JP2022525627A - Ｇｐｎｍｂ及びｃｄ３に特異的に結合する二重特異性抗体並びにその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＣＤ３及びＧＰＮＭＢに特異的に結合する二重特異性抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３抗体、並びにその使用に関する。特に、二重特異性抗体は、ＣＤ３及びＧＰＮＭＢに高い親和性及び特異性を示し、したがって、ＧＰＮＭＢを発現する癌細胞の死を誘導し、且つその増殖を阻害することができる。それゆえに、二重特異性抗体は、ＧＰＮＭＢを発現する癌に対する有効な治療剤として用いることができる。【選択図】 なし

Description

本発明は、ＧＰＮＭＢ及びＣＤ３に特異的に結合する新規の二重特異性抗体並びにその使用に関する。

様々な死因の中で、癌による死亡が頻繁に起こっており、その占める割合は２番目に多い。癌を処置するための様々な方法が継続的に試みられており、その典型的な例には、抗癌剤の投与、放射線治療、又は外科手術が挙げられる。癌が早期である場合、その処置は、これらの方法を単独で、又は組み合わせて用いることにより行われ得る；しかしながら、癌が後期である場合、又は癌が他の組織へ血液を通して広がっており、若しくは再発している場合、そのような方法はあまり治療効果を生じない。

したがって、免疫細胞に基づいた治療技術に関する研究は、注目を集めている。詳細には、患者の末梢血から採取された免疫細胞がインビトロ大量増殖に供され、その後、その生じた免疫細胞が患者に再投与されて、その結果、免疫細胞に存在する癌細胞特異的毒性Ｔ細胞が癌細胞を除去するという技術が開発されつつある。さらに、組換えテクノロジーの発達と共に、癌についてなどの、Ｔ細胞媒介性死滅を必要とする治療領域に用いられる二重特異性抗体もまた、開発されており、その効果が同定されている（Ｂｕｈｌｅｒ，Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ５７．１、２００８：４３～５２）。それにも関わらず、有害効果が最小化された、より良い抗癌効果を生じる二重特異性抗体の開発の必要性が未だに存在する。

［発明の開示］
［技術的問題］
本発明者らは、ＧＰＮＭＢ発現癌細胞の死が効果的に誘導されるようにＣＤ３発現免疫細胞をＧＰＮＭＢ発現癌細胞に配置させることができる二重特異性抗体を開発し、その優れた抗癌効果を同定しており、それにより、本発明を完成している。

したがって、本発明の目的は、ＣＤ３及びＧＰＮＭＢに特異的に結合する二重特異性抗体を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、活性成分として二重特異性抗体又はその断片を含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物を提供することである。

［問題の解決］
上記で述べられた目的を達成するために、本発明は、ＧＰＮＭＢに特異的に結合する第１のドメイン及びＣＤ３に特異的に結合する第２のドメインを含む二重特異性抗体を提供する。

加えて、本発明は、二重特異性抗体又はその断片を含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。

［発明の有利な効果］
ＧＰＮＭＢ及びＣＤ３に対する高い親和性及び特異性を有することにより、本発明による二重特異性抗体は、ＧＰＮＭＢ発現癌細胞の死を誘導し、又はその増殖を阻害することができる。したがって、二重特異性抗体は、ＧＰＮＭＢ発現癌に対する有効な治療剤として用いることができる。

抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が獲得されていることを示す結果を示す図である。ここで、横軸はｍＬ（バッファー流量）を意味し、縦軸はｍＡｕ（２８０ｎｍにおけるＯＤ）を意味する。 抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体にＨＰＬＣ分析を実施することにより得られた結果を示す図である。 抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の癌細胞株に対する結合パターンを示すＦＡＣＳ結果を示す図である。 抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の存在下で観察された癌細胞株（ＳＫ－ＭＥＬ－２、Ｕ８７ＭＧ、及びＴ９８Ｇ）に対するＰＢＭＣ媒介性死滅効力を示す図である。 抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の存在下で観察された癌細胞株（ＳＫ－ＭＥＬ－２、Ｕ８７ＭＧ、及びＴ９８Ｇ）におけるＴリンパ球活性化を示す図である。

本発明の態様において、ＧＰＮＭＢに特異的に結合する第１のドメイン及びＣＤ３に特異的に結合する第２のドメインを含む二重特異性抗体が提供される。

本明細書で用いられる場合、用語「ＧＰＮＭＢ」は、糖タンパク質非転移性黒色腫タンパク質Ｂ（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｏｎ－Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ）の略語であり、乳癌及び黒色腫などの様々な癌を有する患者において過剰発現している糖タンパク質を指す。ＧＰＮＭＢの機能は今まで明確には解明されていないが、ＧＰＮＭＢの過剰発現が癌細胞において生じている。加えて、ＧＰＮＭＢは、動物、好ましくはヒト及びサルに存在するＧＰＮＭＢを指す。すなわち、用語「ヒトＧＰＮＭＢ」はヒト由来ＧＰＮＭＢを指し、用語「マウスＧＰＮＭＢ」はマウス由来ＧＰＮＭＢを指す。例えば、ヒトＧＰＮＭＢは、配列番号３７のアミノ酸配列を有し得る。

本明細書で用いられる場合、用語「ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３（ＣＤ３）」は、Ｔ細胞に発現したホモ二量体又はヘテロ二量体タンパク質を指し、それは、Ｔ細胞受容体複合体と会合し、Ｔ細胞活性化のための必須の要素である。機能性ＣＤ３は、４つの異なる鎖（ε、ζ、δ、及びγ）のうちの２つ以上の二量体会合により形成され、ＣＤ３二量体構成には、γ／ε、δ／ε、及びζ／ζが挙げられる。例えば、ヒトＣＤ３タンパク質（ε／δ）は配列番号３８のアミノ酸配列を有し得、ヒトＣＤ３タンパク質（ε）は配列番号３９のアミノ酸配列を有し得る。ＣＤ３に対する抗体は、Ｔ細胞に存在するＣＤ３に結合して、Ｔ細胞活性化を誘導することが知られている。加えて、ＣＤ３は、動物、好ましくはヒト及びサルに存在するＣＤ３を指す。すなわち、用語「ヒトＣＤ３」はヒト由来ＣＤ３を指し、「サルＣＤ３」はサル由来ＣＤ３を指す。

本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子、すなわち、抗原を特異的に認識する受容体として働くタンパク質分子を指す。抗体は、抗体全体及び抗体断片を包含する概念として用いられ得る。

本明細書で用いられる場合、用語「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原に同時に結合することができる抗体を指す。特に、二重特異性抗体が結合する抗原の型が適切に選択される場合、Ｔ細胞などの免疫細胞は、癌細胞などの特異的な標的細胞に対してのみ毒性を示すことができ、他の正常細胞に対して毒性を示し得ない。したがって、二重特異性抗体は、有害効果を最小化しながら、最大化された治療効果を示すことができ、それゆえに、Ｔ細胞媒介性死滅を必要とする処置に効果的に用いることができる。本発明による、ＣＤ３及びＧＰＮＭＢに特異的に結合する二重特異性抗体は、「抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体」と名づけられ得る。

本発明の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の実施形態において、抗体の可変領域の一方を形成する、ＧＰＮＭＢに特異的に結合する第１のドメイン、及び他方の可変領域を形成する、ＣＤ３に特異的に結合する第２のドメインを含む抗体が提供される。ここで、ＧＰＮＭＢに特異的に結合する第１のドメインは、ヒト及びサルＧＰＮＭＢとの交差反応性を有する可能性がある。加えて、ＣＤ３に特異的に結合する第２のドメインは、ヒト及びサルＣＤ３との交差反応性を有する可能性がある。

第１のドメイン及び第２のドメインにおいて、本発明の目的と一致した性質、例えば、それぞれ、ＧＰＮＭＢ及びＣＤ３に対する親和性及び特異性が維持される限り、いくつかのアミノ酸が置換、挿入、及び／又は欠失されてもよい。例えば、アミノ酸の保存的置換がそれに存在し得る。保存的置換は、本来のアミノ酸残基が、それに類似した性質を有する別のアミノ酸残基により置換されることを意味する。

例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジンは、それらが塩基性側鎖を有する点において類似した性質を有し、アスパラギン酸及びグルタミン酸は、それらが酸性側鎖を有する点において類似した性質を有する。加えて、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、及びトリプトファンは、それらが非荷電性極性側鎖を有する点において類似した性質を有し、アラニン、バリン、ロイシン、スレオニン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、及びメチオニンは、それらが非極性側鎖を有する点において類似した性質を有し、並びに、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びヒスチジンは、それらが芳香族側鎖を有する点において類似した性質を有する。

本発明の実施形態において、第１のドメインは、配列番号１、７、８、９、１０、及び１１からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ１；配列番号２のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ２；及び配列番号３のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号４のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ１；配列番号５又は１２のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ２；及び配列番号６のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。

本発明の実施形態において、第１のドメインは、配列番号１、７、８、９、１０、及び１１からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ１；配列番号２のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ２；及び配列番号３のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号４のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ１；配列番号５のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ２；及び配列番号６のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。

本発明の別の実施形態において、第１のドメインは、配列番号１のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ１；配列番号２のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ２；及び配列番号３のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号４のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ１；配列番号１２のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ２；及び配列番号６のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。

加えて、第１のドメインの重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、又は３１のアミノ酸配列により表され得る。加えて、第１のドメインの軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号３２又は３３のアミノ酸配列により表され得る。

加えて、第１のドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が互いにリンカーを介して連結されている、ｓｃＦｖ型を含み得る。ここで、アミノ酸リンカーが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を互いに連結させ得る限り、任意のアミノ酸リンカーがそのリンカーとして用いられ得る。例として、そのようなｓｃＦｖは、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５のいずれか１つのアミノ酸配列により表される配列を有し得る。

本発明の実施形態において、第２のドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ１；配列番号１４のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ２；及び配列番号１５のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；並びに配列番号１６のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ１；配列番号１７のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ２；及び配列番号１８のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。

加えて、第２のドメインの重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号４４、４５、又は４６のアミノ酸配列により表され得る。加えて、第２のドメインの軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号４２又は４３のアミノ酸配列により表され得る。

加えて、第２のドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が互いにリンカーを介して連結されている、ｓｃＦｖ型を含み得る。ここで、アミノ酸リンカーが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を互いに連結させ得る限り、任意のアミノ酸リンカーがそのリンカーとして用いられ得る。例として、そのようなｓｃＦｖは、配列番号４９又は配列番号５１のアミノ酸配列により表される配列を有し得る。加えて、前記アミノ酸配列をコードする核酸が、それぞれ、配列番号５０及び配列番号５２のヌクレオチド配列を有し得る。

本発明の実施形態において、第１のドメイン及び第２のドメインのそれぞれが、Ｆｃ領域をさらに含み得、前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ）に由来し得る。

本明細書で用いられる場合、用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の一部分を含有する、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。Ｆｃ領域は、通常、抗体の重鎖定常領域のＣＨ２及びＣＨ３を含有し得、Ｆｃ領域には、野生型Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域が挙げられ得る。

本発明の実施形態において、第１のドメイン及び第２のドメインにおけるＦｃ領域の一方はノブ（ｋｎｏｂ）構造を有し得、他方がホール（ｈｏｌｅ）構造を有し得る。例えば、第１のドメインのＦｃ領域がノブ構造を有する場合、第２のドメインのＦｃ領域はホール構造を有し得、第１のドメインのＦｃ領域がホール構造を有する場合、第２のドメインのＦｃ領域はノブ構造を有し得る。

本明細書で用いられる場合、用語「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）構造」は、ノブ構造が一方のＩｇ重鎖ＣＨ３領域に誘導され、且つホール構造が他方のＩｇ重鎖ＣＨ３領域に誘導され、前記２つの領域がヘテロ二量体を形成するのを可能にするように、２つの異なるＩｇ重鎖のそれぞれのＣＨ３領域に変異を誘導することにより得られる構造を指す。

典型的には、ノブ構造を形成するアミノ酸残基において、大きい側鎖を有する疎水性アミノ酸残基が、小さい側鎖を有する疎水性アミノ酸残基で置換され、ホール構造を形成するアミノ酸残基において、小さい側鎖を有する疎水性アミノ酸残基が、大きい側鎖を有する疎水性アミノ酸残基で置換される。しかしながら、本発明はそれに限定されない。

詳細には、置換は、第１のドメインのＦｃ領域におけるＣＨ３領域のいくつかのアミノ酸（Ｑ３４７Ｒ、Ｓ３５４Ｃ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ）についてなされ得、置換は、第２のドメインのＦｃ領域におけるＣＨ３領域のいくつかのアミノ酸（Ｙ３４９Ｃ、Ｋ３６０Ｅ、及びＫ４０９Ｗ）についてなされ得る。したがって、第１のドメイン及び第２のドメインは、ジスルフィド結合又はノブ・イントゥ・ホール構造を介して（ノブ・イントゥ・ホール構造が好ましい）互いに連結されて、二重特異性抗体を形成し得る。しかしながら、本発明はそれに限定されない。ここで、アミノ酸残基はＥＵナンバリングに従ってナンバリングされる。

ある実施形態において、ホール構造を有するＦｃ領域は配列番号４７のアミノ酸配列を有し得、ノブ構造を有するＦｃ領域は配列番号４８のアミノ酸配列を有し得る。したがって、第１のドメインは、配列番号４７又は配列番号４８のアミノ酸配列を有するＦｃ領域を含み得、その場合、第２のドメインは配列番号４８又は配列番号４７のアミノ酸配列を有するＦｃ領域を含み得る。

加えて、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２４３Ａ、Ｌ２４５Ａ）が、第１のドメイン及び第２のドメインのそれぞれのＦｃ領域に存在し得る。ＬＡＬＡ変異がＦｃ領域に存在する場合、その抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効力を示さない。したがって、その抗体は、ＧＰＮＭＢ発現細胞が含まれる癌細胞に対してのみ選択的毒性を示し得るが、他の正常細胞に対して毒性を示さない。ここで、アミノ酸残基はＥＵナンバリングに従ってナンバリングされる。

本発明の実施形態において、第１のドメインは、配列番号３４又は３５のアミノ酸配列によって表され得、第２のドメインは、配列番号３６、４０、又は４１のアミノ酸配列によって表され得る。

加えて、本発明の態様において、第１のドメインのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、及び第２のドメインのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供される。ある実施形態において、第１のドメインのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５３又は配列番号５４の核酸配列であり得る。

ポリヌクレオチドは、二重特異性抗体のアミノ酸配列から当業者により容易に導かれ得る。

加えて、本発明の別の態様において、第１のドメインをコードするポリヌクレオチド及び第２のドメインをコードするポリヌクレオチド、それぞれを含む、発現ベクターが提供される。

本明細書で用いられる場合、用語「発現ベクター」は、宿主細胞において標的タンパク質を発現することができる組換えベクターを指し、挿入された遺伝子が発現するように、作動可能に連結された必須の制御エレメントを含有する遺伝子構築物を意味する。第１のドメイン及び第２のドメインのアミノ酸配列をコードするそれぞれのポリヌクレオチドは、別々のベクターへ挿入されている、又は単一のベクターへ挿入されている形をとって用いられ得る。

本明細書で用いられる場合、用語「作動可能に連結された」は、核酸発現制御配列、及び所望のタンパク質をコードする核酸配列が、所望の機能を実施するように機能的に連結されていることを意味する。組換えベクターに関する作動可能な連結は、当技術分野においてよく知られた遺伝子組換え技術を用いて達成され得、部位特異的ＤＮＡ切断及びライゲーションは、当技術分野において一般的に知られた酵素等を用いて容易に達成され得る。

様々な発現宿主／ベクターの組合せが、二重特異性抗体を発現するために用いられ得る。真核生物宿主に適した発現ベクターには、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、及びレトロウイルスに由来した発現調節配列等が挙げられるが、それらに限定されない。細菌宿主に用いられ得る発現ベクターには、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から得られる細菌プラスミド、例えば、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、及びそれらの誘導体；ＲＰ４などの幅広い宿主範囲を有するプラスミド；並びに同類のものが挙げられる。

加えて、本発明の態様において、発現ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。第１のドメインをコードするポリヌクレオチド及び第２のドメインをコードするポリヌクレオチド、それぞれを含む発現ベクターが、それぞれ、宿主細胞へ挿入されて、形質転換体を形成し得る。前記ベクターについての適切な宿主細胞には、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、及びシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）などの原核細胞が挙げられ得る。宿主細胞には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母を含む真核細胞、及び昆虫細胞などのより高等真核細胞が挙げられ得る。

加えて、宿主細胞はまた、植物又は哺乳動物に由来し得る。好ましくは、用いられ得る宿主細胞には、サル腎細胞（ＣＯＳ７細胞）、ＮＳＯ細胞（マウス起源の骨髄腫細胞）、ＳＰ２／０細胞（マウス起源の骨髄腫細胞）、他の骨髄腫細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＭＤＣＫ、ＨｕＴ ７８細胞及びＨＥＫ２９３細胞等が挙げられるが、それらに限定されず、ＣＨＯ細胞が好ましい。

その一方で、本発明の別の態様において、抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を作製するための方法であって、宿主細胞を培養するステップ、及び抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３抗体を精製するステップを含む方法が提供される。

詳細には、二重特異性抗体を作製するための方法は、第１のドメインをコードするポリヌクレオチド及び第２のドメインをコードするポリヌクレオチドをベクターへ挿入して、組換えベクターを構築するステップ、前記組換えベクターを宿主細胞へ形質転換し、培養を実施するステップ、並びに前記培養された形質転換体から二重特異性抗体を分離及び精製するステップを含み得る。

二重特異性抗体は、組換えベクターが発現している形質転換体を栄養培地において培養することにより大量に作製することができ、前記培地及び培養条件は、宿主細胞の型に依存して、当技術分野において知られたものから適切に選択され得る。培養中、温度、培地のｐＨ、及び培養時間などの条件は、細胞成長及びタンパク質の大量生産に適しているように適切に調整され得る。

加えて、本発明の態様において、二重特異性抗体又はその断片を含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。

二重特異性抗体は、ＣＤ３発現Ｔ細胞及びＧＰＮＭＢ発現癌細胞に特異的に結合することができる。ここで、癌は、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、膵癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、甲状腺癌、頭頚部癌、胃癌、膀胱癌、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、黒色腫、白血病、神経芽細胞腫、及び神経膠芽腫からなる群から選択される１つ又は複数であり得る。しかしながら、癌は、それらに限定されず、ＧＰＮＭＢが発現している任意の癌を含み得る。ここで、二重特異性抗体は、ＣＤ３との特異的結合を通してＴ細胞を誘導し、それにより、ＧＰＮＭＢ発現癌細胞の死を誘導し、又はその増殖を阻害し得る。

医薬組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含み得る。薬学的に許容できる担体として、結合剤、流動促進剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定剤、懸濁剤、色素及び香料等が経口投与に用いられ得、バッファー、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張剤及び安定剤等が注射用混合物に用いられ得、基剤、賦形剤、滑沢剤及び保存剤等が局所投与用に用いられ得る。

医薬組成物の調製は、上記のような薬学的に許容できる担体と混合することにより、様々な方法で調製され得る。例えば、経口投与について、医薬組成物は、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハース、又は同類のものの形をとって製剤化され得る。注射について、医薬組成物は、単位用量アンプル又は反復剤形の形で製剤化され得る。

医薬組成物は、癌細胞若しくはその転移を処置するための、又は癌成長を阻害するための薬学的有効量で投与され得る。有効量は、癌の型、患者の年齢、体重、性質、及び症状の重症度、現在の治療の型、処置の回数、剤形、並びに投与経路などの様々な因子に依存して異なり得、対応する分野の専門家によって容易に決定され得る。

医薬組成物は、上記で述べられた薬理学的又は生理学的コンポーネントと一緒に又は逐次的に投与され得、追加の従来の治療剤と組み合わせて投与されてもよく、その場合、医薬組成物は、従来の治療剤と逐次的に又は同時に投与され得る。そのような投与は、単回又は複数回投与であり得る。上記の因子の全部を考慮して、最小量であり、且つ有害効果なしに最大効果が得られることを可能にする量を投与することが重要であり、そのような量は、当業者により容易に決定され得る。

本発明において、医薬組成物を対象に投与するステップを含む、癌を予防又は治療するための方法が提供される。

本明細書で用いられる場合、用語「対象」は、医薬組成物の投与により軽減、阻害、又は処置され得る状態又は疾患を患っている又はそのリスクがある哺乳動物、好ましくはヒトを指す。

本明細書で用いられる場合、用語「投与」は、所定の物質を対象へ任意の適切な様式で導入することを意味し、医薬組成物は、経路が、医薬組成物が標的組織に達するのを可能にする限り、任意の経路を介して投与され得る。そのような投与方法には、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺投与、又は直腸投与が挙げられ得るが、それらに限定されない。ここで、経口投与される場合において、タンパク質が消化される観点から、活性物質がコーティングされ、又はその組成物が胃における消化から保護されるような様式で経口用の組成物を製剤化することが望ましくあり得る。加えて、医薬組成物は、活性成分がそれの標的細胞へ移動することができるように任意のデバイスによって投与される場合がある。

加えて、本発明において、癌を予防又は治療するための医薬の製造のための医薬組成物の使用が提供される。

以下、本発明は、次の実施例を通して、より詳細に記載される。しかしながら、次の実施例は、例示の目的のものに過ぎず、本発明の範囲はそれらに限定されない。

実施例１．抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の作製
実施例１．１．抗ＧＰＮＭＢ抗体の選択
ＧＰＮＭＢ特異的抗体を選択するために、遺伝子組換え技術を用いて、大腸菌に寄生しているバクテリオファージのゲノムへ、発現することになっているＤＮＡ配列を挿入した。その後、ファージディスプレイ技術を用いて、挿入された遺伝子を、ファージコートタンパク質の１つと融合した形でファージ表面に発現させた。

合成ファージディスプレイｓｃＦｖライブラリーの最終的に増幅された集団から単一コロニーを収集した。引き続いて、そのコロニーを、ＯＤ６００値が約０．８～１．０に達するまで、１．５ｍＬのＳＢ／カルベニシリン中、３７℃及び２２０ｒｐｍで培養し、その後、１ｍＭ ＩＰＴＧ、３０℃、及び２００ｒｐｍの条件下で１２時間以上、培養した。この反応産物を、５，５００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、その後、各上清のみを、ＧＰＮＭＢ抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートへ加えた。引き続いて、プレートを室温で２時間、反応させておき、ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で４回、洗浄した。その後、１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ中のＨＲＰ／抗ｈＦａｂ－ＨＲＰコンジュゲートの１：５０００希釈物をそのプレートに加え、室温で１時間、反応を進行させた。引き続いて、プレートを、再び、ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で４回、洗浄した。その後、ＴＭＢ溶液をそのプレートに加え、５～１０分間、反応を進行させ、ＴＭＢ停止溶液をそれに加えた。

引き続いて、ＴＥＣＡＮ Ｓｕｎｒｉｓｅを用いて、４５０ｎｍの測定波長においてＯＤ値を読み取り、高いＯＤ値を有するクローンを、個々のクローンとして得た。結果として、ヒトＧＰＮＭＢに特異的に結合する２３個のクローンが選択され、そのアミノ酸配列を同定した。選択されたクローンを用いて、ＧＰＮＭＢ発現癌細胞株に対するそれらの結合能をチェックした。結果として、たった１個のクローンが前記細胞株に結合したことが同定された。これに基づいて、親和性成熟によって、タンパク質結合能及び細胞結合能が増強している６個のクローンを、追加として得た。

結果として、ＧＰＮＭＢタンパク質及びＧＰＮＭＢ発現癌細胞株に結合する合計７個のクローンが得られ、その選択されたクローンをそれぞれ、クローンＧＰＮＭＢ１（配列番号５５）、クローンＧＰＮＭＢ２（配列番号５６）、クローンＧＰＮＭＢ３（配列番号５７）、クローンＧＰＮＭＢ４（配列番号５８）、クローンＧＰＮＭＢ５（配列番号５９）、クローンＧＰＮＭＢ６（配列番号６０）、及びクローンＧＰＮＭＢ７（配列番号６１）と名づけた。

クローンの可変領域配列は、それぞれ、配列番号２６～３３に示されており、Ｋａｂａｔナンバリングに従って同定された、各可変領域におけるＣＤＲアミノ酸配列は下記の表１に示されている。

加えて、抗ＧＰＮＭＢ抗体の中で最も高い親和性を示すクローンＧＰＮＭＢ６（配列番号１８）を、ノブ・イントゥ・ホール構造を有するように形成した。

実施例１．２．抗ＣＤ３抗体の選択
ヒト及びサルＣＤ３に特異的な抗体を選択するために、マウスＳＰ３４抗体をヒト化し、様々な親和性でＣＤ３に結合する抗体を選択した。これらの中で、配列番号３６のアミノ酸配列からなるクローンＡ１５、及び配列番号４１のアミノ酸配列からなるクローンＥ１５が得られた。加えて、配列番号４０のアミノ酸配列を有する抗体（Ｈｕ３８Ｅ４．ｖ１、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより製造された）を作製し、用いた。加えて、二重特異性抗体について、抗ＣＤ３抗体（Ｈｕ３８、Ａ１５、又はＥ１５）を、ノブ・イントゥ・ホール構造を有するように形成した。

実施例１．３．抗体発現のためのベクターの導入
トランスフェクションの２４時間前に、２．０×１０^６細胞／ｍｌの密度のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、振盪インキュベーター中１２５±１０ｒｐｍ、３７℃及び８％ＣＯ_２において、Ｅｘｐｉ２９３培地を用いて継代した。トランスフェクションの時点において、細胞数及び細胞生存率を測定して、９５％以上の細胞生存率が示されているかどうかを同定した。細胞を、５００ｍＬ培養フラスコ中５×１０^８細胞で分配し、その後、最終体積を１７０ｍＬ（２００ｍＬに基づいている）に調整するようにＥｘｐｉ２９３培地を加えた。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地を用いて、２００μｇの抗体発現ベクターを、それと混合して、合計１，５００μｌにし、室温で５分間、培養を実施した。

Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地を用いて、５４０μｌのトランスフェクション試薬を、それと混合して、合計１，５００μｌにし、室温で５分間、培養を実施した。ベクター及びトランスフェクション試薬、それぞれを含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地を穏やかに混合し、室温で２０分間、反応させた。その後、その反応生成物を、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を含有するフラスコに入れた。振盪インキュベーター中１２５±１０ｒｐｍ、３７℃及び８％ＣＯ_２において１６～２０時間、培養を実施した。その後、１ｍｌのトランスフェクションエンハンサーＩ及び１０ｍｌのトランスフェクションエンハンサーＩＩをそれに加え、培養を６日間、実施して、候補抗体を得た。

実施例１．４．抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の作製
培養物を、４，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、その後、細胞片を除去して、上清を得た。１ｍｌのＭａｂｓｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ樹脂をカラムに加え、樹脂体積の１０倍に対応する体積でのプロテインＡ結合バッファーを用いて、平衡が達成された。

引き続いて、上清をカラムへ重力を利用して負荷した。負荷が完了した後、カラムを、樹脂体積の１０倍に対応する体積でのプロテインＡ結合バッファーを用いて洗浄した。引き続いて、ＩｇＧ溶出バッファーをカラムに加え、溶出を実施した。溶出液を、１ｍｌの溶出液あたり２５μｌの１．５Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌを加えることにより中和し、その後、濃度をＯＤ２８０ｎｍにおいて測定した。濃度が測定されている溶出液を、透析によるＰＢＳでのバッファー交換に供した。

次に、試料を、約１．０ｇ／Ｌ～２．０ｇ／Ｌへ濃縮又は希釈し、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ９００におけるＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８９８９３３５）に負荷した。２００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．０）を移動相として用い、１．０ｍｌ／分の流速で流した。その後、試料負荷から約５０～７０分後に溶出された画分を採取した。溶出された画分を、４％～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、０３２１ＢＯＸ）を用いるＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅでの染色に供し、その後、１５０ｋＤａサイズの抗体を含有する画分をそこから採取した。引き続いて、３０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ、ＵＦＣ８０３０２４）を用いて、画分を濃縮した。

図１は、抗ＧＰＮＭＢ抗体断片（配列番号２２）及び抗ＣＤ３抗体断片（配列番号１）を含む二重特異性抗体に関して、同時発現及び精製を実施することにより、１５０ｋＤａに対応するタンパク質試料が獲得されていることを示す結果を図示する。

実施例１．５．ＨＰＬＣ分析による二重特異性抗体の純度の同定
ＨＰＬＣ分析のために、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ６．０）を平衡バッファーとして用い、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ６．０）に塩化ナトリウムを５００ｍＭの濃度まで加え、その後、０．４５μｍボトルトップフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ、５９７－４５２０）での濾過を実施することにより得られた溶液を、溶出バッファーとして用いた。ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、２６９５／２４８９）へ陽イオンカラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、０５４９９３）を接続し、その後、平衡バッファーを用いて平衡を達成した。分析されるべき試料を、平衡バッファー中に１０倍以上に希釈して、負荷試料を調製した。平衡バッファーが０．５ｍｌ／分で１０分間、流れるような様式で移動相を分析し、その後、溶出バッファーを、０％～１００％の線形濃度勾配法で４０分間に渡って流した。分析が完了した後、ＵＶ２８０ｎｍで測定されたクロマトグラムにおける面積を計算して、純度を同定した。

図１に図示されているような結果が得られている精製されたタンパク質試料にＨＰＬＣ分析を実施した。結果として、ＧＰＮＭＢ／ＣＤ３二重特異性抗体試料に抗ＧＰＮＭＢ抗体断片及び抗ＣＤ３抗体断片がほとんど存在していないことが同定された（図２）。

実施例２．ＧＰＮＭＢタンパク質に対する二重特異性抗体の親和性の分析
精製された二重特異性抗体の組換えヒトＧＰＮＭＢに対する定量的結合能（親和性）を、バイオセンサーであるＢｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて測定した。ＨＥＫ２９３細胞から精製されたＧＰＮＭＢを、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアミン－カルボキシル反応を用いて、２００ Ｒｍａｘが得られるまで固定した。次に、ＨＢＳ－ＥＰバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％表面活性剤Ｐ２０）中に連続希釈されたＧＰＮＭＢ／ＣＤ３二重特異性抗体を、０．０７８ｎＭ～５ｎＭの濃度範囲において１２０秒間、前記チップに結合させ、３０μＬ／分の流速で１８００秒間、流して、解離に達した。ＧＰＮＭＢに結合した抗体の解離は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ １．５）を３０μＬ／分の流速で３０秒間、流すことにより誘導された（表２）。親和性は、動力学的速度定数（Ｋ_ｏｎ及びＫ_ｏｆｆ）及び平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）としてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００評価ソフトウェアを用いて得られた（表３）。

実施例３．ＧＰＮＭＢ発現細胞及びＣＤ３発現細胞に対する二重特異性抗体の親和性の分析
実施例３．１．ヒトＧＰＮＭＢ発現癌細胞株に対する二重特異性抗体の親和性の分析
二重特異性抗体がＧＰＮＭＢ発現細胞に対して親和性を示すかどうかを、フローサイトメトリーを用いて同定した。詳細には、各チューブが１００μｌのＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）を含有する５ｍｌのチューブを調製し、その各チューブに３つの型の癌細胞株（ＳＫ ＭＥＬ２、Ｕ８７ＭＧ、及びＴ９８Ｇ）のそれぞれを３×１０^５細胞の濃度で加え、各チューブを０．５μｇの一次抗体で処理した。その後、３０分間、光を遮断し、４℃でインキュベーションを実施した。引き続いて、それに１ｍｌのＦＡＣＳバッファーを加えた。１，５００ｒｐｍ、４℃で３分間、遠心分離を実施し、その後、上清を除去した。

次に、各チューブを、１００μｌのＦＡＣＳバッファーにおいて、前記一次抗体に特異的に結合することができる０．２μｇの蛍光色素標識二次抗体で処理した。その後、３０分間、光を遮断し、４℃でインキュベーションを実施した。引き続いて、それに１ｍｌのＦＡＣＳバッファーを加え、１，５００ｒｐｍ、４℃で３分間、遠心分離を実施し、その後、上清を除去して、試料を得た。その後、ＦＡＣＳバッファー：ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ（商標）＝１：４の比で調製された２００μｌのバッファーを、細胞が懸濁するように前記試料に加え、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにより分析を実施した。結果は図３に図示されている。

図３に示されているように、ＧＰＮＭＢ（配列番号１８）／Ａ１５（配列番号２０）二重特異性抗体が３つの型の癌細胞株に結合したことが見出された。無関係の対照として用いられた陰性対照抗体は、３つの型の癌細胞株のいずれとも結合しなかった。

実施例３．２．ヒトＣＤ３発現癌細胞株に対する二重特異性抗体の親和性の分析
実施例１により作製された二重特異性抗体がＣＤ３発現細胞に対しても親和性を示すかどうかを、フローサイトメトリーを用いて同定した。詳細には、各チューブが１００μｌのＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）を含有する５ｍｌのチューブを調製し、その各チューブに細胞株ジャーカットを３×１０^５細胞の濃度で加え、各チューブを０．５μｇの一次抗体で処理した。その後、３０分間、光を遮断し、４℃でインキュベーションを実施した。引き続いて、それに３ｍｌのＦＡＣＳバッファーを加え、１，５００ｒｐｍ、４℃で３分間、遠心分離を実施し、その後、上清を除去した。

次に、各チューブを、１００μｌのＦＡＣＳバッファーにおいて、前記一次抗体に特異的に結合することができる０．２μｇの蛍光色素標識二次抗体で処理した。その後、３０分間、光を遮断し、４℃でインキュベーションを実施した。引き続いて、それに１ｍｌのＦＡＣＳバッファーを加え、１，５００ｒｐｍ、４℃で３分間、遠心分離を実施し、その後、上清を除去して、試料を得た。その後、ＦＡＣＳバッファー：ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ（商標）＝１：４の比で調製された２００μｌのバッファーを、細胞が懸濁するように前記試料に加え、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにより分析を実施した。結果は図３に図示されている。

図３に図示されているように、ＧＰＮＭＢ（配列番号３５）／Ａ１５（配列番号３６）二重特異性抗体が細胞株ジャーカットに結合したことが見出された。無関係の対照として用いられた陰性対照抗体は、３つの型の癌細胞株のいずれとも結合しなかった。

実施例４．腫瘍細胞株に対する二重特異性抗体の細胞死滅効力の評価
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及び実施例１により作製された二重特異性抗体を用いて、二重特異性抗体の３つの型のＧＰＮＭＢ＋腫瘍細胞（ＳＫ－ＭＥＬ－２、Ｕ８７ＭＧ、及びＴ９８Ｇ）に対するＧＰＮＭＢ特異的腫瘍細胞死滅効力を、下記のような方法に従って同定した。

実施例４．１．標的細胞株の構築
３つの型のＧＰＮＭＢ＋腫瘍細胞（ＳＫ－ＭＥＬ－２、Ｕ８７ＭＧ、及びＴ９８Ｇ）を、１×トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を用いて収集し、１，２００ｒｐｍ、４℃で５分間、遠心分離した。引き続いて、上清を除去し、ｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、Ａ１０４９１－０１＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ β－ＭＥ）において再懸濁を実施した。その後、細胞の数を定量化した。各細胞株懸濁液を、１．０×１０^５細胞／ｍｌの濃度で調製し、６ウェルプレートに１ｍｌ／ウェルで加え、プレートをＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で１日間、インキュベートして、細胞株を調製した。次に、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄレンチウイルス試薬（ＥＦ－１アルファプロモーター、ピューロマイシン選択）を用いて、ＭＯＩ３（感染多重度３）で形質導入を実施した。

実施例４．２．標的細胞株の調製
詳細には、細胞を、１×トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を用いて収集し、１，２００ｒｐｍ、４℃で５分間、遠心分離した。引き続いて、上清を除去し、ｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、Ａ１０４９１－０１＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ β－ＭＥ）において再懸濁を実施した。その後、細胞数を定量した。各細胞株懸濁液を、１×１０^５細胞／ｍｌの濃度で調製し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで加え、プレートをＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で１日間、インキュベートして、標的細胞株を調製した。

実施例４．３．末梢血単核球の調製
凍結保存した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、水浴中、３７℃で急速解凍し、その後、５０ｍｌコニカルチューブへ移した。解凍培地（ＲＰＭＩ、１１８７５－０９３＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ β－ＭＥ）をそのチューブに滴下し、振盪させながら、混合を実施した。その後、１，２００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離を実施することにより上清を除去し、３０ｍｌの解凍培地において再懸濁を実施した。その後、細胞の数を定量化し、濃度が１．０×１０^６細胞／ｍｌに調整されるように、それぞれのドナーについて細胞をｃＲＰＭＩ中に懸濁した。

実施例４．４．末梢血単核球及び抗体のプレーティング
各抗体をｃＲＰＭＩ中に希釈し、その後、２０ｎＭから始めて１／５希釈した。１日前に標的細胞を播種したウェルに抗体を適用した。その後、予め調製されたＰＢＭＣの１００μｌ／ウェルを、標的：ＰＢＭＣ＝１：１０（ＳＫ－ＭＥＬ－２）又は１：２０（Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ）の比が得られるように、そのウェルに加えた。

実施例４．５．ＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３を用いたリアルタイム細胞画像分析
ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２日間、インキュベーションを実施しながら、ＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３を用いて、明視野及び赤色蛍光を２時間の間隔で１０×倍率において測定した。測定結果から、二重特異性抗体が３つの型のＧＰＮＭＢ発現癌細胞に対して用量依存的様式で細胞死滅効力を示すことが同定された（図４）。反対に、無関係のＡｂをＡ１５抗体に連結することにより得られた二重特異性抗体（無関係／Ａ１５）は細胞死を誘導しなかった。他方、ＧＰＮＭＢ（配列番号３５）／Ａ１５（配列番号３６）と類似した細胞結合能を示したサードパーティ抗体及びＡ１５（配列番号３６）を用いて、二重特異性抗体を作製し、その細胞死滅効力を同定した。結果として、この二重特異性抗体がクローンＧＰＮＭＢより低い効力を示すことが同定された。このことに基づいて、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体としてのＧＰＮＭＢ抗体（配列番号３５）が有効なエピトープを認識することが示されている。

実施例５．二重特異性抗体により引き起こされるＴ細胞活性の測定
実施例１に従って作製された二重特異性抗体により引き起こされるＴ細胞活性化の程度を分析するために、二重特異性抗体のＴ細胞活性化能を、ＧＰＮＭＢを過剰発現する３つの癌細胞株（ＳＫ ＭＥＬ２、Ｕ８７ＭＧ、及びＴ９８Ｇ）に対する細胞株ＩＬ２－ｌｕｃ２Ｐジャーカット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、分析した。

詳細には、ＧＰＮＭＢ発現ＳＫ ＭＥＬ２、Ｕ８７ＭＧ、及びＴ９８Ｇ細胞をそれぞれ、１００μｌの培地を用いて、９６ウェルプレートへウェルあたり３×１０^４細胞で播種し、加湿インキュベーターにおいて、３７℃及び５％ＣＯ_２で１８時間、インキュベートして、標的細胞株を調製した。ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）Ｆｒｏｚｅｎ Ｔｈａｗ ａｎｄ Ｕｓｅ（ＦＴＵ）ＩＬ－２－ｌｕｃ２Ｐジャーカットエフェクター細胞を、水浴中３７℃で２分間、溶解した。４ｍＬの予熱されたアッセイ培地（１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地）を１５ｍＬコニカル遠心チューブへ加え、その後、１ｍｌの溶解したエフェクター細胞をそのチューブに加えた。緩徐に混合して、エフェクター細胞株を調製した。次に、７５μｌの培地を、標的細胞が播種されている９６ウェルプレートから除去し、２５μｌのＦＴＵ ＩＬ２－Ｌｕｃ２Ｐジャーカット細胞を、そのプレートへウェルあたり１×１０^５細胞で加えた。

３×用量で１０個の点が得られるように、抗体を、１０ｎＭから始めて１／３希釈することにより調製した。その後、１０個の濃度での２５μｌの調製された抗体を、１×用量が達成されるようにＦＴＵ ＩＬ２－Ｌｕｃ２Ｐジャーカット細胞を含有する予め調製された９６ウェルプレートへ加えた。加湿インキュベーターにおいて３７℃及び５％ＣＯ_２で５時間、インキュベーションを実施した。その後、プレートをインキュベーターから取り出し、室温で１０～１５分間、静置した。引き続いて、ウェルあたり７５μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を加え、プレートを５分間、静置した。その後、ＧｌｏＭａｘ（商標）Ｍｕｌｔｉ＋マルチウェルプレートリーダーを用いて測定を実施した。測定結果から、全ての３つの型の癌細胞においてＴ細胞活性化が二重特異性抗体により引き起こされたことが見出され、抗体のＣＤ３に対する親和性が減少するにつれて、ＥＣ_５０値が増加したことが観察された。無関係なＡｂ及びＨｕ３８を用いて作製された二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性を誘導しなかった（図５）。

図３に示されているように、ＧＰＮＭＢ（配列番号３５）／Ａ１５（配列番号３６）二重特異性抗体が３つの型の癌細胞株に結合したことが見出された。無関係の対照として用いられた陰性対照抗体は、３つの型の癌細胞株のいずれとも結合しなかった。

図３に図示されているように、ＧＰＮＭＢ（配列番号３５）／Ａ１５（配列番号３６）二重特異性抗体が細胞株ジャーカットに結合したことが見出された。無関係の対照として用いられた陰性対照抗体は、細胞株ジャーカットに結合しなかった。

Claims (27)

1. ＧＰＮＭＢに特異的に結合する第１のドメイン、及び
   ＣＤ３に特異的に結合する第２のドメイン
   を含む、抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
2. 第１のドメインが、配列番号１、７、８、９、１０、又は１１のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ１；配列番号２のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ２；及び配列番号３のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号４のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ１；配列番号５又は１２のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ２；及び配列番号６のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ３；を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
3. 第１のドメインが、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がリンカーを介して互いに連結されている可変領域を有する、請求項２に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
4. 第１のドメインの可変領域が、配列番号１９～２５からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
5. 第２のドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ１；配列番号１４のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ２；及び配列番号１５のアミノ酸配列により表されるＨ－ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１６のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ１；配列番号１７のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ２；及び配列番号１８のアミノ酸配列により表されるＬ－ＣＤＲ３；を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
6. 第２のドメインが、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がリンカーを介して互いに連結されている可変領域を有する、請求項５に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
7. 第２のドメインの可変領域が、配列番号４９又は配列番号５１のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
8. 第１のドメインがＦｃ領域をさらに含む、請求項１に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
9. 第２のドメインがＦｃ領域をさらに含む、請求項１に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
10. Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ）に由来する、請求項８又は９に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
11. 第１のドメイン及び第２のドメインにおけるＦｃ領域の一方がノブ構造を有し、他方がホール構造を有する、請求項８又は９に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
12. 第１のドメインが、配列番号４７又は４８のアミノ酸配列により表されるＦｃ領域を含む、請求項８に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
13. 第２のドメインが、配列番号４８又は４７のアミノ酸配列により表されるＦｃ領域を含む、請求項９に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
14. 第１のドメインが配列番号３４又は３５のアミノ酸配列により表される、請求項１に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
15. 第２のドメインが配列番号３６、４０、又は４１のアミノ酸配列により表される、請求項１に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
16. Ｔ細胞及びＧＰＮＭＢ発現癌細胞に特異的に結合する、請求項１に記載の抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
17. 請求項１における第１のドメインのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
18. 請求項１における第２のドメインのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
19. 請求項１７に記載のポリヌクレオチドを入れられた発現ベクター。
20. 請求項１８に記載のポリヌクレオチドを入れられた発現ベクター。
21. 請求項１９に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
22. 請求項２０に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
23. 抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を作製するための方法であって、
    請求項２１又は２２に記載の宿主細胞を培養するステップ、及び
    抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３抗体を精製するステップ
    を含む方法。
24. 癌を予防又は治療するための医薬組成物であって、
    抗ＧＰＮＭＢ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含み、
    前記二重特異性抗体が、ＧＰＮＭＢに特異的に結合する第１のドメイン及びＣＤ３に特異的に結合する第２のドメインを含む、医薬組成物。
25. 癌が、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、膵癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、甲状腺癌、頭頚部癌、胃癌、膀胱癌、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、黒色腫、白血病、神経芽細胞腫、及び神経膠芽腫からなる群から選択される１つ又は複数である、請求項２４に記載の医薬組成物。
26. 請求項２４に記載の医薬組成物を対象に投与するステップ
    を含む、癌を予防又は治療するための方法。
27. 癌を予防又は治療するための医薬の製造のための請求項２４に記載の医薬組成物の使用。

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