CN116355096A - 重组抗人tigit抗体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合TIGIT的新抗体和抗体片段，以及包含该抗体或抗体片段的组合物，编码该抗体或其抗体片段的核酸，含有该核酸的宿主细胞，以及相关用途。

Description

重组抗人TIGIT抗体及应用
技术领域
本发明涉及抗体药物领域，具体而言，本发明涉及针对人TIGIT的抗体及其用于制备药物的用途。
背景技术
T细胞激活由共刺激信号网络协调的，该网络参与T细胞反应的所有阶段。在这些刺激网络信号中，Ig超家族(IGSF)的B7/CD28家族和TNF受体超家族的几个成员都是T细胞共刺激信号的主要分子。TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)是在T细胞亚群(诸如活化T细胞、记忆T细胞和调节T细胞)和自然杀伤(NK)细胞上表达的免疫受体。TIGIT是蛋白质Ig超家族中CD28家族的成员，并且充当限制T细胞增殖和活化以及NK细胞功能的共抑制分子。
TIGIT通过与CD226(也称为DNAM-1)竞争同一组配体来介导其免疫抑制作用，所述配体是：CD155(也称为脊髓灰质炎病毒受体或“PVR”)和CD112(也称为脊髓灰质炎病毒相关受体2或“PVRL2”)(Levin等人，Eur.J.Immunol.，2011，41：902-915)。CD155是该配体/受体网络中的主要配体，因为CD112和TIGIT之间的相互作用非常弱。CD155与CD226(DNAM-1)相互作用以共同刺激T细胞，但是因为CD155对TIGIT的亲和力高于其对CD226的亲和力，当存在TIGIT时CD226信号传导被抑制，由此限制T细胞增殖和活化。
因此，本领域存在着开发新的TIGIT抗体的需求，尤其是靶向TIGIT的CD155/CD112阻断型抗体，特别是人抗TIGIT抗体，及其组合疗法，用于疾病治疗，尤其是癌症治疗。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，通过B细胞筛选、人源化、重组等技术，获得PVR阻断型的抗人TIGIT的新抗体。
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种抗人TIGIT的抗体或其抗原结合片段，能够以高亲和力阻断TIGIT与其配体CD155(PVR)的结合，减少或消除传递至细胞的抑制性信号，增加IL-2和IFN-γ产生，并且在体内施用时抑制肿瘤生长，尤其是在与抗PD-1抗体联用时，抑瘤效果尤为显著。
本发明所述抗体的“片段”涵盖抗体的各种功能性片段或活性片段，例如其抗原结合部分，如scFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv片段。
本发明所述的“至少80％同一性”为例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％同一性等≥80％的任何百分比的同一性。
第一方面，本发明提供一种抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段，根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合：
(1)依次示于SEQ ID NO:25、26、27的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:38、39、40的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(2)依次示于SEQ ID NO:25、28、29的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:41、39、42的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(3)依次示于SEQ ID NO:30、31、32的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:43、44、45的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(4)依次示于SEQ ID NO:30、33、34的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、47、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(5)依次示于SEQ ID NO:35、36、37的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:49、50、51的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(6)依次示于SEQ ID NO:25、26、29的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:41、39、42的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(7)依次示于SEQ ID NO:30、52、32的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:43、44、45的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(8)依次示于SEQ ID NO:53、26、27的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:38、39、40的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(9)依次示于SEQ ID NO:53、26、54的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:38、39、40的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。
基于上述给定轻、重链可变区的氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定其中包含的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列。例如，根据本发明的具体实施方式，采用Kabat、IMGT、ABM及Chotia编码方法划分可变区氨基酸序列中的CDR。以本领域其他已知方法划分得到的轻重链CDR及其组合也被涵盖在本发明的范围内。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述重链可变区包含与选自SEQ IDNO:3-7、13-18的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；和
所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:8-12、19-24的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，可以“混合并匹配”来自本发明的抗体的VH和VL序列，以产生结合TIGIT的抗体。在混合和匹配这些链时，优选地，将来自具体VH/VL配对的VH序列替换为结构相似的VH序列。同样，来自特定VH/VL配对的VL序列优选地替换为结构上相似的VL序列。可以使用本领域已知的结合测定法(例如，ELISA)测试这类“混合并匹配”抗体与TIGIT的结合。同时，本发明的抗体包含所述VH序列的变体或所述VL序列的变体。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述抗体或其抗原结合片段包含的重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
(1)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(2)与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(3)与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(4)与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(5)与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(6)与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(7)与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(8)与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(9)与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(10)与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(11)与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(12)与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区。
进一步，上述抗体为全人源抗体、人源化抗体、或嵌合抗体；上述抗原结合片段为半抗体或者所述抗体的scFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv片段；
优选地，所述抗体为单克隆抗体或单链抗体；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段还包含人或鼠源的恒定区，优选包含人或鼠源的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；
更优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。
第二方面，本发明提供一种核酸分子，其编码前述任一项所述的抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段。所述核酸可以包含编码抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列的核酸，或包含编码抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列的核酸。
第三方面，本发明提供含有如上所述的核酸分子的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。
第四方面，本发明还提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。
第五方面，本发明提供一种制备抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段的方法，包括在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。为了重组产生抗人TIGIT抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并将其插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。
第六方面，本发明提供一种免疫偶联物，其包含上述中任一项的抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段、以及偶联部分；
优选地，所述偶联部分为可检测标记物、细胞毒性分子或生物活性分子；
更优选地，所述可检测标记为化学发光标记、荧光标记、酶标记、放射性标记、量子点或纳米颗粒；所述细胞毒性分子为白喉毒素、绿脓杆菌外毒素和蓖麻毒素；所述生物活性分子包含细胞因子、酶、化疗剂、脂质体或病毒颗粒。
第七方面，本发明提供一种药物组合物，其包含前述任一项的抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物，与一种或多种任选的药用辅料(Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合，来制备包含本发明的药物制剂，本发明所提供的药物的剂型并没有严格的限制，可根据药剂领域的现有方法制备成各种剂型，通过口服、鼻吸、直肠、肠胃外或经皮给药等方式施用于需要治疗的患者。优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
进一步，根据本发明的实施例，所述药物组合物还包含第二治疗剂，所述第二治疗剂可以选自包括但不限于：例如抗-PD-1抗体和抗-PD-L1抗体。优选地，第二治疗剂是PD-1拮抗剂，尤其是抗PD-1抗体(例如人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体)。抗PD-1抗体选自下组：IBI308(信迪利单抗，WO2017/025016A1)、MDX-1106(nivolumab，OPDIVO)、Merck 3475(MK-3475，pembrolizumab，KEYTRUDA)和CT-011(Pidilizumab)。优选地，PD-1抗体是pembrolizumab。
第八方面，在一些实施方案中，本发明提供一种预防、治疗和/或改善疾病的方法，尤其是表达TIGIT的肿瘤浸润性淋巴细胞浸润的实体肿瘤。所述方法包括向由此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体、宿主细胞、免疫偶联物、或药物组合物，以及任选的其他药物或手段。优选地，所述疾病为实体瘤或血液瘤。更优选地，所述实体瘤为结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、宫颈癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤或头颈癌。另外优选地，所述受试者为哺乳类动物，优选地，所述受试者为人。
本发明还提供了前述的抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段、前述的核酸分子、前述的载体、前述的宿主细胞、前述的免疫偶联物、或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗和/或改善实体瘤或血液瘤。
优选地，所述实体瘤为结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、宫颈癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤或头颈癌。
根据实施例，本发明还提供一种在受试者中阻断TIGIT与CD155的结合以降低或消除TIGIT的免疫抑制作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的前述任一项所述的抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段、或药物组合物。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源于两个或更多个物种的抗体。通常，轻链与重链两者的可变区均对应于抗体的源于一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的可变区，而恒定区与抗体中源于另一物种(通常是人)的序列同源以避免在那个物种中引发免疫应答。
“Fc区”或“Fc”是指免疫球蛋白重链的C端区，其含有铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体结合或与经典补体系统的第一组分(例如C1q)结合，包括天然序列Fc区和变异Fc区。通常，人IgG重链Fc区为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段，但其边界可能有变化。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以存在或可以不存在。Fc还可以指隔离的这一区域，或在包含Fc的蛋白多肽的情况下，例如“包含Fc区的结合蛋白”，还称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘合素)。本发明的抗体中天然序列Fc区包括人IgG1，IgG2(IgG2A，IgG2B)，IgG3和IgG4。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含抗体的两条重链的每一条的CH2和CH3恒定结构域；IgM和IgEFc区包含在每条多肽链中的三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。
“人源化抗体”是指将源自其他哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列接到人构架序列上的抗体。可以在人构架序列内进行额外的构架区修饰。
“序列同一性”是指在比较窗中以逐个核苷酸或逐个氨基酸为基础的序列相同的程度。可以通过以下方式计算“序列同一性百分比”：将两条最佳比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同一性百分比。为了确定序列同一性百分数而进行的最佳比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。
“单克隆抗体”或“单抗”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。术语“免疫结合”是指发生在抗体分子和抗原(对于该抗原而言抗体为特异性的)之间的特异性结合反应。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(KD)表示，其中KD值越小，表示亲和力越高。两分子间的的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。指特定抗体-抗原相互作用的“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出，可用任何有效的方法测量KD、Ka和Kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或KinExa来测量解离常数。
“载体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。
“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cDNA。
在下面的附图和具体实施方案中进一步说明本发明。然而，这些附图和具体实施方案不应被认为限制本发明的范围，并且本领域技术人员容易想到的改变将包括在本发明的精神和所附权利要求的保护范围内。
附图说明
图1A-G显示了嵌合抗体抑制hPVR结合human TIGIT活性
图2A-C显示了嵌合抗体报告基因生物学活性
图3显示了嵌合抗体对猴子TIGIT交叉结合活性
图4A-C显示了人源化抗体报告基因生物学活性
图5A-H显示了人源化抗体的小鼠PK曲线
图6显示了抗TIGIT人源化抗体提高CEFT活化PBMC分泌IFN-γ的功能
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1：鼠抗筛选
1.1动物免疫
采用CHO-K1表达，C末端融合了6个组氨酸标签的Human TIGIT(NP_776160.2)(Met1-Phe138)蛋白。按照常规弗氏佐剂免疫程序免疫4只BALB/c小鼠，分两批进行免疫，每批2只，两批之间间隔两周。每批动物进行4次免疫，采用Human TIGIT his进行ELISA检测，如果动物血清效价>1:100000,则进行动物终免，3-4天之后收集脾脏。
1.2B细胞淘选及培养
在进行正式实验前2天，将饲养细胞使用培养基铺到4个10cm培养皿(corning,cat.430167)中，在正式实验前1天将饲养细胞按照10000个/孔铺96孔板40块(corning,cat.3599)，100μL/孔。同时，使用包被的抗原Human TIGIT his对收集的免疫后小鼠B细胞进行淘选，将淘选获得B细胞铺到上述已经铺有饲养细胞的96孔板中。37℃、5％CO2培养10～14天，取B细胞培养上清进行ELISA和cell-based assay筛选。
1.3鼠抗上清筛选
鼠抗结合Human TIGIT his ELISA筛选：将上述的免疫原C末端融合了6个组氨酸标签的Human TIGIT(NP_776160.2)(Met1-Phe138)蛋白采用包被缓冲液稀释到1μg/mL，50μL/孔，4℃包被过夜；第二天将包被板取出用PBST洗涤3次，再用封闭液室温孵育1h，PBST再洗涤3次，将已经形成明显克隆的B细胞孔内上清加入到ELISA板中；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入羊抗鼠二抗(1：10000)，50μL/孔；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入TMB 50μL/孔，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值。以阴性对照OD值10倍以上作为阳性判定标准，挑取阳性克隆进行B细胞测序。
实施例2：抗体工程
2.1 B细胞测序
按照PureLinkTM RNA Mini Kit说明书提取B细胞克隆mRNA，并分装保存于-80℃；以提取的mRNA作为模板，采用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit方案逆转录成cDNA，并分装保存于-80℃。
采用表1和表2所示的重链VH钓取引物和轻链VL钓取引物，以上述cDNA为模板，采用Ex Taq酶扩增VH和VL，然后连接到pMD18T载体送测序。将测序获得的VH和VL分别构建到hIgG1和hKappa恒定区N端。
表1重链VH钓取引物
Figure BDA0004072011620000101
Figure BDA0004072011620000111
表2轻链VL钓取引物
Figure BDA0004072011620000112
Figure BDA0004072011620000121
Figure BDA0004072011620000131
2.2嵌合抗体的重组表达及筛选
(1)嵌合抗体重组表达
将来自相同克隆的轻重链搭配转染CHO-K1细胞，转染24h后加入10μg/mL MSX加压筛选，待细胞密度和活力恢复后接种进行Feed-batch表达，将表达完成后的上清离心并经protein A纯化，采用BCA法定量抗体浓度后用于定量筛选。
嵌合抗体的命名以包含的轻重链(HL)所来自的细胞克隆编号表示，例如嵌合抗体“1718-308HL”表示来自1718-308细胞克隆的嵌合抗体，其重链为1718-308H，轻链为1718-308L。
(2)嵌合抗体亲和力测定
采用Tiragolumab作为对照抗体，Tiragolumab来源于专利CN108290946B，其中Tiragolumab重链可变区见该专利SEQ ID NO：34，轻链可变区见该专利SEQ ID NO：36。
实验均在25℃条件下，1×HBS-EP+缓冲液中操作。各嵌合抗体浓度5μg/ml，捕捉于Protein A芯片表面，捕捉时间60s。human TIGIT his注射溶液，浓度起始10nM，两倍梯度稀释6个点，监测缔合180s，监测解离600s，通过注射pH1.5的甘氨酸溶液获得传感器表面的再生。动力学数据使用1：1结合模型分析。根据拟合情况去掉了最高浓度点。具体结果可见表3，由表3可知嵌合抗体1718-85HL2、16-537HL等的亲和力明显优于对照抗体Tiragolumab。
表3嵌合抗体亲和力测定
Figure BDA0004072011620000132
/>
Figure BDA0004072011620000141
(3)嵌合抗体抑制hPVR结合human TIGIT活性筛选
将human TIGIT Fc蛋白(南京诺艾新生物技术有限公司自制，NP_776160.2(Met1-Phe138)融合到人IgG1 FC N端)使用包被液稀释到50μg/mL，按照50μL/孔包到96孔板中，4℃冰箱孵育过夜；PBST洗涤三次，按照100μL/孔加入封闭液，室温孵育1h；PBST洗涤三次。使用稀释液将biotin-hPVRhis(南京诺艾新生物技术有限公司自制,(NP_006496.3)(Met1-Asn343)，在C末端融合6个组氨酸)稀释到浓度100ng/mL，使用稀释液将嵌合抗体稀释到起始浓度20μg/ml，然后3倍稀释，共8个浓度，将稀释好的biotin-hPVRhis与稀释好的嵌合抗体1:1混合，按照50μL/孔加入到96孔板中，室温孵育1h；PBST洗涤三次，加入采用稀释液10000倍稀释的HRP标记的链霉亲和素(购自美国Jackson ImmunoResearchLaboratories)，50μL/孔，室温孵育1h；PBST洗涤三次，TMB(购自Thermo)按照50μL/孔加到96孔板中，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值，结果见表4和图1A-G。由此结果可知所获得嵌合抗体1718-57HL、1718-278HL等在抑制hPVR结合humanTIGIT Fc活性中明显优于Tiragolumab。
表4嵌合抗体抑制hPVR结合human TIGIT活性以及相较于Tiragolumab的相对活性
Figure BDA0004072011620000151
/>
Figure BDA0004072011620000161
(4)嵌合抗体报告基因生物学活性筛选
取对数生长的CD155/TCR Activator/CHO细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)，胰酶(购自Thermo)消化重悬于新鲜的含10％FBS的F12K培养基(购自Thermo)中，将重悬的细胞密度调整为4*105/mL。将重悬的细胞接种到白壁透明底的96孔细胞培养板中，100μL/孔细胞悬液，37度培养箱培养过夜。第二天将接种CD155/TCR Activator/CHO细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)的96孔板内F12K培养基吸干，另用10％血清RPMI1640培养基对样品进行梯度，加入梯度稀释的2*浓度样品(50μL/孔)到接种好细胞的96孔板(购自corning)中，样品从最高浓度60μg/mL(2*浓度)开始，3倍稀释11个浓度梯度，并另外设置空白培养基对照孔。取对数期生长的TIGIT/NFAT-Luc/Jurkat细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)离心弃上清，重悬于新鲜的10％FBS的RPMI1640培养基(购自Thermo)中将重悬的细胞密度调整为4*105/mL,然后将细胞加到上述的96孔板中，每孔50μL，放置37度培养箱中继续培养5到6小时。将96孔板从培养箱中取出，加入100μL/孔Bright-GloTM萤光素酶检测试剂(购自promega)放置3到5分钟，放入酶标仪中读取数值。根据每个梯度浓度孔对应的读值，利用Prism Graphpad软件拟合样品对细胞激活的梯度曲线，并且计算样品的EC50，结果见表5和图2A-C。由此结果可知所获得嵌合抗体1718-27HL、1718-57HL、1718-59HL、1718-85HL2、1718-155HL2、1718-248HL、1718-264HL、1718-278HL、1718-293HL1、1718-308HL、1718-512HL在报告基因生物学活性上均明显优于Tiragolumab。
表5嵌合抗体报告基因生物学活性以及相较于Tiragolumab的相对活性
Figure BDA0004072011620000171
Figure BDA0004072011620000181
(5)嵌合抗体对猴子TIGIT交叉结合活性
cyno TIGIT his((购自上海近岸生物科技有限公司)用包被缓冲液稀释到1μg/mL，按照50μL/孔加入96孔板内，4℃包被过夜；第二天将包被板取出用PBST洗涤3次；再用封闭液室温孵育1h，PBST再洗涤3次。嵌合抗体从2000ng/mL起始3倍稀释，共8个浓度，按照50μL/孔加入该96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入羊抗人二抗(1:10000)，按照50μL/孔加入96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，按照50μL/孔加TMB到96孔板内，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值，结果见图3。由图3可知所获得嵌合抗体均与猴子TIGIT交叉结合。
实施例3：嵌合抗体的人源化
选择嵌合抗体1718-85HL2、1718-116HL、1718-264HL、1718-308HL、16-576HL抗体进行人源化设计。
将嵌合抗体1718-85HL2、1718-116HL、1718-264HL、1718-308HL、16-576HL的重链和轻链可变区序列与人种系序列进行比较，该比较是对IMGT数据库进行的blast搜索。从该组人种系基因中去除冗余基因以及那些具有未配对半胱氨酸的基因。在框架和CDR区两者中选择其余最接近匹配人种系基因作为受体人框架。基于IGHJ/IGJK种系基因的序列相似性选择FR-4。表6～表10显示了嵌合抗体1718-85HL2、1718-116HL、1718-264HL、1718-308HL、16-576HL等5个嵌合抗体的人源化序列形式，其中以下划线示出了相应的CDR(根据增强Chothia/AbM CDR的定义)。
表6嵌合抗体1718-85HL2重轻链可变区的人源化序列形式
Figure BDA0004072011620000191
表7嵌合抗体1718-116HL重轻链可变区的人源化序列形式
Figure BDA0004072011620000201
表8嵌合抗体1718-264HL重轻链可变区的人源化序列形式
Figure BDA0004072011620000202
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Figure BDA0004072011620000211
表9嵌合抗体1718-308HL重轻链可变区的人源化序列形式
Figure BDA0004072011620000212
表10嵌合抗体16-576HL重轻链可变区的人源化序列形式
Figure BDA0004072011620000213
/>
Figure BDA0004072011620000221
实施例4：人源化抗体重组表达及筛选
4.1人源化抗体重组表达
以SEQ ID NO.1所示重链恒定区和SEQ ID NO.2所示轻链恒定区，构建源自于相同嵌合的人源化轻重链，进行搭配并转染CHO-K1细胞，转染24h后加入10μg/mL MSX进行加压筛选，待细胞密度和活力恢复后接种进行Feed-batch表达，将表达完成后的离心上清经protein A纯化，采用BCA法定量抗体浓度后用于定量筛选。
人源化抗体及其重轻链可变区的搭配方式见表11。
表11人源化抗体的轻重链可变区序列搭配
人源化抗体 重链 轻链
1718-116H2L1 1718-116H-HZ2 1718-116L-HZ1
1718-264H2L1 1718-264H-HZ2 1718-264L-HZ1
1718-308H0L1 1718-308H-HZ0 1718-308L-HZ1
16-576H5L1 1718-576H-HZ5 1718-576L-HZ1
1718-85H12L0 1718-85H-HZ12 1718-85L-HZ0
1718-85H12L1 1718-85H-HZ12 1718-85L-HZ1
1718-85H13L1 1718-85H-HZ13 1718-85L-HZ1
4.2人源化抗体亲和力测定
实验均在25℃条件下，1×HBS-EP+缓冲液中操作。各嵌合抗体浓度5μg/ml，捕捉于Protein A芯片表面，捕捉时间60s。human TIGIT his注射溶液，浓度起始10nM，两倍梯度稀释6个点，监测缔合180s，监测解离600s，通过注射pH1.5的甘氨酸溶液获得传感器表面的再生。动力学数据使用1：1结合模型分析。根据拟合情况去掉了最高浓度点。具体结果可见表12，由表12可知人源化抗体1718-85H13L1、1718-308H0L1等的亲和力明显优于对照抗体Tiragolumab。
表12人源化抗体亲和力测定
人源化抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
Triagolumab 5.87E+05 1.50E-04 2.55E-10
1718-116H2L1 7.48E+05 2.37E-04 3.17E-10
1718-264H2L1 5.76E+05 2.11E-04 3.66E-10
1718-308H0L1 9.59E+05 2.17E-04 2.26E-10
16-576H5L1 9.13E+05 2.30E-04 2.52E-10
1718-85H12L0 1.04E+06 3.36E-04 3.24E-10
1718-85H12L1 1.23E+06 3.34E-04 2.72E-10
1718-85H13L1 1.31E+06 2.44E-04 1.87E-10
4.3人源化抗体报告基因生物学活性筛选
取对数生长的CD155/TCR Activator/CHO细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)，胰酶(购自Thermo)消化重悬于新鲜的含10％FBS的F12K培养基(购自Thermo)中，将重悬的细胞密度调整为4*105/mL。将重悬的细胞接种到白壁透明底的96孔细胞培养板中，100μL/孔细胞悬液，37度培养箱培养过夜。第二天将接种CD155/TCR Activator/CHO细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)的96孔板内F12K培养基吸干，另用10％血清RPMI1640培养基对样品进行梯度，加入梯度稀释的2*浓度样品(50μL/孔)到接种好细胞的96孔板(购自corning)中，样品从最高浓度60μg/mL(2*浓度)开始，3倍稀释11个浓度梯度，并另外设置空白培养基对照孔。取对数期生长的TIGIT/NFAT-Luc/Jurkat细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)离心弃上清，重悬于新鲜的10％FBS的RPMI1640培养基(购自Thermo)中将重悬的细胞密度调整为4*105/mL,然后将细胞加到上述的96孔板中，每孔50μL，放置37度培养箱中继续培养5到6小时。将96孔板从培养箱中取出，加入100μL/孔Bright-GloTM萤光素酶检测试剂(购自promega)放置3到5分钟，放入酶标仪中读取数值。根据每个梯度浓度孔对应的读值，利用Prism Graphpad软件拟合样品对细胞激活的梯度曲线，并且计算样品的EC50，结果见表13和图4A-C。由此结果可知所获得人源化抗体1718-308H0L1在报告基因生物学活性上明显优于Tiragolumab。
表13人源化抗体报告基因生物学活性以及相较于Tiragolumab的相对活性
人源化抗体 EC50(ug/ml) 相对活性(％)
Triagolumab 1.85 -
1718-116H2L1 3.16 58.54
1718-264H2L1 2.44 75.82
1718-308H0L1 1.66 111.45
Triagolumab 1.51 -
16-576H5L1 2.29 65.94
1718-85H12L0 1.9 79.47
1718-85H12L1 1.5 100.6
Triagolumab 1.23 -
1718-85H13L1 1.33 92.48％
4.4人源化抗体野生型小鼠PK试验
4～6周BALB/c小鼠(卡文斯百格(苏州)模式动物研究有限公司)，个体体重15-23g，性别：雌性，适应期一周；适应期后，将小鼠随机分17组，每组5只。根据组别分别进行给药，给药剂量：5mg/kg，给药途径：腹腔注射(i.p.)，给药抗体：Triagolumab、1718-116H2L1、1718-264H2L1、1718-308H0L1、16-576H5L1、1718-85H12L0、1718-85H12L1、1718-85H13L1，记录给药时间。每组小鼠在给药前(0hr)及给药后4hr、8hr、24hr(1d)、72hr(3d)、120hr(5d)、168hr(7d)、240hr(10d)、288hr(12d)、336hr(14d)分别进行采血，并收集血清，-60～-80℃保存。
小鼠PK血药浓度检测方法如下：
①包被：将C末端融合了6个组氨酸标签的Human TIGIT(NP_776160.2)(Met1-Phe138)蛋白(南京诺艾新生物技术有限公司自制)使用包被缓冲液(无水碳酸钠1.59g、无水碳酸氢钠2.93g，溶解于900mL超纯水，用1M盐酸调整pH值至9.6，加超纯水水补足1L)稀释到0.5μg/mL，加入96孔ELSIA板内，100μL/孔，封膜。2-8℃放置15-20小时。使用PBST(pH7.2-7.4，Tween-200.05％v/v)洗涤3次。
②封闭与干燥：使用N502(thermo)封闭，200μL/孔，室温封闭1-2hr。吸去N502(thermo)封闭液。在25℃恒温箱内干燥>1hr。立即使用或封膜放置于2-8℃。
③标曲和质控品制备：将抗体样品使用小鼠血清(上述BALB/c小鼠采取)稀释至10000ng/mL，随后3倍梯度稀释(含1000ng/mL共8个点)。
④待测样品处理：获得各个采血点样品，使用纯小鼠血清稀释1000倍。
⑤标曲、QC及待测样品稀释：采用0.1％酪蛋白(pH6.2，使用PBS6.2稀释酪蛋白母液)稀释10倍(例如10μL+90μL)，加入干燥后的板内，50μL/孔，每个样品2个复孔。封膜，室温孵育2hr。使用PBST(pH7.2-7.4，Tween-20 0.05％v/v)洗涤3次。
⑥二抗孵育：将Goat anti-Human IgG Fc-HRP(Jackson)使用10％山羊血清稀释50000倍，加入板内，50μL/孔，封膜，室温孵育1hr。使用PBST(pH7.2-7.4，Tween-20 0.05％v/v)洗涤3次。
⑦显色：将已温育至室温的TMB加入板内，50μL/孔，避光反应20min。
⑧终止与读数：2M硫酸，100μL/孔，轻敲板，混匀。于450nm参比650nm读数，计算待测样品浓度。
试验结果显示8个抗体的半衰期均超过120h，具体结果见图5，其中Triagolumab和1718-85H13L1的半衰期均超过200h。
4.5抗TIGIT人源化抗体提高CEFT活化PBMC分泌IFN-γ的功能实验
本测试用于评价抗TIGIT人源化抗体单独用药或与抗PD-1抗体联合用药，对用抗原肽混合物CEFT(购自JPT Peptide Technologies公司，货号：PM-CEFT-4)刺激的PBMC产生IFN-γ的影响。采用PBMC(购自妙通(上海)生物科技有限公司)，用含100IU/ml IL-2和4μg/ml抗原肽混合物CEFT的RPMI 1640(购自thermo)+10％FBS(购自thermo)培养基重悬PBMC，调整细胞密度为1╳106个/ml，接种于96孔板U底板(购自corning)，100μl/孔；将20μg/ml的Triagolumab、1718-85H13L1、同型IgG对照抗体与抗PD-1抗体pembrolizumab(南京诺艾新生物技术有限公司自制)的组合物，加入到96孔板中，100μl/孔，设双复孔；于37℃、5％CO2培养箱中培养6天后，取上清，使用IFN-γELISA试剂盒(购自R&D公司)测定IFN-γ上清浓度，结果如图6所示。由图6可知，Triagolumab和1718-85H13L1均能够显著促进IFN-γ分泌，且与PD-1抗体的联用效果也优于单药组，无论是单药还是联用PD-1抗体1718-85H13L1均明显优于Triagolumab。

Claims (17)

1.一种抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合：
(1)依次示于SEQ ID NO:25、26、27的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:38、39、40的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(2)依次示于SEQ ID NO:25、28、29的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:41、39、42的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(3)依次示于SEQ ID NO:30、31、32的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:43、44、45的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(4)依次示于SEQ ID NO:30、33、34的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、47、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(5)依次示于SEQ ID NO:35、36、37的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、50、51的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(6)依次示于SEQ ID NO:25、26、29的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:41、39、42的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(7)依次示于SEQ ID NO:30、52、32的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:43、44、45的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(8)依次示于SEQ ID NO:53、26、27的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:38、39、40的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(9)依次示于SEQ ID NO:53、26、54的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:38、39、40的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:3-7、13-18的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；和
所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:8-12、19-24的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
(1)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:8所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(2)与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:9所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(3)与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:10所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(4)与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:11所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(5)与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:12所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(6)与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:19所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(7)与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:20所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(8)与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:21所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(9)与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:22所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(10)与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:23所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(11)与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:24所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
(12)与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区；和，与SEQID NO:24所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为全人源抗体、人源化抗体、或嵌合抗体；所述抗原结合片段为半抗体或者所述抗体的scFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv片段。
5.根据权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体或单链抗体。
6.根据权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含人或鼠源的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)。
7.根据权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。
8.一种核酸分子，其编码权利要求1-7任一项所述的抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段。
9.一种表达载体，其包含权利要求8所述的核酸分子。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求8所述的核酸分子和/或权利要求9所述的载体。
11.制备权利要求1-7任一项所述的抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段的方法，其包含培养权利要求7所述的宿主细胞，从培养产物中分离纯化获得所述抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段。
12.一种免疫偶联物，其特征在于，包含权利要求1-7中任一项的抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段、以及偶联部分；所述偶联部分为可检测标记物、细胞毒性分子或生物活性分子。
13.根据权利要求12所述的免疫偶联物，其特征在于，所述可检测标记为化学发光标记、荧光标记、酶标记、放射性标记、量子点或纳米颗粒；所述细胞毒性分子为白喉毒素、绿脓杆菌外毒素或蓖麻毒素；所述生物活性分子为细胞因子、酶、化疗剂、脂质体或病毒颗粒。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1-7任一项的抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段、或权利要求12-13任一项所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的辅料。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其包含第二治疗剂，所述第二治疗剂选自抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
16.权利要求1-7任一项所述的抗人TIGIT抗体或其抗原结合片段、权利要求8所述的核酸分子、权利要求9所述的载体、权利要求10所述的宿主细胞、权利要求12-13任一项所述的免疫偶联物、或权利要求14-15任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗和/或改善实体瘤或血液瘤。
17.根据权利要求16所述的用途，所述实体瘤为结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、宫颈癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤或头颈癌。
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