CN116635071A

CN116635071A - 抗tspan8-抗cd3双特异性抗体和抗tspan8抗体

Info

Publication number: CN116635071A
Application number: CN202180076884.7A
Authority: CN
Inventors: 天田由幸; 由利正利; 山宿大介; 堤刚; 楠崎佑子; 佐佐木博己; 千胁史子; 小松将之
Original assignee: NATIONAL CANCER CENTER; Astellas Pharma Inc
Current assignee: NATIONAL CANCER CENTER; Astellas Pharma Inc
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2023-08-22
Also published as: PE20240224A1; EP4245855A1; JP2022079486A; KR20230108288A; US20240166736A1; US11897954B2; CO2023007734A2; TW202229353A; ECSP23034684A; CA3200860A1; CR20230244A; JPWO2022102768A1; US20230348587A1; IL302544A; JP7078237B1; CL2023001392A1; WO2022102768A1; MX2023005346A; DOP2023000096A; AU2021378575A1

Abstract

本发明的课题在于，提供可以用于人的治疗或预防的抗TSPAN8‑抗CD3双特异性抗体和抗TSPAN8抗体。用从患者分离出的癌腹膜播散细胞免疫产生人单克隆抗体的小鼠，获得显示与癌腹膜播散细胞选择性结合的16B11抗体和16B12抗体。这些抗体为与TSPAN8的氨基酸编号126～155的区域结合的抗TSPAN8抗体，对癌腹膜播散细胞所表达的TSPAN8显示强结合活性。进而，基于16B11的序列制作的抗TSPAN8(16B11)‑抗CD3双特异性抗体在体外对表达TSPAN8的癌细胞显示细胞杀伤活性，在体内对表达TSPAN8的癌细胞荷瘤小鼠有抗肿瘤作用且延长腹膜播散模型小鼠的生存期。

Description

抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体和抗TSPAN8抗体

技术领域

本发明涉及作为在人的治疗中使用的药物组合物的有效成分有用的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体和抗TSPAN8抗体。

背景技术

转移性胃癌是指原发性胃癌比肌层更深地浸润，穿透包裹胃壁的浆膜而转移到淋巴结、腹腔，进而经由血液、淋巴液转移至各种脏器的状态，转移性胃癌患者的一半以上患者中，可观察到向腹腔的播散。晚期患者已知有由腹膜播散引起的腹水潴留所导致的腹部肿胀、持续性涨满感、疼痛、恶心、呼吸困难、失眠和疲劳等症状(World J.Gastroenterol.、2016、Vol.22、p.6829-6840、Int.J.Cancer、2010、Vol.127、p.2209-2221)。但是，胃癌腹膜播散患者难以通过手术完全治愈，作为胃癌腹膜播散的标准疗法的化学疗法有效性也不充分，因此，这些患者的5年生存率为约2％，预后非常差，期望针对胃癌腹膜播散的有效治疗方法。另外，腹膜播散在以卵巢癌、大肠癌、胰腺癌等为原发的多种癌症患者中也可观察到(Int.J.Adv.Res.、2016、Vol.4、p.735-748)，针对这些患者的治疗方法也尚未建立起来。

在癌症治疗用抗体的开发中，尝试了通过各种方法鉴定对癌细胞显示选择性表达的肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigen；TAA)。作为其方法之一，报道了将癌细胞免疫于动物而制作抗体、并且获得与癌细胞所表达的TAA结合的抗体的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.、2018、Vol.505、p.181e-186、FEBS Open Bio、2017、Vol.7、p.627-635)。

四次穿膜蛋白8(Tetraspanin-8；TSPAN8)为属于四次穿膜蛋白家族的4次跨膜蛋白，具有细胞外小环(small extracellular loop；SEL)和细胞外大环(largeextracellular loop；LEL)这2个细胞外环区域和3个细胞质结构域，形成作为支架蛋白的具有多种跨膜蛋白和细胞质蛋白的分子簇。已知TSPAN8参与细胞粘附、细胞运动性、细胞的活化和增殖等，在胃癌、胰腺癌、大肠癌、肝癌等中观察到高表达，据报道TSPAN8表达亢进与癌症的进展或转移有相关性等(非专利文献1)。正在进行旨在使用抗TSPAN8抗体的癌症的诊断、治疗的研究(专利文献1～2和非专利文献1～2)。

分化簇3(Cluster of Differentiation 3；CD3)是通过在T细胞表面与T细胞受体(T cell receptor；TCR)形成复合体而将活化信号转导至T细胞的蛋白质。CD3为由Gamma(γ)、Delta(δ)、Epsilon(ε)、Zeta(ζ)和Eta(η)链这5种亚单位构成的复合体，各亚单位形成εγ、εδ、ζζ这3种二聚体。CD3在正常T细胞和肿瘤性T细胞中均表达，因此被用作T细胞的标记物，另外，报道了多种以癌症治疗为目的的包含各种抗TAA抗体和抗CD3抗体的双特性抗体作为药品的应用(非专利文献3)。

作为能够以低抗体浓度得到癌细胞选择性细胞杀伤活性的划时代的方法，报道了包含各种抗体构型的双特异性T细胞募集抗体(bispecific T-cell-recruitingantibodies)，正在研究这些抗体对T细胞介导性免疫疗法的效果(非专利文献4)。双特异性T细胞募集抗体为包含针对在癌细胞表面表达的TAA的抗体和与T细胞结合的抗体的双特异性抗体。作为与T细胞结合的抗体，大多使用抗CD3抗体。包含抗TAA和抗CD3抗体的分子的双特异性T细胞募集抗体拉近目标癌细胞与细胞杀伤性T细胞(Cytotoxic T Lymphocyte；CTL)的物理距离，通过抗CD3抗体活化CTL，通过CTL的细胞杀伤活性杀伤癌细胞(Redirected T Cell Cytotoxicity；RTCC)。作为抗CD3-抗上皮细胞粘附分子(EpithelialCell Adhesion Molecule；EpCAM)双特异性抗体的卡妥索单抗(catumaxomab)、作为抗CD3-抗CD19(Cluster of Differentiation 19)双特异性抗体的博纳吐单抗(blinatumomab)已经确认了临床效果(Int.J.Cancer、2010、Vol.127、p.2209-2221、N.Engl.J.Med.、2017、Vol.376、p.836-847)，目前正在研究开发各种针对TAA的双特异性T细胞募集抗体。但是，截至目前为止，抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体尚属未知。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开2012/010696号

专利文献2：国际公开2015/130115号

非专利文献

非专利文献1：Biomolecules、(瑞士)、2020；10(3)：p.383

非专利文献2：Cancers、(瑞士)、2019；11(2)：p.179

非专利文献3：Pharmacology and Therapeutics、(英国)、2018；182：p.161-175

非专利文献4：mAbs、2017：9(2)：p.182-212

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题在于，提供可以在人的治疗中使用的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体和抗TSPAN8抗体。

用于解决问题的方法

本发明人为了创制癌细胞选择性的治疗药，通过用从患者分离出的癌腹膜播散细胞免疫产生人单克隆抗体的小鼠以获得抗体的方法获得了作为抗TSPAN8抗体的16B11和16B12(实施例1)。该抗体与在正常细胞中表达的TSPAN8相比更强烈地结合在癌腹膜播散细胞中表达的TSPAN8(实施例1～5)。通过16B11和16B12的表位分析获知，该抗体将人TSPAN8的氨基酸编号126至155的氨基酸序列所构成的区域作为表位识别，并且人TSPAN8的第131位的苏氨酸对于与该抗体的结合是必需的(实施例4)。另外，制作了使16B11的Fc区为人序列的完全人抗体16B11.1(实施例3)，发现该完全人抗体对60As6-Luc/GFP细胞显示细胞杀伤活性(实施例6)。

进而，为了提高T细胞的抗原选择性抗肿瘤活性，制作了含有包含由序列号6的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链可变区和由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链可变区、以及由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区的、抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体(实施例7)。确认了：该双特异性抗体与TSPAN8和CD3结合(实施例8)，对在细胞表面表达TSPAN8的癌细胞显示细胞杀伤活性(实施例9、10、12-1、12-2)，在体内延长小鼠的生存期，发挥抗肿瘤作用(实施例11和12-3)。

即，本发明涉及以下的[1]～[55]。

[1]一种与TSPAN8和CD3结合的双特异性抗体，其包含：

(a)由包含抗TSPAN8抗体的重链可变区的重链片段和包含抗TSPAN8抗体的轻链可变区的轻链构成的抗TSPAN8抗体的Fab区；

(b)包含抗CD3抗体的重链可变区和轻链可变区的抗CD3-scFv区；以及，

(c)由与(a)的Fab区的重链片段连接的第一Fc多肽和与(b)的抗CD3-scFv区连接的第二Fc多肽构成的Fc区。

[2]根据[1]所述的双特异性抗体，其中，

抗TSPAN8抗体的重链可变区包含由序列号6的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号6的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号6的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3，抗TSPAN8抗体的轻链可变区包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3；或者，

抗TSPAN8抗体的重链可变区包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3，抗TSPAN8抗体的轻链可变区包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3。

[3]根据[1]所述的双特异性抗体，其中，

抗TSPAN8抗体的重链可变区由序列号6的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成，抗TSPAN8抗体的轻链可变区由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成；或者，

抗TSPAN8抗体的重链可变区由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成，抗TSPAN8抗体的轻链可变区由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成。

[4]根据[1]所述的双特异性抗体，其中，

抗TSPAN8抗体的Fab区由重链片段和轻链构成，所述重链片段由序列号6的氨基酸编号1至219的氨基酸序列构成，所述轻链由序列号8的氨基酸序列构成；或者，

抗TSPAN8抗体的Fab区由重链片段和轻链构成，所述重链片段由序列号10的氨基酸编号1至219的氨基酸序列构成，所述轻链由序列号12的氨基酸序列构成。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗CD3抗体的重链可变区包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3，抗CD3抗体的轻链可变区包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3。

[6]根据[1]～[4]中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗CD3抗体的重链可变区由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成，抗CD3抗体的轻链可变区由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成。

[7]根据[1]～[4]中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗CD3-scFv区由序列号14的氨基酸编号1至254的氨基酸序列构成。

[8]根据[1]所述的双特异性抗体，其中，

该双特异性抗体包含：含有包含由序列号6的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号6的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号6的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；含有包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，含有包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的重链可变区和包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽；或者，

该双特异性抗体包含：含有包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；含有包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，含有包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的重链可变区和包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽。

[9]根据[1]所述的双特异性抗体，其中，

该双特异性抗体含有：包含由序列号6的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；包含由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽；或者，

该双特异性抗体含有：包含由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；包含由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽。

[10]根据[1]～[9]中任一项所述的双特异性抗体，其含有包含LALA突变(L234A和L235A(在此，上述突变位置为人Igγ1恒定区中的根据EU索引的氨基酸位置))的Fc区。

[11]根据[1]～[10]中任一项所述的双特异性抗体，其含有包含N297G突变(在此，上述突变位置为人Igγ1恒定区中的根据EU索引的氨基酸位置)的Fc区。

[12]根据[1]～[11]中任一项所述的双特异性抗体，其含有包含杵臼结构(Knobsinto holes)突变的Fc区。

[13]根据[1]～[12]中任一项所述的双特异性抗体，其含有包含LALA突变、N297G突变和杵臼结构突变的Fc区。

[14]根据[12]或[13]所述的双特异性抗体，其中，杵臼结构突变为形成Fc区的1个Fc多肽中的T366W突变以及形成Fc区的另一个Fc多肽中的T366S、L368A和Y407V突变(在此，上述突变位置为人Igγ1恒定区中的根据EU索引的氨基酸位置)。

[15]根据[1]～[14]中任一项所述的双特异性抗体，其包含第一Fc多肽由序列号6的235至451的氨基酸序列构成、且第二Fc多肽由序列号14的270至486的氨基酸序列构成的Fc区。

[16]根据[1]～[15]中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽借助铰链区连接，抗CD3-scFv区与第二Fc多肽借助铰链区连接。

[17]根据[1]所述的双特异性抗体，其包含：

由序列号6的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；由序列号8的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv区与第二多肽连接而成的多肽。

[18]根据[2]～[17]中任一项所述的双特异性抗体，其经过了翻译后修饰。

[19]根据[18]所述的双特异性抗体，其中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷氨酰化和/或重链C末端赖氨酸缺失。

[20]一种多核苷酸，其选自由下述(a)～(e)组成的组：

(a)包含编码包含由序列号6的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码包含由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(c)包含编码包含由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

(d)包含编码包含由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(e)包含编码包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

[21]一种多核苷酸，其选自由下述(a)～(c)组成的组：

(a)包含编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码由序列号8的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(c)包含编码由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

[22]一种表达载体，其包含[20]或[21]所述的多核苷酸。

[23]一种宿主细胞，其为用[22]所述的表达载体进行了转化的宿主细胞。

[24]一种宿主细胞，其含有：包含编码包含由序列号6的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；包含编码包含由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；以及，包含编码包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

[25]一种宿主细胞，其含有：包含编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；包含编码由序列号8的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；以及，包含编码由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

[26]一种与TSPAN8和CD3结合的双特异性抗体的生产方法，其包括培养[23]～[25]中任一项所述的宿主细胞的步骤。

[27]一种药物组合物，其包含[1]～[19]中任一项所述的双特异性抗体和药学上可接受的赋形剂。

[28]根据[1]～[19]中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗癌症。

[29]根据[27]所述的药物组合物，其用于治疗癌症。

[30]一种治疗癌症的方法，其包括向对象给予治疗有效量的[1]～[19]中任一项所述的双特异性抗体的步骤。

[31][1]～[19]中任一项所述的双特异性抗体在制造用于治疗癌症的药物组合物中的应用。

[32]一种抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与表达人TSPAN8的癌细胞选择性地结合。

[33]一种抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与序列号2的氨基酸编号126至155的人TSPAN8的区域中存在的至少1个氨基酸结合。

[34]根据[33]所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与上述人TSPAN8的区域中存在的至少序列号2的氨基酸编号131的氨基酸结合。

[35]一种抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其选自下述(a)和(b)：

(a)含有包含由序列号4的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号4的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区、以及包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段；

(b)含有包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区、以及包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段。

[36]根据[35]所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其选自下述(a)和(b)：

(a)包含由序列号4的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段；

(b)包含由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段。

[37]根据[35]所述的抗TSPAN8抗体，其选自下述(a)和(b)：

(a)包含由序列号4的氨基酸序列构成的重链和由序列号8的氨基酸序列构成的轻链的抗TSPAN8抗体；

(b)包含由序列号10的氨基酸序列构成的重链和由序列号12的氨基酸序列构成的轻链的抗TSPAN8抗体。

[38]一种抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与[33]～[37]中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段竞争对表达人TSPAN8的癌细胞的结合。

[39]根据[32]～[38]中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与针对T细胞或NK细胞的表面抗原的抗体或其抗原结合片段连接。

[40]根据[39]所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其中，T细胞的表面抗原为CD3。

[41]根据[40]所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其中，针对T细胞的表面抗原的抗原结合片段为抗CD3抗体的scFv。

[42]根据[32]～[41]中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其经过了翻译后修饰。

[43]根据[42]所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷氨酰化和/或重链C末端赖氨酸缺失。

[44]一种[32]～[43]中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的融合体或复合体、或者在细胞表面表达[32]～[43]中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的细胞。

[45]一种多核苷酸，其选自由下述(a)～(d)组成的组：

(a)包含编码由序列号4的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

(c)包含编码由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸；

(d)包含编码由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。

[46]一种多核苷酸，其选自由下述(a)～(d)组成的组：

(a)包含编码由序列号4的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

(c)包含编码由序列号10的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

(d)包含编码由序列号12的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

[47]一种表达载体，其包含[45]或[46]所述的多核苷酸。

[48]一种宿主细胞，其为用[47]所述的表达载体进行了转化的宿主细胞。

[49]一种宿主细胞，其选自下述(a)或(b)：

(a)包含[45]所述的包含编码抗TSPAN8抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和[45]所述的包含编码抗体的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的宿主细胞；

(b)包含[46]所述的包含编码抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和[46]所述的包含编码抗体的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的宿主细胞。

[50]一种抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的生产方法，其包括培养[48]或[49]中任一项所述的宿主细胞的步骤。

[51]根据[32]～[43]中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段、或者[44]所述的融合体、复合体或细胞，其用于治疗癌症。

[52]一种药物组合物，其包含[32]～[43]中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段、或者[44]所述的融合体、复合体或细胞，还包含药学上可接受的赋形剂。

[53]根据[52]所述的药物组合物，其用于治疗癌症。

[54]一种治疗癌症的方法，其包括向对象给予治疗有效量的[32]～[43]中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的步骤、或者向对象给予治疗有效量的[44]所述的融合体、复合体或细胞的步骤。

[55][32]～[43]中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段、或者[44]所述的融合体、复合体或细胞在制造用于治疗癌症的药物组合物中的应用。

发明效果

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体与作为癌抗原的TSPAN8和作为T细胞表面分子的CD3这两者结合，通过拉近癌细胞与T细胞的物理距离而增强T细胞的癌细胞杀伤作用。另外，本发明的抗TSPAN8抗体具有通过与TSPAN8结合而杀伤癌细胞的效果。本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体和抗TSPAN8抗体、或包含上述抗体的药物组合物可以用于治疗癌症。

附图说明

图1-1示出通过流式细胞术法测定抗TSPAN8抗体(16B11、16B12、9F6、18C10)对KM-291-As的结合性的结果。图中的16B11、16B12、9F6、18C10表示抗体名称。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的白色区域表示阴性对照抗体的结合，深灰色表示抗TSPAN8抗体的结合。

图1-2示出通过流式细胞术法测定抗TSPAN8抗体(16B11、9F6、18C10)对KM-555-As的结合性的结果。图中的16B11、9F6、18C10表示抗体名称。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的白色区域表示阴性对照抗体的结合，深灰色表示抗TSPAN8抗体的结合。

图1-3示出通过流式细胞术法测定抗TSPAN8抗体(16B11、9F6、18C10)对KM-556-As的结合性的结果。图中的16B11、9F6、18C10表示抗体名称。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的白色区域表示阴性对照抗体的结合，深灰色表示抗TSPAN8抗体的结合。

图2-1示出通过流式细胞术法测定抗TSPAN8抗体(16B11、16B12、9F6、5B7、12C12、13A9、15D1、TAL69)对培养人腹膜间皮细胞的结合性的结果。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的白色区域表示阴性对照抗体的结合，深灰色表示抗TSPAN8抗体的结合。

图2-2示出通过流式细胞术法测定抗TSPAN8抗体(18C10、19E4、21F7、TAL69)对培养人腹膜间皮细胞的结合性的结果。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的白色区域表示阴性对照抗体的结合，深灰色表示抗TSPAN8抗体的结合。

图3-1示出通过流式细胞术法测定抗TSPAN8抗体(16B11、16B12、9F6、18C10、TAL69)对KM-501-As的结合性的结果。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的白色区域表示阴性对照抗体的结合，深灰色表示抗TSPAN8抗体的结合。

图3-2示出通过流式细胞术法测定抗TSPAN8抗体(16B11、16B12、9F6、18C10、TAL69)对KM-503-As的结合性的结果。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的白色区域表示阴性对照抗体的结合，深灰色表示抗TSPAN8抗体的结合。

图4示出通过流式细胞术法测定抗TSPAN8抗体(16B11、16B12、9F6、5B7、12C12、13A9、15D1、18C10、19E4、21F7、TAL69)对人脐带血管内皮细胞供体2的结合性的结果。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的白色区域表示阴性对照抗体的结合，深灰色表示抗TSPAN8抗体的结合。

图5-1示出通过流式细胞术法测定抗TSPAN8抗体(16B11、16B12、TAL69)对表达人小鼠TSPAN8-GFP嵌合蛋白或人大鼠TSPAN8-GFP嵌合蛋白的CHO-K1细胞(表达嵌合蛋白的CHO-K1细胞)的结合性的结果。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的灰色表示表达野生型人TSPAN8的CHO-K1细胞，黑色表示表达嵌合蛋白的CHO-K1细胞，白色区域表示抗TSPAN8抗体对空白对照细胞(mock cell)的结合。实验以重复方式实施。

图5-2示出人、小鼠、大鼠和食蟹猴的4种TSPAN8蛋白的氨基酸编号126～155所构成的序列的同源性。星号表示为完全一致的氨基酸，圆点表示4种中的3种为相同的氨基酸。空白表示2种以上为不同的氨基酸。

图5-3示出通过流式细胞术法测定抗TSPAN8抗体(16B11、16B12、TAL69)对人TSPAN8蛋白的T131A突变体或T131N突变体的结合性的结果。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的灰色表示表达野生型人TSPAN8的CHO-K1细胞，黑色表示表达突变体的CHO-K1细胞，白色区域表示抗TSPAN8抗体对空白对照细胞的结合。实验以重复方式实施。

图6-1示出通过流式细胞术法测定其它抗TSPAN8抗体(Competitor(CPTR)：16B11、9F6、18C10、TAL69)对于16B11与NSC-15CF的结合的竞争作用的结果。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的灰色表示阴性对照抗体存在下的荧光标记16B11的结合，黑色表示各CPTR存在下的荧光标记16B11的结合，白色区域表示荧光标记16B11未染色的直方图。

图6-2示出通过流式细胞术法测定16B12对于荧光标记抗TSPAN8抗体(16B11、9F6、18C10)与NSC-15CF的结合的竞争作用的结果。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的灰色表示阴性对照抗体存在下的荧光标记抗TSPAN8抗体的结合，黑色表示16B12存在下的荧光标记抗TSPAN8抗体的结合，白色区域表示荧光标记抗体未染色的直方图。

图6-3示出通过流式细胞术法测定其它抗TSPAN8抗体(CPTR：16B12、16B11、9F6、18C10、TAL69)对于16B12与NSC-15CF的结合的竞争作用的结果。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的灰色表示阴性对照抗体存在下的荧光标记16B12的结合，黑色表示其它抗TSPAN8抗体(CPTR)存在下的荧光标记16B12的结合，白色区域表示荧光标记抗体未染色的直方图。

图7示出60As6-Luc/GFP细胞与人NK细胞的共培养体系中的、16B11.1的细胞杀伤活性。横轴表示抗体浓度，纵轴表示根据由60As6-Luc/GFP细胞产生的荧光素酶活性算出的细胞杀伤活性。●、▲分别表示对照抗体、16B11.1的各浓度下的细胞杀伤活性的平均值。误差棒表示标准偏差。

图8示出抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体对TSPAN8的LEL区域肽和CD3εδ复合蛋白的结合活性。横轴表示抗体浓度，纵轴表示抗体的结合量。图8-1、图8-2分别示出抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体对TSPAN8的LEL区域肽、CD3εδ复合蛋白的结合量的平均值。误差棒表示标准偏差。

图9示出60As6-Luc/GFP细胞与人外周血单核细胞的共培养体系中的抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体的细胞杀伤活性。横轴表示抗体浓度，纵轴表示60As6-Luc/GFP细胞的添加抗体3天后的荧光面积中、设未添加抗体为100％时的细胞增殖(％)。●表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体的各浓度下的细胞增殖的平均值。误差棒表示标准偏差。

图10-1示出抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体对人胃癌患者腹水细胞中的胃癌细胞的细胞杀伤活性。横轴表示抗体浓度，纵轴表示胃癌细胞的添加抗体3天后的活细胞数中、设未添加抗体为100％时的活细胞数(％)。●、■分别表示对照抗体、抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体的各浓度下的活细胞数(％)的平均值。误差棒表示标准偏差。

图10-2为以CD25的表达诱导来示出抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体所带来的人胃癌患者腹水细胞中的CD4阳性T细胞的活化的图。横轴表示抗体浓度。纵轴表示向腹水中CD4阳性T细胞中添加抗体3天后的CD25表达量的倍率变化。●、■分别示出对照抗体、抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体的各浓度下的CD25表达量的倍率变化的平均值。误差棒表示标准偏差。

图10-3为以CD25的表达诱导来示出抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体所带来的人胃癌患者腹水细胞中的CD8阳性T细胞的活化的图。横轴表示抗体浓度。纵轴表示向腹水中CD8阳性T细胞中添加抗体3天后的CD25表达量的倍率变化。●、■分别示出对照抗体、抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体的各浓度下的CD25表达量的倍率变化的平均值。误差棒表示标准偏差。

图11-1示出胃癌腹膜播散模型中的抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体的抗肿瘤效果。纵轴表示腹腔中的60As6-Luc/GFP细胞所表达的荧光素酶引起的荧光素发光量的平均值。误差棒表示标准误差。横轴表示抗体给药量。显著性概率P值通过利用邓尼特多重比较检验比较对照组的发光量与抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体给药组的发光量来求出。图中的**表示P值小于显著水平0.01的组。

图11-2示出胃癌腹膜播散模型中的抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体对生存天数的效果。纵轴表示生存率。横轴表示癌细胞移植后的天数。抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体和扩增panT细胞在▲所示的60As6-Luc/GFP移植后7、10天后给予。

图12示出通过流式细胞术法测定16B11对各种癌细胞株的结合性的结果。图中的横轴表示荧光强度，纵轴表示细胞计数。图中的白色区域表示阴性对照抗体的结合，深灰色表示16B11的结合。

图13-1示出抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体对人外周血单核细胞共培养下的各种癌细胞株的细胞杀伤活性。横轴表示抗体浓度，纵轴表示各癌细胞株的添加抗体3天后的活细胞数中、设未添加抗体为100％时的活细胞数(％)。各符号表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体的各浓度下的各癌细胞株的活细胞数(％)的平均值(quadruplicate)。

图13-2为以CD25的表达诱导来示出抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体所带来的人外周血单核细胞与各种癌细胞株共培养中的CD4阳性T细胞的活化的图。横轴表示抗体浓度。纵轴表示添加抗体3天后的CD4阳性T细胞的CD25表达量的倍率变化。各符号表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体的各浓度下的CD25表达量的倍率变化的平均值(quadruplicate)。

图13-3为以CD25的表达诱导来示出抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体所带来的人外周血单核细胞与各种癌细胞株的共培养中的CD8阳性T细胞的活化的图。横轴表示抗体浓度。纵轴表示添加抗体3天后的CD8阳性T细胞的CD25表达量的倍率变化。各符号表示抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体的各浓度下的CD25表达量的倍率变化的平均值(quadruplicate)。

图14示出移植人PBMC的HT-29细胞皮下荷瘤模型中的抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体的抗肿瘤效果。图14-1示出开始给予抗体后的天数的、肿瘤体积的平均值，误差棒表示标准误差。图14-2示出开始给予11天后的各个体的肿瘤体积的值，横线表示平均值和标准误差，横轴表示抗体给药量。显著性概率P值通过利用邓尼特多重比较检验比较PBS给药组的肿瘤体积与抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体给药组的肿瘤体积来求出。图中的**表示P值小于显著水平0.01的组。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。

＜定义＞

本说明书的术语只要未在以下特别地定义，则以该技术领域中本领域技术人员通常使用的含义来使用。

抗体(或免疫球蛋白)是指由具有由2条具有单一序列的重链和2条具有单一序列的轻链构成的左右对称Y字型结构的4条链结构构成的糖蛋白。抗体存在IgG、IgM、IgA、IgD和IgE这5个类。抗体分子的基本结构在各类中是共通的，2条分子量5万～7万的重链和2条分子量2万～3万的轻链通过二硫键和非共价键而结合，形成分子量15万～19万的由Y字型的4条链结构构成的抗体分子。重链通常由包含约440个氨基酸的多肽链构成，在各类中具有特征性结构，与IgG、IgM、IgA、IgD、IgE对应地分别被称为Igγ、Igμ、Igα、Igδ、Igε。进而，IgG中存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的亚类，各自对应的重链被称为Igγ1、Igγ2、Igγ3、Igγ4。轻链通常由包含约220个氨基酸的多肽链构成，已知有L型和K型这2种，分别称为Igλ、Igκ。上述2种轻链可以与任意种类的重链配对。

关于抗体分子的链内二硫键，在重链中存在4个(Igμ、Igε中存在5个)，在轻链中存在2个，每100～110个氨基酸残基形成1个环。这些立体结构在各环之间是相似的，被称为结构单元或结构域。重链、轻链均是位于N末端的结构域被称为可变区，已知即使是由同种动物的同一类(或亚类)产生的抗体也具有多样的氨基酸序列，参与抗体与抗原的结合特异性结合。位于可变区下游的C末端侧的结构域的氨基酸序列在各类或亚类中大致恒定，被称为恒定区。重链中，从N末端向C末端具有重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。CH中，进一步从N末端侧起分为CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域这3个结构域。轻链中，从N末端向C末端具有轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。

VH和VL中存在的3个互补决定区(CDR)的氨基酸序列的变化非常大，有助于可变区的可变性。CDR为在重链和轻链的N末端分别以CDR1、CDR2、CDR3的顺序存在的由大约5～10个氨基酸残基构成的区域，形成抗原结合部位。另一方面，可变区的CDR以外的部分被称为框架区(FR)，由FR1～4构成，氨基酸序列的变化比较少。

将抗体用蛋白水解酶的木瓜蛋白酶进行处理时，得到3个抗体片段。N末端侧的2个片段被称为Fab(抗原结合片段、Fragment，antigen binding)区。本说明书中，“Fab区”是指由重链的VH和CH1结构域、以及轻链(VL和CL)构成的区域，以该Fab区所构成的前端部分的抗原结合部位与抗原结合。本说明书中，“重链片段”是指由构成Fab区的重链的VH和CH1结构域构成的片段。

另外，将C末端侧的片段称为Fc(可结晶化片段、Fragment，crystallizable)区。本说明书中，“Fc多肽”是指由重链的CH2结构域和CH3结构域构成的多肽，“Fc区”是指由2个Fc多肽构成的复合体。

重链片段与Fc多肽通过被称为铰链区的部分来连接。另外，抗体的2条重链在铰链区形成二硫键。

本说明书中，“抗原”以通常使用的含义来使用，特别地，作为表示抗体、抗原结合片段等抗原结合蛋白能特异性结合的分子或分子的一部分的术语来使用。抗原可以为蛋白质、核酸等分子。1个抗原有时具有能够与不同的抗体等进行相互作用的1个或1个以上表位。

本说明书中，“表位”或“抗原决定簇”是指抗原结合蛋白识别并结合的抗原的特定结构单元，包括可被抗体或T细胞受体等抗原结合蛋白结合的所有决定簇。表位决定簇可以包括氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基等分子的化学活性表面基团，可以具有特异性的三维结构特征和/或特异性的电荷特长。在抗原为蛋白质的情况下，包括与抗体等直接接触的特定氨基酸。通常，针对特定靶抗原的特异性抗体在蛋白质和/或高分子的复杂混合物中会优先识别靶抗原上的表位。表位大多由可接触表面的氨基酸残基和/或糖侧链构成，通常由6～10个氨基酸、5～8个单糖的序列构成。表位有时具有特有的三维结构特性和特有的电荷特性。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基。关于抗原结合蛋白所结合的表位的鉴定，例如可以使用质谱法(例如氢-氘交换质谱(Hydrogen/Deuterium eXchange Mass Spectrometry；HDX-MS)、丙氨酸扫描诱变法、晶体分析法、肽竞争法等本领域技术人员周知的方法来进行鉴定。

本说明书中，“竞争”或“进行竞争”是指：将2种以上抗体同时或连续地添加于反应液时，一种抗体妨碍另一种抗体与抗原的结合，由此使另一种抗体与抗原的结合能力下降。

本说明书中，“抗原结合片段”是指：包含来自抗体的具有抗原结合活性的至少1个多肽链的分子。作为代表性的抗原结合片段，可列举单链可变区片段(scFv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段。scFv是由以接头连接的VH和VL构成的一价的抗原结合片段。Fab片段是由轻链和包含重链的VH、CH1结构域的片段构成的一价的抗原结合片段。Fab’片段是由轻链以及包含重链的VH、CH1结构域和铰链区的一部分的片段构成的一价的抗原结合片段，在该铰链区的部分包含构成重链间S-S键的半胱氨酸残基。F(ab’)₂片段是用二硫键连接Fab’片段而成的二价分子。一价是指包含1个抗原结合部位，二价是指包含2个抗原结合部位。

本说明书中，“scFv区”是指：含有包含以接头连接的VH和VL的一价的抗原结合片段的区域。

单臂(One-armed)抗体也是抗原结合片段的一种，具有包含1个Fab区和1个Fc区、并且该Fab区的重链片段与该Fc区中的2个Fc多肽中的1个连接的结构。一个实施方式中，单臂抗体包含1个重链(VH、CH1结构域、铰链区、Fc多肽(CH2结构域和CH3结构域))、1个轻链(VL和CL)和Fc多肽。

本说明书中，“多特异性抗体”是指：能够与2个以上的不同抗原特异性结合的抗体，根据所结合的抗原的数量而称为例如双特异性抗体、三特异性抗体。多特异性抗体包括能够分别与不同抗原结合的2个以上抗体和/或抗原结合片段的复合体，本说明书中使用的“抗体”只要上下文没有特别限制，则包括多特异性抗体。

本说明书中，“双特异性抗体”是指：能够与2个不同的抗原特异性结合的抗体。“抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体”是指：具有对TSPAN8的结合活性和对CD3的结合活性的双特异性抗体。

本说明书中，“人抗体”是指具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体。本说明书中，“人源化抗体”是指：CDR以外的氨基酸残基的一部分、大部分或全部被来自人免疫球蛋白分子的氨基酸残基置换的抗体。作为人源化的方法，没有特别限制，例如可以参照美国专利第5225539号、美国专利第6180370号等制作人源化抗体。

本说明书中使用的抗体的氨基酸残基编号可以通过指定Kabat编号或EU索引(Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed，1991，NIHPublication No.91-3242)而按照这些编号系统进行规定。

本说明书中，“第一”或“第二”之类的术语是当部分的各种类存在2种以上时为了方便区分而使用的。这类术语的使用只要没有明确进行表述则并非意图赋予特定的顺序、含义。

本说明书中，“连接”或“连接的”是指：两个以上成分(例如Fab区和Fc多肽)直接结合、或者借助一个或两个以上中介物(例如肽接头)结合。本说明书中，“肽接头”是指：用于连接可变区之间的、可通过基因工程导入的1个以上的任意氨基酸残基。本发明中使用的肽接头的长度没有特别限定，可以根据目的由本领域技术人员适宜选择。

本说明书中，“一致性”是指：使用EMBOSS Needle(Nucleic Acids Res.、2015、Vol.43、pW580-W584)通过以默认准备的参数而得到的Identity值。上述参数如下所述。

Gap Open Penalty＝10

Gap Extend Penalty＝0.5

Matrix＝EBLOSUM62

End Gap Penalty＝false

本说明书中，“对象”是指需要进行该预防或治疗的人或其它动物。一个方式中，为需要进行该预防或治疗的人。

＜本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体＞

本发明提供以下所示的与TSPAN8和CD3结合的双特异性抗体(也称为“抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体”)：

一种与TSPAN8和CD3结合的双特异性抗体，其包含：

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体具有包含第一抗体的1个Fab区、第二抗体的scFv区和1个Fc区的结构。这种结构的抗体也被称为“开瓶器(Bottle-opener)型抗体”(国际公开2014/110601号)。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体为人抗体或人源化抗体。

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体包含由包含抗TSPAN8抗体的重链可变区的重链片段和包含抗TSPAN8抗体的轻链可变区的轻链构成的抗TSPAN8抗体Fab区作为Fab区。

一个实施方式中，抗TSPAN8抗体的重链可变区包含由序列号6的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号6的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号6的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3，抗TSPAN8抗体的轻链可变区包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3。

一个实施方式中，抗TSPAN8抗体的重链可变区包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3，抗TSPAN8抗体的轻链可变区包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3。

一个实施方式中，抗TSPAN8抗体的重链可变区由序列号6的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成，抗TSPAN8抗体的轻链可变区由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成。

一个实施方式中，抗TSPAN8抗体的重链可变区由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成，抗TSPAN8抗体的轻链可变区由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成。

作为抗TSPAN8抗体Fab区的重链片段的CH1结构域所来源的重链恒定区，Igγ、Igμ、Igα、Igδ或Igε中的任一恒定区均可以选择。作为Igγ，例如可以从Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4中选择。一个实施方式中，抗TSPAN8抗体Fab区的重链片段包含来自人Igγ1恒定区的CH1结构域。

作为抗TSPAN8抗体Fab区的轻链的CL，Igλ或Igκ中的任一恒定区均可以选择。一个实施方式中，抗TSPAN8抗体Fab区包含作为Igκ恒定区的CL。一个实施方式中，抗TSPAN8抗体Fab区的轻链包含作为人Igκ恒定区的CL。

一个实施方式中，抗TSPAN8抗体Fab区由重链片段和轻链构成，所述重链片段由序列号6的氨基酸编号1至219的氨基酸序列构成，所述轻链由序列号8的氨基酸序列构成。一个实施方式中，抗TSPAN8抗体Fab区由重链片段和轻链构成，所述重链片段由序列号10的氨基酸编号1至219的氨基酸序列构成，所述轻链由序列号12的氨基酸序列构成。

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有包含抗CD3抗体的重链可变区和轻链可变区的抗CD3-scFv区作为scFv区。本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体中，可以使用本领域公知的抗CD3-scFv区或基于本领域公知的抗CD3抗体的重链可变区和轻链可变区的序列信息制作的抗CD3抗体的scFv区。作为公知的抗CD3抗体，已知有OKT3、UTCH1、L2K、TR66等克隆，它们的序列作为双特异性抗体来使用(Pharmacol.Ther.、2018、Vol.182、p.161-175)。

一个实施方式中，抗CD3抗体的重链可变区包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3，抗CD3抗体的轻链可变区包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3。

一个实施方式中，抗CD3抗体的重链可变区由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成，抗CD3抗体的轻链可变区由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成。

抗CD3-scFv区中，连接抗CD3抗体的重链可变区与轻链可变区的肽接头的种类和长度没有特别限定，可以由本领域技术人员适宜地选择，优选的长度为5氨基酸以上(上限没有特别限定，通常为30氨基酸以下、优选20氨基酸以下)，特别优选为15氨基酸。作为肽接头，可以使用例如甘氨酸-丝氨酸接头(GS接头)、甘氨酸-赖氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸接头(GKPGS接头)。作为这样的接头，可列举例如以下接头。

Ser

Gly-Ser

Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly

Gly-Gly-Gly-Ser(序列号15)

Ser-Gly-Gly-Gly(序列号16)

Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号17)

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号18)

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号19)

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号20)

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号21)

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号22)

(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n

(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n

Gly-Lys-Pro-Gly-Ser(序列号23)

(Gly-Lys-Pro-Gly-Ser)n

上述的n表示1以上的整数。肽接头的长度、序列可根据目的由本领域技术人员适宜地选择。

一个实施方式中，抗CD3-scFv区由序列号14的氨基酸编号1至254的氨基酸序列构成。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体包含：含有包含由序列号6的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号6的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号6的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；含有包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及含有包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的重链可变区和包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有：包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；含有包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及含有包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的重链可变区和包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有：包含由序列号6的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；包含由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有：包含由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；包含由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽。

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体中，作为构成Fc区的第一Fc多肽和第二Fc多肽所来源的重链恒定区，Igγ、Igμ、Igα、Igδ或Igε中的任一恒定区均可以选择。作为Igγ，例如可从Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4中选择。一个实施方式中，第一Fc多肽和第二Fc多肽为来自人Igγ1恒定区的Fc多肽。

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体中的Fc区可以包含使抗体依赖性细胞杀伤活性(ADCC)、补体依赖性杀伤活性(CDC)下降的突变。L234A是指人Igγ1恒定区中的根据EU索引的氨基酸第234位的亮氨酸向丙氨酸的置换。L235A是指人Igγ1恒定区中的根据EU索引的氨基酸第235位的亮氨酸向丙氨酸的置换。将人Igγ1恒定区L234A和L235A的氨基酸突变称为“LALA突变”。已知该突变使抗体的抗体依赖性细胞杀伤活性、补体依赖性杀伤活性下降(Mol.Immunol.、1992、Vol.29、p.633-639；J.Immunol.、2000、Vol.164、p.4178-4184)。

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体中的Fc区可以还包含其它基于公知技术的突变。例如，Fc区可以包含N297G突变(Protein cell、2018、Vol.9、p.63-73)或基于杵臼结构(Knobs into holes)技术的突变(以下也称为“杵臼结构突变”)。杵臼结构技术为如下技术：将存在于一条重链的CH3区域的氨基酸侧链置换为更大的侧链(knob；突起)，将存在于另一条重链的CH3区域的氨基酸侧链置换为更小的侧链(hole；空隙)，由此将突起配置在空隙内，促进重链的异二聚体化，可以高效地获得目标异二聚体化抗体分子(Nature、1994、Vol.372、p.379-383；Nature Biotech.、1998、Vol.16、p.677-681；J.Mol.Biol.、1997、Vol.270、p.26-35；Proc.Natl.Acad.Sci.USA、2013、Vol.110、p.E2987-E2996)。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有包含L234A和L235A的氨基酸突变(LALA突变)的Fc区。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有包含N297G突变的Fc区。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有包含杵臼结构突变的Fc区。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有包含L234A和L235A的氨基酸突变(LALA突变)、N297G突变和杵臼结构突变中的1种以上突变的Fc区。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有包含L234A和L235A的氨基酸突变(LALA突变)、N297G突变和杵臼结构突变的Fc区。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体所包含的杵臼结构突变为形成其Fc区的1个Fc多肽中的T366W突变、以及形成其Fc区的另一个Fc多肽中的T366S、L368A和Y407V突变(参照国际公开1998/050431号)。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体包含：由序列号6的氨基酸编号235至451的氨基酸序列构成的第一Fc多肽与由序列号14的氨基酸编号270至486的氨基酸序列构成的第二Fc多肽所构成的Fc区。

需要说明的是，本说明书中，LALA突变、N297G突变、杵臼结构突变等氨基酸突变的记载基于人Igγ1恒定区中的根据EU索引的氨基酸位置。例如，如上所述，L234A是指人Igγ1恒定区中的根据EU索引的氨基酸第234位的亮氨酸向丙氨酸的置换。

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体中，包含抗TSPAN8抗体的重链可变区的重链片段与Fc多肽(第一Fc多肽)可以借助铰链区连接并构成抗TSPAN8抗体的重链。

另外，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体中，抗CD3-scFv区与Fc多肽(第二Fc多肽)可以借助铰链区连接。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有：包含抗TSPAN8抗体的重链可变区的重链片段与第一Fc多肽借助铰链区连接而成的抗TSPAN8抗体的重链。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体包含：抗CD3-scFv区与第二Fc多肽借助铰链区连接而成的多肽。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有：包含抗TSPAN8抗体的重链可变区的重链片段与第一Fc多肽借助铰链区连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；以及，抗CD3-scFv区与第二Fc多肽借助铰链区连接而成的多肽。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体包含：含有包含由序列号6的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号6的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号6的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽借助铰链区连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；含有包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，含有包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的重链可变区和包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽借助铰链区连接而成的多肽。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体包含：含有包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽借助铰链区连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；含有包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，含有包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的重链可变区和包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽借助铰链区连接而成的多肽。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有：包含由序列号6的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽借助铰链区连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；包含由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽借助铰链区连接而成的多肽。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有：包含由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽借助铰链区连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；包含由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽借助铰链区连接而成的多肽。

一个实施方式中，包含抗TSPAN8抗体的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽借助铰链区连接而成的抗TSPAN8抗体的重链由序列号6或10的氨基酸序列构成。一个实施方式中，包含抗TSPAN8抗体的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽借助铰链区连接而成的抗TSPAN8抗体的重链由序列号6的氨基酸序列构成。一个实施方式中，抗TSPAN8抗体的轻链由序列号8或12的氨基酸序列构成。一个实施方式中，抗TSPAN8抗体的轻链由序列号8的氨基酸序列构成。一个实施方式中，抗CD3-scFv区与第二Fc多肽借助铰链区连接而成的多肽由序列号14的氨基酸序列构成。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有：包含由序列号6或10的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段、由序列号8或12的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链和第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；以及，由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体含有：包含由序列号6的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段、由序列号8或12的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链和第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；以及，由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体为包含由序列号6的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链、由序列号8的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链和由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的双特异性抗体。

本说明书中，“翻译后修饰”是指在细胞内表达抗体时抗体在翻译后接受修饰。作为翻译后修饰的例子，可列举重链N末端的谷氨酰胺或谷氨酸的焦谷氨酰化、糖基化、氧化、脱酰胺化、糖化等修饰以及重链C末端的赖氨酸被羧肽酶切断而导致的赖氨酸缺失。已知在各种抗体中均会发生这样的翻译后修饰(J.Pharm.Sci.、2008、Vol.97、p.2426-2447)。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体可以经过了翻译后修饰。一个实施方式中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷氨酰化和/或重链C末端赖氨酸缺失。基于N末端的焦谷氨酰化或C末端赖氨酸缺失的翻译后修饰不会对抗体的活性造成影响，这是本领域中已知的(Analytical Biochemistry、2006、Vol.348、p.24-39)。

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体与人TSPAN8(基因编号：NM_004616.2)和人CD3εδ复合蛋白(CD3ε基因编号：NM_000733.3、CD3δ基因编号：NM_000732.4或NM_001040651.1)结合。是否与人TSPAN8和人CD3εδ复合蛋白结合可使用公知的结合活性测定方法来进行确认。作为测定结合活性的方法，可列举例如酶联免疫测定(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay，ELISA)法、流式细胞术法等方法。使用ELISA法时，例如可以使用实施例8中记载的方法，使用流式细胞术法时，例如可以使用实施例1中记载的方法。

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体可以由本领域技术人员基于本说明书中公开的抗TSPAN8抗体和抗CD3-scFv区的重链可变区和轻链可变区的序列信息等使用本领域公知的方法来制作。另外，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的抗CD3-scFv区可以由本领域技术人员基于公知的抗CD3抗体的重链可变区和轻链可变区的序列信息等使用本领域公知的方法来制作。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体为人源化抗体或人抗体。制作人源化抗体时，可以使用本领域技术人员熟知的方法适宜地导入回复突变(Bioinformatics、2015、Vol.31、p.434-435)。本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体没有特别限定，例如，可以按照后述的＜生产本发明的双特异性抗体的方法和通过该方法生产的本发明的双特异性抗体＞中记载的方法来制造。

＜本发明的双特异性抗体的多核苷酸＞

本发明另外提供可用于生产本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的、以下的多核苷酸(也称为“本发明的双特异性抗体的多核苷酸”)。

(1)含有编码包含抗TSPAN8抗体的重链片段和第一Fc多肽的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

(2)包含编码抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(3)含有编码包含抗CD3-scFv区和包含第二Fc多肽的多肽的多肽的碱基序列的多核苷酸。

上述(1)的多核苷酸的一个实施方式中，本发明的双特异性抗体的多核苷酸为选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

(a)包含编码含有包含由序列号6的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号6的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号6的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码含有包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸。

(b)包含编码包含由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸。

上述(1)的多核苷酸的一个实施方式中，本发明的双特异性抗体的多核苷酸为包含编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸。

上述(2)的多核苷酸的一个实施方式中，本发明的双特异性抗体的多核苷酸为选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

(a)包含编码含有包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码含有包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

(a)包含编码包含由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码包含由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

上述(2)的多核苷酸的一个实施方式中，本发明的双特异性抗体的多核苷酸为包含编码由序列号8的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

上述(3)的多核苷酸的一个实施方式中，本发明的双特异性抗体的多核苷酸为以下的多核苷酸：

包含编码抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸，所述抗CD3-scFv区含有：包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的重链可变区；以及，包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的轻链可变区。

包含编码包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

上述(3)的多核苷酸的一个实施方式中，本发明的双特异性抗体的多核苷酸为包含编码由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

本发明的双特异性抗体的多核苷酸可以由本领域技术人员基于其碱基序列使用本领域公知的方法而制作。例如，本发明的双特异性抗体的多核苷酸可以使用本领域公知的基因合成方法而合成。作为这样的基因合成方法，可以使用国际公开号90/07861号中记载的抗体基因的合成方法等本领域技术人员公知的各种方法。

＜本发明的双特异性抗体的表达载体＞

本发明另外提供包含以下的(1)～(3)记载的本发明的双特异性抗体的多核苷酸的表达载体(也称为“本发明的双特异性抗体的表达载体”)。这些多核苷酸既可以分别包含在不同载体中，或者也可以在1个载体中包含两个以上多核苷酸。

(1)包含编码抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

(2)包含编码抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(3)含有编码抗CD3-scFv区与包含第二Fc多肽的多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

包含上述(1)的多核苷酸的本发明的双特异性抗体的表达载体的一个实施方式中，该表达载体包含选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

包含上述(1)的多核苷酸的本发明的双特异性抗体的表达载体的一个实施方式中，该表达载体含有包含编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸。

包含上述(2)的多核苷酸的本发明的双特异性抗体的表达载体的一个实施方式中，该表达载体包含选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

包含上述(2)的多核苷酸的本发明的双特异性抗体的表达载体的一个实施方式中，该表达载体含有包含编码由序列号8的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

包含上述(3)的多核苷酸的本发明的双特异性抗体的表达载体的一个实施方式中，该表达载体包含以下的多核苷酸：

包含上述(3)的多核苷酸的本发明的双特异性抗体的表达载体的一个实施方式中，该表达载体含有包含编码由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

一个实施方式中，本发明的双特异性抗体的表达载体为包含选自以下的(a)～(e)中的1种以上数量的多核苷酸的表达载体：

(b)包含编码含有包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(c)包含编码含有包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸。

(d)包含编码含有包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

(e)包含编码抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸，所述抗CD3-scFv区含有：包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的重链可变区；以及，包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的轻链可变区。

(c)包含编码包含由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸。

(d)包含编码包含由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

一个实施方式中，本发明的双特异性抗体的表达载体为包含选自以下的(a)～(c)中的1种以上数量的多核苷酸的表达载体：

本发明的双特异性抗体的表达载体只要能够在真核细胞(例如动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母)和/或原核细胞(例如大肠杆菌)等各种宿主细胞中产生本发明的多核苷酸则没有特别限制。作为这样的表达载体，可列举例如质粒载体、病毒载体等。作为质粒载体，可以使用例如pcDNA系列(Thermo Fisher Scientific公司)、pALTER(注册商标)-MAX(普洛麦格)、pHEK293超级表达载体(宝生物公司)、pEE6.4或pEE12.4(Lonza Biologics公司)等。作为病毒载体，可以使用例如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒。例如，在使用慢病毒以向细胞导入本发明的多核苷酸时，该慢病毒可以使用pLVSIN-CMV/EF1α载体(宝生物公司)、pLenti载体(Thermo Fisher Scientific公司)等。一个实施方式中，本发明的双特异性抗体的表达载体中使用的载体为pcDNA ^TM3.4-TOPO(注册商标)(Thermo FisherScientific公司)和pcDNA ^TM3.1(Thermo Fisher Scientific公司)。

本发明的双特异性抗体的表达载体可以包含以可操作方式与本发明的双特异性抗体的多核苷酸连接的启动子。作为用于在动物细胞中表达本发明的双特异性抗体的多核苷酸的启动子，可列举例如CMV、RSV、SV40等病毒来源启动子、肌动蛋白启动子、EF(elongation factor，延伸因子)1α启动子、热休克启动子等。作为用于在细菌(例如埃希氏菌属菌)中表达本发明的双特异性抗体的多核苷酸的启动子，可列举例如trp启动子、lac启动子、λPL启动子、tac启动子等。作为用于在酵母中表达本发明的双特异性抗体的多核苷酸的启动子，可列举例如GAL1启动子、GAL10启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。

使用动物细胞、昆虫细胞或酵母作为宿主细胞时，本发明的双特异性抗体的表达载体可包含起始密码子和终止密码子。这种情况下，可以包含增强子序列、编码本发明的抗体或其重链或轻链的基因的5’侧和3’侧的非翻译区、分泌信号序列、剪接接合部、聚腺苷酸化部位、或可复制单元等。使用大肠杆菌作为宿主细胞时，本发明的表达载体可以包含起始密码子、终止密码子、终止子区域和可复制单元。本发明的表达载体可以包含根据目的通常使用的药剂选择标记基因(例如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因)。

＜本发明的进行了转化的宿主细胞＞

本发明另外提供利用本发明的双特异性抗体的表达载体进行了转化的宿主细胞(也称为“本发明的进行了转化的宿主细胞”)。本发明的进行了转化的宿主细胞可以通过利用本发明的双特异性抗体的表达载体的转化而包含以下的(1)～(3)的本发明的双特异性抗体的多核苷酸中的1个或2个以上多核苷酸，一个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞包含以下的(1)～(3)的多核苷酸的全部：

(2)包含编码抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(3)包含编码抗CD3-scFv区与包含第二Fc多肽的多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

作为要转化的宿主细胞，只要适合于使用的表达载体、用该表达载体转化后能够表达抗体或融合体则没有特别限定。作为要转化的宿主细胞，可列举例如本发明的技术领域中通常使用的现有细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如动物细胞(例如CHO-K1细胞、ExpiCHO-S(注册商标)细胞、CHOK1SV细胞、CHO-DG44细胞、HEK293细胞、NS0细胞)、昆虫细胞(例如Sf9)、细菌(埃希氏菌属菌等)、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)等)。一个实施方式中，本发明的宿主细胞为CHO-K1细胞或ExpiCHO-S细胞。

转化宿主细胞的方法没有特别限定，可以使用例如磷酸钙法、电穿孔法或脂质体转染法等本领域技术人员通常使用的方法。

进行了转化的宿主细胞的筛选可以利用本领域技术人员通常使用的方法来进行。作为筛选方法，可以使用例如利用药剂选择标记基因和四环素、氨苄青霉素、新霉素或潮霉素等药剂的药剂选择法；有限稀释法、单细胞分选法或菌落挑取法等细胞分离法。

包含上述(1)的多核苷酸的本发明的进行了转化的宿主细胞的一个实施方式中，该宿主细胞包含选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

包含上述(1)的多核苷酸的本发明的进行了转化的宿主细胞的一个实施方式中，该宿主细胞含有包含编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸。

包含上述(2)的多核苷酸的本发明的进行了转化的宿主细胞的一个实施方式中，该宿主细胞包含选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

包含上述(2)的多核苷酸的本发明的进行了转化的宿主细胞的一个实施方式中，该宿主细胞含有包含编码由序列号8的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

包含上述(3)的多核苷酸的本发明的进行了转化的宿主细胞的一个实施方式中，该宿主细胞包含以下的多核苷酸：

包含编码包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区、由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

包含上述(3)的多核苷酸的本发明的进行了转化的宿主细胞的一个实施方式中，该宿主细胞含有包含编码由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

一个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞为包含选自以下的(a)～(e)中的1种以上多核苷酸的宿主细胞：

(c)包含编码含有包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

(d)包含编码含有包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(e)包含编码包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

一个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞为包含选自以下的(a)～(c)中的多核苷酸的宿主细胞：

(c)包含编码由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

一个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞含有：包含编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；包含编码由序列号8的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；以及，包含编码由序列号14的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

＜生产本发明的双特异性抗体的方法＞

本发明另外提供生产本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的方法(也称为“本发明的生产方法”)。本发明的生产方法可包括培养＜本发明的进行了转化的宿主细胞＞中记载的进行了转化的宿主细胞并在该细胞或该培养上清液中表达该抗体的步骤；对该抗体进行回收、分离、纯化的方法等，但只要能够生产本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体则不限于这些方法。

本发明的进行了转化的宿主细胞的培养可以通过公知的方法进行。培养条件、例如温度、培养基的pH和培养时间可以由本领域技术人员适宜选择。宿主细胞为动物细胞时，作为培养基，可以使用例如包含约5～20％的胎牛血清的MEM培养基(Science、1959、Vol.130、p.432-437)、DMEM培养基(Virol.、1959、Vol.8、p.396)、RPMI-1640培养基(J.Am.Med.Assoc.、1967、Vol.199、p.519)、199培养基(Exp.Biol.Med.、1950、Vol.73、p.1-8)等。培养基的pH例如为约6～8，培养可以边根据需要进行通气、搅拌边通常在约30～40℃下进行约15～336小时。宿主细胞为昆虫细胞时，作为培养基，可以使用例如包含胎牛血清的Grace’s培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1985、Vol.82、p.8404)等。培养基的pH例如为约5～8，培养可以边根据需要进行通气、搅拌边通常在约20～40℃下进行约15～100小时。宿主细胞为大肠杆菌或酵母时，作为培养基，例如含有营养源的液体培养基是适当的。营养培养基含有例如进行了转化的宿主细胞的生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，可以包含例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，可以包含例如铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、豆粕、马铃薯提取液等。可以根据期望含有其它营养素(例如无机盐(例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类)、抗生素(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素)等。培养基的pH例如为约5～8。宿主细胞为大肠杆菌时，作为培养基，可以使用例如LB培养基、M9培养基(MolecularCloning、Cold Spring Harbor Laboratory、Vol.3、A2.2)等。培养边根据需要进行通气、搅拌边通常在约14～43℃下进行约3～24小时。宿主细胞为酵母时，作为培养基，可以使用例如Burkholder最小培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1980、Vol.77、p.4505)等。培养边根据需要进行通气、搅拌边通常在约20～35℃下进行约14～144小时。通过上述那样的培养，可以表达本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体。

本发明的生产方法除了包括培养本发明的进行了转化的宿主细胞并使其表达抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的步骤以外，可以还包括从该进行了转化的宿主细胞回收、分离或纯化抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的步骤。作为分离或纯化方法，可列举例如盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法、透析、超滤、凝胶过滤等利用分子量差异的方法、离子交换层析、羟基磷灰石层析等利用带电的方法、亲和层析等利用特异性亲和性的方法、反相高效液相层析等利用疏水性差异的方法、等电点电泳等利用等电点差异的方法等。一个实施方式中，分泌到培养上清液中的抗体可以通过各种层析、例如使用蛋白A柱或蛋白G柱的柱层析来进行纯化。

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体也包括通过本发明的生产方法生产的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体。

＜本发明的双特异性抗体的药物组合物等＞

本发明的药物组合物包括：包含本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明的药物组合物可以使用该领域中通常所使用的赋形剂、即药剂用赋形剂、药剂用载体等通过通常所使用的方法来制备。作为这些药物组合物的剂型的例子，可列举例如注射剂、点滴用剂等非经口剂，可以通过静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药等来给药。在制剂化时，可以在药学上可接受的范围内使用与这些剂型相应的赋形剂、载体、添加剂等。

本发明的药物组合物可包含本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的翻译后修饰体。例如，含有接受了C末端赖氨酸缺失、N末端焦谷氨酰化中的两者或一者而成的抗体等的药物组合物也包括在本发明中。

一个实施方式中，本发明的药物组合物为含有选自以下(a)和(b)中的本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体和/或该抗体的翻译后修饰体的药物组合物：

(a)双特异性抗体，其包含：含有包含由序列号6的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号6的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号6的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；含有包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，含有包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的重链可变区和包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽；

(b)双特异性抗体，其包含：含有包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；含有包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，含有包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的重链可变区和包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3的抗CD3抗体的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽。

(a)双特异性抗体，其含有：包含由序列号6的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；包含由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽；

(b)双特异性抗体，其含有：包含由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；包含由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽。

一个实施方式中，本发明的药物组合物为含有抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体和/或该抗体的翻译后修饰体的药物组合物，所述抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体包含：由序列号6的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链；由序列号8的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链；以及，由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽。

制剂化中的本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体、抗TSPAN8抗体的添加量根据患者的症状程度、年龄、使用的制剂的剂型、或抗体的结合效价等而不同，例如可以使用0.001mg/kg～100mg/kg左右。

＜本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的药物用途＞

本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体和含有它们的药物组合物可以用于治疗癌症。另外，本发明包括治疗癌症的方法，其包括向对象给予治疗有效量的本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的步骤。另外，本发明包括用于治疗癌症的本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体。另外，本发明包括本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体在制造癌症治疗用药物组合物中的应用。成为本发明的治疗对象的癌症没有特别限定，可列举例如各种腹膜播散癌、胃癌、肺癌、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤等血液癌、骨髓异常增生综合征、腺癌、鳞状上皮癌、腺鳞癌、未分化癌、大细胞癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、皮肤癌、皮肤T细胞淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、颈癌、头颈癌、子宫癌、宫颈癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、肾癌、胰腺癌、结肠癌、大肠癌、直肠癌、小肠癌、胃癌、食道癌、睾丸癌、卵巢癌、脑瘤等实体癌；以及骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织和造血组织的癌症；以及软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性施万瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤等肉瘤；胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等母细胞瘤等。

＜本发明的抗TSPAN8抗体＞

本发明另外提供以下说明的针对人TSPAN8的新颖的抗TSPAN8抗体或其结合片段。也将本发明所提供的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段统称为“本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段”。

本发明提供与表达人TSPAN8的癌细胞选择性结合的抗TSPAN8抗体或其结合片段。

本说明书中，“与表达人TSPAN8的癌细胞选择性结合”是指：将某一抗TSPAN8抗体与市售抗TSPAN8抗体(TAL69、REA443等)或显示与市售抗TSPAN8抗体同样的结合谱的抗TSPAN8抗体(例如9F6、18C10等)比较结合活性时，与市售抗体等相比，与表达人TSPAN8的癌细胞所表达的TSPAN8的结合强度为3倍以上、优选5倍以上、进一步优选10倍以上，并且与正常细胞所表达的TSPAN8的结合强度为1/3以下、优选1/5以下、进一步优选1/10以下。抗体与细胞的结合强度例如可以使用通过实施例1所示的流式细胞术法得到的MFI(MeanFluorescence Intensity，平均荧光强度)值或从各抗体的MFI减去各同种型MFI而算出的ΔMFI值来算出。另外，抗体与细胞的结合强度也可以通过使用癌细胞和正常细胞的ELISA法等本领域技术人员通常可使用的方法来测定和算出。

在此，表达人TSPAN8的癌细胞是指从癌患者分离出的表达人TSPAN8的癌细胞，除了可以使用实施例1-1中记载的患者来源的癌腹膜播散细胞以外，还可以使用可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)等细胞库等获得的癌细胞株。作为癌细胞株，除了可以使用例如按照实施例1-1中记载的方法由患者腹水建立的细胞株以外，还可以使用AGS、KATOIII、SNU5、SNU16、SNU520、ANU719、NCI-N87、HT-29、LoVo、GP2d、AsPC-1、OE19、Li-7Hs746、NUGC-4、OCUM1、MNK45等表达TSPAN8的细胞株。另外，正常细胞是指来自正常组织的细胞，除了可以使用实施例1-5中使用的患者来源腹膜间皮细胞以外，还可以使用实施例1-3中使用的人外周血单核细胞、实施例1-3中使用的培养腹膜间皮细胞等市售原代培养细胞或细胞株。一个实施方式中，正常细胞表达TSPAN8。一个实施方式中，表达TSPAN8的正常细胞为患者来源腹膜间皮细胞和实施例1-3中使用的培养腹膜间皮细胞。一个实施方式中，正常细胞为不表达TSPAN8的细胞。一个实施方式中，不表达TSPAN8的正常细胞为实施例1-3中使用的人外周血单核细胞。

本发明另外提供识别TSPAN8蛋白的一部分作为表位的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段。一个实施方式中，该表位为由TSPAN8的LEL区中包含的氨基酸序列构成的结构单元。一个实施方式中，该表位为由序列号2的126至155的氨基酸序列所示的TSPAN8蛋白的一部分区域构成的结构单元。一个实施方式中，该表位为由序列号2的126至155的氨基酸序列所示的TSPAN8蛋白的一部分区域所包含的1或2个以上氨基酸序列构成的结构单元。一个实施方式中，该表位为至少包含序列号2的氨基酸编号131的结构单元。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段与序列号2的氨基酸编号126至155的人TSPAN8的区域中存在的至少1个氨基酸结合。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段与序列号2的氨基酸编号126至155的人TSPAN8的区域中存在的至少1个氨基酸结合、并且与表达人TSPAN8的癌细胞选择性地结合。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段与序列号2的氨基酸编号126至155的人TSPAN8的区域中存在的至少序列号2的氨基酸编号131的氨基酸结合。一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段与序列号2的氨基酸编号126至155的人TSPAN8的区域中存在的至少序列号2的氨基酸编号131的氨基酸结合、并且与表达人TSPAN8的癌细胞选择性地结合。

抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段是否与序列号2的氨基酸编号126至155的人TSPAN8的区域中存在的氨基酸(例如序列号2的氨基酸编号131的氨基酸)结合可以使用本申请实施例4-1和4-2中记载的表位鉴定方法来确认。

本发明另外提供以下的(a)和(b)所示的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段：

(a)抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其含有：包含由序列号4的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号4的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区；以及，包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区；

(b)抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其含有：包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区；以及，包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段为选自以下的(a)和(b)中的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段：

(a)抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其包含：由序列号4的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区；以及，由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区；

(b)抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段或其抗原结合片段，其包含：由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区；以及，由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区。

作为本发明的抗TSPAN8抗体的重链恒定区，Igγ、Igμ、Igα、Igδ或Igε中的任一恒定区均可以选择。作为Igγ，例如可以从Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4中选择。一个实施方式中，重链恒定区为Igγ1恒定区，例如为人Igγ1恒定区。另外，本发明的抗TSPAN8抗体的重链恒定区可以包含LALA突变等氨基酸突变，以降低ADCC、CDC。作为本发明的抗TSPAN8抗体的轻链恒定区，Igλ或Igκ中的任一恒定区均可以选择。一个实施方式中，轻链恒定区为Igκ恒定区，例如为人Igκ恒定区。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体的抗原结合片段为scFv、Fab、Fab’、F(ab’)₂、或单臂抗体。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体为选自以下的(a)和(b)中的抗TSPAN8抗体：

本发明另外提供以下的(a)～(d)所示的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段(也将这些特别地统称为“本发明的竞争抗TSPAN8抗体”)：

(a)抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与包含由序列号4的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体竞争对表达人TSPAN8的癌细胞的结合；

(b)抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与包含由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体竞争对表达人TSPAN8的癌细胞的结合；

(c)抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与包含由序列号34的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号36的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体竞争对表达人TSPAN8的癌细胞的结合；

(d)抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与包含由序列号35的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号37的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体竞争对表达人TSPAN8的癌细胞的结合。

本发明的竞争抗TSPAN8抗体例如可以由本领域技术人员如下获得：以表达人TSPAN8的细胞为抗原使用公知的抗体制作技术获得针对人TSPAN8的抗体，对于得到的抗体，与竞争对象的抗TSPAN8抗体进行关于对表达人TSPAN8的细胞的结合的竞争试验，由此获得。作为竞争试验，可以使用流式细胞术法等本领域技术人员公知的方法，例如，可以使用实施例4-3中记载的利用表达人TSPAN8的癌细胞进行的竞争试验。作为竞争试验中使用的表达人TSPAN8的癌细胞，可使用上述的各种细胞。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段为选自下述(a)和(b)中任一者的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段：

(a)抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与包含由序列号4的氨基酸序列构成的重链和由序列号8的氨基酸序列构成的轻链的抗TSPAN8抗体竞争对表达人TSPAN8的癌细胞的结合；

(b)抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与包含由序列号10的氨基酸序列构成的重链和由序列号12的氨基酸序列构成的轻链的抗TSPAN8抗体竞争对表达人TSPAN8的癌细胞的结合。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段为选自下述(c)和(d)中任一者的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段：

＜本发明的其它双特异性抗体＞

本发明提供双特异性抗体，其包含：与针对T细胞或自然杀伤(Natural Killer；NK)细胞的表面抗原的抗体或其抗原结合片段连接的本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段。该双特异性抗体的形状没有特别限定，例如，可以采取非专利文献3或4记载的各种形状的抗体等本领域技术人员通常可使用的形状。

本发明另外提供以下的双特异性抗体：

与TSPAN8和T细胞或NK细胞的表面抗原结合的双特异性抗体，其由下述构成：

(a)抗TSPAN8抗体的Fab区，其由包含本发明的抗TSPAN8抗体的重链可变区的重链片段和包含本发明的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的轻链构成；

(b)针对T细胞或NK细胞的表面抗原的抗体的scFv区，其包含针对T细胞或NK细胞的表面抗原的抗体的重链可变区和轻链可变区；以及，

(c)由与(a)的Fab区的重链片段连接的第一Fc多肽和与(b)的scFv区连接的第二Fc多肽构成的Fc区。

本发明的其它双特异性抗体可以由本领域技术人员参考非专利文献4记载的方法或＜本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体＞的记载使用常规方法来制作。作为针对T细胞或NK细胞的表面抗原的抗体，目前已知有多种抗体(Current Opinion inBiotechnology、2020、Vol.65、p.9-16)，可以使用这些抗体的序列信息。关于本发明的其它双特异性抗体的实施方式，除了使用抗CD3抗体的scFv区以外，均如＜本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体＞中所记载的那样。另外，本发明的其它双特异性抗体也可以用于治疗癌症。

一个实施方式中，作为本发明的其它双特异性抗体的针对T细胞或NK细胞的表面抗原的抗体或其抗原结合片段，为针对T细胞或NK细胞的表面抗原的抗体或其抗原结合片段。一个实施方式中，该针对T细胞或NK细胞的表面抗原的抗体或其抗原结合片段为抗CD3抗体、抗CD137抗体、抗PD-1(Programmed cell Death-1，程序性细胞死亡-1)抗体、抗PD-L1(Programmed cell Death 1-Ligand 1，程序性细胞死亡1-配体)抗体、抗TIGIT(T cellimmunoreceptor with Ig and ITIM domains，T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白)抗体、抗CD16抗体、抗NKG2D(Natural Killer Group 2,member D，自然杀伤细胞家族2成员D)抗体、或它们抗原结合片段。一个实施方式中，该针对T细胞的抗体或其抗原结合片段为抗CD3抗体或其抗原结合片段。一个实施方式中，该抗CD3抗体的抗原结合片段为抗CD3抗体的scFv。

＜本发明的融合体、复合体和在细胞表面表达本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的细胞＞

本发明另外提供连接有TSPAN8以外的其它蛋白质(包括抗体)、多肽的本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段(也称为“本发明的融合体”)。本发明的融合体中使用的蛋白质、多肽没有特别限定，可以使用例如各种抗体、细胞因子、趋化因子、人血清白蛋白、各种标签肽、人工螺旋基序肽、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶、其它可促进多聚体化的肽或蛋白质等。本发明的融合体的一个实施方式中，蛋白质、多肽连接在本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段上。一个实施方式中，本发明的融合体中使用的蛋白质、多肽可以为例如针对粒细胞、自然杀伤T(Natural Killer T；NKT)细胞等免疫细胞、树突细胞、巨噬细胞等血细胞的表面抗原的抗体或其抗原结合片段；或各种白介素(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15)等活化免疫细胞的多肽。这种情况下，本发明的融合体中使用的蛋白质、多肽可以与本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段直接连接，另外也可以借助任意的接头(例如肽接头)连接。

本发明另外提供结合有糖质、脂质、金属(包括放射性同位素)、有机化合物(包括毒素、近红外荧光色素、螯合剂)等(也称为“修饰剂”)的本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段(也称为“本发明的复合体”)。本说明书中，“修饰剂”是指与抗体或其抗原结合片段直接结合或借助接头等结合的非肽性物质。本发明的复合体中使用的修饰剂没有特别限定，可列举例如聚乙二醇、糖链、磷脂质、放射线同位素(例如锆-89(⁸⁹Zr)、钇-90(⁹⁰Y)、铟-111(¹¹¹In)、砹-211(²¹¹At)、锕-225(²²⁵Ac))、有机化合物、毒素、近红外荧光色素(例如IRDye(注册商标))、螯合剂等。该复合体中使用的修饰剂可以与本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段直接结合，另外也可以借助任意的接头结合。一个实施方式中，本发明的复合体为抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的药物复合体(Antibody Drug Conjugate；ADC)。ADC中使用的药物和接头可以从本领域技术人员通常使用的药剂和接头中选择。一个实施方式中，本发明的复合体为在抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段上结合有放射线同位素的放射性同位素标记抗体。

本发明另外提供在细胞表面表达本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的细胞(例如嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor-T cell)；CAR-T细胞)。这样的细胞可以由本领域技术人员使用编码本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的多核苷酸来制作。作为表达本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的细胞，可以使用各种免疫细胞(T细胞、NK细胞、NKT细胞等)。

本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段、本发明的融合体、本发明的复合体和在细胞表面表达本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的细胞与人TSPAN8(基因编号：NM_004616.2)结合。与人TSPAN8的结合可以使用公知的结合活性测定方法来确认。作为测定结合活性的方法，可列举例如ELISA法、流式细胞术法等方法。使用ELISA法时，例如可以使用实施例8中记载的方法，使用流式细胞术法时，例如可以使用实施例1中记载的方法。

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段、本发明的融合体和复合体以及在细胞表面表达本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的细胞中的抗体或抗原结合片段部分可以经过了翻译后修饰。一个实施方式中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷氨酰化和/或重链C末端赖氨酸缺失。

本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段、本发明的融合体和本发明的复合体以及在细胞表面表达本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的细胞可以由本领域技术人员基于本说明书中公开的本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的VH和VL的序列信息、本发明的融合体中使用的其它肽或蛋白质(例如抗体)、本发明的复合体中使用的修饰剂的信息使用本领域公知的方法而制作。本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段没有特别限定，例如可以按照＜生产本发明的双特异性抗体的方法＞项中记载的方法来生产。

＜本发明的抗TSPAN8抗体的多核苷酸、表达载体、宿主细胞和生产方法＞

本发明另外提供以下的(1)～(4)记载的多核苷酸：

(1)包含编码本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸；

(2)包含编码本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

(3)包含编码本发明的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

(4)包含编码本发明的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

上述(1)的多核苷酸的一个实施方式中，包含编码本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸为选自以下的(a)和(b)的多核苷酸：

(a)包含编码包含由序列号4的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号4的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的抗TSPAN8抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的抗TSPAN8抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸。

上述(1)的多核苷酸的一个实施方式中，包含编码本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸为选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

(b)包含编码由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸。

上述(2)的多核苷酸的一个实施方式中，包含编码本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸为选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

(a)包含编码包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。

上述(2)的多核苷酸的一个实施方式中，包含编码本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸为选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸：

(a)包含编码由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。

上述(3)的多核苷酸的一个实施方式中，包含编码本发明的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸为选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸：

(a)包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸。

上述(4)的多核苷酸的一个实施方式中，包含编码本发明的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸为选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸：

(a)包含编码由序列号8所示的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码由序列号12所示的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

本项中记载的多核苷酸可以由本领域技术人员基于其碱基序列使用本领域公知的方法而制作。

本发明另外提供包含以下的(1)～(4)记载的多核苷酸中的1个或2个以上多核苷酸的表达载体(也称为“本发明的抗TSPAN8抗体的表达载体”)。1个表达载体中，各个多核苷酸可以各包含一个，也可以包含两个以上。

包含上述(1)的多核苷酸的本发明的抗TSPAN8抗体的表达载体的一个实施方式中，该表达载体包含选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

(b)包含含有由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的抗TSPAN8抗体的重链可变区的多核苷酸。

包含上述(2)的多核苷酸的本发明的抗TSPAN8抗体的表达载体的一个实施方式中，该表达载体包含选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

包含上述(2)的多核苷酸的本发明的抗TSPAN8抗体的表达载体的一个实施方式中，该表达载体包含选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸：

包含上述(3)的多核苷酸的本发明的抗TSPAN8抗体的表达载体的一个实施方式中，该表达载体包含选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸：

包含上述(4)的多核苷酸的本发明的抗TSPAN8抗体的表达载体的一个实施方式中，该表达载体包含选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸：

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体的表达载体为包含选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸的表达载体：

(a)包含编码包含由序列号4的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号4的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的抗TSPAN8抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸；以及，包含编码包含由序列号8的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号8的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码包含由序列号10的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号10的氨基酸编号50至66的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10的氨基酸编号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的抗TSPAN8抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸；以及，包含编码包含由序列号12的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号12的氨基酸编号89至96的氨基酸序列构成的CDR3的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。

(a)包含编码由序列号4的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码由序列号10的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号12的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。

(a)包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号8所示的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(b)包含编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号12所示的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

本项中记载的表达载体可以由本领域技术人员基于上述的＜本发明的双特异性抗体的表达载体＞中记载的方法来制作。

本发明另外提供用包含以下的(1)～(4)的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞(也称为“本发明的抗TSPAN8抗体用的宿主细胞”)。本发明的抗TSPAN8抗体用的宿主细胞可以通过利用本发明的抗TSPAN8抗体的表达载体的转化而包含以下的(1)～(4)的各多核苷酸各1个，也可以包含2个以上。

包含上述(1)的多核苷酸的本发明的抗TSPAN8抗体用的宿主细胞的一个实施方式中，该宿主细胞包含选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

包含上述(2)的多核苷酸的本发明的抗TSPAN8抗体用的宿主细胞的一个实施方式中，该宿主细胞包含选自以下的(a)和(b)中的多核苷酸：

包含上述(2)的多核苷酸的本发明的抗TSPAN8抗体用的宿主细胞的一个实施方式中，该宿主细胞包含选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸：

包含上述(3)的多核苷酸的本发明的抗TSPAN8抗体用的宿主细胞的一个实施方式中，该宿主细胞包含选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸：

包含上述(4)的多核苷酸的本发明的抗TSPAN8抗体用的宿主细胞的一个实施方式中，该宿主细胞包含选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸：

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体用的宿主细胞包含选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸：

一个实施方式中，本发明的抗TSPAN8抗体用的宿主细胞为包含选自以下的(a)或(b)中的多核苷酸的宿主细胞：

本项中记载的宿主细胞可以由本领域技术人员基于上述的＜本发明的进行了转化的宿主细胞＞中记载的方法而制作。

本发明进而提供抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的生产方法，其包括培养本发明的抗TSPAN8抗体用的宿主细胞的步骤。本方法可以由本领域技术人员基于上述的＜生产本发明的双特异性抗体的方法＞来实施。

＜本发明的抗TSPAN8抗体等的药物用途＞

本发明另外提供药物组合物，其包含本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段、本发明的融合体、本发明的复合体和在细胞表面表达本发明的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的细胞(以下在本项中统称为“本发明的抗TSPAN8抗体等”)以及药学上可接受的赋形剂。该药物组合物可以用于治疗癌症。本发明另外提供：包括向对象给予治疗有效量的本发明的抗TSPAN8抗体等的步骤的治疗癌症的方法；用于治疗癌症的本发明的抗TSPAN8抗体等；本发明的抗TSPAN8抗体等在制造癌症治疗用药物组合物中的应用。本发明的抗TSPAN8抗体等的药物用途可以由本领域技术人员基于上述的＜本发明的双特异性抗体的药物组合物等＞的记载实施。成为本发明的抗TSPAN8抗体等的药物用途的治疗对象的癌症可列举上述的＜本发明的双特异性抗体的药物组合物等＞中记载的癌症。

＜本发明的抗CD3抗体＞

本发明另外提供以下所示的抗CD3抗体或其抗原结合片段：

抗CD3抗体或其抗原结合片段，其含有：包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区；以及，包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区。

一个实施方式中，本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段为包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗CD3抗体或其抗原结合片段。

一个实施方式中，本发明的抗CD3抗体的抗原结合片段为scFv。一个实施方式中，本发明的抗CD3抗体的抗原结合片段为包含由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗CD3抗体scFv。一个实施方式中，本发明的抗CD3抗体的抗原结合片段为由序列号14的氨基酸编号1至254的氨基酸序列构成的抗CD3抗体scFv。

本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段可以由本领域技术人员参照＜本发明的抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体＞等本说明书中的记载而制作。本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段可以使用公知的结合活性测定方法来确认。本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段例如可用于癌症治疗中使用的、与针对肿瘤抗原的抗体的双特异性抗体。

在此提供为了进一步理解本发明而参照的特定实施例，但这些是以例示为目的，并非对本发明进行限定。

实施例

[实施例1：与癌腹膜播散细胞所表达的抗原选择性地结合的抗体的获得]

[实施例1-1：患者来源的癌腹膜播散细胞的获得]

通过以下方法从患者获得癌腹膜播散细胞。来自患者的癌腹膜播散细胞的获得按照千胁史子、佐佐木博己的文献“腹膜转移癌(胃、胰、卵巢癌等)细胞株的建立”(佐佐木博己编《使用患者来源的癌模型的癌研究实践指南》羊土社、2019年、p.28-37)中记载的方法来进行。将从患者采集的腹水分注到PROTEOSAVE(注册商标)SS 50mL离心管(住友电木公司、MS-52550、以下记作“50mL离心管”)，在室温下以430×g离心3分钟。除去上清液后，向沉淀中添加溶血缓冲液，在室温下溶血10～20分钟。溶血缓冲液是将包含0.75％氯化铵的17mM Tris-HCL(pH7.65)用孔径0.22μm的过滤器过滤而制备的。离心后，除去上清液，加入杜尔贝科PBS(-)(日水制药公司、05913、以下记作“PBS(-)”)50mL，洗涤细胞。之后，在室温下以430×g离心3分钟，回收细胞。将回收的腹水中的全部细胞重新悬浮于包含10％ FBS(Thermo Fisher Scientific公司、10270-106)、×1抗生素-抗真菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Thermo Fisher Scientific公司、15240062)的RPMI-1640(含有L-谷氨酰胺的)培养基(富士胶片和光纯药公司、189-02025)、(以下将添加FBS等之后的培养基称为“RPMI-1640培养基”)。向100mm胶原蛋白包被培养皿(以下称为“培养皿”)(IWAKI公司、4020-010)中以5×10⁶～1×10⁷个/10mL播种细胞，在37℃、5％ CO₂培养箱中培养。

腹水中的细胞中，存在粘附型细胞和漂浮型细胞。粘附型细胞不仅包括癌细胞，还包括癌细胞以外的细胞(成纤维细胞、腹膜间皮细胞等)。利用癌细胞以外的细胞与癌细胞相比会在短时间内剥离的性质，从腹水中的全部细胞中分离这些细胞。具体而言，将培养上述腹水中的全部细胞后的培养皿用PBS(-)洗涤后，用0.05％胰蛋白酶-EDTA(ThermoFisher Scientific公司、15400054)2mL处理数分钟，从而剥离癌细胞以外的细胞。将剥离下来的细胞中包含的癌细胞以外的细胞在新的培养皿中继续培养，用于实施例1-5。

除去癌细胞以外的细胞后，重复进行在使癌细胞增殖到培养皿面积的80％汇合程度后将全部细胞的1/2传代到新培养皿中的操作，将传代5次以上而得者作为粘附型癌细胞。对于漂浮型细胞，将培养上清液5mL和RPMI-1640培养基5mL从培养用培养皿播种到新的100mm培养皿中进行传代，将传代5次以上者作为漂浮型癌细胞。来自一名患者的癌腹膜播散细胞以包含粘附型癌细胞和漂浮型癌细胞这两者的状态增殖时，将它们作为混合型癌细胞。

本说明书中，将利用上述方法从采自患者的腹水分离出的粘附型癌细胞、漂浮型癌细胞或混合型癌细胞统称为“癌腹膜播散细胞”。将获得的12种细胞(NSC-7C、NSC-9C、NSC-10C、NSC-14C、NSC-15CF、NSC-16C、NSC-20C、NSC-22C、NSC-24C、NSC-32C、NSC-34C和NSC-35C-1(以下也称为“12种癌腹膜播散细胞”))用于以后的研究中。

[实施例1-2：产生抗胃癌抗原抗体的杂交瘤的制作]

使用人单克隆抗体开发技术(“VelocImmune”(注册商标)antibody technology；Regeneron(美国专利6596541号))小鼠，获得与癌腹膜播散细胞结合的抗胃癌抗原抗体。

将实施例1-1中获得的癌腹膜播散细胞中的NSC-10C、NSC-35C-1、NSC-24C、NSC-7C、NSC-14C、NSC-34C各分出3个细胞并混合，悬浮于TiterMax(注册商标)Gold ADJUVANT(MERCK公司、T2684)或PBS(-)，由此制备癌腹膜播散细胞悬浮液。将该悬浮液免疫于VelocImmune小鼠，按照常规方法制作杂交瘤。利用自动挑取装置分离杂交瘤的单个菌落，获得单克隆化杂交瘤细胞(以下称为“克隆”)。将分离出的克隆在37℃、8％ CO₂培养箱中培养，将培养4天后的上清液回收到96孔板，用于以下的实验。

[实施例1-3：与癌腹膜播散细胞选择性地结合的抗胃癌抗原抗体的筛选]

1.抗胃癌抗原抗体与癌腹膜播散细胞和EpCAM表达细胞的结合确认

实施例1-2中得到的克隆的细胞上清液中包含抗体(以下称为“克隆上清液所包含的抗体”)。

首先，通过流式细胞术法测定克隆上清液所包含的抗体与实施例1-1获得的12种癌腹膜播散细胞的结合，选拔产生与癌腹膜播散细胞强烈结合的抗体的克隆。流式细胞术中使用BV421山羊抗小鼠Ig(Becton，Dickinson and Company公司、563846)。之后，为了排除提供与作为癌抗原的EpCAM结合的抗体的克隆，测定克隆上清液所包含的抗体与表达人EpCAM-Myc-DDK的CHO-K1细胞的结合。表达人EpCAM-Myc-DDK的CHO-K1细胞通过将EPCAM(Myc-DDK-tagged)-人上皮细胞粘附分子(EPCAM)(ORIGENE公司、RC201989)转染于CHO-K1细胞(ATCC、CCL-61)而制作。利用流式细胞术法测定该细胞与克隆上清液所包含的抗体的结合。流式细胞术法中使用BV421山羊抗小鼠Ig。为了选择提供对EpCAM表达细胞不显示结合活性的上清液的克隆，排除与该细胞结合的克隆。作为阳性对照，使用CD326(EpCAM)单克隆抗体(1B7)(eBioscience公司、14-9326)。

通过上述实验，选择出提供与12种癌腹膜播散细胞中的10种以上结合且不与人EpCAM结合的抗体的克隆。

2.抗体对人外周血单核细胞的结合的确认

进而，为了选拔提供与癌腹膜播散细胞选择性地结合的抗体的克隆，将提供与人外周血单核细胞结合的抗体的克隆排除。

在人外周血单核细胞与各克隆所提供的抗体的结合的测定中，使用流式细胞术法。作为人外周血来源单核细胞，使用人外周血来源单核细胞(hMNC-PB),混合来源,超纯(PromoCell公司、C-12908)。流式细胞术法中使用PE山羊抗小鼠Ig(Multiple Adsorption)(Becton，Dickinson and Company公司、550589、以下记作“PE山羊抗小鼠Ig”)、BV421小鼠抗人CD3(Becton，Dickinson and Company公司、562426)、APC小鼠抗人CD14(Becton，Dickinson and Company公司、555399)、BB515小鼠抗人CD19(Becton，Dickinson andCompany公司、564456)。

3.从杂交瘤上清液中纯化抗体

在CD杂交瘤培养基(Thermo Fisher Scientific公司、11279023)中培养实施例1-3的1.和2.的步骤中筛选出的克隆。使用MabSelectSuRe(GE医疗公司、17-5438-02)从培养上清液中纯化抗体(以下称为“纯化抗体”)。抗体的纯化按照常规方法进行。

4.纯化抗体对培养人腹膜间皮细胞的结合

为了选拔与癌腹膜播散细胞选择性地结合的抗体，从实施例1-3的3.中得到的纯化抗体中排除与培养人腹膜间皮细胞结合的抗体。作为培养人腹膜间皮细胞，使用人间皮细胞(Zenbio公司、MES-F、Lot.MESM012916B)(本说明书中称为“培养人腹膜间皮细胞”)，利用间皮细胞生长培养基(Zenbio公司、MSO-1)进行培养。纯化抗体与培养人腹膜间皮细胞的结合的测定中使用流式细胞术法。流式细胞术法中使用PE山羊抗小鼠Ig。筛选与培养人腹膜间皮细胞不显示结合或显示弱结合的抗体，获得14种纯化抗体(以下称为“14种纯化抗体”)。

[实施例1-4：获得的抗体所识别的抗原分子候补的鉴定]

对于14种纯化抗体，进行抗原候补分子的鉴定。作为鉴定方法的例子，对16B11、16B12和21F7的抗原候补分子的鉴定方法进行详述。

作为本实验中的对照抗体，使用对癌腹膜播散细胞的结合模式与16B11不同的5D3、9A1、21A3。

制作NSC-15CF细胞的细胞破碎液。向细胞破碎液中添加16B11、16B12、21F7和3种对照抗体(5D3、9A1、21A3)中的任一种抗体。进而加入Dynabeads蛋白G(Life Technologies公司、10003D)，进行搅拌和洗涤。将结合于Dynabeads蛋白G的蛋白质用胰蛋白酶/LysC(Promega公司、V5072)消化，得到肽混合物。将包含肽混合物的溶液供于使用UltiMate3000RSnano(Thermo Fisher Scientific公司)和Orbitrap Fusion(Thermo FisherScientific公司)的LC-MS/MS测定。将得到的LC-MS/MS数据用Progenesis QI forProteomics(Waters公司)和Mascot(Matrix Science公司)的软件进行比较定量分析和肽/蛋白质鉴定，从而鉴定结合蛋白。将16B11、16B12或21F7的数据分别与对照抗体的数据进行比较，鉴定出TSPAN8作为16B11和21F7的抗原候补分子。本实验中未能鉴定出16B12的抗原候补分子。

对于5B7、9F6、12C12、13A9、15D1、18C10和19E4，也使用与上述同样的方法进行实验，鉴定出TSPAN8作为抗原候补分子。作为对照抗体，除了使用5D3、9A1、21A3以外还使用24C7。16B12未实现抗原候补分子的鉴定，但是在实施例1-3中显示出与16B11同样的结合谱，因此推定TSPAN8为抗原候补并进行之后的研究。

进而，为了确定抗原，进行了对表达人TSPAN8-Myc-DDK的CHO-K1细胞的结合实验。表达人TSPAN8-Myc-DDK的CHO-K1细胞是通过向CHO-K1细胞中转染TSPAN8(Myc-DDK-tagged)-人四次穿膜蛋白8(TSPAN8)(ORIGENE公司、RC202694)(序列号2)而制作的。结果确认，16B11、16B12、5B7、9F6、12C12、13A9、15D1、18C10、19E4、21F7这10种抗体(也称为“10种抗TSPAN8抗体”)与表达人TSPAN8-Myc-DDK的CHO-K1细胞结合，识别TSPAN8作为抗原。

[实施例1-5：抗TSPAN8抗体对各种细胞的结合活性的确认]

1.对癌腹膜播散细胞的结合活性的确认和数值化

通过流式细胞术法测定从胃癌患者腹水分离出的7种癌腹膜播散细胞(KM-291-As、KM-555-As、KM-556-As、P-249-As、KM-568-As、KM-570-As和KM-577-As)与4种抗TSPAN8抗体的结合。

从患者的腹水中，使用与实施例1-1同样的方法制备KM-291-As。所制备的KM-291-As中含有很多表达CD45的血细胞系细胞，因此，为了浓缩癌细胞而用柱除去CD45表达细胞。详细而言，将包含5×10⁷个细胞的细胞悬浮液用人CD45微珠(Miltenyi Biotec公司、130-045-801)按照常规方法从预分离柱(30μm)(Miltenyi Biotec公司、130-041-407)和分离柱(Miltenyi Biotec公司、130-042-401)(以下称为“柱”)通过。将柱通过液回收到50mL离心管中，离心分离。向沉淀中加入10mL缓冲液将细胞重新悬浮。从该细胞悬浮液中分取5×10⁶个细胞至1.5mL微型管(WATSON公司、131-7155C)中，通过离心分离得到沉淀。向沉淀中加入包含2％ FBS、100μg/mL青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific公司、15140-122)的PBS(FCM缓冲液)950μL，由此制备细胞悬浮液。加入FcR封闭剂50μL，在冰中反应10分钟。向7个1.5mL微型管中各分注100μL该反应液，通过以下方法进行细胞的染色。向7个微型管中的3个中各加入5μL小鼠IgG1-PE抗体(Miltenyi Biotec公司、130-092-212)，接着向各微型管中各添加2.5μL的Alexa Fluor647标记对照抗体，作为同种型对照。作为对照抗体，使用小鼠IgG2a同种型对照(Becton，Dickinson and Company公司、558053)、小鼠IgG2b同种型对照(Becton，Dickinson and Company公司、558713)、小鼠IgG3同种型对照(Becton，Dickinson and Company公司、560803)中的任一者。向剩余的4个微型管中各加入5μL的CD326(EpCAM)-PE(Miltenyi Biotec公司、130-091-253)，进而向微型管中分别加入2.5μL(0.25μg/管)的16B11、16B12、9F6、18C10，对细胞进行染色，作为4种评价抗体样品。各微型管在添加抗体后在冰中反应30分钟。加入FCM缓冲液1mL进行离心分离，向得到的沉淀中加入FCM缓冲液500μL而将细胞重新悬浮。添加7-AAD(Becton，Dickinson and Company公司、559925)5μL，全部转移到5mL带细胞滤网帽的圆底聚苯乙烯管(CORNING公司、352235)中，使用FACSVerse流式细胞仪(Becton，Dickinson and Company公司)进行测定。数据获取时，使用BD FACSuite软件(Becton，Dickinson and Company公司)。

KM-555-As、KM-556-As、P-249-As、KM-568-As、KM-570-As、KM-577-As的制备也通过与KM-291-As的制备同样的方法进行。在与KM-555-As、KM-556-As的结合测定中，作为评价抗体样品，使用16B11、9F6和18C10。在与P-249-As的结合测定中，作为评价抗体样品，使用16B11和作为市售抗TSPAN8抗体的抗人TSPAN8抗体,REAfinity(130-106-855、Miltenyi公司、本说明书中称为“REA443”)。在与KM-568-As、KM-570-As、KM-577-As的结合测定中，作为评价抗体样品，使用16B11、9F6、18C10和REA443。全部实验中，将同种型对照抗体小鼠IgG1(130-113-196，Miltenyi公司)用作同种型对照。另外，在细胞的染色中，使用IgG2a-VioBlue抗体(Miltenyi Biotec公司、130-113-277)和CD326(EpCAM)-VioBlue抗体(Miltenyi Biotec公司、131-113-266)。

各癌腹膜播散细胞的基于流式细胞术的测定结果的分析使用BD FACSuite软件来进行。详细而言，通过FSC-A(lin)/SSC-A(log)作图，对得到的细胞群设门，再次用FSC-W(lin)/FSC-A(lin)展开，仅对Singlet群设门而制作子集并进行分析。在KM-291-As细胞的测定结果的分析中，将子集用PE(log)/Alexa Fluor647(log)展开。在KM-555-As、KM-556-As、P-249-As、KM-568-As、KM-570-As、KM-577-As的测定结果的分析中，使用利用VioBlue(log)/Alexa Fluor647(log)展开而得的数据。对于各样品，对1×10⁴个细胞子集获得数据。用FlowJo(Becton，Dickinson and Company公司)对得到的fcs文件进行分析，制作Alexa Fluor647的直方图。对于同种型和各评价抗体，分别算出阳性群的Alexa Fluor647的MFI，从各抗体的MFI减去各同种型MFI而算出ΔMFI(表1)。

作为得到的直方图的例子，将表示与KM-291-As的结合测定中的16B11和16B12、以及与KM-555-As和KM-556-As的结合测定中的16B11、9F6、18C10的结合的直方图分别示于图1-1至图1-3。

2.对培养人腹膜间皮细胞的结合活性的确认和数值化

测定实施例1-4中鉴定出的10种抗TSPAN8抗体与培养人腹膜间皮细胞的结合活性。培养人腹膜间皮细胞为正常细胞。

通过流式细胞术法测定实施例1-3中得到的10种抗TSPAN8抗体和作为市售抗TSPAN8抗体的纯化抗人TSPAN8抗体(BioLegend公司、363702Clone TAL69、本说明书中称为“TAL69”)对培养人腹膜间皮细胞的结合。作为二抗，使用PE山羊抗小鼠Ig。将得到的直方图示于图2-1和图2-2。另外，使用FlowJo分析流式细胞术的结果，由此，分别算出关于各细胞群的PE的MFI。作为阴性对照抗体，分析中使用Ultra-LEAF纯化小鼠IgG1,κ同种型对照抗体(BioLegend公司、401408)、纯化NA/LE小鼠IgG2a,κ同种型对照(Becton，Dickinson andCompany公司、554645)和纯化NA/LE小鼠IgG2b,κ同种型对照(Becton，Dickinson andCompany公司、559530)这3种抗体。将16B11、16B12、9F6、18C10和TAL69的ΔMFI值记载于表1。抗体的ΔMFI值通过从各抗体的MFI值中减去阴性对照抗体的MFI值而算出。

3.对胃癌腹膜播散患者来源腹膜间皮细胞的结合活性的确认和数值化

通过以下方法得到作为从人胃癌腹膜播散患者的腹水中分离出的腹膜间皮细胞(本说明书中称为“患者来源腹膜间皮细胞”)的KM-501-As和KM-503-As。

在实施例1-1的细胞建立的过程中，在培养皿的一面观察到以铺路石状增殖的间皮细胞。使用0.05％胰蛋白酶-EDTA回收该间皮细胞，重新悬浮于包含10％ FBS、×1抗生素-抗真菌素的D-MEM(高葡萄糖)(富士胶片和光纯药公司、044-29765)10mL中。分取4×10⁵个细胞至1.5mL微型管中，离心分离后，除去上清液，加入FCM缓冲液96μL，将细胞悬浮。加入FcR封闭剂4μL，在冰中反应10分钟。将该反应液50μL分注到其它1.5mL微型管中，得到2×10⁵个细胞/50μL的微型管2个。向1个微型管中加入CD45-APC抗体(Miltenyi Biotec公司、130-091-230)2μL、CD326(EpCAM)-PE(Miltenyi Biotec公司、130-113-264)0.5μL。向另一个管中加入小鼠IgG2a-APC抗体(Miltenyi Biotec公司、130-091-836)2μL、小鼠IgG1-PE抗体0.5μL。将各微型管在冰中反应30分钟。向微型管中各加入1mL FCM缓冲液，离心分离，除去上清液。向沉淀中加入FCM缓冲液500μL而重新悬浮细胞，使用FACSVerse进行分析。利用FSC-A(lin)和SSC-A(log)对细胞群设门，将该子集用PE(log)和APC(log)再次展开，获得数据。用FlowJo分析所获得的fcs文件。结果确认，该细胞群为CD45阴性且EpCAM阴性的正常细胞。认为该患者来源腹膜间皮细胞是来自腹膜播散时成为用于使癌细胞定植、增殖的支架的大网膜、肠系膜的正常细胞。将分离出的患者来源腹膜间皮细胞的KM-501-As和KM-503-As用于以下实验。

10种抗TSPAN8抗体和TAL69对KM-501-As和KM-503-As的结合通过与实施例1-5的2.中记载的对培养人腹膜间皮细胞的结合的测定同样的方法来实施。将16B11、16B12、9F6、18C10和TAL69对KM-501-As和KM-503-As的直方图记载于图3-1和图3-2，将ΔMFI值记载于表1。

4.对培养人脐带血管内皮细胞的结合活性的确认和数值化

通过流式细胞术法测定10种抗TSPAN8抗体和TAL69对培养人脐带血管内皮细胞的结合。培养人脐带血管内皮细胞(PromoCell公司、C-12200)使用内皮细胞生长培养基2试剂盒(PromoCell公司、C-22111)进行培养。作为阴性对照抗体，使用Ultra-LEAF纯化小鼠IgG1,κ同种型对照抗体、纯化NA/LE小鼠IgG2a,κ同种型对照、Ultra-LEAF纯化小鼠IgG2b,κ同种型对照抗体(BioLegend公司、400348)、LEAF纯化小鼠IgG3,κ同种型对照抗体(BioLegend公司、401310)。作为二抗，使用PE山羊抗小鼠Ig。

将10种抗TSPAN8抗体和TAL69的结合的直方图示于图4。将关于16B11、16B12、9F6、18C10和TAL69的ΔMFI值记载于表1。ΔMFI值通过从各抗体的MFI减去阴性对照抗体的MFI而算出。

由图1至图4的直方图的结果和表1的结果表明，16B11和16B12对癌腹膜播散细胞显示高的结合，但对正常细胞(培养人腹膜间皮细胞、患者来源腹膜间皮细胞、培养人脐带血管内皮细胞)的结合低。另一方面表明，作为其它抗TSPAN8抗体的9F6、18C10和市售抗TSPAN8抗体(TAL69或REA443)对癌腹膜播散细胞的结合低于16B11和16B12，对正常细胞的结合高于16B11和16B12。由该结果可知，16B11和16B12与其它抗TSPAN8抗体(9F6、18C10、TAL69等)性质明显不同。

[表1]

[实施例2：16B11和16B12的序列确定]

按照常规方法克隆编码16B11和16B12的重链和轻链的基因，进行抗体的序列确定。VelocImmune技术为使用内源性的免疫球蛋白重链和轻链的可变区被对应的人可变区置换的转基因小鼠制作抗体的技术。因此，使用VelocImmune技术得到的抗体为具有人抗体的可变区和小鼠抗体的恒定区的抗体(本说明书中有时也称为“嵌合抗体”)。将得到的16B11的重链可变区的氨基酸序列示于序列号34，将该抗体的轻链可变区的氨基酸序列示于序列号36。将得到的16B12的重链可变区的氨基酸序列示于序列号35，将该抗体的轻链可变区的氨基酸序列示于序列号37。

[实施例3：完全人抗TSPAN8抗体的制作]

[实施例3-1：用于制作完全人抗TSPAN8抗体的表达载体的制作]

将实施例2中鉴定出的人可变区的氨基酸序列与人恒定区的氨基酸序列连接，从而制作16B11和16B12的完全人抗体。

设计在16B11和16B12的重链可变区的N末端连接有编码序列号38记载的信号序列的氨基酸序列、且在C末端连接有人IgG1恒定区的氨基酸序列(序列号4或10的氨基酸编号122至451的序列)的多肽。进而导入如下突变：将该多肽的重链可变区的第16至19位的氨基酸序列所构成的弗林蛋白酶切断序列(J.Biol.Chem.、1992、Vol.267、p.16396-16402)的第16位的精氨酸(R)置换为甘氨酸(G)的突变。将编码所设计的多肽的多核苷酸导入到pcDNA3.4 TOPO(注册商标)载体(Thermo Fisher Scientific公司)中。将制作的重链载体分别称为pcDNA3.4-16B11.1_HC和pcDNA3.4-16B12.1_HC。

另外，设计在16B11的轻链可变区的N末端连接有编码序列号39记载的信号序列的氨基酸序列、在16B12的轻链可变区的N末端连接有编码序列号40记载的信号序列的氨基酸序列且在两抗体的C末端侧分别连接有人κ链的恒定区氨基酸序列(序列号8或12的氨基酸编号108至213的序列)的多肽。将编码所设计的多肽的多核苷酸导入到pcDNA3.4TOPO(注册商标)载体中。将制作的轻链载体分别称为pcDNA3.4-16B11_LC和pcDNA3.4-16B12_LC。

[实施例3-2：完全人抗TSPAN8抗体的制作]

使用pcDNA3.4-16B11.1_HC和pcDNA3.4-16B11_LC制作16B11.1抗体。

详细而言，对于在ExpiCHO表达培养基(Thermo Fisher Scientific公司、A2910001)中培养至大约6.0×10⁶个/mL的浓度的ExpiCHO-S细胞(Thermo FisherScientific公司、A29127)，使用基因导入试剂ExpiFectamineCHO转染试剂盒(ThermoFisher Scientific公司、A29129)转染pcDNA3.4-16B11.1_HC和pcDNA3.4-16B11_LC，培养12天。将培养上清液用MabSelectSuRe进行纯化，得到完全人抗体的纯化抗体。将得到的抗体称为16B11.1。将16B11.1的重链的碱基序列示于序列号3、将由其编码的氨基酸序列示于序列号4，将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号7、将由其编码的氨基酸序列示于序列号8。

16B12.1可以使用pcDNA3.4-16B12.1_HC和pcDNA3.4-16B12_LC通过与上述同样的方法制作。将16B12.1的重链的碱基序列示于序列号9、将由其编码的氨基酸序列示于序列号10，将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号11、将由其编码的氨基酸序列示于序列号12。

[实施例4：抗体所结合的抗原侧的表位部位的鉴定]

[实施例4-1：利用氢-氘交换质谱法的表位作图]

为了鉴定16B11.1的表位而实施氢-氘交换质谱(HDX-MS)。结果检测出与序列号2的氨基酸编号126～155相当的人TSPAN8的区域是在16B11.1存在下氘交换度减少的区域。由该结果推定，与序列号2的氨基酸编号126～155相当的人TSPAN8的区域为16B11.1的表位。

[实施例4-2：通过人TSPAN8突变导入来锁定重要表位]

为了确认实施例4-1中推定的区域是否为16B11.1的表位，制作将该区域替换为小鼠或大鼠的TSPAN8的同源区域的嵌合蛋白并对结合进行评价。与人TSPAN8的氨基酸编号126～155相当的小鼠TSPAN8的氨基酸编号126～155示于序列号41，将大鼠TSPAN8的氨基酸编号126～155示于序列号42。

为了制作表达TSPAN8与GFP的融合蛋白的细胞，使用限制酶从实施例1-4中使用的TSPAN8(Myc-DDK-tagged)-人四次穿膜蛋白8(TSPAN8)(ORIGENE公司、RC202694)切出人TSPAN8序列。将切出的人TSPAN8序列亚克隆到pCMV6-AC-GFP载体(ORIGENE公司、PS100010)中(以下称为“人TSPAN8-GFP表达载体”)。进而使用In-Fusion(注册商标)HD克隆试剂盒(宝生物公司、639633)，制作将与序列号2记载的人TSPAN8-GFP表达载体的氨基酸编号126～155相当的序列置换为小鼠或大鼠TSPAN8的氨基酸编号126～155的序列的载体。将制作的载体分别导入到CHO-K1细胞中，由此制作瞬时表达人TSPAN8-GFP蛋白、人小鼠TSPAN8-GFP嵌合蛋白或人大鼠TSPAN8-GFP嵌合蛋白的细胞。将制作的细胞分别称为表达野生型人TSPAN8的CHO-K1细胞、表达人小鼠TSPAN8嵌合蛋白的CHO-K1细胞或表达人大鼠TSPAN8嵌合蛋白的CHO-K1细胞。另外，制作将pCMV6-AC-GFP载体导入到CHO-K1细胞中而得到的细胞(称为空白对照细胞)。通过流式细胞术法测定16B11、16B12和TAL69对这些细胞中的GFP阳性细胞的结合。TAL69的情况下，对于表达人大鼠、人小鼠TSPAN8嵌合蛋白的CHO-K1细胞均未观察到结合的下降。16B11和16B12的情况下，对表达人大鼠TSPAN8嵌合蛋白的CHO-K1细胞，显示出与表达野生型人TSPAN8的CHO-K1细胞同等的结合。另一方面，对于表达人小鼠TSPAN8嵌合蛋白的CHO-K1细胞，与表达野生型人TSPAN8的CHO-K1细胞相比观察到结合的减弱(图5-1)。

为了确定有助于减弱对表达人小鼠TSPAN8嵌合蛋白的CHO-K1细胞的结合活性的氨基酸序列，对于人、小鼠、大鼠和食蟹猴的TSPAN8蛋白，进行了与人TSPAN8的氨基酸序列的126～155相当的序列的比较(图5-2)。将与小鼠、大鼠和食蟹猴TSPAN8的氨基酸序列的126～155相当的序列分别示于序列号41、42和43。结果，仅小鼠的TSPAN8蛋白的中，氨基酸序列不同的仅是第131位的氨基酸。根据该信息推测，序列号2记载的人TSPAN8蛋白的第131位的苏氨酸(T)对于与16B11或16B12的结合是重要的。

进而，为了确认人TSPAN8的第131位的氨基酸是否有助于16B11或16B12的结合，制作了该氨基酸的置换体。具体而言，制作了包含编码序列号2的人TSPAN8-GFP中的人TSPAN8的氨基酸序列的第131位的苏氨酸(T)被置换为丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)的人TSPAN8-GFP融合蛋白(分别称为“人TSPAN8(T131A)-GFP”或“人TSPAN8(T131N)-GFP”)的碱基序列的载体，向CHO-K1细胞中导入这些载体，由此构建了瞬时表达人TSPAN8(T131A)-GFP、人TSPAN8(T131N)-GFP的细胞。将构建的细胞称为表达人TSPAN8(T131A)的CHO-K1细胞或人TSPAN8(T131N)细胞。通过流式细胞术法测定了16B11、16B12和TAL69对这些细胞中的GFP阳性细胞的结合(图5-3)。结果是，16B11和16B12对表达人TSPAN8(T131A)的CHO-K1细胞和表达人TSPAN8(T131N)的CHO-K1细胞的结合与对表达野生型人TSPAN8的CHO-K1细胞的结合相比减弱。另一方面，TAL69对任一细胞均显示出同等的结合活性。结果获知，被鉴定为表位的与序列号2的氨基酸编号126～155对应的人TSPAN8的区域中，第131位的苏氨酸是与16B11和16B12的结合所必需的氨基酸。

将从对各TSPAN8表达细胞的结合的MFI减去对空白对照细胞的结合的MFI而算出的ΔMFI值记载于表2-1。另外，将设表2-1的对表达野生型人TSPAN8的CHO-K1细胞的结合的ΔMFI为100时的、对表达人小鼠TSPAN8嵌合蛋白的CHO-K1细胞、表达人大鼠TSPAN8嵌合蛋白的CHO-K1细胞和表达人TSPAN8(T131A或T131N)的CHO-K1细胞的结合的ΔMFI相对值示于表2-2。

[表2-1]

	16B11	16B12	TAL69
				人TSPAN8(野生型)	172723	26673	132771
人大鼠嵌合TSPAN8	160579	22352	96180
				人小鼠嵌合TSPAN8	5274	102	304830
人TSPAN8(T131A)	23373	12189	184065
				人TSPAN8(T131N)	3457	2629	143332

[表2-2]

	16B11	16B12	TAL69
				人TSPAN8(野生型)	100	100	100
人大鼠嵌合TSPAN8	93	84	72
				人小鼠嵌合TSPAN8	3	0	230
人TSPAN8(T131A)	14	46	139
				人TSPAN8(T131N)	2	10	108

[实施例4-3：结合竞争实验]

调查了16B11或16B12与其它抗TSPAN8抗体(9F6、18C10或TAL69)在与TSPAN8的结合中是否进行竞争。

为了调查16B11与其它抗TSPAN8抗体(9F6、18C10或TAL69)的竞争，通过流式细胞术法测定了16B11对NSC-15CF细胞的结合量的变化(实验1；图6-1)。具体而言，向2×10⁵个NSC-15CF中添加终浓度1μg/mL的Alexa Fluor647标记16B11和终浓度100μg/mL的其它抗TSPAN8抗体(16B11、9F6、18C10或TAL69中的1种抗体)，通过流式细胞仪测定16B11对NSC-15CF的结合量。作为阴性对照抗体，使用Ultra-LEAF纯化小鼠IgG1,κ同种型对照抗体、Ultra-LEAF纯化小鼠IgG2a,κ同种型对照抗体(BioLegend公司、400264)、Ultra-LEAF纯化小鼠IgG2b,κ同种型对照抗体。结果，16B11的结合仅在添加16B11本身时减弱。

为了调查16B12与其它抗TSPAN8抗体(16B11、9F6、18C10或TAL69)的竞争，通过流式细胞术法测定了由16B12引起的16B11、9F6或18C10对NSC-15CF的结合量的变化(实验2；图6-2)。具体而言，向1×10⁵个NSC-15CF中添加终浓度0.25μg/mL的Alexa Fluor647标记16B11、9F6或18C10和终浓度100μg/mL的16B12，通过流式细胞仪测定16B11、9F6或18C10对NSC-15CF的结合量。作为阴性对照抗体，使用LEAF纯化小鼠IgG3,κ同种型对照抗体。结果，16B12导致16B11的结合减弱。对于其它抗体的结合没有影响。同样实施了使用AlexaFluor647标记16B12和其它抗TSPAN8抗体(16B11、16B12、9F6、18C10或TAL69)的竞争实验(实验3；图6-3)。作为阴性对照抗体，使用LEAF纯化小鼠IgG3,κ同种型对照抗体、Ultra-LEAF纯化小鼠IgG2a,κ同种型对照抗体、Ultra-LEAF纯化小鼠IgG2b,κ同种型对照抗体和Ultra-LEAF纯化小鼠IgG1,κ同种型对照抗体。结果，16B12的结合仅在添加16B11和16B12本身时减弱。16B11和16B12的结合是相互竞争的，由此推测16B11和16B12识别近似的表位。将从各标记抗体结合的MFI减去未染色细胞的MFI而算出的值中、设添加同种型对照作为竞争性抗体时的值为100时的添加竞争性抗体时的相对值示于表3。

[表3]

实验1

竞争抗体	相对于利用同种型对照进行的竞争的％
		16B11	12
9F6	98
		18C10	119
TAL69	180

实验2

荧光标记抗体	相对于利用同种型对照进行的竞争的％
		16B11	0
9F6	100
		18C10	109

实验3

竞争抗体	相对于利用同种型对照进行的竞争的％
		16B12	1
16B11	2
		9F6	94
18C10	133
		TAL69	112

[实施例5：60As6-Luc/GFP细胞的制作]

通过以下方法制作使作为胃癌患者腹水来源株化细胞的60As6细胞表达荧光素酶蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)的60As6-Luc/GFP细胞。

[实施例5-1：包含Luc/GFP的病毒溶液的制作]

使用L293T细胞(Thermo Fisher Scientific公司、K4975-00)按照常规方法制作慢病毒。

制作慢病毒时，使用MISSION(注册商标)慢病毒包装混合物(SIGMA公司、SHP001)和pCDH-CMV-GL3-EF1a-GFP-T2A-puro改造载体(广岛大学医系科学研究科细胞分子生物学研究室高桥陵宇副教授惠赠(PLoS One、2015、Vol.10、e0123407、Front Biosci.、2008、Vol.13、p.1619-1633))。从包含病毒的细胞的培养上清液中，使用45μm Millex(注册商标)-HV过滤器(Merck Millipore公司、SLHV033RS)过滤病毒，将所得液体作为病毒溶液，在-80℃下冷冻保存。

[实施例5-2：病毒对60As6细胞的感染]

病毒对60As6细胞(国立癌研究中心柳原五吉先生惠赠)的感染按照常规方法来进行。培养基使用包含10％FBS的RPMI-1640。感染3天后，从60As6细胞培养板除去培养液，置换为包含10％FBS、2μg/mL嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific公司、A-11138-02)的RPMI-1640(筛选培养基)，继续进行培养。之后，重复进行筛选培养基中的培养和传代而除去未感染细胞，确认病毒已被完全除去。将建立的细胞称为60As6-Luc/GFP细胞。该细胞表达荧光素酶和GFP。进而，通过流式细胞术法确认了60As6-Luc/GFP细胞内源性地高表达TSPAN8。

[实施例6：作为完全人抗体的16B11.1的ADCC活性评价]

测定了由完全人抗体抗TSPAN8抗体的16B11.1诱导的ADCC活性。ADCC活性可通过评价效应细胞杀伤靶细胞的作用来进行测定。本实施例中，在作为效应细胞的NK细胞与作为靶细胞的60As6-Luc/GFP细胞的共培养下，16B11.1活化NK细胞，其结果是，以荧光素酶为指标来测定60As6-Luc/GFP细胞通过ADCC活性而被杀伤的细胞杀伤活性。

作为NK细胞，使用了从冷冻人PBMC(ePBMC(注册商标)，CharacterizedCryopreserved Human PBMC、Cellular Technology Limited公司、CTL-CP1)中使用NK细胞分离试剂盒(NK Cell Isolation Kit、human、Miltenyi Biotec公司、130-092-657)分离、并利用NK细胞用培养基(NK MACS Medium、Miltenyi Biotec公司、130-114-429)培养而得的细胞。

向圆底96孔板(Sumitomo Bakelite公司、MS-9096U)中，以5×10³个/25μL/孔播种悬浮于含有5％ FBS(Hyclone公司、SH30084.03)的RPMI-1640(SIGMA公司、R8758-500mL)培养基中的60As6-Luc/GFP细胞，以5×10⁴个/50μL/孔播种NK细胞。进而，以25μL/孔添加将16B11.1或作为阴性对照抗体的本公司制的抗KLH抗体(3G6)稀释成终浓度1、10、100、1000、10000ng/mL的溶液，使用荧光素酶定量化试剂盒(ONE-GloLuciferase Assay System、Promega公司、E6120)测定24小时后的荧光素酶的发光量。荧光素酶的发光量表示60As6-Luc/GFP细胞的生存量，因此可以通过荧光素酶的发光量的减少来测定基于ADCC活性的细胞杀伤活性。

图7的纵轴表示设对仅培养基进行测定时的荧光素酶的发光量为100％、且设未添加抗体时的60As6-Luc/GFP细胞中的荧光素酶的发光量为0％时的各样品的荧光素酶的发光量的相对值。横轴表示添加于各孔中的抗体的浓度。如图7所示，仅在添加16B11.1时，通过ADCC活性杀伤了靶细胞。

[实施例7：抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的制作]

[实施例7-1：抗TSPAN8抗体的双特异性抗体载体制作]

导入如下突变：将16B11.1的重链的氨基酸编号238和239(EU索引：234和235)的氨基酸分别由亮氨酸(L)置换为丙氨酸(A)的LALA突变(L234A和L235A)；将氨基酸编号370、372和411(EU索引：366、368和407)的氨基酸分别由苏氨酸(T)置换为丝氨酸(S)、由L置换为A、由酪氨酸(Y)置换为缬氨酸(V)的杵臼结构突变；以及将氨基酸编号301(EU索引：297)的氨基酸由天冬酰胺(N)置换为甘氨酸(G)的突变。将所设计的16B11.1的重链的氨基酸序列示于序列号6。将制作的载体称为pcDNA3.4-16B11.1_HC_H。

[实施例7-2：抗人CD3抗体的双特异性抗体载体制作]

基于日本专利第5686953号记载的小鼠抗CD3抗体的重链可变区和轻链可变区的序列按照文献(Front Biosci.、2008、Vol.13、p.1619-1633)记载的方法进行人源化抗CD3抗体的序列设计。此时导入了回复突变。通过MOLSIS Inc.公司提供的综合计算化学系统MOE分析了立体结构信息(PDB Code：5FCS)，确定了框架区内的回复突变导入位置。人源化抗CD3抗体以按照重链可变区(序列号14氨基酸编号1至125)、接头(序列号14氨基酸编号126至145)、轻链可变区(序列号14氨基酸编号146至254)、铰链(序列号14氨基酸编号255至269)、CH2结构域(序列号14氨基酸编号270至379)和CH3结构域(序列号14氨基酸编号380至486)的顺序配置的方式来设计。进而，向序列号14中导入了下述突变：(1)将与氨基酸编号44和氨基酸编号247相当的氨基酸置换为半胱氨酸(C)；(2)将氨基酸编号259(EU索引：220)的氨基酸从C置换为S；(3)将氨基酸编号273和274(EU索引：234和235)的氨基酸从L置换为A的LALA突变；(4)将氨基酸编号405(EU索引：366)的氨基酸从T置换为色氨酸(W)的杵臼结构突变；(5)将氨基酸编号336(EU索引：297)的氨基酸由N置换为G的突变。为了导入这些突变，合成编码包含各个突变点的氨基酸序列的多核苷酸，并插入到pcDNA3.1(+)载体(ThermoFisher scientific公司、V79020)中。将制作的载体称为pcDNA3.1-m7_scFV_K。将制作的人源化抗CD3抗体的碱基序列示于序列号13，将氨基酸序列示于序列号14。

[实施例7-3：抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的制作]

为了制作由抗TSPAN8抗体的Fab区、抗CD3抗体的scFv区和Fc区构成的双特异性抗体，与实施例3的方法同样地将pcDNA3.4-16B11.1_HC_H、pcDNA3.4-16B11_LC、pcDNA3.1-m7_scFV_K转染到ExpiCHO-S(注册商标)细胞中。将培养上清液使用MabSelect SuRe纯化，再用凝胶过滤柱HiLoad26/600Superdex(注册商标)200pg(GE医疗公司、28-9893-36)进行纯化，由此得到纯度95％以上的纯化抗体。将得到的抗体称为抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体。

[实施例8：抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的结合活性评价]

通过使用TSPAN8的LEL蛋白或CD3εδ复合蛋白的ELISA法分别评价抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体对TSPAN8和CD3的结合活性。

详细而言，将用PBS稀释的重组人TSPAN8蛋白(SinoBiological公司、15683-H07H)或人CellExp CD3 epsilon&CD3 delta异二聚体，人重组体(BioVision公司、P1183-10)1μg/mL以30μL/孔添加于384孔白板中，MaxiSorp(Nunc公司、460372)中。在4℃下静置过夜后，除去上清液，以120μL/孔添加Blocking One(Nacalai Tesque公司、03953-95)。在室温下静置1小时后，除去上清液，用TBST缓冲液(Thermo Fisher scientific公司、28360)洗涤2次后，以30μL/孔添加用含有10％ Blocking One的TBST稀释的抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体，在室温下静置1小时。除去抗体溶液，用TBST缓冲液洗涤2次后，以30μL/孔添加用含有10％ Blocking One的TBST稀释5000倍的山羊抗人κ,小鼠ads-HRP(SouthernBiotech公司、2061-05)，在室温下静置30分钟。除去抗体溶液，用TBST缓冲液洗涤4次后，以30μL/孔添加BM化学发光ELISA底物(POD)(Roche公司、11582950001)。在室温下反应15分钟后，利用ARVO X3(Perkin Elmer公司)测定化学发光。结果，算出相对于TSPAN8和CD3的EC50值分别为1.0μg/mL(8.1nM)、4.6μg/mL(36nM)(图8)。

[实施例9：抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的RTCC活性评价]

向RPMI-1640(Thermo Fisher Scientific公司、11875-119)500mL中加入FBS50mL、MEM非必需氨基酸(Merck公司、M7145)5mL、丙酮酸钠(Merck公司、S8636)5mL、GlutaMAX I(Thermo Fisher Scientific公司、35050-061)5mL、青霉素-链霉素(ThermoFisher Scientific公司、15070-063)5mL、HEPES(Thermo Fisher Scientific公司、15630-080)5mL，将所得培养基作为培养用培养基使用(以下，在本实施例中称为“培养用培养基”)。将用培养用培养基将实施例4中制作的60As6-Luc/GFP细胞制备为2×10⁵个/mL而得的细胞悬浮液以50μL播种到平底96孔板(IWAKI公司、3860-096)中，在37℃、5％ CO₂培养箱中培养。3小时后，将用培养用培养基制备为1×10⁶个/mL的冷冻人外周血单核细胞(LP.CR.MNC 10M；AllCells LLC公司、4W-270)以100μL播种到培养中的96孔板中。以50μL添加制备为终浓度0、3、10、30、100、300、1000、3000、10000ng/mL的抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体，在37℃、5％CO₂培养下在3天后用IncuCyte(注册商标)ZOOM(Sartorius公司)测定各孔的荧光(GFP)面积。将荧光面积作为细胞增殖的指标，图9中示出细胞增殖曲线。图9的纵轴示出设仅培养基的孔的荧光面积为0％、设未添加抗体溶液的孔的荧光面积为100％时的60As6-Luc/GFP细胞的荧光面积的相对值。结果，抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体在体外对作为表达TSPAN8的胃癌细胞的60As6-Luc/GFP细胞显示出细胞增殖抑制作用。

[实施例10：抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的使用患者腹水细胞的药效评价]

如果抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体与患者腹水细胞所包含的癌细胞和免疫细胞结合，则免疫细胞被活化，从而杀伤癌细胞。通过以下方法评价了抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体所带来的癌细胞杀伤作用和免疫细胞活化作用。

患者腹水细胞使用了与实施例1-1同样地对患者腹水实施至溶血处理后冷冻保存的细胞。将融化的细胞用与实施例9同样的培养用培养基制备为2×10⁶个/mL，将该细胞溶液以100μL/孔播种于平底96孔板。作为被检抗体，使用抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体和对照抗体(将16B11.1的Fab置换为抗KLH(匙孔血蓝蛋白)抗体的Fab的、抗KLH抗体与抗CD3抗体的双特异性抗体)。被检抗体从10μg/mL起以10倍公比稀释至0.1ng/mL。将被检抗体添加到播种了细胞的96孔板中后，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养中，使用培养用培养基。3天后回收细胞，播种到V底微孔板中。回收时，对于粘附于板的细胞，在使用Accutase(Innovative Cell Technologies公司、AT-104)剥离后添加到V底微孔板中。以720×g离心分离2分钟后，除去上清液，以20μL/孔添加在染色缓冲液(含有10％ FBS的PBS 0.09％NaN₃ 2mM EDTA)中加入有40分之1量的人BD Fc Block(Becton，Dickinson and Company公司、564220)的液体。对于各孔，以10μL/孔添加用染色缓冲液稀释的FITC小鼠抗人CD4(Becton，Dickinson and Company公司、550628)、APC-H7小鼠抗人CD8(Becton，Dickinsonand Company公司、560179)、APC小鼠抗人CD45(Becton，Dickinson and Company公司、555485)、PE小鼠抗人CD25(Becton，Dickinson and Company公司、555432)、亮紫421抗人CD326(EpCAM)抗体(BioLegend公司、324220)，在4℃下静置50分钟。将细胞用染色缓冲液洗涤1次后，重新悬浮于包含1/200量的7-AAD溶液的染色缓冲液中，使用CytoFLEX S(BeckmanCoulter公司)通过流式细胞术法测定各种抗体对腹水细胞的结合。数据分析用FlowJo来进行。对于作为活细胞的指标的7-AAD阴性细胞级分，用作为免疫细胞的指标的CD45和作为癌细胞的指标的EpCAM展开。CD45阴性EpCAM阳性癌细胞展开为Fsc(lin)和Ssc(lin)，除去片段化的级分，将所得细胞作为癌细胞的活细胞数。进而，测定CD45阳性级分的CD4或CD8阳性细胞中的活化标记物CD25的表达，算出抗CD25-PE荧光强度的MFI。图10-1示出癌细胞的活细胞数的变化。纵轴示出设未添加抗体溶液时的癌细胞的细胞数为100％时的细胞数的相对值。图10-2和10-3示出被检抗体所带来的CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞上的CD25表达量的变化。纵轴表示计算抗CD25-PE荧光强度的MFI的相对值而得的值。

结果如图10-1所示，观察到添加抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体使腹水中癌细胞的活细胞数减少，如图10-2、图10-3所示，观察到腹水中CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞的活化。由该结果暗示了，抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体活化了腹水中CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞、杀伤了腹水中癌细胞。

[实施例11：抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体的体内抗肿瘤评价]

使用胃癌腹膜播散模型评价抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体所带来的体内抗肿瘤作用。

[实施例11-1：扩增panT细胞的制作]

将用PBS溶解成3μg/mL的抗CD3抗体(BioLegend公司、317315)以250μL添加于24孔板(IWAKI公司、3820-024)，在4℃下静置。次日利用培养用培养基将板洗涤2次后，添加培养用培养基，在室温下静置，直至后述的细胞播种为止。从HPBMC,冷冻保存的人外周血单核细胞(LONZA公司、CC-2702)中分离panT细胞(包括CD4T细胞和CD8T细胞这两者)。分离中，使用人PanT细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec公司、130-096-535)，基于附带的规程进行实验。从上述24孔板中除去培养用培养基，在板中以500μL播种用培养用培养基制备为3×10⁶个/mL的panT细胞。进一步以500μL添加包含20ng/mL的人IL-2(PeproTech公司、200-2)和2μg/mL的抗CD28抗体(BioLegend公司、302923)的培养用培养基，在37℃、5％ CO₂培养箱中进行培养。对于细胞，在培养开始3天后、5天后和7天后传代到新的板(IWAKI公司、3810-006)中，以终浓度为10ng/mL的方式添加IL-2。回收培养开始7天后和10天后的细胞，用于实施例10-2。这里，将分离、增殖的细胞称为扩增panT细胞。

[实施例11-2：胃癌腹膜播散模型中的药效确认]

向每组7只的7周龄C.B17/Icr-scid/scidJcl雌小鼠(日本CLEA公司)的腹腔内移植1×10⁶个/1mL/PBS的60As6-Luc/GFP细胞。移植6天后，以导入到60As6-Luc/GFP细胞中的荧光素酶所引起的底物荧光素的发光量为指标，以各组均等的方式进行分组。荧光素的发光量作为表示肿瘤体积的指标使用。

详细而言，向各个体的腹腔内给予将3mg荧光素(VivoGlo Luciferin，In VivoGrade、Promega公司、P1043)溶解于0.5mL的PBS而得的溶液，在给予10分钟后，利用IVISLumina II(perkinelmer公司)测定发光量。接着在移植60As6-Luc/GFP细胞7天后和10天后，腹腔内给予将1×10⁷个扩增panT细胞悬浮于0.5mL的PBS而成的液体和将0、0.3、1.0、3.0mg/kg抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体悬浮于0.2mL的PBS而成的液体。在移植胃癌细胞14天后，测定荧光素的发光量，评价肿瘤体积的增减。另外，观察该腹膜播散模型小鼠的生存，直至60As6-Luc/GFP细胞移植34天后为止。如图11-1所示，抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体给药组中显示出显著的肿瘤体积缩小作用，如图11-2所示，1.0和3.0mg/kg给药组中观察到显著的生存期延长效果。表4示出生存中央值和检验结果。表中的显著性概率P值通过利用对数秩检验比较对照组(溶剂给药组)的生存期与抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体给药组的生存期而求出。**表示P值小于用邦费罗尼(Bonferroni)法校正后的显著水平0.01/3的组。

[表4]

对数-秩(Mantel-Cox)检验(邦费罗尼校正)

[实施例12：抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体对各癌瘤细胞株的作用]

[实施例12-1：抗TSPAN8抗体对各癌瘤细胞株的结合活性的确认]

通过流式细胞术法测定Alexa Fluor647标记16B11对胃癌细胞株(KATOIII细胞：日本研究生物资源细胞库(Japanese Collection of Research Bioresources，JCRB)、JCRB0611、NUGC-4细胞：RIKEN生物资源研究中心(BioResource Research Center，BRC)、RCB1939、60As6-Luc/GFP细胞)、结肠癌细胞株(HT-29细胞：ATCC、HTB-38、LoVo细胞：ATCC、CCL-229、GP2d细胞：欧洲认证细胞培养物保藏中心(The European Collection ofAuthenticated Cell Cultures，ECACC)、95090714)、胰腺癌细胞株(AsPC-1细胞：ATCC、CRL-1682)、食道癌细胞株(OE19细胞：ECACC、96071721)、肝癌细胞株(Li-7细胞：RIKENBRC、RCB1941)的结合。作为阴性对照抗体，将本公司制造的抗KLH抗体(173A1)用AlexaFluor647标记后使用。将各癌瘤细胞株的与16B11和阴性对照抗体的结合的直方图示于图12。

[实施例12-2：抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体对各癌瘤细胞株的RTCC活性评价]

将KATOIII细胞、NUGC-4细胞、HT-29细胞、LoVo细胞、GP2d细胞、AsPC-1细胞、OE19细胞、Li-7细胞利用培养用培养基制备为2×10⁵个/mL，以50μL播种于平底96孔板(IWAKI公司、3860-096)中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。将利用培养用培养基制备为1×10⁶个/mL的冷冻人外周血单核细胞(LONZA公司、CC-2702)以100μL播种于培养中的96孔板。对于抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体，将40μg/mL或20μg/mL设为最高浓度以2倍公比利用培养用培养基稀释。以50μL添加稀释后的抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体(最高终浓度为10μg/mL或5μg/mL)。将添加了癌细胞株、冷冻人外周血单核细胞和抗体的96孔板在37℃、5％ CO₂培养箱中培养。3天后回收细胞，播种于V底微孔板。回收时，对于粘附于培养板的细胞，在用Accutase(Innovative Cell Technologies公司、AT104)剥离后添加于V底微孔板。以720×g离心分离2分钟后，除去上清液，以20μL/孔添加向染色缓冲液中添加40分之1量的人BD Fc Block而得的液体。对于各孔，以10μL/孔加入用染色缓冲液稀释的APC小鼠抗人CD4(Becton，Dickinson and Company公司、555349)、APC-H7小鼠抗人CD8、亮紫421小鼠抗人CD45(Becton，Dickinson and Company公司、563879)、PE小鼠抗人CD25，在4℃下静置1小时。用染色缓冲液洗涤1次后，加入1/200量的7-AAD溶液。重新悬浮于染色缓冲液中，使用CytoFLEX S，通过流式细胞术法测定各种抗体的结合。数据分析用FlowJo来进行。将活细胞的指标的7-AAD阴性细胞级分中的CD45阴性细胞数作为癌细胞的活细胞数。将未添加抗体溶液设为100％。进而，对CD45阳性级分的CD4或CD8阳性细胞，对于活化标记物的CD25的表达，分别以设未添加抗体溶液为1时的倍率变化的形式算出抗CD25-PE荧光强度的MFI。结果如图13-1所示，观察到添加抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体使表达TSPAN8的癌细胞的活细胞数减少。进而，如图13-2和图13-3所示，分别观察到CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞的活化。

[实施例12-3：移植人PBMC的HT-29细胞皮下荷瘤模型中的药效确认]

将正常人PBMC(Precision for Medicine、33000-10M)以1.25×10⁷个/mL方式悬浮于PBS，对于6周龄NOD/Shi-scid，IL-2RγKO(NOG)雌小鼠(In-Vivo Science Inc.)，向小鼠尾静脉内注射2.5×10⁶个/200μL的细胞。在移植人PBMC的10天后，将HT-29细胞以5×10⁷个/mL悬浮于PBS，以5×10⁶个/100μL使小鼠的皮下荷瘤。在从HT-29细胞的荷瘤起10天后，使用游标卡尺测定肿瘤体积，以各组均等的方式进行分组(n＝10)。当日开始给予抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体。将初次给予日定义为第0天。在第0、4、7天，对小鼠静脉内给予PBS或0.3、1、3、10mg/kg的抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体。在第0、4、7和11天测定肿瘤体积(图14-1)。肿瘤体积[mm³]通过下式来计算。

(肿瘤长轴的长度[mm])×(肿瘤短轴的长度[mm])²×0.5

如图14-2所示，抗TSPAN8(16B11)-抗CD3双特异性抗体在0.3、1、3和10mg/kg下显著抑制HT-29肿瘤的增殖。

产业上的可利用性

本发明的抗TSPAN8抗体和抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体等抗TSPAN8抗体的融合体可期待在癌症治疗中有用。另外，生产本发明的多核苷酸、表达载体、进行了转化的宿主细胞和抗体的方法在生产上述抗TSPAN8抗体和其融合体的方面有用。

序列表自由文本

以下的序列表的数字标题＜223＞中，记载“人工序列”的说明。具体而言，序列号2示出人TSPAN8-Myc-DDK的氨基酸序列，序列号1所示的碱基序列为编码序列号2所示的人TSPAN8的氨基酸序列的碱基序列。序列号4、6、或10为抗TSPAN8抗体的重链的氨基酸序列，序列号3、5、或9所示的碱基序列为编码序列号4、6、或10所示的抗TSPAN8抗体的重链的氨基酸序列的碱基序列。序列号8或12的序列为抗TSPAN8抗体的轻链的氨基酸序列，序列号7或11所示的碱基序列为编码序列号8或12所示的抗TSPAN8抗体的轻链的氨基酸序列的碱基序列。序列号14为抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的氨基酸序列，序列号13所示的碱基序列为编码序列号14所示的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的氨基酸序列的碱基序列。序列号15～23为在发明的详细说明中记载的各种接头的氨基酸序列。序列号24～37为16B11和16B12的CDR和可变区的氨基酸序列。序列号38～40为信号序列的氨基酸序列。序列号41～43分别为小鼠、大鼠或食蟹猴的TSPAN8的氨基酸编号126～155的区域的氨基酸序列。

序列表

<110> 安斯泰来制药株式会社

国立研究开发法人国立癌症研究中心

<120> 抗TSPAN8-抗CD3双特异性抗体和抗TSPAN8抗体

<130> FA1535-21168

<150> JP2020-189988

<151> 2020-11-16

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TSPAN8-Myc-DDK

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(807)

<400> 1

atg gca ggt gtg agt gcc tgt ata aaa tat tct atg ttt acc ttc aac 48

Met Ala Gly Val Ser Ala Cys Ile Lys Tyr Ser Met Phe Thr Phe Asn

1 5 10 15

ttc ttg ttc tgg cta tgt ggt atc ttg atc cta gca tta gca ata tgg 96

Phe Leu Phe Trp Leu Cys Gly Ile Leu Ile Leu Ala Leu Ala Ile Trp

20 25 30

gta cga ata agc aat gac tct caa gca att ttt ggt tct gaa gat gta 144

Val Arg Ile Ser Asn Asp Ser Gln Ala Ile Phe Gly Ser Glu Asp Val

35 40 45

ggc tct agc tcc tac gtt gct gtg gac ata ttg att gct gta ggt gcc 192

Gly Ser Ser Ser Tyr Val Ala Val Asp Ile Leu Ile Ala Val Gly Ala

50 55 60

atc atc atg att ctg ggc ttc ctg gca tgc tgc ggt gct ata aaa gaa 240

Ile Ile Met Ile Leu Gly Phe Leu Ala Cys Cys Gly Ala Ile Lys Glu

65 70 75 80

agt cgc tgc atg ctt ctg ttg ttt ttc ata ggc ttg ctt ctg atc ctg 288

Ser Arg Cys Met Leu Leu Leu Phe Phe Ile Gly Leu Leu Leu Ile Leu

85 90 95

ctc ctg cag gtg gcg aca ggt atc cta gga gct gtt ttc aaa tct aag 336

Leu Leu Gln Val Ala Thr Gly Ile Leu Gly Ala Val Phe Lys Ser Lys

100 105 110

tct gat cgc att gtg aat gaa act ctc tat gaa aac aca aag ctt ttg 384

Ser Asp Arg Ile Val Asn Glu Thr Leu Tyr Glu Asn Thr Lys Leu Leu

115 120 125

agc gcc aca ggg gaa agt gaa aaa caa ttc cag gaa gcc ata att gtg 432

Ser Ala Thr Gly Glu Ser Glu Lys Gln Phe Gln Glu Ala Ile Ile Val

130 135 140

ttt caa gaa gag ttt aaa tgc tgc ggt ttg gtc aat gga gct gct gat 480

Phe Gln Glu Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Val Asn Gly Ala Ala Asp

145 150 155 160

tgg gga aat aat ttt caa cac tat cct gaa tta tgt gcc tgt cta gat 528

Trp Gly Asn Asn Phe Gln His Tyr Pro Glu Leu Cys Ala Cys Leu Asp

165 170 175

aag cag aga cca tgc caa agc tat aat gga aaa caa gtt tac aaa gag 576

Lys Gln Arg Pro Cys Gln Ser Tyr Asn Gly Lys Gln Val Tyr Lys Glu

180 185 190

acc tgt att tct ttc ata aaa gac ttc ttg gca aaa aat ttg att ata 624

Thr Cys Ile Ser Phe Ile Lys Asp Phe Leu Ala Lys Asn Leu Ile Ile

195 200 205

gtt att gga ata gca ttt gga ctg gca gtt att gag ata ctg ggt ttg 672

Val Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Ala Val Ile Glu Ile Leu Gly Leu

210 215 220

gtg ttt tct atg gtc ctg tat tgc cag atc ggg aac aaa acg cgt acg 720

Val Phe Ser Met Val Leu Tyr Cys Gln Ile Gly Asn Lys Thr Arg Thr

225 230 235 240

cgg ccg ctc gag cag aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg gca gca aat 768

Arg Pro Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Asn

245 250 255

gat atc ctg gat tac aag gat gac gac gat aag gtt taa 807

Asp Ile Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Val

260 265

<210> 2

<211> 268

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Met Ala Gly Val Ser Ala Cys Ile Lys Tyr Ser Met Phe Thr Phe Asn

1 5 10 15

Phe Leu Phe Trp Leu Cys Gly Ile Leu Ile Leu Ala Leu Ala Ile Trp

20 25 30

Val Arg Ile Ser Asn Asp Ser Gln Ala Ile Phe Gly Ser Glu Asp Val

35 40 45

Gly Ser Ser Ser Tyr Val Ala Val Asp Ile Leu Ile Ala Val Gly Ala

50 55 60

Ile Ile Met Ile Leu Gly Phe Leu Ala Cys Cys Gly Ala Ile Lys Glu

65 70 75 80

Ser Arg Cys Met Leu Leu Leu Phe Phe Ile Gly Leu Leu Leu Ile Leu

85 90 95

Leu Leu Gln Val Ala Thr Gly Ile Leu Gly Ala Val Phe Lys Ser Lys

100 105 110

Ser Asp Arg Ile Val Asn Glu Thr Leu Tyr Glu Asn Thr Lys Leu Leu

115 120 125

Ser Ala Thr Gly Glu Ser Glu Lys Gln Phe Gln Glu Ala Ile Ile Val

130 135 140

Phe Gln Glu Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Val Asn Gly Ala Ala Asp

145 150 155 160

Trp Gly Asn Asn Phe Gln His Tyr Pro Glu Leu Cys Ala Cys Leu Asp

165 170 175

Lys Gln Arg Pro Cys Gln Ser Tyr Asn Gly Lys Gln Val Tyr Lys Glu

180 185 190

Thr Cys Ile Ser Phe Ile Lys Asp Phe Leu Ala Lys Asn Leu Ile Ile

195 200 205

Val Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Ala Val Ile Glu Ile Leu Gly Leu

210 215 220

Val Phe Ser Met Val Leu Tyr Cys Gln Ile Gly Asn Lys Thr Arg Thr

225 230 235 240

Arg Pro Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Asn

245 250 255

Asp Ile Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Val

260 265

<210> 3

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B11.1_HC

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1356)

<400> 3

cag gtt cag ctg gtt gaa tct ggc ggc gga gtt gtt cag cct ggc gga 48

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

tct ctg aga ctg tct tgt gcc gcc tcc ggc ttc acc ttc tcc tct tac 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

gga atg cac tgg gtc cga cag gcc cct ggc aaa gga ttg gaa tgg gtc 144

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

gcc gtg att tgg tac gac ggc cgg aac aag tac tac gcc gac tcc gtg 192

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

aag ggc aga ttc acc atc tct cgg gac aac tcc aag aac acc ctg tac 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

acc aga gat cac tcc ggc tcc ggc agc tac tac atc gat tat tgg ggc 336

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100 105 110

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

gtg ttc cct ctg gct cct tcc agc aag tct acc tct ggc gga aca gct 432

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130 135 140

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145 150 155 160

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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

cct tcc agc tct ctg gga acc cag acc tac atc tgc aat gtg aac cac 624

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

aag cct tcc aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag tcc tgc 672

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

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225 230 235 240

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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

atc tct cgg acc cct gaa gtg aca tgc gtg gtg gtg gat gtg tcc cac 816

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260 265 270

gag gat ccc gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac ggc gtg gaa gtg 864

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

cac aac gcc aag acc aag cct aga gag gaa cag tac aac tcc acc tac 912

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

aga gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gat tgg ctg aac ggc 960

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg cct gct cct atc 1008

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

gaa aag acc atc tcc aag gct aag ggc cag cct cgg gaa cct cag gtt 1056

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

tac aca ctg cct cca tct cgg gac gag ctg acc aag aat cag gtg tcc 1104

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

ctg acc tgc ctc gtg aag ggc ttc tac cct tct gat atc gcc gtg gaa 1152

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

tgg gag tcc aac ggc cag cct gag aac aac tac aag aca acc cct cct 1200

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

gtg ctg gac tcc gac ggc tca ttc ttc ctg tac tcc aag ctg aca gtg 1248

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

gat aag tcc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc tct tgt tct gtg atg 1296

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag agt ctg tct ctg tcc 1344

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

cct ggc aag tga 1356

Pro Gly Lys

450

<210> 4

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

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130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

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340 345 350

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370 375 380

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405 410 415

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420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 5

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B11.1_HC_H

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1356)

<400> 5

cag gtt cag ctg gtt gaa tct ggc ggc gga gtt gtt cag cct ggc gga 48

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

tct ctg aga ctg tct tgt gcc gcc tcc ggc ttc acc ttc tcc tct tac 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

aag ggc aga ttc acc atc tct cgg gac aac tcc aag aac acc ctg tac 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

ctg cag atg aac tcc ctg aga gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc 288

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

acc aga gat cac tcc ggc tcc ggc agc tac tac atc gat tat tgg ggc 336

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100 105 110

cag ggc acc ctg gtc acc gtg tcc tct gct tct acc aag gga ccc agc 384

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

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130 135 140

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<400> 13

gaa gta cag ctg gtg gag tct ggc gga ggt ctt atc cag ccc gga ggt 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

tct ctg cgc ctg agc tgt gca gct tcc ggt ttc acc ttc aac acc tat 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

gcc atg aat tgg gta cgc cag gct cca gga aaa tgt ctg gag tgg gtg 144

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

gct cgg att cga agc aaa tac aac aat tat gca acc tac tat gcc gac 192

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

agt gtc aag gac cgc ttc acc ata agt cgg gat gac tcc aag agc act 240

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr

65 70 75 80

ctg tat ctg cag atg aac aac ttg agg gcc gag gat acc gcc gtt tac 288

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

tat tgc gta agg cat ggc aac ttc ggt aat tcc tac gtg tcc tgg ttt 336

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

gcc tat tgg ggc caa ggg acg ctg gtt aca gtg tca agt gga aag ccc 384

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Pro

115 120 125

ggg tct ggc aaa cct ggg agt ggc aag ccc ggg agt ggg aaa cca gga 432

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly

130 135 140

tcc cag gct gtt gtc act caa gaa ccc agt ctc act gtt tct cca ggc 480

Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly

145 150 155 160

ggt aca gtc aca ctc aca tgt cgt agc agc act ggg gct gtg acc acc 528

Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr

165 170 175

agc aac tat gca aac tgg gtc cag cag aaa ccc ggt caa gct ccc aga 576

Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

180 185 190

gga ttg att ggc ggt acc aat aag cgg gcc cct ggg act cct gct cga 624

Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg

195 200 205

ttt tct ggc tcc ttg ctt gga gat aaa gcc gca ctg act ttg agc ggc 672

Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly

210 215 220

gct caa cca gag gac gaa gca gag tac tat tgt gct ctg tgg tac tcc 720

Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser

225 230 235 240

aac ctc tgg gtg ttt ggc tgt ggc acc aag gta aca gtg ctg gaa cct 768

Asn Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Glu Pro

245 250 255

aag tca agc gac aaa aca cac acc tgt cct ccc tgt cca gca cca gag 816

Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

260 265 270

gca gct ggt ggc cca tct gtc ttt ctg ttc cca cca aag ccc aag gac 864

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

275 280 285

act ctg atg atc tca cga aca ccc gaa gtg act tgc gta gtg gtg gac 912

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

290 295 300

gtt tct cat gag gat cca gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gat gga 960

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

305 310 315 320

gtg gaa gtg cac aat gcc aaa aca aag ccc cgt gag gag cag tac ggc 1008

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly

325 330 335

tcc acg tac agg gtt gtc tcc gtt ttg acc gtc ctg cat cag gat tgg 1056

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

340 345 350

ctt aac gga aaa gag tat aag tgc aag gta tcc aat aag gcc ctt ccc 1104

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

355 360 365

gcc cct atc gag aaa act atc agc aag gcc aaa gga cag ccc aga gag 1152

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

370 375 380

ccc cag gtg tac act ttg cct cct tct agg gat gaa ctc acc aag aat 1200

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

385 390 395 400

cag gtt agc ctg tgg tgc ctg gtg aag ggg ttt tac cca tcc gat att 1248

Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

405 410 415

gcc gtg gag tgg gaa agc aat ggc caa ccc gag aac aac tat aag aca 1296

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

420 425 430

act cct cct gtg ctg gac tca gat gga agt ttc ttc ctg tac agc aag 1344

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

435 440 445

ctc aca gtg gac aag agc aga tgg cag cag ggc aat gtg ttt tct tgc 1392

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

450 455 460

tct gtc atg cac gaa gcc ctg cac aat cac tac acc cag aaa tcc ctt 1440

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

465 470 475 480

agt ctg tca cct ggg aag tga 1461

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210> 14

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Pro

115 120 125

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly

130 135 140

Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly

145 150 155 160

Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr

165 170 175

Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

180 185 190

Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg

195 200 205

Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly

210 215 220

Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser

225 230 235 240

Asn Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Glu Pro

245 250 255

Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

260 265 270

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

275 280 285

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

290 295 300

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

305 310 315 320

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly

325 330 335

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

340 345 350

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

355 360 365

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

370 375 380

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

385 390 395 400

Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

405 410 415

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

420 425 430

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

435 440 445

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

450 455 460

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

465 470 475 480

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GGGS接头

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(4)

<400> 15

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SGGG接头

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(4)

<400> 16

Ser Gly Gly Gly

1

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GGGGS接头

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(5)

<400> 17

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SGGGG接头

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(5)

<400> 18

Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GGGGGS接头

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(6)

<400> 19

Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SGGGGG接头

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(6)

<400> 20

Ser Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GGGGGGS接头

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(7)

<400> 21

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SGGGGGG接头

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(7)

<400> 22

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GKPGS接头

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(5)

<400> 23

Gly Lys Pro Gly Ser

1 5

<210> 24

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B11&16B12_HCDR1

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(5)

<400> 24

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 25

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B11_HCDR2

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(16)

<400> 25

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B12_HCDR2

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(16)

<400> 26

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B11_HCDR3

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(12)

<400> 27

Asp His Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Ile Asp Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B12_HCDR3

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(12)

<400> 28

Asp His Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ile Asp Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B11_LCDR1

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(9)

<400> 29

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B12_LCDR1

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(9)

<400> 30

Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B11&16B12_LCDR2

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(5)

<400> 31

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B11_LCDR3

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(8)

<400> 32

Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Trp Thr

1 5

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B12_LCDR3

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(8)

<400> 33

Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Trp Thr

1 5

<210> 34

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B11_VH

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(114)

<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asp His Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B12_VH

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(113)

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B11_VL

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(97)

<400> 36

Glu Ile Ala Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Leu Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 16B12_VL

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(98)

<400> 37

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 38

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号序列

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(19)

<400> 38

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 39

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号序列

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(19)

<400> 39

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 40

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号序列

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(19)

<400> 40

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 41

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠TSPAN8 126-155

<400> 41

Lys Leu Leu Ser Asp Asn Thr Asp Glu Ala Lys Asp Phe Gln Lys Ala

1 5 10 15

Met Ile Val Phe Gln Ser Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Glu

20 25 30

<210> 42

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠TSPAN8 126-155

<400> 42

Lys Leu Leu Ser Glu Thr Ser Asn Glu Ala Lys Glu Val Gln Lys Ala

1 5 10 15

Met Ile Ala Phe Gln Ser Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Arg

20 25 30

<210> 43

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 食蟹猴TSPAN8 126-155

<400> 43

Lys Leu Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ser Ala Lys Gln Phe Gln Gln Ala

1 5 10 15

Met Ala Glu Phe Gln Lys Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Val

20 25 30

Claims

1.一种与TSPAN8和CD3结合的双特异性抗体，其包含：

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，

4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，

5.根据权利要求1～4中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗CD3抗体的重链可变区包含由序列号14的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号50至68的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号101至114的氨基酸序列构成的CDR3，抗CD3抗体的轻链可变区包含由序列号14的氨基酸编号168至181的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号14的氨基酸编号197至203的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号14的氨基酸编号236至244的氨基酸序列构成的CDR3。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗CD3抗体的重链可变区由序列号14的氨基酸编号1至125的氨基酸序列构成，抗CD3抗体的轻链可变区由序列号14的氨基酸编号146至254的氨基酸序列构成。

7.根据权利要求1～4中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗CD3-scFv区由序列号14的氨基酸编号1至254的氨基酸序列构成。

8.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，

9.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，

10.根据权利要求1～9中任一项所述的双特异性抗体，其含有包含LALA突变(L234A和L235A(在此，所述突变位置为人Igγ1恒定区中的根据EU索引的氨基酸位置))的Fc区。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的双特异性抗体，其含有包含N297G突变(在此，所述突变位置为人Igγ1恒定区中的根据EU索引的氨基酸位置)的Fc区。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的双特异性抗体，其含有包含杵臼结构(Knobsinto holes)突变的Fc区。

13.根据权利要求1～12中任一项所述的双特异性抗体，其含有包含LALA突变、N297G突变和杵臼结构突变的Fc区。

14.根据权利要求12或13所述的双特异性抗体，其中，杵臼结构突变为形成Fc区的1个Fc多肽中的T366W突变以及形成Fc区的另一个Fc多肽中的T366S、L368A和Y407V突变(在此，所述突变位置为人Igγ1恒定区中的根据EU索引的氨基酸位置)。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的双特异性抗体，其包含第一Fc多肽由序列号6的235至451的氨基酸序列构成、且第二Fc多肽由序列号14的270至486的氨基酸序列构成的Fc区。

16.根据权利要求1～15中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽借助铰链区连接，抗CD3-scFv区与第二Fc多肽借助铰链区连接。

17.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其包含：

18.根据权利要求2～17中任一项所述的双特异性抗体，其经过了翻译后修饰。

19.根据权利要求18所述的双特异性抗体，其中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷氨酰化和/或重链C末端赖氨酸缺失。

20.一种多核苷酸，其选自由下述(a)～(e)组成的组：

21.一种多核苷酸，其选自由下述(a)～(c)组成的组：

22.一种表达载体，其包含权利要求20或21所述的多核苷酸。

23.一种宿主细胞，其为用权利要求22所述的表达载体进行了转化的宿主细胞。

24.一种宿主细胞，其含有：

包含编码包含由序列号6的氨基酸编号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

包含编码包含由序列号8的氨基酸编号1至107的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；以及，

25.一种宿主细胞，其含有：

包含编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的重链片段与第一Fc多肽连接而成的抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；

包含编码由序列号8的氨基酸序列构成的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；以及，

包含编码由序列号14的氨基酸序列构成的抗CD3-scFv区与第二Fc多肽连接而成的多肽的碱基序列的多核苷酸。

26.一种与TSPAN8和CD3结合的双特异性抗体的生产方法，其包括培养权利要求23～25中任一项所述的宿主细胞的步骤。

27.一种药物组合物，其包含权利要求1～19中任一项所述的双特异性抗体和药学上可接受的赋形剂。

28.根据权利要求1～19中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗癌症。

29.根据权利要求27所述的药物组合物，其用于治疗癌症。

30.一种治疗癌症的方法，其包括向对象给予治疗有效量的权利要求1～19中任一项所述的双特异性抗体的步骤。

31.权利要求1～19中任一项所述的双特异性抗体在制造用于治疗癌症的药物组合物中的应用。

32.一种抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与表达人TSPAN8的癌细胞选择性地结合。

33.一种抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与序列号2的氨基酸编号126至155的人TSPAN8的区域中存在的至少1个氨基酸结合。

34.根据权利要求33所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与所述人TSPAN8的区域中存在的至少序列号2的氨基酸编号131的氨基酸结合。

35.一种抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其选自下述(a)和(b)：

36.根据权利要求35所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其选自下述(a)和(b)：

37.根据权利要求35所述的抗TSPAN8抗体，其选自下述(a)和(b)：

38.一种抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与权利要求33～37中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段竞争对表达人TSPAN8的癌细胞的结合。

39.根据权利要求32～38中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其与针对T细胞或NK细胞的表面抗原的抗体或其抗原结合片段连接。

40.根据权利要求39所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其中，T细胞的表面抗原为CD3。

41.根据权利要求40所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其中，针对T细胞的表面抗原的抗原结合片段为抗CD3抗体的scFv。

42.根据权利要求32～41中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其经过了翻译后修饰。

43.根据权利要求42所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段，其中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷氨酰化和/或重链C末端赖氨酸缺失。

44.一种权利要求32～43中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的融合体或复合体、或者在细胞表面表达权利要求32～43中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的细胞。

45.一种多核苷酸，其选自由下述(a)～(d)组成的组：

46.一种多核苷酸，其选自由下述(a)～(d)组成的组：

47.一种表达载体，其包含权利要求45或46所述的多核苷酸。

48.一种宿主细胞，其为用权利要求47所述的表达载体进行了转化的宿主细胞。

49.一种宿主细胞，其选自下述(a)或(b)：

(a)包含权利要求45所述的包含编码抗TSPAN8抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和权利要求45所述的包含编码抗体的抗TSPAN8抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的宿主细胞；

(b)包含权利要求46所述的包含编码抗TSPAN8抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和权利要求46所述的包含编码抗体的抗TSPAN8抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的宿主细胞。

50.一种抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的生产方法，其包括培养权利要求48或49中任一项所述的宿主细胞的步骤。

51.根据权利要求32～43中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段、或者权利要求44所述的融合体、复合体或细胞，其用于治疗癌症。

52.一种药物组合物，其包含权利要求32～43中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段、或者权利要求44所述的融合体、复合体或细胞，还包含药学上可接受的赋形剂。

53.根据权利要求52所述的药物组合物，其用于治疗癌症。

54.一种治疗癌症的方法，其包括向对象给予治疗有效量的权利要求32～43中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段的步骤、或者向对象给予治疗有效量的权利要求44所述的融合体、复合体或细胞的步骤。

55.权利要求32～43中任一项所述的抗TSPAN8抗体或其抗原结合片段、或者权利要求44所述的融合体、复合体或细胞在制造用于治疗癌症的药物组合物中的应用。