TW202317631A - 抗crtam抗體及其應用 - Google Patents

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肖揚
蔣美玲
李婷婷
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Abstract

本發明涉及抗體藥物技術領域，尤其涉及抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，包含抗CRTAM抗體或其抗原結合片段的藥物組合物以及它們的應用。本發明的抗CRTAM抗體具有顯著的抗腫瘤活性，可在製備抗腫瘤的藥物中應用。

Description

抗CRTAM抗體及其應用
本發明涉及抗體藥物技術領域，尤其涉及一種抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，包含抗CRTAM抗體或其抗原結合片段的藥物組合物以及它們的應用。
CRTAM(Class-I MHC-restricted T cell associated molecule)為免疫球蛋白超家族(IgSF)的一員，是主要表達於激活後的CD8+T細胞和NK細胞上的共刺激性靶點，它的配體是Nectin-like 2 (Necl-2)。CRTAM的表達嚴格受到TCR (T cell receptor)激活的調控，僅表達於激活的免疫細胞上。在健康人的PBMC (Peripheral blood mononuclear cell)中表達量很低，在哮喘病人的PBMC中高表達。CRTAM的啓動子和IL-2一樣受到AP-1轉錄因子的調控。CRTAM激活後會刺激CD8+T細胞分泌IFN-γ以及增强CD8+T細胞和NK細胞的殺傷能力。同時，有文獻報道CRTAM能夠影響CD4+T細胞的極化，在MHC和TCR結合激活後，促進CD4+T細胞的進一步分化，提高IFN-γ、IL-17、IL-22等細胞因子的分泌能力。CRTAM的配體Necl-2又被稱為TSLC1( The tumor suppressor in lung cancer-1)和CADM1，是Necl家族的一員，nectin和necl是非鈣離子依賴的細胞粘附分子，Necl-2與CRTAM結合能夠激活T細胞、NK細胞產生殺傷作用。在腫瘤細胞上Necl-2的表達會逐漸减少至沉默，這被認為是另一條腫瘤逃逸的機制。
文獻表明，Necl-2在腫瘤細胞的表達會抑制腫瘤細胞的生長和侵襲；同時Necl-2與CRTAM結合能夠進一步激活CD8+T細胞和NK細胞，提高免疫細胞的殺傷能力。Necl-2和CRTAM通路與PD1-PDL1通路不重合且具備互補的作用。腫瘤細胞會藉由下調Necl-2蛋白的表達達到免疫逃逸的目的。
CRTAM是一個全新、安全的免疫共刺激分子，具有潜在的實體瘤治療能力，因此研究開發CRTAM激動性抗體具有重要的意義。
本發明一方面提供一種抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含重鏈可變區的互補決定區1(HCDR1)、重鏈可變區的互補決定區2(HCDR2)和/或重鏈可變區的互補決定區3(HCDR3)，所述輕鏈可變區包含輕鏈可變區的互補決定區1(LCDR1)、輕鏈可變區的互補決定區2(LCDR2)和/或輕鏈可變區的互補決定區3(LCDR3)。
在一些實施方案中，本發明提供一種抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中：
(1)所述重鏈可變區包含選自如下組的HCDR1、HCDR2和HCDR3： (a1)如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列； (a2)如SEQ ID NO: 8、9和10所示的胺基酸序列； (a3)如SEQ ID NO: 8、11和10所示的胺基酸序列； (a4)如SEQ ID NO: 16、17和18所示的胺基酸序列； (a5)如SEQ ID NO: 22、23和24所示的胺基酸序列； (a6)如SEQ ID NO: 22、25和24所示的胺基酸序列；和 (a7)與(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)或(a6)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和/或
(2)所述輕鏈可變區包含選自如下組的LCDR1、LCDR2和LCDR3： (b1)如SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列； (b2)如SEQ ID NO: 7、5和6所示的胺基酸序列； (b3)如SEQ ID NO: 12、13和14所示的胺基酸序列； (b4)如SEQ ID NO: 15、13和14所示的胺基酸序列； (b5)如SEQ ID NO: 19、20和21所示的胺基酸序列； (b6)如SEQ ID NO: 26、27和28所示的胺基酸序列； (b7)與(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 1、2和3或與SEQ ID NO: 1、2和3所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，和所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO:4、5和6、SEQ ID NO: 7、5和6或與SEQ ID NO:4、5和6或SEQ ID NO: 7、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或
所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 8、9和10、SEQ ID NO: 8、11和10或與SEQ ID NO: 8、9和10或SEQ ID NO: 8、11和10所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 12、13和14、SEQ ID NO: 15、13和14或與SEQ ID NO: 12、13和14或SEQ ID NO: 15、13和14所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或
所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 16、17和18或與SEQ ID NO: 16、17和18所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 19、20和21或與SEQ ID NO: 19、20和21所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或
所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 22、23和24、SEQ ID NO: 22、25和24或與SEQ ID NO: 22、23和24或SEQ ID NO: 22、25和24所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 26、27和28或與SEQ ID NO: 26、27和28所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86和SEQ ID NO: 87，SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91和SEQ ID NO: 92，SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91或SEQ ID NO: 92經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91或SEQ ID NO: 92功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91或SEQ ID NO: 92具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:80經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:80功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:80具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:81經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:81功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:81具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86和SEQ ID NO: 87，SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90和SEQ ID NO: 91，SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90或SEQ ID NO: 91經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90或SEQ ID NO: 91功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90或SEQ ID NO: 91具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:87經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:87功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:87具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:90經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:90功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:90具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或者
所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:87經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:87功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:87具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:92經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:92功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:92具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53和SEQ ID NO: 54，SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66和SEQ ID NO: 67，SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:45經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:45功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:45具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:46經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:46功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:46具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:106經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:106功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:106具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:46經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:46功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:46具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53和SEQ ID NO: 54，SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65和SEQ ID NO: 66，SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65或SEQ ID NO: 66經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65或SEQ ID NO: 66功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65或SEQ ID NO: 66具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:51經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:51功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:51具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:66經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:66功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:66具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或者
所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:51經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:51功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:51具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:67經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:67功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:67具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74和SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78和SEQ ID NO: 79，SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:68經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:68功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:68具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:69經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:69功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:69具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74和SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78和SEQ ID NO: 79，SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:75經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:75功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:75具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:77功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:77具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53和SEQ ID NO: 54，SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66和SEQ ID NO: 67，SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:45經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:45功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:45具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:46經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:46功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:46具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:106經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:106功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:106具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:46經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:46功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:46具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53和SEQ ID NO: 54，SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65和SEQ ID NO: 66，SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65或SEQ ID NO: 66經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65或SEQ ID NO: 66功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65或SEQ ID NO: 66具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:51經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:51功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:51具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:66經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:66功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:66具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或者
所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:51經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:51功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:51具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:67經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:67功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:67具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100和SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100或SEQ ID NO: 101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100或SEQ ID NO: 101功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100或SEQ ID NO: 101具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104和SEQ ID NO: 105，SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:93經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:93功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:93具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:94經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:94功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:94具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99和SEQ ID NO: 100，SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99或SEQ ID NO: 100經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99或SEQ ID NO: 100功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99或SEQ ID NO: 100具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104和SEQ ID NO: 105， SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:104經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:104功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:104具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或者
所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:104經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:104功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:104具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 1、2和3，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO:4、5和6，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:80經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:80功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:80具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:81經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:81功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:81具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 1、2和3，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO:4、5和6，所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86和SEQ ID NO: 87，SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90和SEQ ID NO: 91，SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90或SEQ ID NO: 91經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90或SEQ ID NO: 91功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90或SEQ ID NO: 91具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 1、2和3，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO:4、5和6，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:87，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:90。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 1、2和3，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO:7、5和6，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:87經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:87功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:87具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:92經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:92功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:92具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:7、5和6所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供一種抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 8、9和10，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 12、13和14，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:45經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:45功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:45具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 8、9和10所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:46經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:46功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:46具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 12、13和14所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 8、11和10，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 12、13和14，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:106經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:106功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:106具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 8、11和10所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:46經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:46功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:46具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 12、13和14所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 8、11和10，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 12、13和14，所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53和SEQ ID NO: 54，SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 8、11和10所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65和SEQ ID NO: 66，SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65或SEQ ID NO: 66經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65或SEQ ID NO: 66功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65或SEQ ID NO: 66具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 12、13和14所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 8、11和10，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 12、13和14，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:51，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:66。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 8、11和10，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 15、13和14，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:51經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:51功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:51具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 8、11和10所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:67經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:67功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:67具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 15、13和14所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供一種抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 16、17、18，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 19、20、21，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:68經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:68功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:68具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 16、17、18所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:69經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:69功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:69具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 19、20、21所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 16、17、18，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 19、20、21，所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74和SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 16、17、18所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78和SEQ ID NO: 79，SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 19、20、21所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 16、17、18，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 19、20、21，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:75經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:75功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:75具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 16、17、18所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:77功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:77具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 19、20、21所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 22、23和24，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 26、27和28，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:93經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:93功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:93具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 22、23和24所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:94經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:94功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:94具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 26、27和28所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 22、23和24，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 26、27和28，所述重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99和SEQ ID NO: 100，SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99或SEQ ID NO: 100經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99或SEQ ID NO: 100功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99或SEQ ID NO: 100具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 22、23和24所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104和SEQ ID NO: 105， SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 26、27和28所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 22、23和24，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 26、27和28，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 22、23和24所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:104經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:104功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:104具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 26、27和28所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 22、25和24，所述輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 26、27和28，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 22、25和24所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:104經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:104功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:104具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 26、27和28所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，本發明提供抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是鼠源單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或完全人抗體。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗CRTAM抗體為鼠源抗體，其還含有鼠源的IgG1、IgG2a、、IgG2b、IgG2c、IgG3或其變體的重鏈恆定區，和鼠源的κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些較佳的實施方案中，所述的抗CRTAM嵌合抗體或其抗原結合片段的抗體重鏈進一步包含鼠源IgG1、IgG2a、、IgG2b、IgG2c、IgG3或其突變序列的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1或IgG2重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後顯著降低ADCC (抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG4恆定區。
在一些實施方案中，本發明提供一種抗CRTAM人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈包含人源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，所述輕鏈包含人源的κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些較佳的實施方案中，本發明的抗CRTAM人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1或IgG2或其變體的重鏈恆定區，和人源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，所述抗CRTAM抗體或抗原結合片段是Fc沉默的工程化IgG1抗體或抗原結合片段，所述Fc沉默的工程化IgG1抗體或抗原結合片段具有降低的與Fc受體結合或者不與Fc受體結合。在另一個實施方案中，所述抗體是IgG4抗體。
在一些實施方案中，所述抗CRTAM抗體或抗原結合片段是介導T細胞細胞毒性和/或NK細胞細胞毒性的雙特異性抗體或抗原結合片段。
在一些實施方案中，所述抗CRTAM抗體或抗原結合片段能夠誘導和/或增强免疫細胞的活化。在一個較佳的實施方案中，所述免疫細胞是T細胞。在另一較佳的實施方案中，所述免疫細胞是NK細胞。
在一些實施方案中，所述抗CRTAM抗體或抗原結合片段是雙特異性或多特異性抗體或抗原結合片段，其與CRTAM蛋白結合並且與一個或多個另外的結合靶結合，較佳地所述另外的結合靶是一種或多種腫瘤抗原。在一些具體的實施方案中，所述一個或多個另外的結合靶是免疫調節分子。
在一些實施方案中，本發明提供抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗原結合片段為Fab、Fab'、Fv、scFv、F(ab')2、F(ab)2、dAb或單結構域抗體。
本發明的另一方面提供一種分離的核酸，其編碼根據本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含：
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91或SEQ ID NO: 92的核苷酸序列。
在一些較佳的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含：
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 80的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 81的核苷酸序列；或者
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 87的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 90或SEQ ID NO: 92的核苷酸序列。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含：
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67的核苷酸序列。
在一些較佳的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含：
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO: 106的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 46的核苷酸序列；或者
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 51的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67的核苷酸序列。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含：
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79的核苷酸序列。
在一些較佳的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含：
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 68的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 69的核苷酸序列；或者
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 75的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 77的核苷酸序列。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含：
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100或SEQ ID NO: 101的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105的核苷酸序列。
在一些較佳的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含：
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 93的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 94的核苷酸序列；或者
編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 99或SEQ ID NO:101的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 104的核苷酸序列。
本發明的另一方面提供一種表達載體，其表達本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段。根據本發明的表達載體其包含本發明的分離的核酸分子。
本發明的另一方面提供一種嵌合抗原受體(CAR)融合蛋白，其包含本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，所述嵌合抗原受體融合蛋白包含本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其為針對CRTAM抗原的VH和VL的單鏈可變片段(scFv)。所述針對CRTAM抗原的VH和VL的scFv具有以上實施方案中描述的重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3和輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本發明的另一方面提供一種如上所述的表達載體轉化的宿主細胞。
在一些實施方案中，根據本發明的宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。在一些實施方案中，所述的宿主細胞為細菌，較佳為大腸杆菌。在另一個較佳的實施方案中，所述的宿主細胞為哺乳動物細胞。
本發明的另一方面提供製備本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段的方法，包括在所述宿主細胞中表達抗體以及從宿主細胞中分離所述抗體的步驟。
本發明的另一方面提供一種藥物組合物，其包含本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段和藥學可接受的載體。在一些實施方案中，本發明提供藥物組合物，其包含本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，還包含其他活性組分，如其他抗體、靶向藥物等。在一些實施方案中，所述藥學可接受的載體選自抗氧化劑、多肽、蛋白質、親水性聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、糖醇、離子和表面活性劑。在一個具體的實施方案中，所述藥學可接受的載體為緩衝水溶液。在另一個具體的實施方案中，所述藥學可接受的載體為脂質體的形式。
可以將本發明的抗CRTAM人源化抗體或其抗原結合片段與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合製備成藥物製劑，以適合於經口或胃腸外給藥。給藥方法包括，但不限於經口、皮內、肌內、腹膜內、靜脉內、腦內、眼內、氣管內、皮下、鼻內途徑。所述製劑可以藉由任何途徑施用，例如藉由輸注或推注，藉由經上皮或皮膚粘膜(例如口腔粘膜或直腸等)吸收的途徑施用。給藥可以是全身的或局部的。所述製劑可藉由本領域已知的方法製備，且包含藥物製劑領域常規使用的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明的另一方面提供治療癌症的方法，所述方法包括向有此需要的個體施用本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物。
本發明的另一方面提供本發明的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物在製備預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用。在一些實施方案中，所述腫瘤選自肺癌、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、睾丸癌、甲狀腺癌、骨癌、宮頸癌、子宮癌、腎癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤、皮膚癌、前列腺癌、鼻咽癌、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、肉瘤和神經內分泌腫瘤。在一些實施方案中，所述腫瘤選自小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黑素瘤、肝細胞癌、血液系統惡性腫瘤、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌和神經膠質瘤。
本發明提供的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段具有顯著的抗腫瘤作用，不影響CRTAM與其配體的結合，不影響其正常功能，同時人源化後的抗體免疫原性大大降低，有效消除人體免疫系統對外源性單抗的排異反應，可在製備用於治療各類腫瘤疾病的藥物中應用，具有廣闊的市場前景。
定義
除非另有定義，本文中使用的科學和技術術語的含義是本領域技術人員所通常理解的含義。本文中所述的細胞和組織培養、分子生物學以及蛋白質和寡或多核苷酸化學及雜交中使用的命名和技術是本領域習知且普遍使用的。對於重組DNA、寡核苷酸合成和組織培養與轉化(如電穿孔、脂質轉染)，使用了標準技術。酶促反應和純化技術根據生產商的說明書或本領域普遍使用或本文所述的方法進行。前述技術和方法通常根據本領域習知且本說明書中引用和討論的多部綜合和較具體的文獻中描述的那樣使用。參見例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約冷泉港(1989))。本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥學化學中使用的命名以及實驗室方法和技術是本領域習知且普遍使用的。
在本發明中，術語“至少80%序列同一性”是指至少80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%的序列同一性。在本發明中，術語“至少85%序列同一性”是指至少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%的序列同一性。在一些較佳的實施方案中，本發明所述的序列同一性可以至少為90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%。兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以藉由National Center For Biotechnology Instutute網站上的BLASTN/BLASTP算法來進行。
在抗體分子中，輕鏈的三個高變區和重鏈的三個高變區在三維空間中以相對彼此的位置排列以形成抗原結合表面。抗原結合表面與所結合抗原的三維表面互補，且每條重鏈和輕鏈的三個高變區均被稱作“互補決定區”或“CDR”。胺基酸向每個結構域的分配是根據Kabat《免疫學感興趣的蛋白質的序列》(國立衛生研究院，馬裏蘭州貝塞斯達(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196: 901-917(1987)，Chothia等，Nature 342: 878-883(1989)定義。
本發明的“抗體”是指特異性地識別並結合抗原的多肽或多肽複合物。抗體可以是完整抗體和其任何抗原結合片段或單鏈。本發明的“抗體”包括含有Ig分子的具有結合抗原的生物活性的至少一部分的任何蛋白質或肽。本發明“抗體”的實例包括但不限於重鏈或輕鏈的CDR或其配體結合部分、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、框架區或其任何部分。
本發明所述的“抗原結合片段”是指具有抗原結合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段及與人CRTAM結合的Fv片段、scFv片段。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)。本發明的抗CRTAM抗體可以是單鏈可變區片段(scFv)，其源自抗體的單鏈多肽，保留了結合抗原的能力。scFv的實例包括藉由重組DNA技術形成的抗體多肽，其中免疫球蛋白重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)片段的Fv區經由間隔序列連接。製備scFv的各種方法是本領域技術人員所熟知的。
本發明所述的抗體指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即包含特異性結合抗原(與其免疫反應)的抗原結合位點的分子。“特異性結合”指抗體與抗原的一種或多種抗原決定簇反應而不與其他多肽反應或以很低的親和性(Kd＞10-6)結合其他多肽。抗體包括但不限於多克隆、單克隆、嵌合、dAb(結構域抗體)、單鏈、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、scFv及Fab表達文庫。單克隆抗體(mAb)是由單一的克隆細胞株得到的抗體，所述的細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的克隆細胞株。單克隆抗體或抗原結合片段可以用如雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術及合成技術如CDR grafting或其它現有技術進行重組得到。
本發明所述的“鼠源抗體”為根據本領域知識和技能製備的對人CRTAM的單克隆抗體。製備時用hCRTAM抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。
本發明所述的“嵌合抗體”是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以减輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從小鼠雜交瘤細胞中克隆可變區基因，再根據需要克隆人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。
本發明所述的“人源化抗體”也稱為CDR移植抗體，是將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架(FR)中產生的抗體。此類可變區框架序列可以從公共的DNA數據庫或公開的參考文獻獲得，例如從ImMunoGeneTics (IMGT)網站http: //imgt.cines.fr得到或從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
下面代表性的實施例是為了更好地說明本發明，而非用於限制本發明的保護範圍。以下實施例中未註明條件的實驗方法通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手册、分子克隆手册等，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件進行。實施例中使用的材料、試劑如無特殊說明均為商購獲得。
實施例1：CRTAM抗體相關抗原蛋白及陽性對照抗體的製備
1、抗原蛋白及陽性對照抗體的表達載體構建
(1)抗原蛋白的表達載體構建
合成編碼人源CRTAM蛋白全長的基因片段，胺基酸序列設計如SEQ ID NO:29所示。將其核苷酸序列克隆至真核表達質粒pTargetT上，獲得其表達質粒pT-hCRTAM。
合成編碼猴源CRTAM蛋白全長的基因片段，胺基酸序列設計如SEQ ID NO:33所示。將其核苷酸序列克隆至真核表達質粒pTargetT上，獲得其表達質粒pT-cCRTAM。
融合的人源CRTAM蛋白胞外區和mIgG1-Fc標簽的胺基酸序列如SEQ ID NO:30所示。對人源CRTAM蛋白胞外區序列進行密碼子優化後，合成帶有標簽的hCRTAM-mFc的核苷酸序列，並將克隆至真核表達質粒pHR上，獲得其表達質粒pHR-hCRTAM-mFc。
融合的人源CRTAM蛋白胞外區和hIgG1-Fc或His標簽的胺基酸序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示，對上述胺基酸序列進行密碼子優化後合成帶有標簽的hCRTAM-hFc和hCRTAM-His的核苷酸序列，並將其分別克隆至真核表達質粒pHR上，獲得其表達質粒pHR-hCRTAM-hFc、pHR-hCRTAM-His。
融合的猴源CRTAM蛋白胞外區和mIgG1-Fc標簽的胺基酸序列如SEQ ID NO:34所示。對猴源CRTAM蛋白胞外區序列進行密碼子優化後，合成帶有標簽的cCRTAM-mFc的核苷酸序列，並將克隆至真核表達質粒pHR上，獲得其表達質粒pHR-cCRTAM-mFc。
融合的猴源CRTAM蛋白胞外區和hIgG1-Fc或His標簽的胺基酸序列如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示，對上述胺基酸序列進行密碼子優化後合成帶有標簽的cCRTAM-hFc和cCRTAM-His的核苷酸序列，並將其分別克隆至真核表達質粒pHR上，獲得其表達質粒pHR-cCRTAM-hFc、pHR-cCRTAM-His。
融合的鼠源CRTAM蛋白胞外區和mIgG1-Fc標簽的胺基酸序列如SEQ ID NO:37所示。對鼠源CRTAM蛋白胞外區序列進行密碼子優化後，合成帶有標簽的mCRTAM-mFc的核苷酸序列，並將克隆至真核表達質粒pHR上，獲得其表達質粒pHR-mCRTAM-mFc。
融合的鼠源CRTAM蛋白胞外區和hIgG1-Fc或His標簽的胺基酸序列如SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示，對上述胺基酸序列進行密碼子優化後合成帶有標簽的mCRTAM-hFc和mCRTAM-His的核苷酸序列，並將其分別克隆至真核表達質粒pHR上，獲得其表達質粒pHR-mCRTAM-hFc、pHR-mCRTAM-His。
(2)配體蛋白的表達載體構建
融合的人源CADM1蛋白胞外區和mIgG1-Fc標簽的胺基酸序列如SEQ ID NO:40所示，對上述胺基酸序列進行密碼子優化後合成帶有標簽的CADM1-mFc的核苷酸序列。將其克隆至真核表達質粒pHR上，獲得其表達質粒pHR- CADM1-mFc。
融合的人源CADM1蛋白胞外區和hIgG1-Fc或His標簽的胺基酸序列如SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示，對上述胺基酸序列進行密碼子優化後合成帶有標簽的CADM1-hFc和CADM1-His的核苷酸序列，並將其分別克隆至真核表達質粒pHR上，獲得其表達質粒pHR- CADM1-hFc、pHR- CADM1-His。
(3)陽性對照抗體的表達載體構建
使用PCT申請WO2019/086878中公開的人源化抗體5A11(本文簡稱5A11)作為陽性對照抗體。參照WO2019/086878中公開的方法製備5A11。5A11的胺基酸序列如下所示：
5A11重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:43；
5A11輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:44；
對5A11抗體所對應的胺基酸序列進行密碼子人工優化，將其輕、重鏈基因片段分別克隆到真核表達質粒pHR上，獲得5A11的重鏈真核表達質粒pHR-5A11-hG1m，輕鏈表達質粒pHR-5A11-hλ。
2、抗原蛋白的表達與純化
(1)表達抗原蛋白的穩定轉染細胞株構建
將真核表達質粒pT-hCRTAM在160 V電壓，15 msec的方形脉衝下以電轉的方式轉染到CHO-K1細胞(中國科學院上海細胞生物學研究所)，置於37 ℃，5% CO 2濃度的培養箱中培養。24 h後採用含1000 µg/mL G418(Gibco，#10131-027)的培養基進行加壓培養。轉染16天后採用流式細胞術檢測轉染pool的陽性率，將陽性率較高的pool的細胞進行鋪板(按照1×10 6個/mL的細胞密度，100 µL/孔，鋪96孔板)，採用5A11抗體和Goat pAb to Hu IgG (PE) (Abcam, ab98596)抗體與細胞孵育，以流式細胞儀(ACEABIO, Novocyte 2060R)檢測392 nm波長下mean值，使用GraphPad生成進行數據分析。將陽性細胞株進行亞克隆，挑選出高表達hCRTAM蛋白的克隆化的CHO-K1細胞株，命名為CHO-K1-hCRTAM。
將真核表達質粒pT-cCRTAM在160 V電壓，15 msec的方形脉衝下以電轉的方式轉染到CHO-K1細胞(中國科學院上海細胞生物學研究所)，置於37 ℃，5% CO 2濃度的培養箱中培養。24 h後採用含1000 µg/mL G418(Gibco，#10131-027)的培養基進行加壓培養。轉染16天后採用流式細胞術檢測轉染pool的陽性率，將陽性率較高的pool的細胞進行鋪板(按照1×10 6個/mL的細胞密度，100 µL/孔，鋪96孔板)，採用5A11抗體和Goat pAb to Hu IgG (PE) (Abcam, ab98596)抗體與細胞孵育，以流式細胞儀(ACEABIO, Novocyte 2060R)檢測392 nm波長下mean值，使用GraphPad生成進行數據分析。將陽性細胞株進行亞克隆，挑選出高表達cCRTAM蛋白的克隆化的CHO-K1細胞株，命名為CHO-K1-cCRTAM。
(2)標簽抗原蛋白的表達
在1L細胞培養瓶中接種密度為1 × 10 6個/ml的293E細胞(來源於ATCC)，加入新鮮的預熱的FreeStyle293培養基，使接種後總體積達到250 mL，置37 ℃，8% CO 2，加濕的細胞搖床中100 rpm培養過夜。取7.5 mL FreeStyle293培養基，加入1 mg/mL的PEI溶液500 µL，混合均勻，靜置5 min，同時取250 µg待轉染質粒加入8 mL FreeStyle293培養基中，混合均勻，靜置5 min，其中標簽抗原蛋白質粒pHR-hCRTAM-mFc、pHR-hCRTAM-hFc、pHR-hCRTAM- His、pHR-cCRTAM-mFc、pHR-cCRTAM-hFc、pHR-cCRTAM- His、pHR-mCRTAM-mFc、pHR-mCRTAM-hFc、pHR-mCRTAM- His、pHR- CADM1-mFc、pHR- CADM1-hFc、pHR- CADM1-His分別轉染，陽性對照抗體5A11重鏈質粒pHR-5A11-hG1m和輕鏈質粒pHR-5A11-hλ按照質量比1.1 ：1共同轉染。將PEI與FreeStyle293培養基的混合溶液加入到質粒中，混合均勻，室溫靜置20 min，然後加入細胞培養物中，置37℃，8% CO 2，加濕的細胞搖床中100 rpm培養。在細胞轉染後第1天和第3天對細胞進行補料，每瓶加入12.5 mL的OPM-CHO PFF05(上海奧浦邁生物科技有限公司，F81279)、5 mL的葡萄糖(母液濃度為180 g/L)和2.5 mL的穀胺醯胺(母液濃度為200 mM)。當細胞活力降至75 % 時，收集細胞上清。將細胞培養物2000 rpm離心5 min，收集上清，再6000 rpm離心20 min，收集上清，分別使用0.45 µm和0.22 µm的濾杯過濾，收集濾液保存於4 ℃冰箱待純化。
(3)親和層析柱純化
利用AKTA(GE，AKTA pure-150)根據蛋白性質採用親和層析柱進行純化(不同蛋白適配的親和層析柱見表1)，具體純化步驟如下： 表1 不同蛋白適配的親和層析柱
蛋白屬性 適配管柱 品牌 型號
鼠單抗mab Protein G 預裝柱 博格隆 Ezfast Protein G/4FF
His標簽蛋白 NI 柱預裝柱 GE His Trap, HP/5 mL
hFc/ mFc標簽蛋白、嵌合抗體、人源化抗體 Protein A 預裝柱 GE Hi Trap, Mabselect SuRe/5 mL
Protein A 自裝柱 GE Mabselect LX/18 mL
清洗：超純水清洗設備及管路2 min，流速10 mL/min，後用0.1 M NaOH清洗層析系統；
接柱：將層析柱接入層析設備，並用超純水沖洗5 min；後用0.1 M NaOH沖洗30 min，保留時間5 min；
平衡：20 mM PB+ 0.15 M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV(柱體積)；
上樣：將細胞表達上清上樣，保留時間5 min；
後平衡：20 mM PB+ 0.15 M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV；
洗脫：50 mM醋酸，pH =3.4洗脫，保留時間5 min。UV280至50 mAu左右時開始收集，降至50 mAu左右時停止收集。用1 M Tris-HCl，pH 9.0將樣品pH調節至7.0；
再平衡：20 mM PB+ 0.15 M NaCl，pH 7.2 平衡3個CV，保留時間5 min；
在線清洗：0.1 M NaOH清洗30 min，保留時間5 min；
清洗保存：純化水清洗10 min，後20 %乙醇2個CV。
實施例2：抗CRTAM單克隆抗體的製備
1、雜交瘤單克隆的製備
(1)動物免疫
採用不同標簽的hCRTAM抗原蛋白與佐劑共同免疫實驗動物，或採用CHO-K1-hCRTAM細胞株進行細胞免疫。實驗動物包括Balb/c品系小鼠、SJL品系小鼠和SD大鼠。蛋白免疫：小鼠免疫按照首次免疫50 µg抗原免疫一隻小鼠，後期均使用抗原蛋白25 µg/只；SD大鼠免疫按照首次免疫100 µg抗原免疫一隻大鼠，後期均使用抗原蛋白50 µg/只。免疫佐劑可以是弗氏佐劑(Sigma)或Quick Antibody-Mouse5W(Q5W，北京博奧龍免疫技術有限公司)。採用弗氏佐劑乳化抗原，將不同標簽的hCRTAM抗原蛋白樣品逐滴加入到佐劑溶液中，邊滴加邊渦旋以充分混合，佐劑使用劑量參考說明書進行。混合均勻形成油包水的乳狀後免疫。採用Quick Antibody-Mouse5W作為佐劑，將不同標簽的hCRTAM抗原蛋白樣品與Quick Antibody-Mouse5W按照1:1的體積比進行混合，混勻後即採用肌肉注射的方式，免疫SD大鼠。細胞免疫：CHO-K1-hCRTAM細胞使用PBS重懸，小鼠免疫按照1 × 10 7個細胞/只；SD大鼠免疫按照2 × 10 7個細胞/只。免疫方案如表2所示。 表2 動物免疫方案
組別 抗原 佐劑 品系 免疫方式
P1 hCRTAM-his(Acro，CRM-H52H3) 弗氏佐劑 Balb/c i.p./i.m.
P2 hCRTAM-his(Acro，CRM-H52H3) 弗氏佐劑 Balb/c i.m./s.c.
P3 hCRTAM-his(Acro，CRM-H52H3) Q5W Balb/c s.c.
P4 hCRTAM-his(Acro，CRM-H52H3) Q5W SD s.c.
P5 hCRTAM-his Q5W SJL s.c.
P6 hCRTAM-mFc 弗氏佐劑 SJL i.p./s.c.
P7 CHO-K1-hCRTAM Cells / SJL i.p.
P8 hCRTAM-mFc 弗氏佐劑 Balb/c i.p./s.c.
P9 CHO-K1-hCRTAM Cells / SD i.p.
*i.m. 肌內注射；s.c.皮下注射；i.p. 腹腔注射。
(2)雜交瘤融合
脾細胞的獲取和製備：將加强免疫後的小鼠/大鼠處死後浸泡75%的酒精中，解剖取出脾臟，用研磨棒研磨後，經細胞篩網過濾後製備成單細胞懸液。將脾細胞懸液2000 rpm離心5 min，棄上清。加入2 mL紅細胞裂解液，室溫裂解紅細胞2 min，加入PBS至20 mL，1500 rpm離心7 min，棄上清，重懸後進行活細胞計數。收集培養瓶中的Sp2/0細胞，1000 rpm離心5 min後棄上清，重懸後進行活細胞計數。按脾細胞 ：Sp2/0細胞 =1.6 ：1的比例混合細胞，1500 rpm離心7 min後棄上清。用20 mL電轉緩衝液重懸細胞，1500 rpm 離心7 min。棄上清，重複一次。分別用適量電轉緩衝液重懸細胞，保證細胞濃度2×10 7個細胞/mL左右。把細胞懸液加入9 mL 電轉融合槽中融合。融合後將細胞懸液轉入到含有20% FBS的15 mL RPMI 1640完全培養基中，室溫放置20 min。用含1×HAT、1×BIOMYC3、20% FBS的RPMI 1640培養基重懸融合細胞。按100 µL/孔將細胞懸液加到若干塊96孔細胞培養板中，保證每孔細胞量約為4×10 4個細胞/孔，置於37 ℃細胞培養箱中培養。5天后補加100 µL/孔RPMI 1640完全培養基(含20% FBS，1×HAT，1×BIOMYC-3)。
(3)雜交瘤及亞克隆篩選
融合一周後，取雜交瘤母克隆的細胞培養上清，藉由ELISA篩選結合hCRTAM蛋白和cCRTAM蛋白的雜交瘤母克隆，進一步藉由流式細胞術篩選出能結合CHO-K1-hCRTAM細胞株的母克隆。
藉由ELISA和FACS篩選出結合能力較强的母克隆，利用有限稀釋法將陽性母克隆進行亞克隆，培養一周後利用ELISA檢測亞克隆上清與hCRTAM蛋白的結合活性，進而獲得分泌抗hCRTAM抗體的單克隆細胞株。獲得多個較好的單克隆細胞株，分別標記為C68、C94、C110、C124。
2、單克隆抗體的製備
根據亞克隆上清活性分析結果確定單克隆抗體細胞株，將其擴大培養。培養條件是含有10% FBS、1×NAEE、1×丙酮酸鈉、1%青鏈黴素雙抗的1640培養基。待細胞匯合度大於＞80%時，進將細胞傳代擴培，待培養至約50 mL時收集上清，純化抗體。獲得抗體經SDS-PAGE凝膠電泳確定純度良好。
3、單克隆抗體測序
將經亞克隆操作的陽性雜交瘤細胞進行擴大培養，取適量細胞按RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen，74134)試劑盒說明書提取總RNA，利用Prime Script 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara，6110A)反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。
根據抗體可變區兩端保守序列設計通用引物(5’端含有用於與真核表達載體發生同源重組的同源臂序列)，以cDNA為模板進行抗體可變區基因的PCR擴增，從而分別獲得鼠抗輕鏈與重鏈可變區的基因片段；設計引物(參考文獻：1. Anke Krebber, Susanne Bornhauser, Jorg Burmester et al. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of Immunological Methods, 1997, 201: 35–55; 2. Simon KorenMihaKosmačAnjaColjaVenturinietal. Antibody variable-region sequencing as a method for hybridoma cell-line authentication, 2008, 78: 1071–1078)，進行DNA測序獲得序列。鼠抗測序結果見表3。 表3 抗CRTAM鼠源單克隆抗體序列
抗體 重鏈可變區 胺基酸序列 輕鏈可變區 胺基酸序列 HCDR1、HCDR2、 HCDR3 LCDR1、LCDR2、 LCDR3
C68 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO: 8、9、10 SEQ ID NO: 12、13、14
C94 SEQ ID NO:68 SEQ ID NO:69 SEQ ID NO: 16、17、18 SEQ ID NO:19、20、21
C110 SEQ ID NO:80 SEQ ID NO:81 SEQ ID NO: 1、2、3 SEQ ID NO: 4、5、6
C124 SEQ ID NO:93 SEQ ID NO:94 SEQ ID NO: 22、23、24 SEQ ID NO: 26、27、28
實施例3：抗CRTAM嵌合抗體的構建
將純化後(純化步驟見實施例1)的小鼠抗體重鏈與輕鏈可變區基因片段分別與線性化的含有人抗體重鏈或輕鏈恆定區的真核表達質粒pHR-hG1m/pHR-hλ共轉化大腸杆菌DH5α感受態細胞。將混合液均勻塗布於含有胺苄抗生素的瓊脂平板表面，於37 ℃恆溫培養箱倒置過夜培養後分別挑取若干單菌落進行DNA測序。將測序正確的嵌合抗體分別標記為C68CHI、C94CHI、C110CHI、C124CHI。抗體C68CHI、C94CHI、C110CHI、C124CHI的重鏈可變區胺基酸序列和輕鏈可變區胺基酸序列與相應的鼠源抗體C68、C94、C110、C124相同。
將嵌合抗體重輕鏈質粒共轉染HEK293E細胞，表達純化獲得嵌合抗體，然後進行純度檢測、活性分析及親和力測定。
利用定點突變的方法，將嵌合抗體C68CHI進行基因突變，以篩選更佳的抗體。C68CHI重鏈可變區第53位N突變為S，抗體穩定性提高，標記為C68CHIm1。C68CHIm1的重鏈可變區胺基酸序列為SEQ ID NO:106，輕鏈可變區胺基酸序列為SEQ ID NO:46，HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 8、11和10，LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO: 12、13和14。嵌合抗體序列見表4。 表4 抗CRTAM嵌合抗體序列表
嵌合抗體名稱 重鏈胺基酸序列 輕鏈胺基酸序列
C68CHI SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:48
C94CHI SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:71
C110CHI SEQ ID NO:82 SEQ ID NO:83
C124CHI SEQ ID NO:95 SEQ ID NO:96
C68CHIm1 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:48
實施例4：抗CRTAM人源化抗體的構建及生產
根據嵌合抗體的免疫活性分析，選擇C68CHIm1、C94CHI、C110CHI、C124CHI等多個活性好的嵌合抗體進行人源化抗體改造。
抗體的人源化改造，首先是藉由與免疫基因數據庫(IMGT)中的小鼠抗體序列進行比對，確認C68CHIm1、C94CHI、C110CHI、C124CHI抗體可變區的鼠源種系，經過同源比對，C68CHIm1、C94CHI、C110CHI、C124CHI抗體的重鏈可變區序列的FR區分別與小鼠抗體種系基因(IGHV3-2*02、IGHV5-9-1*01、IGHV1-85*01、IGHV1-9*01)最為相似；抗體輕鏈可變區的FR序列則分別與小鼠抗體(IGKV1-110*01、IGKV10-96*01、IGKV1-110*01、IGKV5-48*01)最為相似。以C68CHIm1、C94CHI、C110CHI、C124CHI抗體框架區序列FR1-FR3作為模板，在人框架區庫中尋找3D結構相似但是免疫原性較低的全人框架替代C68CHIm1、C94CHI、C110CHI、C124CHI的FR1-FR3序列，重鏈/輕鏈全長序列進行3D建模並和原抗體重鏈/輕鏈序列進行結構比對分析，綜合考慮抗原性和3D結構相似度，最終選擇C68CHIm1的5條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO:50~54)和12條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO:55~59、60~66)、C94CHI的4條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO:72~75)和4條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO:76~79)、C110CHI的4條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO:84~87)和5條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO:88~91)以及C124CHI的4條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO:97~100)和4條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO:102~105)進行下一步優化。C68CHIm1、C94CHI、C110CHI、C124CHI的人源化抗體非CDR區序列均達到95%以上人源化。
挑選純度、活性和親和力均較好的人源化抗體，分別標記為HuC68-16、HuC94-31、HuC110-32、HuC124-22，序列見表5。 表5 抗CRTAM人源化抗體序列
人源化抗體 重鏈可變區 胺基酸序列 輕鏈可變區 胺基酸序列 HCDR1、HCDR2、 HCDR3 LCDR1、LCDR2、 LCDR3
HuC68-16 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:66 SEQ ID NO: 8、11、10 SEQ ID NO: 12、13、14
HuC94-31 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:77 SEQ ID NO: 16、17、18 SEQ ID NO:19、20、21
HuC110-32 SEQ ID NO:87 SEQ ID NO:90 SEQ ID NO: 1、2、3 SEQ ID NO: 7、5、6
HuC124-22 SEQ ID NO:99 SEQ ID NO:104 SEQ ID NO: 22、23、24 SEQ ID NO: 26、27、28
利用定點突變的方法，將人源化抗體HuC68-16、HuC110-32、HuC124-22進行基因突變，以篩選更佳的抗體。HuC68-16輕鏈可變區第34位G突變為K(參見SEQ ID NO:67)，抗體穩定性提高，標記為HuC68-17。HuC110-32輕鏈可變區第34位G突變為K(參見SEQ ID NO:92)，抗體穩定性提高，標記為HuC110-34。HuC124-22重鏈可變區第62位G突變為A(參見SEQ ID NO:101)，抗體穩定性提高，標記為HuC124-42。優化後抗體序列見表6。 表6 抗CRTAM人源化抗體優化後序列
人源化抗體 重鏈可變區胺 基酸序列 輕鏈可變區胺 基酸序列 HCDR1、HCDR2、HCDR3 LCDR1、LCDR2、LCDR3
HuC68-17 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:67 SEQ ID NO: 8、11、10 SEQ ID NO: 15、13、14
HuC110-34 SEQ ID NO:87 SEQ ID NO:92 SEQ ID NO: 1、2、3 SEQ ID NO: 7、5、6
HuC124-42 SEQ ID NO:101 SEQ ID NO:104 SEQ ID NO: 22、25、24 SEQ ID NO: 26、27、28
考慮到抗體的功能與穩定性，選擇合適的抗體亞型骨架與優化後的人源化抗體可變區進行匹配，構建完整的人源化抗體。將人源化抗體輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列反轉錄成相對應的核苷酸序列，根據表達宿主進行密碼子優化，並生成相鄰片段之間含有互補序列的寡核苷酸片段，藉由Overlap PCR將寡核苷酸片段退火後連接起來，再利用特異性引物(5’端含有用於與真核表達載體發生同源重組的同源臂序列)擴增出完整的輕鏈與重鏈可變區核苷酸片段；將純化後的輕鏈可變區核苷酸片段與線性化的含有人κ輕鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸杆菌DH5α感受態細胞，將純化後的重鏈可變區核苷酸片段與人IgG重鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸杆菌DH5α感受態細胞，分別將轉化質粒的感受態細胞均勻塗布於含有胺苄抗生素的瓊脂平板表面，於37℃恆溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單菌落進行DNA測序。
將測序正確的陽性克隆接種於含有胺苄抗生素的2×YT液體培養基中，於37℃振蕩培養12小時以上，然後收集菌體進行質粒提取，從而獲得人源化抗體輕鏈與重鏈表達質粒，使用核酸定量分析儀檢測質粒的濃度與純度。
將質粒轉染HEK293E細胞，表達純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。完整的人源化抗體序列見表7。 表7 抗CRTAM人源化抗體完整序列
人源化抗體 重鏈胺基酸序列 輕鏈胺基酸序列
HuC68-17 SEQ ID NO:107 SEQ ID NO:108
HuC94-31 SEQ ID NO:109 SEQ ID NO:110
HuC110-34 SEQ ID NO:111 SEQ ID NO:112
HuC124-42 SEQ ID NO:113 SEQ ID NO:114
實施例5：抗CRTAM抗體與人CRTAM結合活性測定(ELISA)
採用ELISA分析抗體的結合活性。將hCRTAM-His蛋白(1.5 µg/mL，50 µL/孔，實施例1中製得)包被到96孔酶標板，於37 ℃孵育2 h。用1 x PBST清洗3次後用含5 %脫脂牛奶的PBST 37 ℃封閉2 h。用1 x PBST清洗3次後，本發明的抗CRTAM抗體作為一抗從10 μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入酶標板(50 µL/孔)，共8個濃度，濃度分別為10000 ng/mL、2000 ng/mL、400 ng/mL、80 ng/mL、16ng/mL、3.2 ng/mL、0.64 ng/mL、0.128 ng/mL，37 ℃孵育1.5 h，對照抗體為5A11 (實施例1中製得)；用1 x PBST清洗3次後拍乾，二抗使用Anti-Human IgG HRP (Jackson，109-035-003，1: 5000，50 µL/孔)，37 ℃孵育1 h。用1xPBST清洗5次後拍乾，加入單組分TMB顯色液(索萊寶，PR1200，50 µL/孔)，避光顯色約5 min，加入2 M硫酸(50 µL/孔)終止，使用酶標儀(thermo，Multiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成EC50，結果如表8所示。 表8 抗CRTAM人源化抗體與人CRTAM結合活性
抗體名稱 HuC94-31 HuC110-34 HuC124-42 5A11
EC50(ng/mL) 11.41 11.17 9.91 38.18
實驗結果顯示，本發明的抗CRTAM抗體具有較好的與人CRTAM結合的能力。
實施例6：抗CRTAM抗體與食蟹猴CRTAM結合活性測定(ELISA)
採用ELISA分析抗體的結合活性。將cCRTAM-His蛋白(2 µg/mL，50 µL/孔，實施例1中製得)包被到96孔酶標板，於37 ℃孵育2 h。用1 x PBST清洗3次後用含5 %脫脂牛奶的PBST 37 ℃封閉2 h。用1 x PBST清洗3次後，本發明的抗CRTAM抗體作為一抗從10 μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入酶標板(50 µL/孔)，共8個濃度，濃度分別為10000 ng/mL、2000 ng/mL、400 ng/mL、80 ng/mL、16ng/mL、3.2 ng/mL、0.64 ng/mL、0.128 ng/mL，37 ℃孵育1.5 h，對照抗體為5A11 (實施例1中製得)；用1 x PBST清洗3次後拍乾，二抗使用Anti-Human IgG HRP (Jackson，109-035-003，1: 5000，50 µL/孔)，37 ℃孵育1 h。用1xPBST清洗5次後拍乾，加入單組分TMB顯色液(索萊寶，PR1200，50 µL/孔)，避光顯色約5 min，加入2 M硫酸(50 µL/孔)終止，使用酶標儀(thermo，Multiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成EC50，結果如表9所示。 表9 抗CRTAM抗體與食蟹猴CRTAM結合活性
抗體名稱 HuC94-31 HuC110-34 HuC124-42
EC50(ng/mL) 4.68 8.17 4.78
實驗結果顯示，本發明的抗CRTAM抗體具有較好的與食蟹猴CRTAM結合的能力。
實施例7：抗CRTAM抗體對CRTAM與其配體CADM1的阻斷活性測定(ELISA)
採用ELISA法分析抗體對人CRTAM與其配體CADM1的阻斷活性。將hCRTAM-His蛋白(1.5 µg/mL，50 µL/孔，實施例1中製得)包被到96孔酶標板，於37 ℃孵育2 h。用1 x PBST清洗3次後用含5 %脫脂牛奶的PBST 37 ℃封閉2 h。同時用biotin-NHS ester (biovsion，2347-50)標記配體蛋白hCADM1-His，標記好的配體命名為hCADM1-His-biotin。封閉好的酶標板用1 x PBST清洗3次後，配置濃度為20 µg/mL的hCADM1-His-biotin配體溶液，以上述配體溶液為稀釋液稀釋一抗，本發明的抗CRTAM抗體作為一抗從100 μg/mL開始，3倍梯度稀釋加入酶標板(50 µL/孔)，共8個濃度，濃度分別為100000 ng/mL、33333 ng/mL、11111 ng/mL、3704 ng/mL、1235 ng/mL、412 ng/mL、137 ng/mL、46 ng/mL，37 ℃孵育1.5 h，對照抗體為5A11 (實施例1中製得)；用1 x PBST清洗3次後拍乾，二抗使用Streptavidin-HRP (BD，554066，1: 10000，50 µL/孔)，37 ℃孵育1 h。用1xPBST清洗5次後拍乾，加入單組分TMB顯色液(索萊寶，PR1200，50 µL/孔)，避光顯色約5 min，加入2 M硫酸(50 µL/孔)終止，使用酶標儀(thermo，Multiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成IC50，結果如圖1所示。
實驗結果顯示，本發明的抗CRTAM抗體優於對照抗體5A11，幾乎不阻斷人CRTAM與CADM1的結合，不影響其正常功能。
實施例8：抗CRTAM抗體與細胞表面人CRTAM結合活性測定(FACS)
採用FACS分析抗體與CHO-K1-hCRTAM細胞表面的hCRTAM的結合活性。CHO-K1-hCRTAM細胞消化後，用2% FBS-PBS的溶液重懸，計數。將上述細胞按照每孔1.5 x10 5個細胞的方式鋪細胞板，本發明的抗CRTAM抗體作為一抗從20 μg/ml開始，5倍梯度稀釋加入細胞板，共8個濃度，濃度分別為20000 ng/mL、4000 ng/mL、800 ng/mL、160 ng/mL、32 ng/mL、6.4 ng/mL、1.28 ng/mL、0.26 ng/mL，4 ℃條件下孵育1.5 h，對照抗體為5A11；使用PBS清洗三次細胞後，二抗使用PE-Anti-Human IgG (Biolegend，Cat.No. 409303，1.25 μl/孔)4 ℃條件下孵育1 h；PBS三次洗滌後使用流式細胞儀檢測抗體與細胞表面結合產生的螢光强度，結果如表10所示。 表10 抗CRTAM抗體與細胞表面hCRTAM結合活性
抗體名稱 HuC110-34 5A11
EC50(ng/mL) 41.74 60.70
實驗結果顯示，本發明的人源化抗CRTAM抗體HuC110-34具有較好的與細胞表面hCRTAM結合能力。
實施例9：抗CRTAM抗體與細胞表麵食蟹猴CRTAM結合活性測定(FACS)
採用FACS分析抗體與CHO-K1-cCRTAM細胞表面的cCRTAM的結合活性。CHO-K1-cCRTAM細胞消化後，用2 % FBS-PBS的溶液重懸，計數。將上述細胞按照每孔1.5 x10 5個細胞的方式鋪細胞板，本發明的抗CRTAM抗體作為一抗從20 μg/ml開始，5倍梯度稀釋加入細胞板，共8個濃度，濃度分別為20000 ng/mL、4000 ng/mL、800 ng/mL、160 ng/mL、32 ng/mL、6.4 ng/mL、1.28 ng/mL、0.26 ng/mL，4 ℃條件下孵育1.5 h；使用PBS清洗三次細胞後，二抗使用PE-Anti-Human IgG (Biolegend，Cat.No. 409303，1.25 μl/孔)4 ℃條件下孵育1 h；PBS三次洗滌後使用流式細胞儀檢測抗體與細胞表面結合產生的螢光强度，結果如表11所示。 表11 抗CRTAM抗體與細胞表麵食蟹猴CRTAM結合活性
抗體名稱 HuC94-31 HuC110-34 HuC124-42
EC50(ng/mL) 35.02 50.69 90.38
實驗結果顯示，本發明的人源化抗CRTAM抗體具有較好的與細胞表面cCRTAM結合能力。
實施例10：抗CRTAM抗體與5A11對人CRTAM的表位競爭活性測定(ELISA)
採用ELISA法分析本發明的抗CRTAM抗體與5A11對人CRTAM的表位競爭活性。將hCRTAM-His蛋白(2 µg/mL，50 µL/孔，實施例1中製得)包被到96孔酶標板，於37 ℃孵育2 h。用1 x PBST清洗3次後用含5 %脫脂牛奶的PBST 37 ℃封閉2 h。同時用Biotin-NHS esterTM(Biovsion公司，2347-50)標記本發明的抗CRTAM抗體，標記好的抗體分別命名為HuC68-17-biotin、HuC94-31-biotin、HuC110-34-biotin、HuC124-42-biotin。封閉好的酶標板用1 x PBST清洗3次後，分別配置濃度為1 µg/mL的HuC68-17-biotin、HuC94-31-biotin、HuC110-34-biotin、HuC124-42-biotin溶液，以上述溶液為稀釋液分別稀釋一抗，本發明的抗CRTAM抗體(競爭陽性對照)與5A11作為一抗從100 μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入酶標板(50 µL/孔)，共8個濃度，濃度分別為100000 ng/mL、20000 ng/mL、4000 ng/mL、800 ng/mL、160 ng/mL、32 ng/mL、6.4 ng/mL、1.28 ng/mL，37 ℃孵育1.5 h；用1 x PBST清洗3次後拍乾，二抗使用Streptavidin-HRP (BD，554066，1: 10000，50 µL/孔)，37 ℃孵育1 h。用1xPBST清洗5次後拍乾，加入單組分TMB顯色液(索萊寶，PR1200，50 µL/孔)，避光顯色約5 min，加入2 M硫酸(50 µL/孔)終止，使用酶標儀(thermo，Multiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成IC50，結果如圖2~5所示。
實驗結果顯示，本發明的人源化抗CRTAM抗體HuC68-17、HuC94-31、HuC110-34、HuC124-42與5A11幾乎不存在表位競爭，不阻斷5A11與人CRTAM的結合，表明本發明的人源化抗CRTAM抗體與5A11對CRTAM的結合表位完全不同。
實施例11：抗CRTAM抗體與人CRTAM蛋白的親和力測定
利用Fortebio Octet對本發明的人源化抗CRTAM抗體結合抗原hCRTAM-His(實施例1中製得)的親和力進行測定。將抗CRTAM抗體用SD緩衝液(PBS + 0.02 % Tween20 + 0.1 % BSA)稀釋到濃度10 µg/mL，抗原hCRTAM-His用SD緩衝液4倍濃度梯度稀釋，使其濃度為12 µg/mL、3 µg/mL、0.75 µg/mL、0 µg/mL，選用AHC傳感器固化抗體，按Fortebio Octet RED96的操作規程進行親和力測定，具體參數及實驗結果如表12所示。 表12 抗CRTAM抗體與人CRTAM蛋白的親和力測定
抗體 KD(M) Kon(1/Ms) Kdis(1/s)
HuC94-31 3.72E-09 9.35E+04 3.48E-04
HuC110-34 4.28E-09 4.63E+04 1.98E-04
HuC124-42 7.87E-09 5.57E+04 4.38E-04
5A11 4.56E-08 6.08E+04 2.77E-03
實驗結果顯示，本發明的人源化抗CRTAM抗體的親和力顯著優於5A11，顯示出更持久的與人CRTAM蛋白結合能力。
實施例12：抗CRTAM抗體的體外藥效檢測
採用SEB (葡萄球菌腸毒素B)刺激健康人PBMC的方法來檢測抗CRTAM抗體的體外藥效。
按所需細胞量復蘇PBMC，加到8-9 ml的IMDM完全培養基中，900 g離心10 min，棄上清；用適量培養基重懸，用血球計數板計數，並重懸為1 M/mL，100 μL/孔加入96孔板中；按4倍濃度(即40 μg/mL)，50 μL/孔，用IMDM完全培養基配製待檢測抗體和Isotype，做好標記，渦旋；將抗體溶液加入96孔板中，對照組加入50μL/孔的培養基，96孔板置於37℃孵箱中，細胞和抗體孵育1h；按4倍濃度(即200 ng/mL)用IMDM完全培養基配製SEB溶液，50 μL/孔加入對應孔中；96孔板置於37 ℃，5% CO 2孵箱中孵育72 h後，收集無細胞上清150 μL，按一定比例稀釋後，按照hIFN-γ ELISA檢測試劑盒(R&D Systems® ELISA試劑盒，R&D system Cat：DY285B)說明書檢測上清中IFN-γ的濃度，結果如表13所示。 表13 抗CRTAM抗體促進PBMC釋放IFN-γ
抗體 IFN-γ濃度(pg/mL)
無SEB -236.67
SEB(50 ng/mL) 3526.67
IgG4(10 μg/mL)+SEB(50 ng/mL) 3123.33
5A11(10 μg/mL)+SEB(50 ng/mL) 4433.33
HuC68-17(10 μg/mL)+SEB(50 ng/mL) 6676.67
HuC94-31(10 μg/mL)+SEB(50 ng/mL) 7576.67
HuC110-34(10 μg/mL)+SEB(50 ng/mL) 5990
HuC124-42(10 μg/mL)+SEB(50 ng/mL) 4393.33
實驗結果顯示，與5A11相比，本發明的抗CRTAM抗體具有更好地促IFN-γ釋放能力。
實施例13：HCC827(del19)人非小細胞肺癌細胞PBMC重建模型抗腫瘤實驗
1、實驗材料
(1)實驗細胞及動物
HCC827(del19)細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)；
NSG小鼠，雌性，6-8周齡，體重18-20克，購自百奧賽圖(江蘇)基因生物技術有限公司；
(2)供試品及對照品
對照品5A11由實施例1製得，用作陽性對照；對照品PBS用作陰性對照；試驗前，將本發明的抗CRTAM抗體用PBS配製為1 mg/mL。
2、實驗方法
HCC827(del19)人非小細胞肺癌細胞PBMC重建模型
將含有1×107個 HCC827(del19)細胞的50 μL PBS與50 μL基質膠混合後接種於小鼠的右後肢皮下，待腫瘤生長至平均體積達100 mm3時開始分組。PBMC來自健康獻血者的新鮮血液，於DAY1分組後給抗體前1小時進行尾靜脉注射(每只小鼠注射10M的PBMC細胞)。尾靜脉給藥每周2次，每周兩次用游標卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積的計算公式為：V= 0.5a×b2，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑，計算相對腫瘤增殖率(T/C)。腫瘤生長抑制率用下列公式計算: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] ×100, 其中Ti為某一天某給藥組的平均腫瘤體積，T0為此給藥組在開始給藥時的平均腫瘤體積；Vi為某一天(與Ti同一天)溶媒對照組的平均腫瘤體積，V0為溶媒對照組在給開始藥時的平均腫瘤體積。記錄連續給藥22天測量的腫瘤體積，用GraphPad Prism繪製瘤體積生長曲線。在實驗結束後檢測腫瘤重量，並計算各組的腫瘤抑制率(TGI)%，結果如表14所示。 表14 HCC827(del19)人非小細胞肺癌細胞PBMC重建模型抗腫瘤結果
抗體 劑量(mg/kg) TGI (%)
PBS(溶媒對照組) 0 0
5A11 20 28.97
HuC110-34 10 42.80
實驗結果顯示，相比於5A11，本發明的抗CRTAM抗體能夠更好地抑制HCC827(del19)人非小細胞肺癌腫瘤生長。
實施例14：NUGC-4人胃癌細胞PBMC重建模型抗腫瘤實驗
1、實驗材料
(1)實驗細胞及動物
NUGC-4人胃癌細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)；
NSG小鼠，雌性，6-8周齡，體重18-20克，購自百奧賽圖(江蘇)基因生物技術有限公司；
(2)供試品及對照品
對照品為PBS，用作陰性對照；試驗前，將本發明的抗CRTAM抗體用PBS配製為1 mg/mL。
2、實驗方法
NUGC-4人胃癌細胞PBMC重建模型
將含有5×106 個NUGC-4(del19)細胞的100 μL PBS與100 μL基質膠混合後接種於小鼠的右後肢皮下，待腫瘤生長至平均體積達110 mm3時開始分組。PBMC來自健康獻血者的新鮮血液，於DAY1分組後給抗體前1小時進行尾靜脉注射(每只小鼠注射10M的PBMC細胞)。尾靜脉給藥每周2次，每周兩次用游標卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積的計算公式為：V= 0.5a×b2，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑，計算相對腫瘤增殖率(T/C)。腫瘤生長抑制率用下列公式計算: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] ×100, 其中Ti為某一天某給藥組的平均腫瘤體積，T0為此給藥組在開始給藥時的平均腫瘤體積；Vi為某一天(與Ti同一天)溶媒對照組的平均腫瘤體積，V0為溶媒對照組在給開始藥時的平均腫瘤體積。記錄連續給藥21天測量的腫瘤體積，用GraphPad Prism繪製瘤體積生長曲線。在實驗結束後檢測腫瘤重量，並計算各組的腫瘤抑制率(TGI)%，結果如表15所示。 表15 NUGC-4人胃癌細胞PBMC重建模型抗腫瘤結果
抗體 劑量(mg/kg) TGI(%)
PBS(溶媒對照組) 0 0
HuC94-31 20 31.32
HuC110-34 20 38.24
HuC124-42 20 35.24
實驗結果顯示，本發明的抗CRTAM抗體能夠較好地抑制NUGC-4人胃癌細胞生長。
以上實施例證明本發明提供的抗CRTAM抗體具有顯著的抗腫瘤作用，可明顯抑制腫瘤增長，提示這些抗體可在製備抗腫瘤藥物中應用，具有好的市場前景。
儘管以上已經對本發明作了詳細描述，但是本領域技術人員理解，在不偏離本發明的精神和範圍的前提下可以對本發明進行各種修改和改變。本發明的保護範圍並不限於上文所作的詳細描述，而應歸屬於申請專利範圍。
無
圖1是抗CRTAM人源化抗體阻斷人CRTAM結合CADM1活性實驗結果(ELISA)，其中橫坐標是抗體濃度(ng/mL)，縱坐標是OD450處的吸光值。 圖2是抗CRTAM抗體HuC68-17與5A11競爭結合人CRTAM的實驗結果(ELISA)，其中橫坐標是抗體濃度(ng/mL)，縱坐標是OD450處的吸光值。 圖3是抗CRTAM抗體HuC94-31與5A11競爭結合人CRTAM的實驗結果(ELISA)，其中橫坐標是抗體濃度(ng/mL)，縱坐標是OD450處的吸光值。 圖4是抗CRTAM抗體HuC110-34與5A11競爭結合人CRTAM的實驗結果(ELISA)，其中橫坐標是抗體濃度(ng/mL)，縱坐標是OD450處的吸光值。 圖5是抗CRTAM抗體HuC124-42與5A11競爭結合人CRTAM的實驗結果(ELISA)，其中橫坐標是抗體濃度(ng/mL)，縱坐標是OD450處的吸光值。
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Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
無。

Claims (12)

  1. 一種抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中： (1)該重鏈可變區包含選自如下群組的HCDR1、HCDR2和HCDR3： (a1)如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列； (a2)如SEQ ID NO: 8、9和10所示的胺基酸序列； (a3)如SEQ ID NO: 8、11和10所示的胺基酸序列； (a4)如SEQ ID NO: 16、17和18所示的胺基酸序列； (a5)如SEQ ID NO: 22、23和24所示的胺基酸序列； (a6)如SEQ ID NO: 22、25和24所示的胺基酸序列；以及 (a7)與(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)或(a6)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和 (2)該輕鏈可變區包含選自如下群組的LCDR1、LCDR2和LCDR3： (b1)如SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列； (b2)如SEQ ID NO: 7、5和6所示的胺基酸序列； (b3)如SEQ ID NO: 12、13和14所示的胺基酸序列； (b4)如SEQ ID NO: 15、13和14所示的胺基酸序列； (b5)如SEQ ID NO: 19、20和21所示的胺基酸序列； (b6)如SEQ ID NO: 26、27和28所示的胺基酸序列；以及 (b7)與(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其具有： 該HCDR1、該HCDR2和該HCDR3分別為SEQ ID NO: 1、2和3或與SEQ ID NO: 1、2和3所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，和該LCDR1、該LCDR2和該LCDR3分別為SEQ ID NO:4、5和6、SEQ ID NO: 7、5和6或與SEQ ID NO:4、5和6或SEQ ID NO: 7、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或 該HCDR1、該HCDR2和該HCDR3分別為SEQ ID NO: 8、9和10、SEQ ID NO: 8、11和10或與SEQ ID NO: 8、9和10或SEQ ID NO: 8、11和10所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，和該LCDR1、該LCDR2和該LCDR3分別為SEQ ID NO: 12、13和14、SEQ ID NO: 15、13和14或與SEQ ID NO: 12、13和14或SEQ ID NO: 15、13和14所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或 該HCDR1、該HCDR2和該HCDR3分別為SEQ ID NO: 16、17和18或與SEQ ID NO: 16、17和18所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，和該LCDR1、該LCDR2和該LCDR3分別為SEQ ID NO: 19、20和21或與SEQ ID NO: 19、20和21所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或 該HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO: 22、23和24、SEQ ID NO: 22、25和24或與SEQ ID NO: 22、23和24或SEQ ID NO: 22、25和24所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，和該LCDR1、該LCDR2和該LCDR3分別為SEQ ID NO: 26、27和28或與SEQ ID NO: 26、27和28所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
  3. 如請求項1或請求項2所述的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中： 該重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86和SEQ ID NO: 87，SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91和SEQ ID NO: 92，SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91或SEQ ID NO: 92經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91或SEQ ID NO: 92功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91或SEQ ID NO: 92具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或者 該重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53和SEQ ID NO: 54，SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66和SEQ ID NO: 67，SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或者 該重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74和SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78和SEQ ID NO: 79，SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或者 該重鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100和SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100或SEQ ID NO: 101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100或SEQ ID NO: 101功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100或SEQ ID NO: 101具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變區的胺基酸序列選自SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104和SEQ ID NO: 105，SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105功能相同的胺基酸序列，以及與SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
  4. 如請求項1至請求項3中任一項所述的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中 該重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:80經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:80功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:80具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:81經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:81功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:81具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或者 該重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:87經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:87功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:87具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:90經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:90功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:90具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或者 該重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:87經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:87功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:87具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:92經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:92功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:92具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
  5. 如請求項1至請求項4中任一項所述的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是鼠源單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或完全人抗體。
  6. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至請求項5中任一項所述的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段。
  7. 如請求項6所述的核酸，其包含： 編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 87的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91或SEQ ID NO: 92的核苷酸序列；或者 編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 54的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67的核苷酸序列；或者 編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 75的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79的核苷酸序列；或者 編碼重鏈可變區如SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100或SEQ ID NO: 101的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區如SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 105的核苷酸序列。
  8. 一種表達載體，其包含如請求項6或請求項7所述的核酸。
  9. 一種宿主細胞，其轉化如請求項8所述的表達載體，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，優先為哺乳動物細胞。
  10. 一種製備如請求項1至請求項5中任一項所述的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段的方法，包括在如請求項9所述的宿主細胞中表達抗體或其抗原結合片段，以及從該宿主細胞中分離該抗體或其抗原結合片段的步驟。
  11. 一種藥物組合物，其包含請求項1至請求項5中任一項所述的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段和藥學可接受的載體。
  12. 一種如請求項1至請求項5中任一項所述的抗CRTAM抗體或其抗原結合片段或如請求項11的藥物組合物在製備預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用。
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