使用FlowJo解析，分別算出針對各細胞集團之PE的MFI。作為陰性控制組抗體，係在解析中使用經Ultra-LEAF純化的小鼠IgG1,κ同型控制組抗體(BioLegend公司、401408)、經純化的NA/LE小鼠IgG2a,κ同型控制組(Becton, Dickinson and Company公司、554645)及經純化的NA/LE小鼠IgG2b,κ同型控制組(Becton, Dickinson and Company公司、559530)之3種抗體。16B11、16B12、9F6、18C10及TAL69之   ΔMFI值如表1記載。抗體之ΔMFI值，係由各抗體之MFI值減去陰性控制組抗體之MFI值而算出。
3.對源自胃癌腹膜轉移患者之腹膜間皮細胞的結合活性之確認及數據化 由人類胃癌腹膜轉移患者之腹水中分離的腹膜間皮細胞(本說明書中稱為「源自患者之腹膜間皮細胞」)KM-501-As及KM-503-As之取得係由以下方法進行。 於實施例1-1之細胞建構之過程中，於培養皿一面可見呈石板狀增殖的間皮細胞。將該間皮細胞使用0.05%胰蛋白酶-EDTA回收，以含10% FBS、×1抗生素-抗黴劑之D-MEM(高葡萄糖)(富士軟片和光純藥公司、044-29765) 10mL進行再懸浮。將4×10 5個細胞分取至1.5mL微管，離心分離後去除上清液，添加FCM緩衝液96μL使細胞懸浮。添加FcR Blocking Reagent 4μL，於冰中反應10分鐘。將該反應液50μL分注至別的1.5mL微管，成為細胞2×10 5個/50μL之微管2支。對1支微管添加CD45-APC抗體(Miltenyi Biotec公司、130-091-230)2μL、CD326(EpCAM)-PE (Miltenyi Biotec公司、130-113-264)0.5μL。於另1支管中添加小鼠IgG2a-APC抗體(Miltenyi Biotec公司、130-091-836)2μL、小鼠IgG1-PE抗體0.5μL。將各自的微管於冰中反應30分鐘。於微管各添加1mL之FCM緩衝液，離心分離去除上清液。對沈澱添加FCM緩衝液500μL使細胞再懸浮，使用FACSVerse進行解析。藉由FSC-A(lin)與SSC-A(log)將細胞集團圈選，將該子集合以PE(log)與APC(log)再度展開而取得數據。將所取得之fcs檔案以FlowJo解析。結果，可確認到該細胞集團為CD45陰性且EpCAM陰性之正常細胞。該源自患者之腹膜間皮細胞，可認為係腹膜轉移時作為用以使癌細胞生著、增殖之支架的大網膜或腸道膜所由來之正常細胞。將經分離之源自患者之腹膜間皮細胞之KM-501-As及KM-503-As使用於以下實驗。 10種抗TSPAN8抗體及TAL69對KM-501-As及KM-503-As之結合，係以與實施例1-5之2.記載之對培養人類腹膜間皮細胞之結合的測定相同之方法實施。16B11、16B12、9F6、18C10及TAL69對KM-501-As及KM-503-As之直方圖記載於圖3-1及圖3-2、ΔMFI值記載於表1。
4.對培養人類臍帶血管內皮細胞之結合活性的確認及數據化 藉由流式細胞儀分析法測定10種抗TSPAN8抗體及TAL69對培養人類臍帶血管內皮細胞的結合。培養人類臍帶血管內皮細胞(PromoCell公司、C-12200)係使用內皮細胞成長培養基2套組(PromoCell公司、C-22111)培養。作為陰性控制組抗體，係使用經Ultra-LEAF純化的小鼠IgG1,κ同型控制組抗體、經純化的NA/LE小鼠IgG2a,κ同型控制組、經Ultra-LEAF純化的小鼠IgG2b,κ同型控制組抗體(BioLegend公司、400348)、經LEAF純化的小鼠IgG3,κ同型控制組抗體(BioLegend公司、401310)。作為2次抗體係使用PE山羊抗小鼠Ig。 10種抗TSPAN8抗體及TAL69之結合的直方圖示於圖4。針對16B11、16B12、9F6、18C10及TAL69之ΔMFI值記載於表1。ΔMFI值係由各抗體之MFI減去陰性控制組抗體之MFI而算出。 由圖1至圖4之直方圖之結果及表1之結果，16B11及16B12對癌腹膜轉移細胞顯示出高的結合，但對正常細胞(培養人類腹膜間皮細胞、源自患者之腹膜間皮細胞、培養人類臍帶血管內皮細胞)之結合顯示為較低。另一方面，其他抗TSPAN8抗體9F6、18C10及市售抗TSPAN8抗體(TAL69或REA443)對癌腹膜轉移細胞之結合係低於16B11及16B12，對正常細胞之結合係顯示高於16B11及16B12。由此結果，明顯可知16B11及16B12與其他抗TSPAN8抗體(9F6、18C10、TAL69等)其性質大幅相異。
Figure 02_image001
[實施例2：16B11及16B12之定序] 遵照常規方法，選殖編碼16B11及16B12之重鏈及輕鏈之基因，進行抗體之定序。VelocImmune技術為使用內因性之免疫球蛋白重鏈及輕鏈之可變區域經對應之人類可變區域取代的基因轉殖小鼠來製作抗體之技術。因而，使用VelocImmune技術所得之抗體，為具有人類抗體之可變區域與小鼠抗體之恆定區域的抗體(本說明書中亦稱為「嵌合體抗體」)。所得之16B11之重鏈可變區域之胺基酸序列示於序列編號34、該抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列示於序列編號36。所得之16B12之重鏈可變區域之胺基酸序列示於序列編號35、該抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列示於序列編號37。
[實施例3：完全人類抗TSPAN8抗體之製作] [實施例3-1：完全人類抗TSPAN8抗體製作所用之表現載體之製作] 將實施例2中鑑定的人類可變區域之胺基酸序列與人類恆定區域之胺基酸序列連結來製作16B11及16B12之完全人類抗體。 設計於16B11及16B12之重鏈可變區域之N末端連結有編碼序列編號38記載之訊息序列的胺基酸序列，於C末端連結有人類IgG1恆定區域之胺基酸序列(序列編號4或10之胺基酸編號122至451之序列)的多胜肽。進一步地，導入將由該多胜肽之重鏈可變區域之第16至19號之胺基酸序列所成之弗林(furin)切斷序列(J.Biol.Chem.、1992、Vol.267、p.16396-16402)之第16號的精胺酸(R)取代為甘胺酸(G)之變異。將編碼所設計之多胜肽的多核苷酸導入於pcDNA3.4 TOPO(註冊商標)載體(Thermo Fisher Scientific公司)。所製作之重鏈載體分別稱為pcDNA3.4-16B11.1_HC及pcDNA3.4-16B12.1_HC。 又，設計於16B11之輕鏈可變區域之N末端連結有編碼序列編號39記載之訊息序列的胺基酸序列，於16B12之輕鏈可變區域之N末端連結有編碼序列編號40記載之訊息序列的胺基酸序列，且於兩抗體之C末端側連結有人類κ鏈之恆定區域胺基酸序列(序列編號8或12之胺基酸編號108至213之序列)的多胜肽。將編碼所設計之多胜肽的多核苷酸導入於pcDNA3.4 TOPO(註冊商標)載體。所製作之輕鏈載體分別稱為pcDNA3.4-16B11_LC及pcDNA3.4-16B12_LC。
[實施例3-2：完全人類抗TSPAN8抗體之製作] 使用pcDNA3.4-16B11.1_HC及pcDNA3.4-16B11_LC進行16B11.1抗體之製作。 詳而言之，係對於以ExpiCHO表現培養基(Thermo Fisher Scientific公司、A2910001)培養至達約6.0×10 6個/mL之濃度的ExpiCHO-S細胞(Thermo Fisher Scientific公司、A29127)，使用基因導入試藥ExpiFectamineCHO Transfection Kit(Thermo Fisher Scientific公司、A29129)轉染pcDNA3.4-16B11.1_HC及pcDNA3.4-16B11_LC，培養12日。將培養上清液使用MabSelectSuRe純化，得到完全人類抗體之純化抗體。所得抗體稱為16B11.1。16B11.1之重鏈之鹼基序列示於序列編號3、被其編碼的胺基酸序列示於序列編號4、該抗體之輕鏈之鹼基序列示於序列編號7、被其編碼的胺基酸序列示於序列編號8。 16B12.1可使用pcDNA3.4-16B12.1_HC及pcDNA3.4-16B12_LC以與上述相同之方法製作。16B12.1之重鏈之鹼基序列示於序列編號9、被其編碼的胺基酸序列示於序列編號10、該抗體之輕鏈之鹼基序列示於序列編號11、被其編碼的胺基酸序列示於序列編號12。
[實施例4：抗體所結合之抗原側的抗原決定位部位之鑑定] [實施例4-1：以氫-氘交換質譜分析法來定位抗原決定位] 為了鑑定16B11.1之抗原決定位，係實施氫-氘交換質譜分析(HDX-MS)。結果，係檢測出相當於序列編號2之胺基酸編號126~155的人類TSPAN8區域，作為在16B11.1之存在下氘交換度減少的區域。由此結果，推定相當於序列編號2之胺基酸編號126~155的人類TSPAN8區域為16B11.1之抗原決定位。
[實施例4-2：藉由導入人類TSPAN8變異來細分重要抗原決定位] 為了確認實施例4-1中推定的區域是否為16B11.1之抗原決定位，係將該區域與小鼠或大鼠之TSPAN8之同源區域替換來製作嵌合體蛋白質，以評價結合。相當於人類TSPAN8之胺基酸編號126~155的小鼠TSPAN8之胺基酸編號126~155示於序列編號41、大鼠TSPAN8之胺基酸編號126~155示於序列編號42。 為了製作表現TSPAN8與GFP之融合蛋白質的細胞，係由實施例1-4所用之TSPAN8(Myc-DDK-tagged)-人類四穿膜蛋白8(TSPAN8)(ORIGENE公司、RC202694)使用限制酵素切出人類TSPAN8序列。將所切出之人類TSPAN8序列次選殖於pCMV6-AC-GFP載體(ORIGENE公司、PS100010)(以下稱「人類TSPAN8-GFP表現載體」)。進一步地，使用In-Fusion(註冊商標)HD Cloning Kit(Takara Bio公司、639633)，製作將相當於序列編號2記載之人類TSPAN8-GFP表現載體之胺基酸編號126~155之序列取代為小鼠或大鼠TSPAN8之胺基酸編號126~155之序列的載體。將所製作之載體分別導入於CHO-K1細胞，製作暫時性表現人類TSPAN8-GFP蛋白、人類小鼠TSPAN8-GFP嵌合體蛋白或人類大鼠TSPAN8-GFP嵌合體蛋白之細胞。將所製作之細胞分別稱為表現野生型人類TSPAN8之CHO-K1細胞、表現人類小鼠TSPAN8嵌合體蛋白之CHO-K1細胞或表現人類大鼠TSPAN8嵌合體蛋白之CHO-K1細胞。又，製作將pCMV6-AC-GFP載體導入於CHO-K1細胞而得之細胞(稱為空白對照細胞)。藉由流式細胞儀分析法測定16B11、16B12及TAL69對此等之細胞中之GFP陽性細胞的結合。TAL69對於人類大鼠、表現人類小鼠TSPAN8嵌合體蛋白之CHO-K1細胞均未觀察到結合之降低。16B11及16B12對表現人類大鼠TSPAN8嵌合體蛋白之CHO-K1細胞顯示出與表現野生型人類TSPAN8之CHO-K1細胞同等之結合。另一方面，對表現人類小鼠TSPAN8嵌合體蛋白之CHO-K1細胞，相較於表現野生型人類TSPAN8之CHO-K1細胞而言觀察到結合減弱(圖5-1)。 為了特定出有助於對表現人類小鼠TSPAN8嵌合體蛋白之CHO-K1細胞的結合活性之減弱的胺基酸序列，係對於人類、小鼠、大鼠及食蟹猴之TSPAN8蛋白質，進行相當於人類TSPAN8之胺基酸序列之126~155的序列之比較(圖5-2)。相當於小鼠、大鼠及食蟹猴TSPAN8之胺基酸序列之126~155的序列分別示於序列編號41、42及43。結果，僅於小鼠之TSPAN8蛋白質，胺基酸序列不同的僅為第131號之胺基酸。藉由此資訊，推測序列編號2記載之人類TSPAN8蛋白質之第131號的蘇胺酸(T)對於與16B11或16B12之結合而言為重要。 進一步地，為了確認人類TSPAN8之第131號之胺基酸是否有助於16B11或16B12之結合，係製作該胺基酸之取代體。具體而言，係製作包含編碼序列編號2之人類TSPAN8-GFP中的人類TSPAN8之胺基酸序列的第131號之蘇胺酸(T)取代為丙胺酸(A)或天門冬醯胺(N)之人類TSPAN8-GFP融合蛋白質(分別稱為「人類TSPAN8 (T131A)-GFP」或「人類TSPAN8(T131N)-GFP」)的鹼基序列之載體，於CHO-K1細胞中導入該等載體之基因，構築暫時性表現人類TSPAN8(T131A)-GFP、人類TSPAN8 (T131N)-GFP之細胞。將所構築之細胞稱為表現人類TSPAN8(T131A)之CHO-K1細胞或人類TSPAN8(T131N)細胞。藉由流式細胞儀分析法測定16B11、16B12及TAL69對此等之細胞中之GFP陽性細胞的結合(圖5-3)。結果，16B11及16B12對表現人類TSPAN8(T131A)之CHO-K1細胞及表現人類TSPAN8(T131N)之CHO-K1細胞的結合，相較於對表現野生型人類TSPAN8之CHO-K1細胞的結合而言係減弱。另一方面，TAL69對所有細胞均顯示同等之結合活性。結果，可知鑑定為抗原決定位的對應於序列編號2之胺基酸編號126~155的人類TSPAN8之區域中，第131號之蘇胺酸係對於與16B11及16B12之結合而言必須之胺基酸。 表2-1記載由對各TSPAN8表現細胞之結合之MFI減去對空白對照細胞之結合之MFI所算出的ΔMFI值。又，表2-2係顯示以表2-1之對表現野生型人類TSPAN8之CHO-K1細胞之結合的ΔMFI為100時，對表現人類小鼠TSPAN8嵌合體蛋白之CHO-K1細胞、表現人類大鼠TSPAN8嵌合體蛋白之CHO-K1細胞及表現人類TSPAN8(T131A或T131N)之CHO-K1細胞的結合之ΔMFI相對值。
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[實施例4-3：結合競爭實驗] 調查16B11或16B12與其他抗TSPAN8抗體(9F6、18C10或TAL69)是否競爭與TSPAN8之結合。 為了調查16B11與其他抗TSPAN8抗體(9F6、18C10或TAL69)之競爭，藉由流式細胞儀分析法測定16B11對NSC-15CF細胞之結合量之變化(實驗1；圖6-1)。具體而言，係對2×10 5個NSC-15CF，添加終濃度1μg/mL之Alexa Fluor647標識之16B11與其他抗TSPAN8抗體(16B11、9F6、18C10或TAL69中1種抗體)使得終濃度成為100μg/mL，以流式細胞儀測定16B11對NSC-15CF之結合量。作為陰性控制組抗體，係使用經Ultra-LEAF純化的小鼠IgG1,κ同型控制組抗體、經Ultra-LEAF純化的小鼠IgG2a,κ同型控制組抗體(BioLegend公司、400264)、經Ultra-LEAF純化的小鼠IgG2b,κ同型控制組抗體。結果，16B11之結合，僅在添加16B11本身時減弱。 為了調查16B12與其他抗TSPAN8抗體(16B11、9F6、18C10或TAL69)之競爭，藉由流式細胞儀分析法測定16B12所致之16B11、9F6或18C10對NSC-15CF之結合量的變化(實驗2；圖6-2)。具體而言，係對1×10 5個NSC-15CF，添加終濃度0.25μg/mL之Alexa Fluor647標識16B11、9F6或18C10與終濃度100μg/mL之16B12，以流式細胞儀測定16B11、9F6或18C10對NSC-15CF之結合量。作為陰性控制組抗體，係使用經LEAF純化的小鼠IgG3,κ同型控制組抗體。結果，藉由16B12，16B11之結合係減弱。對其他抗體之結合並不影響。同樣地使用Alexa Fluor647標識16B12與其他抗TSPAN8抗體(16B11、16B12、9F6、18C10或TAL69)實施競爭實驗(實驗3；圖6-3)。作為陰性控制組抗體，係使用經LEAF純化的小鼠IgG3,κ同型控制組抗體、經Ultra-LEAF純化的小鼠IgG2a,κ同型控制組抗體、經Ultra-LEAF純化的小鼠IgG2b,κ同型控制組抗體及經Ultra-LEAF純化的小鼠IgG1,κ同型控制組抗體。結果，16B12之結合，僅於添加16B11及16B12本身時減弱。由16B11及16B12之結合係互相競爭來看，推測16B11與16B12係辨識近似之抗原決定位。表3係顯示由各標識抗體結合之MFI減去未染色細胞之MFI所算出之值中，以添加同型控制組作為競爭抗體時之值為100時，競爭抗體添加時之相對值。
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[實施例5：60As6-Luc/GFP細胞之製作] 由以下方法製作於源自胃癌患者腹水之株化細胞60As6細胞表現螢光酵素蛋白質及綠色螢光蛋白質(GFP)的60As6-Luc/GFP細胞。 [實施例5-1：含Luc/GFP之病毒溶液之製作] 使用L293T細胞(Thermo Fisher Scientific公司、K4975-00)，遵照常規方法進行慢病毒之製作。 慢病毒之製作，係使用MISSION(註冊商標)Lentiviral Packaging Mix(SIGMA公司、SHP001)及pCDH-CMV-GL3-EF1a-GFP-T2A-puro改變載體(廣島大學 醫系科學研究科 細胞分子生物學研究室 高橋陵宇准教授贈送(PLoS One、2015、Vol.10、e0123407、Front Biosci.、2008、Vol.13、p.1619-1633))。由含病毒之細胞之培養上清液，使用45μm Millex(註冊商標)-HV濾器(Merck Millipore公司、SLHV033RS)過濾病毒後，將其作為病毒溶液，於-80℃冷凍保存。 [實施例5-2：病毒對60As6細胞之感染] 病毒對60As6細胞(國立癌研究中心 柳原五吉老師贈送)之感染係遵照常規方法進行。培養基係使用含10%FBS之RPMI-1640。感染3日後由60As6細胞培養盤將培養液去除，取代為含10%FBS、2μg/mL嘌呤黴素(Thermo Fisher Scientific公司、A-11138-02)之RPMI-1640(選擇培養基)，繼續培養。之後，以選擇培養基重複培養及繼代藉以去除未感染之細胞，確認病毒完全去除。將所建構之細胞稱為60As6-Luc/GFP細胞。該細胞係表現螢光酵素及GFP。進一步地，藉由流式細胞儀分析法確認60As6-Luc/GFP細胞係內因性地高表現TSPAN8。
[實施例6：完全人類抗體16B11.1之ADCC活性評價] 測定藉由完全人類抗體抗TSPAN8抗體之16B11.1所誘導之ADCC活性。ADCC活性可藉由評價作用細胞(effector cell)傷害標的細胞之作用來測定。本實施例中，係於作用細胞NK細胞與標的細胞60As6-Luc/GFP細胞之共培養下，藉由16B11.1活化NK細胞，其結果係以螢光酵素為指標來測定60As6-Luc/GFP細胞被ADCC活性所傷害之細胞傷害活性。 NK細胞係由冷凍人類PBMC(ePBMC(註冊商標)，Characterized Cryopreserved人類PBMC、Cellular Technology Limited公司、CTL-CP1)使用NK細胞分離套組(NK Cell Isolation Kit、人類、Miltenyi Biotec公司、130-092-657)分離，且係使用經NK細胞用培養基(NK MACS Medium、Miltenyi Biotec公司、130-114-429)培養者。 於圓底96孔盤(Sumitomo Bakelite公司、MS-9096U)中各播種懸浮於含5% FBS(Hyclone公司、SH30084.03)之RPMI-1640(SIGMA公司、R8758-500mL)培養基的60As6-Luc/GFP細胞5×10 3個/25μL/孔、NK細胞5×10 4個/50μL/孔。進一步地，添加將作為16B11.1或陰性控制組抗體之自公司製之抗KLH抗體(3G6)稀釋為終濃度1、10、100、1000、10000ng/mL的溶液25μL/孔，使用螢光酵素定量化套組(ONE-Glo螢光酵素 Assay System、Promega公司、E6120)測定24小時後之螢光酵素之發光量。螢光酵素之發光量係表示60As6-Luc/GFP細胞之存活量，因此可藉由螢光酵素之發光量的減少來測定ADCC活性所致之細胞傷害活性。 圖7之縱軸表示以僅測定培養基時之螢光酵素之發光量為100%、抗體無添加時之60As6-Luc/GFP細胞中的螢光酵素之發光量為0%時之各樣品的螢光酵素之發光量的相對值。橫軸表示添加於各孔之抗體之濃度。如圖7所示，僅有添加16B11.1的情況，標的細胞係因ADCC活性而被傷害。
[實施例7：抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之製作] [實施例7-1：抗TSPAN8抗體之雙特異性抗體載體製作] 導入將16B11.1之重鏈之胺基酸編號238及239(EU索引：234及235)之胺基酸分別由白胺酸(L)取代為丙胺酸(A)之LALA變異(L234A及L235A)、將胺基酸編號370、372及411(EU索引：366、368及407)之胺基酸分別由蘇胺酸(T)取代為絲胺酸(S)、L取代為A、酪胺酸(Y)取代為纈胺酸(V)之Knobs into holes(Knobs into holes)變異，以及將胺基酸編號301(EU索引：297)之胺基酸由天門冬醯胺(N)取代為甘胺酸(G)之變異。所設計之16B11.1之重鏈胺基酸序列示於序列編號6。所製作之載體稱為pcDNA3.4-16B11.1_HC_H。
[實施例7-2：抗人類CD3抗體之雙特異性抗體載體製作] 人類化抗CD3抗體之序列設計，係基於日本專利第5686953號記載之小鼠抗CD3抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之序列，根據文獻(Front Biosci.、2008、Vol.13、p.1619-1633)記載之方法進行。此時係導入回復突變。將立體結構資訊(PDB Code：5FCS)以MOLSIS Inc.公司提供的整合計算化學系統MOE進行解析，決定框架區域內之回復突變導入位置。人類化抗CD3抗體，係設計為依序配置重鏈可變區域(序列編號14胺基酸編號1至125)、連結基(序列編號14胺基酸編號126至145)、輕鏈可變區域(序列編號14胺基酸編號146至254)、絞鏈(序列編號14胺基酸編號255至269)、CH2結構域(序列編號14胺基酸編號270至379)及CH3結構域(序列編號14胺基酸編號380至486)。進一步地，對於序列編號14，係導入(1)將相當於胺基酸編號44與胺基酸編號247之胺基酸取代為半胱胺酸(C)取代、(2)將胺基酸編號259(EU索引：220)之胺基酸由C取代為S、(3)將胺基酸編號273及274(EU索引：234及235)之胺基酸由L取代為A之LALA變異、(4)將胺基酸編號405(EU索引：366)之胺基酸由T取代為色胺酸(W)之Knobs into holes變異、(5)將胺基酸編號336(EU索引：297)之胺基酸由N取代為G之變異。為了導入此等之變異，係合成編碼包含各自之變異點的胺基酸序列之多核苷酸，插入於pcDNA3.1(+)載體(Thermo Fisher scientific公司、V79020)。將所製作之載體稱為pcDNA3.1-m7_scFV_K。所製作之人類化抗CD3抗體之鹼基序列示於序列編號13、胺基酸序列示於序列編號14。
[實施例7-3：抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之製作] 為了製作由抗TSPAN8抗體之Fab區域、抗CD3抗體之scFv區域與Fc區域所構成的雙特異性抗體，係將pcDNA3.4-16B11.1_HC_H、pcDNA3.4-16B11_LC、pcDNA3.1-m7_scFV_K與實施例3之方法同樣地對ExpiCHO-S(註冊商標)細胞轉染。將培養上清液使用MabSelect SuRe純化，進一步使用凝膠過濾管柱HiLoad26/600 Superdex(註冊商標)200pg(GE Healthcare公司、28-9893-36)純化，藉以得到純度95%以上之純化抗體。所得抗體稱為抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體。
[實施例8：抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之結合活性評價] 藉由使用了TSPAN8之LEL蛋白或CD3εδ複合蛋白的ELISA法，分別評價抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體對TSPAN8與CD3之結合活性。 詳而言之，係將經PBS稀釋之TSPAN8 蛋白質，人類重組(SinoBiological公司、15683-H07H)或Human CellExp CD3 epsilon & CD3 delta異二聚體，人類重組(BioVision公司、P1183-10)1μg/mL於384-Well White Plates, MaxiSorp (Nunc公司、460372)中添加30μL/孔。於4℃靜置整夜後將上清液去除，添加Blocking One(Nacalai Tesque公司、03953-95)120μL/孔。於室溫1小時靜置後，去除上清液，以TBST緩衝液(Thermo Fisher scientific公司、28360)洗淨2次後，將經含10% Blocking One之TBST稀釋之抗TSPAN8 (16B11)-抗CD3雙特異性抗體各添加30μL/孔，於室溫1小時靜置。去除抗體溶液，以TBST緩衝液洗淨2次後，將經含10% Blocking One之TBST稀釋5000倍之山羊抗人類Kappa，小鼠ads-HRP(SouthernBiotech公司、2061-05)添加30μL/孔，於室溫30分鐘靜置。去除抗體溶液，以TBST緩衝液洗淨4次後，添加BM Chemiluminescence ELISA Substrate(POD)(Roche公司、11582950001)30μL/孔。於室溫反應15分鐘後，以ARVO X3(Perkin Elmer公司)測定化學發光。結果，對TSPAN8及CD3之EC50值分別算出為1.0μg/mL(8.1nM)、4.6μg/mL(36nM)(圖8)。
[實施例9：抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之RTCC活性評價] 使用於RPMI-1640(Thermo Fisher Scientific公司、11875-119)500mL中添加有FBS 50mL、MEM非必需胺基酸(Merck公司、M7145)5mL、丙酮酸鈉(Merck公司、S8636)5mL、GlutaMAX I(Thermo Fisher Scientific公司、35050-061)5mL、盤尼西林-鏈黴素(Thermo Fisher Scientific公司、15070-063)5mL、HEPES(Thermo Fisher Scientific公司、15630-080)5mL者作為培養基(以下於本實施例中稱為「培養基」)。將實施例4所製作之60As6-Luc/GFP細胞經培養基調製為2×10 5個/mL之細胞懸浮液於平底96孔盤(IWAKI公司、3860-096)中各播種50μL，於37℃、5% CO 2培養箱中進行培養。3小時後，將經培養基調製為1×10 6個/mL之冷凍人類末梢血單核細胞(LP.CR.MNC 10M；AllCells LLC公司、4W-270)，於培養中之96孔盤中各播種100μL。各添加50μL的調製為終濃度0、3、10、30、100、300、1000、3000、10000 ng/mL的抗TSPAN8 (16B11)-抗CD3雙特異性抗體，於37℃、5% CO 2培養下，於3日後以IncuCyte(註冊商標) ZOOM(Sartorius公司)測定各孔之螢光(GFP)面積。以螢光面積為細胞增殖之指標，於圖9顯示細胞增殖曲線。圖9之縱軸，表示以僅有培養基之孔的螢光面積為0%、以未添加抗體溶液之孔的螢光面積為100%時的60As6-Luc/GFP細胞之螢光面積的相對值。結果，抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體對於表現TSPAN8之胃癌細胞60As6-Luc/GFP細胞，於in vitro顯示出細胞增殖抑制作用。
[實施例10：抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之使用了患者腹水細胞之藥效評價] 抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體結合於患者腹水細胞中所含的癌細胞及免疫細胞時，免疫細胞被活化，癌細胞被傷害。由以下方法評價抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體所致之癌細胞傷害作用及免疫細胞活化作用。 患者腹水細胞係與實施例1-1同樣地將患者腹水實施至溶血處理後，使用經冷凍保存之細胞。將融解之細胞以與實施例9相同之培養基調製為2×10 6個/mL，將該細胞溶液於平底96孔盤中各播種100μL/孔。作為被試驗抗體，係使用抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體及對照抗體(將16B11.1之Fab取代為抗KLH(鑰孔帽貝血藍蛋白)抗體之Fab的抗KLH抗體與抗CD3抗體之雙特異性抗體)。被試驗抗體係由10μg/mL以10倍公比稀釋至0.1ng/mL。將被試驗抗體添加至播種過細胞的96孔盤後，於37℃、5% CO 2培養箱中進行培養。培養係使用培養基。3日後回收細胞，撒種於V底微孔盤。將回收時接著於培養盤的細胞以Accutase(Innovative Cell Technologies公司、AT-104)予以剝離後，添加至V底微孔盤。以720×g離心分離2分鐘後去除上清液，於染色緩衝液(含10% FBS之PBS 0.09% NaN 32mM EDTA)中添加40分之1量的人類BD Fc Block(Becton, Dickinson and Company公司、564220)後將該液體以20μL/孔進行添加。對各孔添加經染色緩衝液稀釋之FITC小鼠抗人類CD4(Becton, Dickinson and Company公司、550628)、APC-H7小鼠抗人類CD8(Becton, Dickinson and Company公司、560179)、APC小鼠抗人類CD45(Becton, Dickinson and Company公司、555485)、PE小鼠抗人類CD25(Becton, Dickinson and Company公司、555432)、Brilliant Violet 421抗人類CD326 (EpCAM)抗體(BioLegend公司、324220)各為10μL/孔，於4℃靜置50分鐘。將細胞以染色緩衝液洗淨1次後，再懸浮於含1/200量之7-AAD solution的染色緩衝液中，使用CytoFLEX S(Beckman Coulter公司)藉由流式細胞儀分析法測定各種抗體對腹水細胞之結合。數據解析係以FlowJo進行。對於活細胞之指標之7-AAD陰性細胞區分，以免疫細胞之指標CD45及癌細胞之指標EpCAM進行展開。將CD45陰性EpCAM陽性癌細胞展開為Fsc(lin)與Ssc(lin)，將去除過經片段化之區分的細胞作為癌細胞之活細胞數。進一步地，測定CD45陽性區分之CD4或CD8陽性細胞中活化標記之CD25的表現，算出anti-CD25-PE螢光強度之MFI。圖10-1中顯示癌細胞之活細胞數之變化。縱軸表示以未添加抗體溶液時之癌細胞的細胞數為100%時之細胞數的相對值。圖10-2及10-3中顯示被試驗抗體所致之CD4陽性T細胞及CD8陽性T細胞上之CD25表現量的變化。縱軸表示算出anti-CD25-PE螢光強度之MFI的相對值後之值。 結果，如圖10-1所示，藉由添加抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體，觀察到腹水中癌細胞之活細胞數的減少，如圖10-2、圖10-3所示，觀察到腹水中CD4陽性T細胞與CD8陽性T細胞之活化。由此結果，顯示了抗TSPAN8 (16B11)-抗CD3雙特異性抗體會活化腹水中CD4陽性T細胞與CD8陽性T細胞，將腹水中癌細胞殺滅。
[實施例11：抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體之in vivo抗腫瘤評價] 使用胃癌腹膜轉移模式評價抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體所致之in vivo抗腫瘤作用。 [實施例11-1：Expanded panT細胞之製作] 將以PBS溶解為3μg/mL之抗CD3抗體(BioLegend公司、317315)於24孔盤(IWAKI公司、3820-024)中各添加250μL，於4℃靜置。翌日，將培養盤以培養基洗淨2次後，添加培養基，於室溫靜置至後述細胞播種為止。由HPBMC，人類周邊血單核球細胞，冷凍保存(LONZA公司、CC-2702)分離panT細胞(含CD4T細胞及CD8T細胞兩者)。分離係使用PanT細胞分離套組，人類(Miltenyi Biotec公司、130-096-535)，基於所附之實驗指南進行實驗。由前述24孔盤去除培養基，於培養盤中播種經培養基調製為3×10 6個/mL之panT細胞各500μL。進一步地添加含20ng/mL之人類IL-2(PeproTech公司、200-2)及2μg/mL之抗CD28抗體(BioLegend公司、302923)的培養基各500μL，於37℃、5% CO 2培養箱進行培養。將細胞於新的培養盤(IWAKI公司、3810-006)中開始培養3日後、5日後及7日後進行繼代，添加IL-2使終濃度成為10ng/mL。回收培養開始7日後與10日後之細胞，使用於實施例10-2。此處經分離、增殖之細胞稱為Expanded panT細胞。
[實施例11-2：胃癌腹膜轉移模式中之藥效確認] 於各群7例之7週齡C.B17/Icr-scid/scidJcl雌小鼠(日本CLEA公司)之腹腔內移植1×10 6個/1mL/PBS之60As6-Luc/GFP細胞。移植6日後以於60As6-Luc/GFP細胞中導入的螢光酵素所致之基質螢光素之發光量為指標，以各群成為均等的方式進行分群。使用螢光素之發光量作為顯示腫瘤體積之指標。 詳而言之，對各個體之腹腔內投予將3mg螢光素(VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade、Promega公司、P1043)溶解於0.5mL之PBS而得的溶液，投予10分鐘後將發光量以IVIS Lumina II(perkinelmer公司)進行測定。接著於60As6-Luc/GFP細胞移植7日後及10日後將使1×10 7個expanded panT細胞懸浮於0.5mL之PBS而得的液體及使0、0.3、1.0、3.0mg/kg抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體懸浮於0.2mL之PBS而得的液體進行腹腔內投予。於胃癌細胞移植14日後，測定螢光素之發光量，評價腫瘤體積之增減。又，觀察該腹膜轉移模式小鼠之存活至60As6-Luc/GFP細胞移植34日後為止。如圖11-1所示，於抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體投予群中，顯示出顯著的腫瘤體積縮小作用，如圖11-2所示，於1.0及3.0mg/kg投予群中，觀察到顯著的存活期間延長效果。表4顯示存活中央值及檢定結果。表中之顯著差異P值，係藉由以對數秩(log-rank)檢定來比較對照群(溶劑投予群)之存活期間與抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體投予群之存活期間而求得。**顯示以Bonferroni之方法所校正之P值小於顯著水準0.01/3之群。
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[實施例12：抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體對各癌腫瘤細胞株之作用] [實施例12-1：抗TSPAN8抗體之對各癌腫瘤細胞株之結合活性之確認] 藉由流式細胞儀分析法測定Alexa Fluor647標識16B11對胃癌細胞株(KATOIII細胞：Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB)、JCRB0611、NUGC-4細胞：RIKEN BioResource Research Center(BRC)、RCB1939、60As6-Luc/GFP細胞)、結腸癌細胞株(HT-29細胞：ATCC、HTB-38、LoVo細胞：ATCC、CCL-229、GP2d細胞：The European Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC)、95090714)、胰臟癌細胞株(AsPC-1細胞：ATCC、CRL-1682)、食道癌細胞株(OE19細胞：ECACC、96071721)、肝臟癌細胞株(Li-7細胞：RIKEN BRC、RCB1941)之結合。作為陰性控制組抗體，係使用自公司製之抗KLH抗體(173A1)經Alexa Fluor647標識者。各癌腫瘤細胞株之16B11與陰性控制組抗體之結合的直方圖示於圖12。
[實施例12-2：抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體對各癌腫瘤細胞株之RTCC活性評價] 將KATOIII細胞、NUGC-4細胞、HT-29細胞、LoVo細胞、GP2d細胞、AsPC-1細胞、OE19細胞、Li-7細胞以培養基調製為2×10 5個/mL，於平底96孔盤(IWAKI公司、3860-096)中各播種50μL，於37℃、5% CO 2培養箱進行培養。將經培養基調製為1×10 6個/mL之冷凍人類末梢血單核細胞(LONZA公司、CC-2702)，於培養中之96孔盤中各播種100μL。將抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體，以40μg/mL或20μg/mL為最高濃度，以成為2倍公比的方式以培養基稀釋。將經稀釋之抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體添加50μL(最高終濃度為10μg/mL或5μg/mL)。將添加有癌細胞株、冷凍人類末梢血單核細胞及抗體之96孔盤於37℃、5% CO 2培養箱進行培養。3日後回收細胞，撒種於V底微孔盤中。將回收時接著於培養盤之細胞以Accutase(Innovative Cell Technologies公司、AT104)予以剝離後，添加於V底微孔盤中。以720×g離心分離2分鐘後去除上清液，以20μL/孔添加於染色緩衝液中添加有40分之1量的人類BD Fc Block之液體。對各孔添加經染色緩衝液稀釋之APC小鼠抗人類CD4(Becton, Dickinson and Company公司、555349)、APC-H7小鼠抗人類CD8、Brilliant Violet 421小鼠抗人類CD45(Becton, Dickinson and Company公司、563879)、PE小鼠抗人類CD25各10μL/孔，於4℃1小時靜置。以染色緩衝液洗淨1次後，添加1/200量之7-AAD solution。再懸浮於染色緩衝液，使用CytoFLEX S藉由流式細胞儀分析法測定各種抗體之結合。數據解析係以FlowJo進行。將活細胞之指標的7-AAD陰性細胞區分中之CD45陰性細胞數作為癌細胞之活細胞數。以未添加抗體溶液作為100%。進一步地，對於CD45陽性區分之CD4或CD8陽性細胞，將anti-CD25-PE螢光強度之MFI，作為以未添加抗體溶液為1時之倍率變化，分別算出活化標記CD25之表現。結果，如圖13-1所示，藉由添加抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體，可見表現TSPAN8之癌細胞之活細胞數的減少。進一步地，如圖13-2及圖13-3所示，分別觀察到CD4陽性T細胞與CD8陽性T細胞之活化。
[實施例12-3：人類PBMC移入HT-29細胞皮下荷癌模式中的藥效確認] 使正常人類PBMC(Precision for Medicine、33000-10M)懸浮於PBS而成為1.25×10 7個/mL，於6週齡NOD/Shi-scid, IL-2RγKO(NOG)雌小鼠(In-Vivo Science)之小鼠尾靜脈內注射2.5×10 6個/200μL之細胞。人類PBMC移入10日後，使HT-29細胞懸浮於PBS而成為5×10 7個/mL，以5×10 6個/100μL使小鼠之皮下荷癌。自HT-29細胞之荷癌起10日後，使用卡尺測定腫瘤體積，以成為各群均等的方式進行分群(n=10)。自同日起開始抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體之投予。將投予初日定義為第0日。於第0、4、7日對小鼠靜脈內投予PBS或0.3、1、3、10mg/kg之抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體。於第0、4、7及11日測定腫瘤體積(圖14-1)。由下式計算腫瘤體積[mm 3]。 (腫瘤長軸之長度[mm])×(腫瘤短軸之長度[mm]) 2×0.5 如圖14-2所示，抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體，係於0.3、1、3及10 mg/kg顯著地抑制HT-29腫瘤之增殖。 [產業上之可利用性]
本發明之抗TSPAN8抗體及抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體等之抗TSPAN8抗體之融合體，被期待有用於癌之治療。又，本發明之多核苷酸、表現載體、經轉形之宿主細胞及生產抗體之方法，係有用於生產前述抗TSPAN8抗體及其融合體。 [序列表非關鍵詞文字]
以下之序列表之數字標題＜223＞，係記載「人工序列」之說明。具體而言，序列編號2表示人類TSPAN8-Myc-DDK之胺基酸序列，序列編號1所示之鹼基序列，為編碼序列編號2所示之人類TSPAN8之胺基酸序列的鹼基序列。序列編號4、6或10為抗TSPAN8抗體之重鏈之胺基酸序列，序列編號3、5或9所示之鹼基序列，為編碼序列編號4、6或10所示之抗TSPAN8抗體之重鏈之胺基酸序列的鹼基序列。序列編號8或12之序列為抗TSPAN8抗體之輕鏈之胺基酸序列，序列編號7或11表示之鹼基序列，為編碼序列編號8或12所示之抗TSPAN8抗體之輕鏈胺基酸序列的鹼基序列。序列編號14為抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽之胺基酸序列，序列編號13所示之鹼基序列，為編碼序列編號14所示之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽之胺基酸序列的鹼基序列。序列編號15~23為發明之詳細說明中所記載的各種連結基之胺基酸序列。序列編號24~37為16B11及16B12之CDR及可變區域之胺基酸序列。序列編號38~40為訊息序列之胺基酸序列。序列編號41~43分別為小鼠、大鼠或食蟹猴的TSPAN8之胺基酸編號126~155之區域之胺基酸序列。
[圖1-1]圖1-1顯示藉由流式細胞儀分析法測定抗TSPAN8抗體(16B11、16B12、9F6、18C10)對KM-291-As之結合性之結果。圖之16B11、16B12、9F6、18C10表示抗體名。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之白底表示陰性控制組抗體之結合，深灰色表示抗TSPAN8抗體之結合。 [圖1-2]圖1-2顯示藉由流式細胞儀分析法測定抗TSPAN8抗體(16B11、9F6、18C10)對KM-555-As之結合性之結果。圖之16B11、9F6、18C10表示抗體名。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之白底表示陰性控制組抗體之結合，深灰色表示抗TSPAN8抗體之結合。 [圖1-3]圖1-3顯示藉由流式細胞儀分析法測定抗TSPAN8抗體(16B11、9F6、18C10)對KM-556-As之結合性之結果。圖之16B11、9F6、18C10表示抗體名。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之白底表示陰性控制組抗體之結合，深灰色表示抗TSPAN8抗體之結合。 [圖2-1]圖2-1顯示藉由流式細胞儀分析法測定抗TSPAN8抗體(16B11、16B12、9F6、5B7、12C12、13A9、15D1、TAL69)對培養人類腹膜間皮細胞之結合性之結果。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之白底表示陰性控制組抗體之結合，深灰色表示抗TSPAN8抗體之結合。 [圖2-2]圖2-2顯示藉由流式細胞儀分析法測定抗TSPAN8抗體(18C10、19E4、21F7、TAL69)對培養人類腹膜間皮細胞之結合性之結果。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之白底表示陰性控制組抗體之結合，深灰色表示抗TSPAN8抗體之結合。 [圖3-1]圖3-1顯示藉由流式細胞儀分析法測定抗TSPAN8抗體(16B11、16B12、9F6、18C10、TAL69)對KM-501-As之結合性之結果。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之白底表示陰性控制組抗體之結合，深灰色表示抗TSPAN8抗體之結合。 [圖3-2]圖3-2顯示藉由流式細胞儀分析法測定抗TSPAN8抗體(16B11、16B12、9F6、18C10、TAL69)對KM-503-As之結合性之結果。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之白底表示陰性控制組抗體之結合，深灰色表示抗TSPAN8抗體之結合。 [圖4]圖4顯示藉由流式細胞儀分析法測定抗TSPAN8抗體(16B11、16B12、9F6、5B7、12C12、13A9、15D1、18C10、19E4、21F7、TAL69)對人類臍帶血管內皮細胞 捐贈者2之結合性之結果。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之白底表示陰性控制組抗體之結合，深灰色表示抗TSPAN8抗體之結合。 [圖5-1]圖5-1顯示藉由流式細胞儀分析法測定抗TSPAN8抗體(16B11、16B12、TAL69)對表現人類小鼠TSPAN8-GFP嵌合體蛋白質或人類大鼠TSPAN8-GFP嵌合體蛋白質的CHO-K1細胞(表現嵌合體蛋白之CHO-K1細胞)之結合性之結果。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之灰色表示抗TSPAN8抗體對表現野生型人類TSPAN8之CHO-K1細胞之結合、黑色表示抗TSPAN8抗體對表現嵌合體蛋白之CHO-K1細胞之結合、白底表示抗TSPAN8抗體對空白對照(mock)細胞之結合。實驗係以二重複(duplicate)實施。 [圖5-2]圖5-2表示由人類、小鼠、大鼠及食蟹猴之4種TSPAN8蛋白質之胺基酸編號126~155所成之序列的相似性。星號表示為完全一致之胺基酸，點表示4種中3種為同一胺基酸。空白表示2種以上為不同的胺基酸。 [圖5-3]圖5-3顯示藉由流式細胞儀分析法測定抗TSPAN8抗體(16B11、16B12、TAL69)對人類TSPAN8蛋白質的T131A變異體或T131N變異體之結合性之結果。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之灰色表示抗TSPAN8抗體對表現野生型人類TSPAN8之CHO-K1細胞之結合、黑色表示抗TSPAN8抗體對表現變異體之CHO-K1細胞之結合、白底表示抗TSPAN8抗體對空白對照細胞之結合。實驗係以二重複實施。 [圖6-1]圖6-1顯示藉由流式細胞儀分析法測定其他抗TSPAN8抗體(Competitor(CPTR)：16B11、9F6、18C10、TAL69)對於16B11對NSC-15CF之結合的競爭作用之結果。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之灰色表示於陰性控制組抗體存在下之螢光標識16B11之結合、黑色表示於各CPTR存在下之螢光標識16B11之結合、白底表示螢光標識16B11未染色之直方圖。 [圖6-2]圖6-2顯示藉由流式細胞儀分析法測定16B12對於螢光標識抗TSPAN8抗體(16B11、9F6、18C10)對NSC-15CF之結合的競爭作用之結果。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之灰色表示於陰性控制組抗體存在下之螢光標識抗TSPAN8抗體之結合、黑色表示於16B12存在下之螢光標識抗TSPAN8抗體之結合、白底表示螢光標識抗體未染色之直方圖。 [圖6-3]圖6-3顯示藉由流式細胞儀分析法測定其他抗TSPAN8抗體(CPTR：16B12、16B11、9F6、18C10、TAL69)對於16B12對NSC-15CF之結合的競爭作用之結果。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之灰色表示於陰性控制組抗體存在下之螢光標識16B12之結合、黑色表示於其他抗TSPAN8抗體(CPTR)存在下之螢光標識16B12之結合、白底表示螢光標識抗體未染色之直方圖。 [圖7]圖7表示於60As6-Luc/GFP細胞與人類NK細胞之共培養系中，16B11.1之細胞傷害活性。橫軸表示抗體濃度、縱軸表示由自60As6-Luc/GFP細胞產生的螢光酵素活性所算出之細胞傷害活性。●、▲分別表示對照抗體、16B11.1之各濃度下的細胞傷害活性之平均值。誤差槓表示標準偏差。 [圖8]圖8表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體對TSPAN8之LEL區域胜肽及CD3εδ複合蛋白之結合活性。橫軸表示抗體濃度、縱軸表示抗體之結合量。圖8-1、圖8-2分別表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體對TSPAN8之LEL區域胜肽、CD3εδ複合蛋白之結合量的平均值。誤差槓表示標準偏差。 [圖9]圖9表示60As6-Luc/GFP細胞與人類末梢血單核細胞之共培養系中的抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體之細胞傷害活性。橫軸表示抗體濃度、縱軸表示60As6-Luc/GFP細胞於抗體添加3日後之螢光面積中，以無添加抗體為100%時之細胞增殖(%)。●表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體之各濃度中，細胞增殖的平均值。誤差槓表示標準偏差。 [圖10-1]圖10-1表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體對人類胃癌患者腹水細胞中之胃癌細胞的細胞傷害活性。橫軸表示抗體濃度、縱軸表示胃癌細胞於抗體添加3日後之活細胞數中，以無添加抗體為100%時的活細胞數(%)。●、■分別表示對照抗體、抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體之各濃度中活細胞數(%)的平均值。誤差槓表示標準偏差。 [圖10-2]圖10-2為以CD25之表現誘導來表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體所致之人類胃癌患者腹水細胞中的CD4陽性T細胞之活化的圖。橫軸表示抗體濃度。縱軸表示對腹水中CD4陽性T細胞添加抗體3日後之CD25表現量的倍率變化。●、■分別表示對照抗體、抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體之各濃度中CD25的表現量之倍率變化的平均值。誤差槓表示標準偏差。 [圖10-3]圖10-3為以CD25之表現誘導來表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體所致之人類胃癌患者腹水細胞中的CD8陽性T細胞之活化的圖。橫軸表示抗體濃度。縱軸表示對腹水中CD8陽性T細胞添加抗體3日後之CD25表現量的倍率變化。●、■分別表示對照抗體、抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體之各濃度中CD25的表現量之倍率變化的平均值。誤差槓表示標準偏差。 [圖11-1]圖11-1表示胃癌腹膜轉移模式中抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體之抗腫瘤效果。縱軸表示腹腔中之60As6-Luc/GFP細胞所表現的螢光酵素所致之螢光素之發光量的平均值。誤差槓表示標準誤差。橫軸表示抗體投予量。顯著差異P值係藉由以Dunnett之多重比較檢定比較對照群之發光量與抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體投予群之發光量來求得。圖中之**，表示P值小於顯著水準0.01之群。 [圖11-2]圖11-2表示胃癌腹膜轉移模式中抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體所致對存活日數之效果。縱軸表示存活率。橫軸表示癌細胞移植後日數。抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體及Expanded panT細胞係於▲表示之60As6-Luc/GFP移植後7、10日後進行投予。 [圖12]圖12表示藉由流式細胞儀分析法測定16B11對各種癌細胞株之結合性之結果。圖之橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞計數。圖中之白底表示陰性控制組抗體之結合，深灰色表示16B11之結合。 [圖13-1]圖13-1表示於人類末梢血單核細胞共培養下，抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體所致對各種癌細胞株之細胞傷害活性。橫軸表示抗體濃度、縱軸表示各癌細胞株於抗體添加3日後之活細胞數中，以無添加抗體為100%時之活細胞數(%)。各符號表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體之各濃度中的各癌細胞株之活細胞數(%)的平均值(quadruplicate)。 [圖13-2]圖13-2為以CD25之表現誘導來表示人類末梢血單核細胞與各種癌細胞株共培養中，抗TSPAN8 (16B11)-抗CD3雙特異性抗體所致之CD4陽性T細胞之活化的圖。橫軸表示抗體濃度。縱軸表示添加抗體3日後之CD4陽性T細胞的CD25表現量之倍率變化。各符號表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體之各濃度中之CD25的表現量之倍率變化的平均值(quadruplicate)。 [圖13-3]圖13-3為以CD25之表現誘導來表示人類末梢血單核細胞與各種癌細胞株共培養中，抗TSPAN8 (16B11)-抗CD3雙特異性抗體所致之CD8陽性T細胞之活化的圖。橫軸表示抗體濃度。縱軸表示添加抗體3日後之CD8陽性T細胞的CD25表現量之倍率變化。各符號表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體之各濃度中之CD25的表現量之倍率變化的平均值(quadruplicate)。 [圖14]圖14表示人類PBMC移入HT-29細胞皮下荷癌模式中之抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體之抗腫瘤效果。圖14-1表示抗體投予開始後之日數中腫瘤體積的平均值及誤差槓表示標準誤差。圖14-2表示投予開始11日後之各個體的腫瘤體積之值及橫線表示平均值與標準誤差，橫軸表示抗體投予量。顯著差異P值，係藉由以Dunnett之多重比較檢定比較PBS投予群之腫瘤體積與抗TSPAN8(16B11)-抗CD3雙特異性抗體投予群之腫瘤體積而求得。圖中之**，表示P值小於顯著水準0.01之群。 

          <![CDATA[<110>  安斯泰來製藥股份有限公司(Astellas Pharma Inc.)]]>
                 國立研究開發法人國立癌症研究中心(National Cancer Center)
          <![CDATA[<120>  抗TSPAN8-抗CD3雙特異性抗體及抗TSPAN8抗體]]>
          <![CDATA[<150>  JP2020-189988]]>
          <![CDATA[<151>  2020-11-16]]>
          <![CDATA[<160>  43    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  807]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類 TSPAN8-Myc-DDK]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  CDS]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(807)]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          atg gca ggt gtg agt gcc tgt ata aaa tat tct atg ttt acc ttc aac         48
          Met Ala Gly Val Ser Ala Cys Ile Lys Tyr Ser Met Phe Thr Phe Asn           
          1               5                   10                  15                
          ttc ttg ttc tgg cta tgt ggt atc ttg atc cta gca tta gca ata tgg         96
          Phe Leu Phe Trp Leu Cys Gly Ile Leu Ile Leu Ala Leu Ala Ile Trp           
                      20                  25                  30                    
          gta cga ata agc aat gac tct caa gca att ttt ggt tct gaa gat gta        144
          Val Arg Ile Ser Asn Asp Ser Gln Ala Ile Phe Gly Ser Glu Asp Val           
                  35                  40                  45                        
          ggc tct agc tcc tac gtt gct gtg gac ata ttg att gct gta ggt gcc        192
          Gly Ser Ser Ser Tyr Val Ala Val Asp Ile Leu Ile Ala Val Gly Ala           
              50                  55                  60                            
          atc atc atg att ctg ggc ttc ctg gca tgc tgc ggt gct ata aaa gaa        240
          Ile Ile Met Ile Leu Gly Phe Leu Ala Cys Cys Gly Ala Ile Lys Glu           
          65                  70                  75                  80            
          agt cgc tgc atg ctt ctg ttg ttt ttc ata ggc ttg ctt ctg atc ctg        288
          Ser Arg Cys Met Leu Leu Leu Phe Phe Ile Gly Leu Leu Leu Ile Leu           
                          85                  90                  95                
          ctc ctg cag gtg gcg aca ggt atc cta gga gct gtt ttc aaa tct aag        336
          Leu Leu Gln Val Ala Thr Gly Ile Leu Gly Ala Val Phe Lys Ser Lys           
                      100                 105                 110                   
          tct gat cgc att gtg aat gaa act ctc tat gaa aac aca aag ctt ttg        384
          Ser Asp Arg Ile Val Asn Glu Thr Leu Tyr Glu Asn Thr Lys Leu Leu           
                  115                 120                 125                       
          agc gcc aca ggg gaa agt gaa aaa caa ttc cag gaa gcc ata att gtg        432
          Ser Ala Thr Gly Glu Ser Glu Lys Gln Phe Gln Glu Ala Ile Ile Val           
              130                 135                 140                           
          ttt caa gaa gag ttt aaa tgc tgc ggt ttg gtc aat gga gct gct gat        480
          Phe Gln Glu Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Val Asn Gly Ala Ala Asp           
          145                 150                 155                 160           
          tgg gga aat aat ttt caa cac tat cct gaa tta tgt gcc tgt cta gat        528
          Trp Gly Asn Asn Phe Gln His Tyr Pro Glu Leu Cys Ala Cys Leu Asp           
                          165                 170                 175               
          aag cag aga cca tgc caa agc tat aat gga aaa caa gtt tac aaa gag        576
          Lys Gln Arg Pro Cys Gln Ser Tyr Asn Gly Lys Gln Val Tyr Lys Glu           
                      180                 185                 190                   
          acc tgt att tct ttc ata aaa gac ttc ttg gca aaa aat ttg att ata        624
          Thr Cys Ile Ser Phe Ile Lys Asp Phe Leu Ala Lys Asn Leu Ile Ile           
                  195                 200                 205                       
          gtt att gga ata gca ttt gga ctg gca gtt att gag ata ctg ggt ttg        672
          Val Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Ala Val Ile Glu Ile Leu Gly Leu           
              210                 215                 220                           
          gtg ttt tct atg gtc ctg tat tgc cag atc ggg aac aaa acg cgt acg        720
          Val Phe Ser Met Val Leu Tyr Cys Gln Ile Gly Asn Lys Thr Arg Thr           
          225                 230                 235                 240           
          cgg ccg ctc gag cag aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg gca gca aat        768
          Arg Pro Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Asn           
                          245                 250                 255               
          gat atc ctg gat tac aag gat gac gac gat aag gtt taa                    807
          Asp Ile Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Val                           
                      260                 265                                       
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  268]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成建構物 (Synthetic construct)]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Ala Gly Val Ser Ala Cys Ile Lys Tyr Ser Met Phe Thr Phe Asn 
          1               5                   10                  15      
          Phe Leu Phe Trp Leu Cys Gly Ile Leu Ile Leu Ala Leu Ala Ile Trp 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Ile Ser Asn Asp Ser Gln Ala Ile Phe Gly Ser Glu Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ser Ser Tyr Val Ala Val Asp Ile Leu Ile Ala Val Gly Ala 
              50                  55                  60                  
          Ile Ile Met Ile Leu Gly Phe Leu Ala Cys Cys Gly Ala Ile Lys Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Cys Met Leu Leu Leu Phe Phe Ile Gly Leu Leu Leu Ile Leu 
                          85                  90                  95      
          Leu Leu Gln Val Ala Thr Gly Ile Leu Gly Ala Val Phe Lys Ser Lys 
                      100                 105                 110         
          Ser Asp Arg Ile Val Asn Glu Thr Leu Tyr Glu Asn Thr Lys Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Ser Ala Thr Gly Glu Ser Glu Lys Gln Phe Gln Glu Ala Ile Ile Val 
              130                 135                 140                 
          Phe Gln Glu Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Val Asn Gly Ala Ala Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Gly Asn Asn Phe Gln His Tyr Pro Glu Leu Cys Ala Cys Leu Asp 
                          165                 170                 175     
          Lys Gln Arg Pro Cys Gln Ser Tyr Asn Gly Lys Gln Val Tyr Lys Glu 
                      180                 185                 190         
          Thr Cys Ile Ser Phe Ile Lys Asp Phe Leu Ala Lys Asn Leu Ile Ile 
                  195                 200                 205             
          Val Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Ala Val Ile Glu Ile Leu Gly Leu 
              210                 215                 220                 
          Val Phe Ser Met Val Leu Tyr Cys Gln Ile Gly Asn Lys Thr Arg Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Pro Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Asn 
                          245                 250                 255     
          Asp Ile Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Val 
                      260                 265             
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  1356]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B11.1_HC]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  CDS]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1356)]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          cag gtt cag ctg gtt gaa tct ggc ggc gga gtt gtt cag cct ggc gga         48
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly           
          1               5                   10                  15                
          tct ctg aga ctg tct tgt gcc gcc tcc ggc ttc acc ttc tcc tct tac         96
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr           
                      20                  25                  30                    
          gga atg cac tgg gtc cga cag gcc cct ggc aaa gga ttg gaa tgg gtc        144
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val           
                  35                  40                  45                        
          gcc gtg att tgg tac gac ggc cgg aac aag tac tac gcc gac tcc gtg        192
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val           
              50                  55                  60                            
          aag ggc aga ttc acc atc tct cgg gac aac tcc aag aac acc ctg tac        240
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr           
          65                  70                  75                  80            
          ctg cag atg aac tcc ctg aga gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc        288
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys           
                          85                  90                  95                
          acc aga gat cac tcc ggc tcc ggc agc tac tac atc gat tat tgg ggc        336
          Thr Arg Asp His Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly           
                      100                 105                 110                   
          cag ggc acc ctg gtc acc gtg tcc tct gct tct acc aag gga ccc agc        384
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser           
                  115                 120                 125                       
          gtg ttc cct ctg gct cct tcc agc aag tct acc tct ggc gga aca gct        432
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala           
              130                 135                 140                           
          gct ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttt cct gag cct gtg acc gtg        480
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val           
          145                 150                 155                 160           
          tct tgg aac tct ggc gct ctg aca tct ggc gtg cac acc ttt cca gct        528
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala           
                          165                 170                 175               
          gtg ctg cag tcc tcc ggc ctg tac tct ctg tcc tct gtc gtg acc gtg        576
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val           
                      180                 185                 190                   
          cct tcc agc tct ctg gga acc cag acc tac atc tgc aat gtg aac cac        624
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His           
                  195                 200                 205                       
          aag cct tcc aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag tcc tgc        672
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys           
              210                 215                 220                           
          gac aag acc cac acc tgt cct cca tgt cct gct cca gaa ctg ctc ggc        720
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly           
          225                 230                 235                 240           
          ggt ccc tcc gtt ttc ctg ttt cca cct aag cct aag gac acc ctg atg        768
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met           
                          245                 250                 255               
          atc tct cgg acc cct gaa gtg aca tgc gtg gtg gtg gat gtg tcc cac        816
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His           
                      260                 265                 270                   
          gag gat ccc gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac ggc gtg gaa gtg        864
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val           
                  275                 280                 285                       
          cac aac gcc aag acc aag cct aga gag gaa cag tac aac tcc acc tac        912
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr           
              290                 295                 300                           
          aga gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gat tgg ctg aac ggc        960
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly           
          305                 310                 315                 320           
          aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg cct gct cct atc       1008
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile           
                          325                 330                 335               
          gaa aag acc atc tcc aag gct aag ggc cag cct cgg gaa cct cag gtt       1056
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val           
                      340                 345                 350                   
          tac aca ctg cct cca tct cgg gac gag ctg acc aag aat cag gtg tcc       1104
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser           
                  355                 360                 365                       
          ctg acc tgc ctc gtg aag ggc ttc tac cct tct gat atc gcc gtg gaa       1152
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu           
              370                 375                 380                           
          tgg gag tcc aac ggc cag cct gag aac aac tac aag aca acc cct cct       1200
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro           
          385                 390                 395                 400           
          gtg ctg gac tcc gac ggc tca ttc ttc ctg tac tcc aag ctg aca gtg       1248
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val           
                          405                 410                 415               
          gat aag tcc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc tct tgt tct gtg atg       1296
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met           
                      420                 425                 430                   
          cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag agt ctg tct ctg tcc       1344
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser           
                  435                 440                 445                       
          cct ggc aag tga                                                       1356
          Pro Gly Lys                                                               
              450                                                                   
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  451]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成建構物 (Synthetic construct)]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Asp His Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Gly Lys 
              450     
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  1356]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B11.1_HC_H]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  CDS]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1356)]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          cag gtt cag ctg gtt gaa tct ggc ggc gga gtt gtt cag cct ggc gga         48
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly           
          1               5                   10                  15                
          tct ctg aga ctg tct tgt gcc gcc tcc ggc ttc acc ttc tcc tct tac         96
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr           
                      20                  25                  30                    
          gga atg cac tgg gtc cga cag gcc cct ggc aaa gga ttg gaa tgg gtc        144
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val           
                  35                  40                  45                        
          gcc gtg att tgg tac gac ggc cgg aac aag tac tac gcc gac tcc gtg        192
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val           
              50                  55                  60                            
          aag ggc aga ttc acc atc tct cgg gac aac tcc aag aac acc ctg tac        240
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr           
          65                  70                  75                  80            
          ctg cag atg aac tcc ctg aga gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc        288
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys           
                          85                  90                  95                
          acc aga gat cac tcc ggc tcc ggc agc tac tac atc gat tat tgg ggc        336
          Thr Arg Asp His Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly           
                      100                 105                 110                   
          cag ggc acc ctg gtc acc gtg tcc tct gct tct acc aag gga ccc agc        384
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser           
                  115                 120                 125                       
          gtg ttc cct ctg gct cct tcc agc aag tct acc tct ggc gga aca gct        432
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala           
              130                 135                 140                           
          gct ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttt cct gag cct gtg acc gtg        480
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val           
          145                 150                 155                 160           
          tct tgg aac tct ggc gct ctg aca tct ggc gtg cac acc ttt cca gct        528
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala           
                          165                 170                 175               
          gtg ctg cag tcc tcc ggc ctg tac tct ctg tcc tct gtc gtg acc gtg        576
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val           
                      180                 185                 190                   
          cct tcc agc tct ctg gga acc cag acc tac atc tgc aat gtg aac cac        624
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His           
                  195                 200                 205                       
          aag cct tcc aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag tcc tgc        672
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys           
              210                 215                 220                           
          gac aag acc cac acc tgt cct cca tgt cct gct cca gaa gct gct ggc        720
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly           
          225                 230                 235                 240           
          ggc cct tcc gtg ttt ctg ttc cct cca aag cct aag gac acc ctg atg        768
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met           
                          245                 250                 255               
          atc tct cgg acc cct gaa gtg acc tgc gtg gtg gtg gat gtg tct cac        816
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His           
                      260                 265                 270                   
          gag gat ccc gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac ggc gtg gaa gtg        864
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val           
                  275                 280                 285                       
          cac aac gcc aag acc aag cct aga gag gaa cag tac ggc tcc acc tac        912
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr           
              290                 295                 300                           
          aga gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gat tgg ctg aac ggc        960
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly           
          305                 310                 315                 320           
          aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg cct gct cct atc       1008
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile           
                          325                 330                 335               
          gaa aag acc atc tcc aag gcc aag ggc cag cct agg gaa ccc cag gtt       1056
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val           
                      340                 345                 350                   
          tac acc ttg cct cca tct cgg gac gag ctg acc aag aac cag gtg tcc       1104
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser           
                  355                 360                 365                       
          ctg tct tgc gct gtg aag ggc ttc tac ccc tcc gat atc gcc gtg gaa       1152
          Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu           
              370                 375                 380                           
          tgg gag tct aat ggc cag cct gag aac aac tac aag aca acc cct cct       1200
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro           
          385                 390                 395                 400           
          gtg ctg gac tcc gac ggc tca ttc ttc ctg gtg tcc aag ctg aca gtg       1248
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val           
                          405                 410                 415               
          gac aag tcc aga tgg cag cag ggc aac gtg ttc tcc tgc agc gtg atg       1296
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met           
                      420                 425                 430                   
          cac gag gcc ctg cac aat cac tac acc cag aag tct ctg tct ctg agc       1344
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser           
                  435                 440                 445                       
          ccc ggc aaa tga                                                       1356
          Pro Gly Lys                                                               
              450                                                                   
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  451]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成建構物 (Synthetic construct)]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Asp His Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Gly Lys 
              450     
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  642]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B11.1_LC]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  CDS]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(642)]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          gag att gcc atg aca cag tct ccc gcc aca ctg tct gtt agc cct ggc         48
          Glu Ile Ala Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly           
          1               5                   10                  15                
          gag aga gct acc ctg tcc tgt aga gcc tct cag tcc gtg tcc tct aac         96
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn           
                      20                  25                  30                    
          ctg gcc tgg tat cag cag aag cct gga cag gct ccc cgg ctg ttg atc        144
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile           
                  35                  40                  45                        
          tat ggc gct tct acc aga gct acc ggc ctg cct gct aga ttc tcc ggc        192
          Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Leu Pro Ala Arg Phe Ser Gly           
              50                  55                  60                            
          tct gga tct ggc acc gag ttt acc ctg acc atc tcc agc ctg cag tcc        240
          Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser           
          65                  70                  75                  80            
          gag gat ttc gcc gtg tac tac tgc cag cag tac aac aac ttc tgg acc        288
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Trp Thr           
                          85                  90                  95                
          ttc ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag aga acc gtg gcc gct cct        336
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro           
                      100                 105                 110                   
          tcc gtg ttc atc ttc cca cct tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc aca        384
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr           
                  115                 120                 125                       
          gct tct gtc gtg tgc ctg ctg aac aac ttt tac cct cgg gaa gcc aag        432
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys           
              130                 135                 140                           
          gtg cag tgg aag gtg gac aat gcc ctg cag agc ggc aac tcc caa gag        480
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu           
          145                 150                 155                 160           
          tct gtg acc gag cag gac tcc aag gac agc acc tac agc ctg tcc tcc        528
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser           
                          165                 170                 175               
          aca ctg acc ctg tcc aag gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc        576
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala           
                      180                 185                 190                   
          tgc gaa gtg acc cat cag ggc ctg tct agc cct gtg acc aag tct ttc        624
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe           
                  195                 200                 205                       
          aac cgg ggc gag tgc tga                                                642
          Asn Arg Gly Glu Cys                                                       
              210                                                                   
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成建構物 (Synthetic construct)]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Glu Ile Ala Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Leu Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Trp Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Gly Glu Cys 
              210             
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  1356]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B12.1_HC]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  CDS]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1356)]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          cag gtt cag ctg gtt gaa tct ggc ggc gga gtt gtt cag cct ggc gga         48
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly           
          1               5                   10                  15                
          tct ctg aga ctg tct tgt gcc gcc tcc ggc ttc atc ttc tcc agc tac         96
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr           
                      20                  25                  30                    
          gga atg cac tgg gtc cga cag gcc cct ggc aaa gga ttg gaa tgg gtc        144
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val           
                  35                  40                  45                        
          gcc gtg att tgg tac gac ggc tcc aac aag tac tac gcc gac tcc gtg        192
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val           
              50                  55                  60                            
          aag ggc aga ttc acc atc tct cgg gac aac tcc aag aac acc ctg tac        240
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr           
          65                  70                  75                  80            
          ctg cag atg aac tcc ctg aga gcc gag gac acc gcc atg tac tac tgc        288
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys           
                          85                  90                  95                
          gcc aga gat cac tac ggc tcc ggc acc tac tac atc gac tat tgg ggc        336
          Ala Arg Asp His Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly           
                      100                 105                 110                   
          cag ggc acc ctg gtc aca gtg tcc tct gct tct acc aag gga ccc agc        384
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser           
                  115                 120                 125                       
          gtg ttc cct ctg gct cct tcc agc aag tct acc tct ggc gga aca gct        432
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala           
              130                 135                 140                           
          gct ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttt cct gag cct gtg acc gtg        480
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val           
          145                 150                 155                 160           
          tcc tgg aac tct ggc gct ctg aca tct ggc gtg cac acc ttt cca gct        528
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala           
                          165                 170                 175               
          gtg ctg cag tcc tcc ggc ctg tac tct ctg tcc tct gtc gtg acc gtg        576
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val           
                      180                 185                 190                   
          cct tcc agc tct ctg gga acc cag acc tac atc tgc aat gtg aac cac        624
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His           
                  195                 200                 205                       
          aag cct tcc aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag tcc tgc        672
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys           
              210                 215                 220                           
          gac aag acc cac acc tgt cct cca tgt cct gct cca gaa ctg ctc ggc        720
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly           
          225                 230                 235                 240           
          ggt ccc tcc gtt ttc ctg ttt cca cct aag cct aag gac acc ctg atg        768
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met           
                          245                 250                 255               
          atc tct cgg acc cct gaa gtg aca tgc gtg gtg gtg gat gtg tcc cac        816
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His           
                      260                 265                 270                   
          gag gat ccc gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac ggc gtg gaa gtg        864
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val           
                  275                 280                 285                       
          cac aac gcc aag acc aag cct aga gag gaa cag tac aac tcc acc tac        912
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr           
              290                 295                 300                           
          aga gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gat tgg ctg aac ggc        960
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly           
          305                 310                 315                 320           
          aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg cct gct cct atc       1008
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile           
                          325                 330                 335               
          gaa aag acc atc tcc aag gct aag ggc cag cct cgg gaa cct cag gtt       1056
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val           
                      340                 345                 350                   
          tac aca ctg cct cca tct cgg gac gag ctg acc aag aat cag gtg tcc       1104
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser           
                  355                 360                 365                       
          ctg acc tgc ctc gtg aag ggc ttc tac cct tct gat atc gcc gtg gaa       1152
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu           
              370                 375                 380                           
          tgg gag tcc aac ggc cag cct gag aac aac tac aag aca acc cct cct       1200
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro           
          385                 390                 395                 400           
          gtg ctg gac tcc gac ggc tca ttc ttc ctg tac tcc aag ctg aca gtg       1248
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val           
                          405                 410                 415               
          gat aag tcc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc tct tgt tct gtg atg       1296
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met           
                      420                 425                 430                   
          cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag agt ctg tct ctg tcc       1344
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser           
                  435                 440                 445                       
          cct ggc aag tga                                                       1356
          Pro Gly Lys                                                               
              450                                                                   
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  451]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成建構物 (Synthetic construct)]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp His Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Gly Lys 
              450     
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  642]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B12.1_LC]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  CDS]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(642)]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          gag att gtg atg acc cag tct cct gcc aca ctg tcc gtg tct cca ggc         48
          Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly           
          1               5                   10                  15                
          gag aga gct acc ctg tct tgc aga gct tct cag acc gtg tcc tcc aac         96
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Ser Asn           
                      20                  25                  30                    
          ctg gcc tgg tat cag cag aag cct gga cag gct ccc cgg ctg ttg atc        144
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile           
                  35                  40                  45                        
          tat ggc gct tct acc aga gcc acc ggc ttt ccc gct aga ttc tcc ggc        192
          Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly           
              50                  55                  60                            
          tct ggc tct ggc aca gag ttt acc ctg acc atc tcc agc ctg cag tcc        240
          Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser           
          65                  70                  75                  80            
          gag gat ttc gcc gtg tac tac tgc cag cag tac aac aac tgg tgg acc        288
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Trp Thr           
                          85                  90                  95                
          ttc ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag aga acc gtg gcc gct cct        336
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro           
                      100                 105                 110                   
          tcc gtg ttc atc ttc cca cct tcc gac gag cag ctg aag tct ggc acc        384
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr           
                  115                 120                 125                       
          gct tct gtc gtg tgc ctg ctg aac aac ttc tac cct cgg gaa gcc aag        432
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys           
              130                 135                 140                           
          gtg cag tgg aag gtg gac aat gcc ctg cag agc ggc aac tcc caa gag        480
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu           
          145                 150                 155                 160           
          tct gtg acc gag cag gac tcc aag gac agc acc tac agc ctg tcc tcc        528
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser           
                          165                 170                 175               
          aca ctg acc ctg tcc aag gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc        576
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala           
                      180                 185                 190                   
          tgc gaa gtg acc cat cag ggc ctg tct agc cct gtg acc aag tct ttc        624
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe           
                  195                 200                 205                       
          aac cgg ggc gag tgt tga                                                642
          Asn Arg Gly Glu Cys                                                       
              210                                                                   
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成建構物 (Synthetic construct)]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Trp Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Gly Glu Cys 
              210             
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  1461]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  anti-CD3-scFv]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  CDS]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1461)]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          gaa gta cag ctg gtg gag tct ggc gga ggt ctt atc cag ccc gga ggt         48
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly           
          1               5                   10                  15                
          tct ctg cgc ctg agc tgt gca gct tcc ggt ttc acc ttc aac acc tat         96
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr           
                      20                  25                  30                    
          gcc atg aat tgg gta cgc cag gct cca gga aaa tgt ctg gag tgg gtg        144
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val           
                  35                  40                  45                        
          gct cgg att cga agc aaa tac aac aat tat gca acc tac tat gcc gac        192
          Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp           
              50                  55                  60                            
          agt gtc aag gac cgc ttc acc ata agt cgg gat gac tcc aag agc act        240
          Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr           
          65                  70                  75                  80            
          ctg tat ctg cag atg aac aac ttg agg gcc gag gat acc gcc gtt tac        288
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr           
                          85                  90                  95                
          tat tgc gta agg cat ggc aac ttc ggt aat tcc tac gtg tcc tgg ttt        336
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe           
                      100                 105                 110                   
          gcc tat tgg ggc caa ggg acg ctg gtt aca gtg tca agt gga aag ccc        384
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Pro           
                  115                 120                 125                       
          ggg tct ggc aaa cct ggg agt ggc aag ccc ggg agt ggg aaa cca gga        432
          Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly           
              130                 135                 140                           
          tcc cag gct gtt gtc act caa gaa ccc agt ctc act gtt tct cca ggc        480
          Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly           
          145                 150                 155                 160           
          ggt aca gtc aca ctc aca tgt cgt agc agc act ggg gct gtg acc acc        528
          Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr           
                          165                 170                 175               
          agc aac tat gca aac tgg gtc cag cag aaa ccc ggt caa gct ccc aga        576
          Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg           
                      180                 185                 190                   
          gga ttg att ggc ggt acc aat aag cgg gcc cct ggg act cct gct cga        624
          Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg           
                  195                 200                 205                       
          ttt tct ggc tcc ttg ctt gga gat aaa gcc gca ctg act ttg agc ggc        672
          Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly           
              210                 215                 220                           
          gct caa cca gag gac gaa gca gag tac tat tgt gct ctg tgg tac tcc        720
          Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser           
          225                 230                 235                 240           
          aac ctc tgg gtg ttt ggc tgt ggc acc aag gta aca gtg ctg gaa cct        768
          Asn Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Glu Pro           
                          245                 250                 255               
          aag tca agc gac aaa aca cac acc tgt cct ccc tgt cca gca cca gag        816
          Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu           
                      260                 265                 270                   
          gca gct ggt ggc cca tct gtc ttt ctg ttc cca cca aag ccc aag gac        864
          Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp           
                  275                 280                 285                       
          act ctg atg atc tca cga aca ccc gaa gtg act tgc gta gtg gtg gac        912
          Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp           
              290                 295                 300                           
          gtt tct cat gag gat cca gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gat gga        960
          Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly           
          305                 310                 315                 320           
          gtg gaa gtg cac aat gcc aaa aca aag ccc cgt gag gag cag tac ggc       1008
          Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly           
                          325                 330                 335               
          tcc acg tac agg gtt gtc tcc gtt ttg acc gtc ctg cat cag gat tgg       1056
          Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp           
                      340                 345                 350                   
          ctt aac gga aaa gag tat aag tgc aag gta tcc aat aag gcc ctt ccc       1104
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro           
                  355                 360                 365                       
          gcc cct atc gag aaa act atc agc aag gcc aaa gga cag ccc aga gag       1152
          Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu           
              370                 375                 380                           
          ccc cag gtg tac act ttg cct cct tct agg gat gaa ctc acc aag aat       1200
          Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn           
          385                 390                 395                 400           
          cag gtt agc ctg tgg tgc ctg gtg aag ggg ttt tac cca tcc gat att       1248
          Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile           
                          405                 410                 415               
          gcc gtg gag tgg gaa agc aat ggc caa ccc gag aac aac tat aag aca       1296
          Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr           
                      420                 425                 430                   
          act cct cct gtg ctg gac tca gat gga agt ttc ttc ctg tac agc aag       1344
          Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys           
                  435                 440                 445                       
          ctc aca gtg gac aag agc aga tgg cag cag ggc aat gtg ttt tct tgc       1392
          Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys           
              450                 455                 460                           
          tct gtc atg cac gaa gcc ctg cac aat cac tac acc cag aaa tcc ctt       1440
          Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu           
          465                 470                 475                 480           
          agt ctg tca cct ggg aag tga                                           1461
          Ser Leu Ser Pro Gly Lys                                                   
                          485                                                       
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  486]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成建構物 (Synthetic construct)]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly 
              130                 135                 140                 
          Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 
                      180                 185                 190         
          Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg 
                  195                 200                 205             
          Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly 
              210                 215                 220                 
          Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Glu Pro 
                          245                 250                 255     
          Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
                      260                 265                 270         
          Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 
                  275                 280                 285             
          Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 
              290                 295                 300                 
          Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly 
                          325                 330                 335     
          Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 
                      340                 345                 350         
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 
                  355                 360                 365             
          Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 
              370                 375                 380                 
          Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 
                      420                 425                 430         
          Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 
                  435                 440                 445             
          Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 
              450                 455                 460                 
          Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          485     
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GGGS 連結基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(4)]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Gly Gly Gly Ser 
          1               
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SGGG 連結基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(4)]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Ser Gly Gly Gly 
          1               
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GGGGS 連結基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SGGGG 連結基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Ser Gly Gly Gly Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GGGGGS 連結基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(6)]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Gly Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SGGGGG 連結基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(6)]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Ser Gly Gly Gly Gly Gly 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GGGGGGS 連結基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(7)]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SGGGGGG 連結基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(7)]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GKPGS 連結基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Gly Lys Pro Gly Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B11&16B12_HCDR1]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Ser Tyr Gly Met His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B11_HCDR2]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(16)]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B12_HCDR2]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(16)]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B11_HCDR3]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(12)]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Asp His Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Ile Asp Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B12_HCDR3]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(12)]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Asp His Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ile Asp Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B11_LCDR1]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B12_LCDR1]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Ser Asn Leu Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B11&16B12_LCDR2]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B11_LCDR3]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(8)]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Trp Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B12_LCDR3]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(8)]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Trp Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B11_VH]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(114)]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Asp His Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B12_VH]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(113)]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp His Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B11_VL]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(97)]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Glu Ile Ala Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Leu Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Trp Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  16B12_VL]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  結合]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(98)]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Trp Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  訊息序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(19)]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser 
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  訊息序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(19)]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser 
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  訊息序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  胜肽]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(19)]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser 
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  小鼠 TSPAN8 126-155]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          Lys Leu Leu Ser Asp Asn Thr Asp Glu Ala Lys Asp Phe Gln Lys Ala 
          1               5                   10                  15      
          Met Ile Val Phe Gln Ser Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Glu 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  大鼠 TSPAN8 126-155]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          Lys Leu Leu Ser Glu Thr Ser Asn Glu Ala Lys Glu Val Gln Lys Ala 
          1               5                   10                  15      
          Met Ile Ala Phe Gln Ser Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Arg 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  食蟹猴 (Macaca fascicula) TSPAN8 126-155]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          Lys Leu Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ser Ala Lys Gln Phe Gln Gln Ala 
          1               5                   10                  15      
          Met Ala Glu Phe Gln Lys Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Val 
                      20                  25                  30
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
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Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044

Claims (55)

  1. 一種雙特異性抗體，其係結合於TSPAN8及CD3之雙特異性抗體，其包含 (a)由含有抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域之重鏈片段及含有抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域之輕鏈所成之抗TSPAN8抗體之Fab區域、 (b)包含抗CD3抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗CD3-scFv區域，以及 (c)由連結於(a)的Fab區域之重鏈片段的第一Fc多胜肽及連結於(b)的抗CD3-scFv區域之第二Fc多胜肽所成之Fc區域。
  2. 如請求項1之雙特異性抗體，其中 抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3；或者 抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3。
  3. 如請求項1之雙特異性抗體，其中 抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，係由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，係由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成；或者 抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域，係由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成，抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域，係由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成。
  4. 如請求項1之雙特異性抗體，其中 抗TSPAN8抗體之Fab區域，係由：由序列編號6之胺基酸編號1至219之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號8之胺基酸序列所成之輕鏈所成；或者 抗TSPAN8抗體之Fab區域，係由：由序列編號10之胺基酸編號1至219之胺基酸序列所成之重鏈片段及由序列編號12之胺基酸序列所成之輕鏈所成。
  5. 如請求項1~4中任一項之雙特異性抗體，其中抗CD3抗體之重鏈可變區域，包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3；抗CD3抗體之輕鏈可變區域，包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3。
  6. 如請求項1~4中任一項之雙特異性抗體，其中抗CD3抗體之重鏈可變區域係由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成，抗CD3抗體之輕鏈可變區域係由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成。
  7. 如請求項1~4中任一項之雙特異性抗體，其中抗CD3-scFv區域係由序列編號14之胺基酸編號1至254之胺基酸序列所成。
  8. 如請求項1之雙特異性抗體，其中 該雙特異性抗體，包含：含有包含由序列編號6之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號6之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號6之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈；含有包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽；或者 該雙特異性抗體，包含：含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈；含有包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有包含由序列編號14之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號50至68之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號101至114之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之重鏈可變區域，及包含由序列編號14之胺基酸編號168至181之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號14之胺基酸編號197至203之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號14之胺基酸編號236至244之胺基酸序列所成之CDR3的抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。
  9. 如請求項1之雙特異性抗體，其中 該雙特異性抗體，包含：含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽；或者 該雙特異性抗體，包含：含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈，以及含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽。
  10. 如請求項1~9中任一項之雙特異性抗體，其包含含有LALA變異(L234A及L235A(此處，前述變異位置為人類Igγ1恆定區域中遵照EU索引的胺基酸位置))之Fc區域。
  11. 如請求項1~10中任一項之雙特異性抗體，其包含含有N297G變異(此處，前述變異位置為人類Igγ1恆定區域中遵照EU索引的胺基酸位置)之Fc區域。
  12. 如請求項1~11中任一項之雙特異性抗體，其包含含有Knobs into holes變異之Fc區域。
  13. 如請求項1~12中任一項之雙特異性抗體，其包含含有LALA變異、N297G變異及Knobs into holes變異之Fc區域。
  14. 如請求項12或13之雙特異性抗體，其中Knobs into holes變異，為形成Fc區域之1個Fc多胜肽中之T366W變異，以及形成Fc區域之另1個Fc多胜肽中之T366S、L368A及Y407V變異(此處，前述變異位置為人類Igγ1恆定區域中遵照EU索引的胺基酸位置)。
  15. 如請求項1~14中任一項之雙特異性抗體，其含有第一Fc多胜肽係由序列編號6之235至451之胺基酸序列所成，第二Fc多胜肽係由序列編號14之270至486之胺基酸序列所成的Fc區域。
  16. 如請求項1~15中任一項之雙特異性抗體，其中抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽係透過絞鏈區域連結，抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽係透過絞鏈區域連結。
  17. 如請求項1之雙特異性抗體，其包含 由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈、由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈，及由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二多胜肽連結而得的多胜肽。
  18. 如請求項2~17中任一項之雙特異性抗體，其係經轉譯後修飾。
  19. 如請求項18之雙特異性抗體，其中轉譯後修飾，為重鏈可變區域N末端之焦麩胺醯化及/或重鏈C末端離胺酸缺失。
  20. 一種多核苷酸，其選自由下述(a)~(e)所成之群： (a)包含編碼含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (b)包含編碼含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (c)包含編碼含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (d)包含編碼含有由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (e)包含編碼含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
  21. 一種多核苷酸，其選自由下述(a)~(c)所成之群： (a)包含編碼由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (b)包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (c)包含編碼由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
  22. 一種表現載體，其包含如請求項20或21之多核苷酸。
  23. 一種宿主細胞，其係經如請求項22之表現載體轉形。
  24. 一種宿主細胞，其包含：包含編碼含有由序列編號6之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、包含編碼含有由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，以及包含編碼含有由序列編號14之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之重鏈可變區域及由序列編號14之胺基酸編號146至254之胺基酸序列所成之抗CD3抗體之輕鏈可變區域的抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
  25. 一種宿主細胞，其包含：包含編碼由序列編號6之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈片段與第一Fc多胜肽連結而得的抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸，及包含編碼由序列編號14之胺基酸序列所成之抗CD3-scFv區域與第二Fc多胜肽連結而得的多胜肽的鹼基序列之多核苷酸。
  26. 一種結合於TSPAN8及CD3之雙特異性抗體之生產方法，其包含培養如請求項23~25中任一項之宿主細胞之步驟。
  27. 一種醫藥組成物，其含有如請求項1~19中任一項之雙特異性抗體及藥學上容許之賦形劑。
  28. 如請求項1~19中任一項之雙特異性抗體，其係使用於癌之治療。
  29. 如請求項27之醫藥組成物，其係使用於癌之治療。
  30. 一種治療癌之方法，其包含將如請求項1~19中任一項之雙特異性抗體之治療有效量投予至對象之步驟。
  31. 一種如請求項1~19中任一項之雙特異性抗體之使用，其係用於製造用於癌之治療的醫藥組成物。
  32. 一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係選擇性地結合於表現人類TSPAN8之癌細胞。
  33. 一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其結合於存在於序列編號2之胺基酸編號126至155之人類TSPAN8區域的至少1個之胺基酸。
  34. 如請求項33之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其結合於存在於前述人類TSPAN8區域的至少序列編號2之胺基酸編號131之胺基酸。
  35. 一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係由下述(a)及(b)中選擇： (a)含有包含由序列編號4之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號4之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號4之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域，以及包含由序列編號8之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號8之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號8之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段； (b)含有包含由序列編號10之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號10之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號10之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所成之CDR3的重鏈可變區域，以及包含由序列編號12之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所成之CDR1、由序列編號12之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所成之CDR2，及由序列編號12之胺基酸編號89至96之胺基酸序列所成之CDR3的輕鏈可變區域之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段。
  36. 如請求項35之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係由下述(a)及(b)中選擇： (a)含有由序列編號4之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域，及由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段； (b)含有由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之重鏈可變區域，及由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之輕鏈可變區域的抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段。
  37. 如請求項35之抗TSPAN8抗體，其係由下述(a)及(b)中選擇： (a)包含由序列編號4之胺基酸序列所成之重鏈及由序列編號8之胺基酸序列所成之輕鏈的抗TSPAN8抗體； (b)包含由序列編號10之胺基酸序列所成之重鏈及由序列編號12之胺基酸序列所成之輕鏈的抗TSPAN8抗體。
  38. 一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與如請求項33~37中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段競爭對於表現人類TSPAN8之癌細胞之結合。
  39. 如請求項32~38中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係與抗T細胞或NK細胞之表面抗原的抗體或其抗原結合片段連結。
  40. 如請求項39之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其中T細胞之表面抗原為CD3。
  41. 如請求項40之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其中對於T細胞之表面抗原的抗原結合片段為抗CD3抗體之scFv。
  42. 如請求項32~41中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其係經轉譯後修飾。
  43. 如請求項42之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，其中轉譯後修飾，為重鏈可變區域N末端之焦麩胺醯化及/或重鏈C末端離胺酸缺失。
  44. 一種如請求項32~43中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之融合體或複合體，或於細胞表面表現如請求項32~43中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之細胞。
  45. 一種多核苷酸，其係選自由下述(a)~(d)所成之群： (a)包含編碼由序列編號4之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸、 (b)包含編碼由序列編號8之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸、 (c)包含編碼由序列編號10之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸、 (d)包含編碼由序列編號12之胺基酸編號1至107之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸。
  46. 一種多核苷酸，其係選自由下述(a)~(d)所成之群： (a)包含編碼由序列編號4之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (b)包含編碼由序列編號8之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (c)包含編碼由序列編號10之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸、 (d)包含編碼由序列編號12之胺基酸序列所成之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
  47. 一種表現載體，其包含如請求項45或46之多核苷酸。
  48. 一種宿主細胞，其係經如請求項47之表現載體轉形。
  49. 一種宿主細胞，其係由下述(a)或(b)中選擇： (a)含有包含編碼如請求項45之抗TSPAN8抗體之重鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼如請求項45之抗體之抗TSPAN8抗體之輕鏈可變區域的鹼基序列之多核苷酸的宿主細胞； (b)含有包含編碼如請求項46之抗TSPAN8抗體之重鏈的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼如請求項46之抗體之抗TSPAN8抗體之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的宿主細胞。
  50. 一種抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之生產方法，其包含培養如請求項48或49之宿主細胞之步驟。
  51. 如請求項32~43中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，或如請求項44之融合體、複合體或細胞，其係使用於癌之治療。
  52. 一種醫藥組成物，其含有如請求項32~43中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段，或如請求項44之融合體、複合體或細胞，且進一步含有藥學上容許之賦形劑。
  53. 如請求項52之醫藥組成物，其係使用於癌之治療。
  54. 一種治療癌之方法，其包含將如請求項32~43中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之治療有效量投予至對象之步驟，或將如請求項44之融合體、複合體或細胞之治療有效量投予至對象之步驟。
  55. 一種如請求項32~43中任一項之抗TSPAN8抗體或其抗原結合片段之使用，或如請求項44之融合體、複合體或細胞之使用，其係用於製造用於癌之治療的醫藥組成物。
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