CN117003873A - 抗vsig4抗体及其应用 - Google Patents

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CN117003873A CN202310494728.3A CN202310494728A CN117003873A CN 117003873 A CN117003873 A CN 117003873A CN 202310494728 A CN202310494728 A CN 202310494728A CN 117003873 A CN117003873 A CN 117003873A
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周冠月
张小猛
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Abstract

本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，包含抗VSIG4抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及它们的应用。本发明的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段具有高的亲和力和稳定性，抗肿瘤活性显著，且不阻断VSIG4和补体C3b的结合，可用于制备抗肿瘤的药物。

Description

抗VSIG4抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，包含抗VSIG4抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及它们的应用。
背景技术
全球患癌人数逐年增加，且约90％的癌症发病率是由实体瘤引起的，最常见的癌症包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌和胃癌。预计2024年全球的癌症新增患者将达到2840万例，相比2020年增加47％。
实体瘤和血液癌症的一个重要区别是实体瘤周围形成的肿瘤微环境(TME，TumorMicroenvironment)。在肿瘤微环境中除瘤细胞外，还包含有多种具有免疫抑制功能的免疫细胞，如调节性T细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)以及过表达的细胞因子，如TGF-β、IL-10、IL-4等。
巨噬细胞是一种多功能的固有免疫细胞，从调节组织稳态、防御病原体到帮助伤口愈合，执行广泛的功能。而巨噬细胞的激活有两种途径。经典激活的巨噬细胞或称“M1”型的巨噬细胞，参与I型辅助性T细胞(Th1)对病原体的促炎(PI)反应。它们由干扰素-γ(IFN-γ)和Toll样受体信号激活，高水平表达MHC-II、IL-12、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。交替激活的巨噬细胞或称“M2”型巨噬细胞，表现出抗炎(AI)和Th2细胞特征，其可由IL-4或IL-13刺激激活后分泌IL-10。M1型巨噬细胞能有效地产生免疫杀伤分子(如活性氧)和特异性炎症细胞因子(如TNF-α、IL-6、IFN-γ)，表现出促炎功能，促进肿瘤细胞的破坏、募集肿瘤杀伤白细胞或直接吞噬肿瘤细胞。而M2型巨噬细胞则具有不同的促肿瘤信号，包括重塑细胞外基质(ECM)、破坏基底膜和促血管生成、构建免疫抑制机制、招募Tregs和MDACs等，协调肿瘤的发展和远处转移。肿瘤相关巨噬细胞同时存在PI/M1和AI/M2表型，但表现出与抗炎亚型更密切相关的特征。在大多数情况下，其与预后不良密切相关，如肺癌、乳腺癌、淋巴瘤和胃癌。随着对肿瘤免疫学认识的加深，TAMs的相关疗法为提高抗癌治疗水平提供了一条新的途径。然而，由于TME中存在复杂的细胞间串扰，TAMs的消除可能会在宿主中引起多方面的间质反应。比如CSFR1抑制剂对单核细胞和巨噬细胞的消耗不是TAMs特异性的，因此随着时间的推移会产生很大的毒性。由于巨噬细胞的可塑性且肿瘤组织内存在大量的浸润性TAMs，改造TAMs已成为一种治疗选择，目前的研究方向是特异性地靶向TAMs，将类M2的TAMs重编程为类M1的表型，是治疗实体瘤的有效策略。
VSIG4(V-set immunoglobulin-domain-containing 4)是属于免疫球蛋白超家族补体受体(CRIg)的一种I型跨膜蛋白。其天然存在两种转录剪切体，VSIG4L包含IgV和IgC结构域；而VSIG4S只含有IgV结构域，和鼠源VSIG4相同。VSIG4特异性表达于驻留在胎盘、肾上腺、心脏、滑膜关节、肝脏和肺等各种组织中的静息巨噬细胞，而在T细胞、B细胞等其他免疫细胞中未见表达。VSIG4同时也是补体C3裂解产物C3b或iC3b的补体受体，介导病原体的清除。VSIG4是一种新型的B7家族免疫共刺激分子，属于二级免疫检查点分子，其在体外和体内均对T细胞有很强的抑制作用，而VSIG4在静息组织巨噬细胞上的限制性表达提示VSIG4在维持健康组织T细胞无反应性中起重要作用。同时VSIG4与C3b结合介导了巨噬细胞中NLRP3炎症体和IL-10的转录抑制，从而调节了机体免疫和炎症反应。
在高级别胶质瘤组织中VSIG4的表达明显高于正常脑组织，发现VSIG4高表达是影响高级别胶质瘤患者较短的无进展生存期和总生存期的独立预后因素，证明VSIG4可以作为胶质瘤的预后因子和潜在的免疫治疗靶点。在进展期胃癌的研究中，VSIG4表达与患者生存之间存在显著关联，且证明是一种独立的预后因素，有望成为进展期胃癌的重要预后因素。有研究表明，VSIG4在卵巢癌患者的组织和血浆中的表达高于卵巢良性肿瘤患者，晚期和复发的卵巢癌与可溶性VSIG4的表达有关，提示VSIG4可能成为卵巢癌的潜在治疗靶点。在多发性骨髓瘤患者中的研究发现，VSIG4高表达组的总生存期明显低于VSIG4低表达组，VSIG4在多发性骨髓瘤的表达是预后不良的一个独立指标，可能是多发性骨髓瘤免疫治疗的潜在靶点。已验证VSIG4是结直肠癌潜在的可用药基因，已识别的突变可以给未来的患者分层进行靶向治疗。还发现VSIG4信号可以在体外抑制共培养的CD4+和CD8+T细胞增殖和细胞因子(IL-2和IFN-γ)的释放，这些结果表明巨噬细胞相关的VSIG4是促进肺癌发展的激活剂。另有研究表明VSIG4可通过重编程线粒体丙酮酸代谢来抑制促炎巨噬细胞的激活。
考虑到VSIG4在免疫检测点及癌症发生发展中的重要作用，本领域需要开发针对VSIG4的特异性抗体以单独或与其它药物组合用于癌症等疾病的治疗。
发明内容
本发明一方面提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中所述重链可变区包含重链可变区的互补决定区1(HCDR1)、重链可变区的互补决定区2(HCDR2)和/或重链可变区的互补决定区3(HCDR3)，所述轻链可变区包含轻链可变区的互补决定区1(LCDR1)、轻链可变区的互补决定区2(LCDR2)和/或轻链可变区的互补决定区3(LCDR3)。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(1)所述重链可变区包含选自如下组的HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(a1)如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列；
(a2)如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列；
(a3)如SEQ ID NO:13、14和15所示的氨基酸序列；和
(a4)与(a1)、(a2)或(a3)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR；和
(2)所述轻链可变区包含选自如下组的LCDR1、LCDR2和LCDR3：
(a5)如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列；
(a6)如SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列；
(a7)如SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列；和
(a8)与(a5)、(a6)或(a7)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:1、2和3或与SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:4、5和6或与SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:7、8和9或与SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:10、11和12或与SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区；
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:13、14和15或与SEQ ID NO:13、14和15所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:16、17和18或与SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区。
在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段是鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段或人源化抗体或其抗原结合片段。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中
(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：
(b1)如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
(b2)(b1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(b3)与(b1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：
(b4)如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
(b5)(b4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(b6)与(b4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:19经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:19功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:20，SEQ IDNO:20经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:20功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:21经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:21功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:22，SEQ IDNO:22经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:22功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:23功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24，SEQ IDNO:24经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:24功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:19经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:19功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:20经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:20功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:21经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:21功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:22经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:22功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:23功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:13、14和15所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:24经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:24功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，根据本发明的VSIG4抗体为鼠源抗体，其还含有鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4或其变体的重链恒定区，和鼠源的κ链或其变体的轻链恒定区。
在一些优选的实施方案中，根据本发明的抗VSIG4鼠源抗体还含有鼠源的IgG1或IgG2或其变体的重链恒定区，和鼠源κ链或其变体的轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗VSIG4抗体为人源化抗体，其中：
(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：
(c1)如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；
(c2)(c1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(c3)与(c1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：
(c4)如SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；
(c5)(c4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(c6)与(c4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗VSIG4抗体为人源化抗体，其中：
(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：
(c1)如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；
(c2)(c1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(c3)与(c1)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列；和
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：
(c4)如SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；
(c5)(c4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(c6)与(c4)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗VSIG4抗体为人源化抗体，其中：
(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：
如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列为SEQ IDNO:1、2和3；和
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：
如SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:4、5和6。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:29经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:29功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少85％序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:35经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:35功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:35具有至少85％序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗VSIG4人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含人源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，所述轻链包含人源的κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，和/或进一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的抗VSIG4嵌合抗体或其抗原结合片段的抗体轻链进一步包含鼠源κ、λ链或其突变序列的轻链恒定区。所述的抗VSIG4嵌合抗体或其抗原结合片段的抗体重链进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、gG4或其突变序列的重链恒定区，优选包含人源IgG1或IgG2重链恒定区，或者使用氨基酸突变后显著降低ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG4恒定区。
在一些具体的实施方案中，本发明的抗VSIG4人源化抗体或其抗原结合片段还包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，和人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。在一些优选的实施方案中，本发明的抗VSIG4人源化抗体或其抗原结合片段还包含人源IgG1或IgG2或其变体的重链恒定区，和人源κ链或其变体的轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明提供抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段为Fab、Fv、sFv或F(ab)2。
本发明的另一方面提供一种分离的核酸，其编码根据本发明的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段。
在一些的具体的实施方案中，根据本发明的分离的核酸，其中编码重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示；编码轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示。
本发明的另一方面提供一种表达载体，其表达本发明的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段。根据本发明的表达载体其包含本发明的分离的核酸分子。
本发明的另一方面一种如上所述的表达载体转化的宿主细胞。
在一些实施方案中，根据本发明的宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。在一些实施方案中，所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌。在另一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。
本发明的另一方面提供制备本发明的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段的方法，包括在所述宿主细胞中表达抗体以及从宿主细胞中分离所述抗体的步骤。
本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明的抗VSIG4人源化抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体。在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的抗VSIG4人源化抗体或其抗原结合片段，还包含其他活性成分，如其他抗体、靶向药物等。在一些实施方案中，所述药学可接受的载体选自抗氧化剂、多肽、蛋白质、亲水性聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、糖醇、离子和表面活性剂。在一个具体的实施方案中，所述药学可接受的载体为缓冲水溶液。在另一个具体的实施方案中，所述药学可接受的载体为脂质体的形式。
可以将本发明的抗VSIG4人源化抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠给药。给药方法包括，但不限于经口、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、脑内、眼内、气管内、皮下、鼻内途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的另一方面提供抑制VSIG4活性的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物。
本发明的另一方面提供本发明的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物在制备抑制VSIG4活性的药物中的应用。在一些实施方案中，所述抑制VSIG4活性的药物用于治疗白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤和/或黑素瘤。在一些实施方案中，本发明提供上述抗VSIG4抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用，优选地，所述肿瘤选自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤和黑素瘤。
本发明提供的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段具有更高的亲和力和稳定性，抗肿瘤作用明显，可明显抑制肿瘤增长，人源化后的抗体免疫原性大大降低，有效消除人体免疫系统对外源性单抗的排斥反应，可在制备用于治疗各类肿瘤疾病的药物中应用，具有广阔的市场前景。
定义
除非另有定义，本文中使用的科学和技术术语的含义是本领域技术人员所通常理解的含义。本文中所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡或多核苷酸化学及杂交中使用的命名和技术是本领域公知且普遍使用的。对于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养与转化(如电穿孔、脂质转染)，使用了标准技术。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明书或本领域普遍使用或本文所述的方法进行。前述技术和方法通常根据本领域公知且本说明书中引用和讨论的多部综合和较具体的文献中描述的那样使用。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版，Cold Spring HarborLaboratoryPress，纽约冷泉港(1989))。本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药学化学中使用的命名以及实验室方法和技术是本领域公知且普遍使用的。
在本发明中，术语“至少80％序列同一性”是指至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的序列同一性。在本发明中，术语“至少85％序列同一性”是指至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的序列同一性。在一些优选的实施方案中，本发明所述的序列同一性可以至少为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以通过National Center For Biotechnology Instutute网站上的BLASTN/BLASTP算法来进行。
在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中以相对彼此的位置排列以形成抗原结合表面。抗原结合表面与所结合抗原的三维表面互补，且每条重链和轻链的三个高变区均被称作“互补决定区”或“CDR”。氨基酸向每个结构域的分配是根据Kabat《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1987和1991))或Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，Chothia等，Nature 342:878-883(1989)定义。
本发明所述的“抗原结合片段”是指具有抗原结合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段及与人VSIG4结合的Fv片段、scFv片段。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体或单链Fv(scFv)。
本发明所述的抗体指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”指抗体与抗原的一种或多种抗原决定簇反应而不与其他多肽反应或以很低的亲和性(Kd>10-6)结合其他多肽。抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、dAb(结构域抗体)、单链、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、scFv及Fab表达文库。单克隆抗体(mAb)是由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术及合成技术如CDR grafting或其它现有技术进行重组得到。
本发明所述的“鼠源抗体”为根据本领域知识和技能制备的对人VSIG4的单克隆抗体。制备时用VSIG4抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
本发明所述的“嵌合抗体”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。
本发明所述的“人源化抗体”也称为CDR移植抗体，是将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架(FR)中产生的抗体。此类可变区框架序列可以从公共的DNA数据库或公开的参考文献获得，例如从ImMunoGeneTics(IMGT)网站http://imgt.cines.fr得到或从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
附图说明
图1是抗VSIG4人源化抗体与猴VSIG4结合活性测定(ELISA)结果，横坐标为抗体浓度nM，纵坐标为OD450值。
图2是抗VSIG4人源化抗体和人VSIG4竞争与C3B的结合活性测定(ELISA)结果，横坐标为抗体浓度nM，纵坐标为OD450值。
图3是抗VSIG4人源化抗体与细胞表面VSIG4结合活性测定(FACS)结果，横坐标为抗体浓度nM，纵坐标为M2％ Parent*M2 Mean值。
图4抗VSIG4人源化抗体在anti-CD3刺激的PBMC体系中IFN-γ释放水平检测结果，PBMC来自donor A。横坐标为不同抗体，纵坐标为IFN-γ释放量(pg/ml)。
图5抗VSIG4人源化抗体在anti-CD3刺激的PBMC体系中IFN-γ释放水平检测结果，PBMC来自donor B。横坐标为不同抗体，纵坐标为IFN-γ释放量(pg/ml)。
图6是抗VSIG4人源化抗体在巨噬细胞表型转分化实验中的测定(FACS)结果，其显示了经HuV5-00处理的M2巨噬细胞中CD163表达降低。
图7是抗VSIG4人源化抗体HuV5-00在人结肠癌MC38移植瘤模型抗肿瘤试验结果。横坐标为治疗天数(Day)，纵坐标为肿瘤体积(mm3)。
具体实施方式
下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中未注明条件的实验方法通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册、分子克隆手册等，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件进行。实施例中使用的材料、试剂如无特殊说明均为商购获得。
实施例1:VSIG4抗原蛋白及抗VSIG4阳性对照抗体的制备
1、抗原蛋白及阳性对照抗体的表达载体构建
(1)抗原蛋白的表达载体构建
合成编码VSIG4蛋白全长的基因片段，氨基酸序列设计如SEQ ID NO:40所示，然后克隆到真核表达质粒pTargeT上，获得其表达质粒pTargeT-VSIG4。
融合人源VSIG4蛋白胞外区氨基酸序列与hIgG1-Fc或His标签氨基酸序列，氨基酸序列设计分别如SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42所示。对上述氨基酸序列进行密码子优化后合成带有标签的VSIG4蛋白胞外区基因片段hVSIG4-hFc、hVSIG4-His，并将其分别克隆至真核表达质粒pHR中，获得其表达质粒pHR-hVSIG4-hFc、pHR-hVSIG4-His。
融合人源VSIG4蛋白胞外区氨基酸序列与mIgG1-Fc标签氨基酸序列，氨基酸序列设计分别如SEQ ID NO:43所示。对上述氨基酸序列进行密码子优化后合成带有标签的VSIG4蛋白胞外区基因片段hVSIG4-mFc，并将其分别克隆至真核表达质粒pHR中，获得其表达质粒pHR-VSIG4-mFc。
融合鼠源VSIG4蛋白胞外区氨基酸序列与His标签氨基酸序列，氨基酸序列设计如SEQ ID NO:44所示。对上述氨基酸序列进行密码子优化后合成带有标签的VSIG4蛋白胞外区基因片段mVSIG4-His，并将其分别克隆至真核表达质粒pHR中，获得其表达质粒pHR-mVSIG4-His。
融合猴源VSIG4蛋白胞外区氨基酸序列与His标签氨基酸序列，氨基酸序列设计分别如SEQ ID NO:45所示。对上述氨基酸序列进行密码子优化后合成带有标签的cVSIG4蛋白胞外区基因片段cVSIG4-His，并将其分别克隆至真核表达质粒pHR中，获得其表达质粒pHR-cVSIG4-His。
(2)阳性对照抗体EU103的表达载体构建
使用专利申请WO2020/069507中公开的人源化抗体EU103.3(本文简称EU103)作为阳性对照抗体，EU103的氨基酸序列如下所示：
EU103重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:46；
EU103轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:47。
根据WO2020/069507公开的方法制备EU103.3。EU103为人IgG1型单克隆抗体，与天然IgG1相比，其Fc段含有特定突变位点(L234F，L235F，P331S)。对EU103人源化抗体的氨基酸进行密码子人工优化，获得阳性对照抗体EU103的重链及轻链全长DNA序列。将EU103的重链全长DNA片段克隆到pHR载体上，获得真核表达质粒pHR-EU103-IgG1。将EU103的轻链全长DNA片段克隆到pHR载体上，获得真核表达质粒pHR-EU103-hK。
(3)鼠源阳性对照抗体EU103的表达载体构建
将阳性对照抗体EU103的重链可变区序列克隆至含鼠mIgG1重链恒定区的真核表达质粒pHR-mIgG1上，获得pHR-EU103-mIgG1的真核表达质粒。将阳性对照抗体EU103的轻链可变区序列克隆至含鼠K轻链恒定区的真核表达质粒pHR-mK上，获得pHR-EU103-mK的真核表达质粒。
2、抗原蛋白及阳性对照抗体的表达与纯化
(1)表达抗原蛋白的稳转细胞株构建
分别将真核表达质粒pTargeT-VSIG4在160V电压，15msec的方形脉冲下以电转的方式转染到CHO-K1细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所)，置37℃，5％CO2的培养箱中培养。24h后采用含500ug/ml G418(INVIVOFEN，#GNL-40-02)的培养基加压培养。转染16天后采用FACS检测pool阳性率，将电转质粒后的细胞铺板(1x106个/ml的细胞密度，100ul/孔)，采用EU103抗体和Goat pAb to Hu IgG(PE)(Abcam,ab98596)抗体与细胞孵育，以流式细胞仪(ACEA，Novocyte 2060R)读取585nm波长下mean值，使用GraphPad进行数据分析。将阳性细胞株进行亚克隆，挑选出克隆化的CHO-K1细胞株，该细胞株高水平表达VSIG4分子，命名为CHO-K1-VSIG4。
(2)标签抗原蛋白及阳性对照抗体的表达
在1L细胞培养瓶中接种密度为0.5x106个细胞/ml的293E细胞，加入新鲜的预热的FreeStyle293表达培养基，使接种后总体积达到250mL，置37℃，8％CO2，加湿的CO2培养箱中培养过夜。取8.5mLFreeStyle293表达培养基，加入1mg/ml的PEI溶液500ul，混合均匀，取250ug待转染质粒加入8.5ml FreeStyle293表达培养基中，混合均匀，其中标签抗原蛋白质粒pHR-hVSIG4-hFc、pHR-hVSIG4-His、pHR-VSIG4-mFc、pHR-mVSIG4-His、pHR-cVSIG4-His分别转染；阳性对照抗体EU103重链质粒pHR-EU103-IgG1和轻链质粒pHR-EU103-hK共同转染；鼠源阳性对照抗体EU103重链质粒pHR-EU103-mIgG1和轻链质粒pHR-EU103-mK共同转染。将PEI与FreeStyle293表达培养基的混合溶液加入到质粒中，混合均匀，然后加入细胞培养物中，置37℃，8％CO2，加湿的CO2培养箱中培养。在细胞转染后第1天和第3天对细胞进行补料，每瓶加入2.5ml的谷氨酰胺(母液浓度为200mM)和5ml的葡萄糖(母液浓度为180g/L)。当细胞细胞活力降至65％～75％时，收集细胞上清。将细胞培养物1500rpm离心5min，收集上清，再8000rpm离心20min，收集上清。
(3)亲和层析柱纯化
利用AKTA(GE，AKTA pure-150)根据蛋白性质采用不同的亲和层析柱进行纯化(不同蛋白适配的亲和层析柱见表1)，具体纯化步骤如下：
表1不同蛋白适配的亲和层析柱
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清洗：超纯水清洗设备及管路2min，流速10mL/min，后用0.1MNaOH清洗层析系统；
接柱：将层析柱接入层析设备，并用超纯水冲洗5min；后0.1MNaOH冲洗30min，保留时间5min；
平衡：20mMPB+0.15M NaCl，pH7.2平衡5个CV(柱体积)；
上样：将细胞表达上清上样，保留时间5min；
后平衡：20mMPB+0.15M NaCl，pH7.2平衡5个CV；
洗脱：50mM醋酸，pH＝3.4洗脱，保留时间5min。UV280至50mAu左右时开始收集，降至50mAu左右时停止收集。用1MTris-HCl，pH9.0将样品pH调节至7.0；
再平衡：20mMPB+0.15MNaCl，pH7.2平衡3个CV，保留时间5min；
在线清洗：0.1MNaOH清洗30min，保留时间5min；
清洗保存：纯化水清洗10min，后20％乙醇2个CV。
实施例2:抗VSIG4鼠单克隆抗体制备
1、杂交瘤单克隆的制备
(1)动物免疫
采用不同标签的VSIG4抗原蛋白与佐剂共同免疫的方法免疫BALB/c或SJL品系的实验小鼠，首次免疫抗原使用量为50μg，后期使用25μg抗原免疫。
免疫佐剂可以是Freund’s Adjuvant,Complete-cell suspension或Freund’sAdjuvant,Complete-Liquid间隔。将不同标签的VSIG4抗原蛋白逐滴加入到佐剂溶液中，边滴加边涡旋以充分混合，佐剂使用剂量参考说明书进行。混合均匀形成油包水的乳剂后免疫小鼠。
高水平表达VSIG4的细胞系如CHO K1-VSIG4也可用来用来免疫小鼠，使之产生抗体。用胰蛋白酶消化处理正在培养的CHO K1-hVSIG4细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞沉淀，取样用细胞计数仪计数，剩余样品1000rpm离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞沉淀，计入适量的PBS以获得1x108个细胞/ml的细胞悬液。实验组小鼠每只免疫1x107个细胞。免疫方案如表2所示：
表2动物免疫方案
组别 抗原 佐剂 免疫途径*
1 PBS 无 i.p./s.c.
2 hVSIG4-hFc/hVSIG4-His Freund’s Adjuvant i.p./s.c.
3 CHO K1-VSIG4 无 i.p.
*s.c.皮下注射；i.p.腹腔注射。
(2)杂交瘤融合
取经加强免疫过的小鼠处死，75％酒精中浸泡5min，转移到操作台上。剪开小鼠下腹部皮肤，用钳子夹住皮肤向上拉开，无菌操作剪开腹膜，取出脾脏放入含有5mL PBS的六孔板中，用研磨棒研磨，经细胞筛过滤后释放脾脏B细胞。收集脾脏细胞悬液于50mL离心管内，加PBS至20mL。1570rpm离心7min，弃上清。加入2mL红细胞裂解液(2mL/脾)，室温裂解2min，加入PBS至20mL，1570rpm离心7min后弃上清，用PBS重悬后进行活细胞计数。收集T75培养瓶中的Sp2/0细胞至离心管中，加入35mLPBS，1570rpm离心7min，弃上清。用PBS重悬后进行活细胞计数。按Sp2/0细胞：脾细胞在1:(1～2)之间混合细胞，1570rpm离心7min后弃上清。用20mL电转缓冲液重悬细胞，1570rpm离心7min后弃上清，重复一次。用电转缓冲液重悬细胞，保证细胞密度在2×107个细胞/mL左右。把细胞悬液加入9mL电转融合槽中融合。融合后将细胞悬液转移到20mL H-SFM培养基(20％FBS,1×BIOMYC-3)中，室温放置20min。把融合后的细胞悬液加入到H-SFM培养基(20％FBS，1×BIOMYC-3，1×HAT)，调整铺板密度在2×105个细胞/mL,按200μL/孔将细胞悬液铺到若干块96孔细胞培养板中，保证每孔细胞量约为4×104个细胞/孔，转移到37℃培养箱中培养。
(3)杂交瘤及亚克隆上清的筛选
融合培养一周后，去母克隆上清，通过ELISA筛选出能结合VSIG4-his蛋白的杂交瘤上清，利用VSIG4-His筛选能针对VSIG4而非hFc、mFc的抗体。挑选结合阳性的母克隆扩大培养，进行竞争活性的检测，包被C3b于酶标板上，加入重组人源蛋白VSIG4-mFc与杂交瘤上清的混合物孵育2h，洗板后加入HRP标记的anti mouse IgG Fc特异性抗体(JacksonImmuno Research)孵育1h,利用酶标仪检测450nm出的吸光值，同时进行结合活性的复测，再次筛选具有与VSIG4结合能力且不阻断VSIG4与C3b结合的杂交瘤阳性克隆。
采用有限稀释法将阳性细胞株进行亚克隆，培养一周后利用ELISA检测亚克隆上清与VSIG4分子的结合活性且不阻断VSIG4与C3b相互作用的活性，获得3种阳性细胞株，分别标记为V5、V22、V71。
2.鼠源单克隆抗体的制备
将经亚克隆上清活性分析结果确定单克隆抗体母克隆株V5、V22、V71，将其扩大培养。培养条件是含有10％FBS，1×BIOMYC-3的H-SFM培养基。待细胞汇合度＞80％时，将细胞传代扩培，待培养至50mL时收集上清，纯化抗体。获得抗体经SDS-PAGE凝胶电泳纯度良好。
3.鼠源单克隆抗体测序
将经亚克隆操作的阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，取适量细胞按RNeasy PlusMini Kit(Qiagen，74134)试剂盒说明书提取总RNA，利用Prime Script 1st strand cDNASynthesis Kit(Takara，6110A)反转录试剂盒合成cDNA第一条链。
根据小鼠抗体亚型可变区设计特异性引物(5’端含有用于与真核表达载体发生同源重组的同源臂序列)，以cDNA为模板进行抗体可变区基因的PCR扩增，从而分别获得小鼠抗体轻链与重链可变区的基因片段；设计引物，进行DNA测序获得序列，测序结果见表3。
表3抗VSIG4鼠源单克隆抗体序列表
抗体 重链可变区氨基酸序列 轻链可变区氨基酸序列
V5 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20
V22 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22
V71 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24
V75 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:26
V94 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28
其中抗体V5的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:1、2和3，LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:4、5和6；抗体V22的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:7、8和9，LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:10、11和12；抗体V71的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:13、14和15，LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:16、17和18。
实施例3:抗VSIG4嵌合抗体的构建
将纯化后(纯化步骤见实施例1)的小鼠抗体轻链与重链可变区基因片段分别与线性化的含有人抗体轻链或重链恒定区的真核表达质粒共转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将混合液均匀涂布于含有相应抗生素的琼脂平板表面，于37℃恒温培养箱过夜培养后分别挑取若干单菌落进行DNA测序；将测序正确的嵌合抗体分别标记为V5CHI、V22CHI、V71CHI。
将测序正确的阳性克隆接种于含有相应抗生素的2×YT液体培养基中，于37℃振荡培养12小时以上，然后收集菌体进行质粒提取，从而获得嵌合抗体轻链与重链表达质粒，使用核酸定量分析仪检测质粒的浓度与纯度。
将嵌合抗体质粒转染HEK293E细胞，表达纯化大量抗体，进行纯度检测、活性分析及亲和力的检测。测序结果见下表4。
表4抗VSIG4嵌合抗体测序结果表
嵌合抗体 重链可变区氨基酸序列 轻链可变区氨基酸序列
V5CHI SEQ ID NO：19 SEQ ID NO：20
V22CHI SEQ ID NO：21 SEQ ID NO：22
V71CHI SEQ ID NO：23 SEQ ID NO：24
嵌合抗体V5CHI、V22CHI、V71CHI的HCDR1、HCDR2和HCDR3及LCDR1、LCDR2和LCDR3与抗体V5、V22和V71的一致。
实施例4:抗VSIG4人源化抗体的构建及生产
根据嵌合抗体的活性分析、亲和力KD值等结果选择V5CHI进行人源化抗体改造。
抗体的人源化改造，首先是通过与免疫基因数据库(TMGT)中小鼠抗体序列进行比对，确认V5CHI抗体可变区的鼠源种系，经过同源比对，V5CHI抗体的重链可变区序列的FR区与小鼠抗体种系基因IGHV1-69*02最为相似；抗体轻链可变区序列的FR区序列与小鼠抗体基因IGKV3-11*01最为相似。
以V5CHI抗体框架区序列FR1-FR3作为模板，在人框架区库中寻找3D结构相似但是免疫原性较低的全人框架代替V5CHI的FR1-FR3序列，重链/轻链全长序列进行3D建模并和原抗体重链/轻链序列进行结构比对分析，综合考虑抗原性和3D结构相似度，最终选择V5CHI的6条人源化重链可变区(参见SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34，HCDR1、HCDR2和HCDR3均分别为SEQ ID NO:1、2和3)和3条人源化轻链可变区(参见SEQ ID NO:35、36、37，LCDR1、LCDR2和LCDR3均分别为SEQ ID NO:4、5和6)进行下一步优化。V5人源化抗体非CDR区序列均达到95％以上人源化。
将以上设计好的人源化抗体轻链与重链可变区氨基酸序列反转录成相对的核苷酸序列，并生成相邻片段之间有互补序列的寡核苷酸片段，通过Overlap PCR将寡核苷酸片段退火后连接起来，再利用特异性引物(5’端含有用于与真核表达载体发生同源重组的同源臂序列)扩增出完整的轻链与重链可变区核苷酸片段；将纯化后的轻链可变区核苷酸片段与线性化的含有IgG4轻链恒定区的真核表达质粒共转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将纯化后的重链可变区核苷酸片段与的IgG4重链恒定区的真核表达质粒共转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，分别将转化质粒的感受态细胞均匀涂布与含有相应抗生素的琼脂平板表面，于37℃恒温培养箱过夜培养后分别挑取若干菌落进行DNA测序。
将测序正确的阳性克隆接种于含有相应抗生素的2×YT液体培养基中，于37℃振荡培养12小时以上，然后收集菌体进行质粒提取，从而获得人源化抗体轻链与重链表达质粒，使用核酸定量分析仪检测质粒的浓度与纯度。
将质粒转染HEK293E细胞，表达纯化获得大量抗体，进行纯度检测、活性分析及亲和力的检测。
挑选纯度、活性和亲和力均较好的人源化抗体，标记为HuV5-00，序列见表5。
表5抗VSIG4人源化抗体序列表
抗体HuV5-00的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:1、2和3，LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:4、5和6。
实施例5:抗VSIG4抗体与猴VSIG4结合活性测定(ELISA)
采用protein based Elisa分析抗体的结合活性。食蟹猴VSIG4-His蛋白(1μg/孔，)包被96孔酶标板。本发明提供的抗VSIG4抗体作为一抗从10μg/mL开始，5倍梯度稀释加入酶标板，共8个浓度，分别为10000ng/mL、2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL、0.64ng/mL、0.128ng/mL，37℃孵育2h。二抗使用Anti-Human IgG HRP(Jackson，109-035-003，1:10000)，加入显色液TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，终止后利用酶标仪(thermo，Multiskan FC)读取OD450值。使用GraphPad生成EC50，结果如图1所示。
实验结果表明，本发明提供的人源化抗VSIG4抗体HuV5-00具有与食蟹猴VSIG4结合的能力。
实施例6:抗VSIG4抗体和VSIG4竞争C3b的测定(ELISA)
采用ELISA检测本发明提供的抗VSIG4抗体竞争VSIG4与C3b结合的能力。C3b(5μg/mL)包被于96孔酶标板上，本发明提供的抗VSIG4抗体作为一抗从45μg/mL开始，2倍梯度稀释加入酶标板，共8个浓度，分别为45000ng/mL、22500ng/mL、11250ng/mL、5625ng/mL、2812.5ng/mL、1406.25ng/mL、703.125ng/mL、351.563ng/mL；配体溶液为0.3μg/mL的hVSIG4-mFc溶液，两者1:1体积比混合后加入酶标板，37℃孵育2h，阳性对照抗体为EU103；二抗使用Anti-mFc-HRP(Jackson，115-035-071，1:5000)，加入显色液TMB，终止后利用酶标仪(thermo，Multiskan FC)读取OD450值。使用GraphPad生成EC50，结果如图2所示。
实验结果表明，本发明提供的人源化抗VSIG4抗体HuV5-00不阻断VSIG4与C3b的结合，与阳性对照抗体EU103结果相当。
实施例7:抗VSIG4抗体与细胞表面VSIG4结合的测定(FACS)
采用FACS分析抗体与细胞表面VSIG4的结合活性。将稳定表达VSIG4的CHO K1-VSIG4细胞以每孔1x106个细胞铺96孔U型板；本发明提供的抗VSIG4抗体作为一抗从30μg/mL开始，5倍梯度稀释加入U型板，共8个浓度，分别为30000ng/mL、6000ng/mL、1200ng/mL、240ng/mL、48ng/mL、9.6ng/mL、1.92ng/mL、0.384ng/mL，4℃孵育60min，阳性对照为EU103；二抗为Goat F(ab')Anti-Human IgG-Fc(PE)(Abcam，ab98596),按每孔0.08μL加入U型板，4℃孵育60min，以流式细胞仪(ACEA，Novocyte 2060R)读取585nm波长下mean值，使用GraphPad进行数据分析，生成EC50值，结果如图3所示。
实验结果显示，本发明提供的人源化抗VSIG4抗体HuV5-00可与细胞表面VSIG4结合，且结合能力优于阳性对照抗体EU103。
实施例8:抗VSIG4抗体与人VSIG4亲和力的测定(Fortebio)
将VSIG4-His用SD缓冲液(0.02％Tween20+0.1％BSA溶液)稀释到浓度5ug/ml，所述人源化抗VSIG4抗体用SD缓冲液4倍浓度梯度稀释，使其浓度为10ug/ml、2.5ug/ml、0.625ug/ml、0ug/ml，选用AHC传感器固化该抗原，按fortebio Octet RED96的操作规程进行亲和力测定，具体参数及实验结果如表6所示。
表6与人VSIG4蛋白结合的亲和力测定
实验结果表明，与阳性对照抗体相比，实验数据表明，本发明提供的VSIG4人源化抗体HuV5-00和人VSIG4蛋白结合具有良好的亲和力，且亲和力数值明显优于阳性抗体EU103。
实施例9:抗CD3活化PBMC细胞因子分泌检测
将anti-CD3(2.5μg/mL)+VSIG4-Fc(5μg/mL)或IgG1(5μg/mL)加入96孔板人,4℃孵育过夜。取PBMC加入到IMDM完全培养基中，血球计数板计数并重悬为0.5M/mL，按100μL/孔加入96孔板中。将本发明提供的人源化抗体HuV5-00抗体用相同培养基配制为终浓度10μg/mL、2μg/mL和0.4μg/mL，同型对照IgG4抗体配制为0.4μg/mL，加入到96孔板中，置于37℃，5％ CO2孵箱中孵育72h，取上清120μL，按一定比例稀释后，用ELISA检测上清中IFN-γ浓度。阳性参照采用EU103，终浓度10μg/mL、2μg/mL和0.4μg/mL。具体参数及实验结果如图4和图5所示。
实验结果表明，在donor A和donor B来源的PBMC体系中，anti-CD3刺激PBMC成功，VSIG4能显著抑制anti-CD3激活PBMC分泌IFN-γ。人源化抗VSIG4抗体HuV5-00能解除VSIG4对PBMC的抑制作用，且效果明显优于阳性抗体EU103。
实施例10:巨噬细胞表型检测(FACS)
取M2 MDM细胞，按20万个/孔接种于细胞培养板，用含有human IL-4(10ng/mL)+humanIL-13(10ng/mL)+human M-CSF(50ng/mL)的完全培养液重悬细胞，放入培养箱培养48h。弃去上清后，分别加入本发明提供的人源化抗VSIG4抗体(10ug/mL)，其中一孔在给予各抗体24h后加入含LPS(10ng/mL)+human IFN-γ(10ng/mL)完全培养基，培养72h后收集细胞进行FACS检测。具体参数及实验结果如图6所示。
实验结果表明，经抗VSIG4人源化抗体HuV5-00处理的M2巨噬细胞标志物CD163表达降低，M1巨噬细胞标志物CD80表达上调，具有使巨噬细胞M2型向M1型转分化的功能。
实施例11:抗VSIG4抗体在人结直肠移植瘤模型中的抗肿瘤实验
1.实验材料
(1)实验细胞及动物
MC38小鼠结肠癌细胞，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)；
VSIG4人源化C57/BL6小鼠，雌性，8周龄，体重18-21克，购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司
(2)供试品及对照品
试验前，将本发明的人源化抗VSIG4抗体用PBS配制为2mg/mL和4mg/mL两个浓度。
(3)实验方法
用含有10％胎牛血清，100μg/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素的RMPI1640培养基在37℃、5％CO2的培养箱中培养MC38结肠癌细胞。一周一次用2mL1×EDTA溶液消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％时，收取细胞，计数，接种。将含有1×106细胞PBS同100μL的PBS混合(终体积100μL)接种于小鼠的右后后肢皮下，接种细胞数目为1×106/只。待肿瘤生长至体积达100-120mm3时开始分组，腹腔给药每周3次，每周三次用游标卡尺测量肿瘤直径，计算肿瘤体积，肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。抗体的抑瘤疗效用相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。相对肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)。RTV＝V18/V0，其中V0是分组给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，V18为给药18天测量时的肿瘤体积。记录连续给药18天测量的肿瘤体积，用GraphPad绘制瘤体积生长曲线。结果如图7所示。
表7小鼠结肠癌MC38抑制瘤模型抗肿瘤试验结果
实验结果表明，本发明提供的抗VSIG4人源化抗体HuV5-00在鼠结肠癌MC38细胞接种C57/BL6小鼠移植瘤模型中具有明显的抑制肿瘤生长作用。
以上实施例证明本发明提供的抗VSIG4抗体具有显著的抗肿瘤作用，可明显抑制肿瘤增长，提示该抗体可在制备抗肿瘤药物中的应用，具有可预期的市场前景。
尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

Claims (15)

1.一种抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(1)所述重链可变区包含选自如下组的HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(a1)如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列；
(a2)如SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列；
(a3)如SEQ ID NO:13、14和15所示的氨基酸序列；和
(a4)与(a1)、(a2)或(a3)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR；和
(2)所述轻链可变区包含选自如下组的LCDR1、LCDR2和LCDR3：
(a5)如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列；
(a6)如SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列；
(a7)如SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列；和
(a8)与(a5)、(a6)或(a7)所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR。
2.如权利要求1所述的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其具有：
所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:1、2和3或与SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:4、5和6或与SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区；
所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:7、8和9或与SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:10、11和12或与SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区；或者
所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:13、14和15或与SEQ ID NO:13、14和15所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:16、17和18或与SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区。
3.如权利要求1或2所述的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体或人源化抗体。
4.如权利要求1-3之任一项所述的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中：
(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：
(b1)如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
(b2)(b1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(b3)与(b1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：
(b4)如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
(b5)(b4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(b6)与(b4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还含有鼠源的IgG1、IgG2或其变体的重链恒定区，鼠源的k链或其变体的轻链恒定区。
6.如权利要求1-3之任一项所述的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:19经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:19功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:20，SEQID NO:20经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:20功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:21经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:21功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:22，SEQID NO:22经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:22功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；或者
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:23功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24，SEQID NO:24经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:24功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求1-3之任一项所述的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗VSIG4抗体为人源化抗体，其中：
(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：
(c1)如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；
(c2)(c1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(c3)与(c1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：
(c4)如SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；
(c5)(c4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(c6)与(c4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段，其中
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:29经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:29功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:35，SEQID NO:35经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:35功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:35具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
9.一种分离的核酸，其编码权利要求1-8之任一项所述的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段。
10.如权利要求9所述的核酸，其中：
(1)编码所述重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示；
(2)编码所述轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示。
11.一种表达载体，其包含如权利要求9或10所述的核酸。
12.一种宿主细胞，其转化如权利要求11所述的表达载体，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优先为哺乳动物细胞。
13.制备权利要求1-8任一项所述的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段的方法，包括在如权利要求12所述的宿主细胞中表达抗体，以及从宿主细胞中分离所述抗体的步骤。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1-8之任一项所述的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体。
15.如权利要求1-8之任一项所述的抗VSIG4抗体或其抗原结合片段或如权利要求14的药物组合物在制备用于抑制VSIG4活性的药物中的应用，优选地，所述抑制VSIG4活性的药物用于治疗乳腺癌、肾癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、结肠癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胆囊癌、肝癌、间皮瘤、甲状腺癌、前列腺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和/或黑素瘤。
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