KR20220007120A - 항-cd25 항체 및 이의 적용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD25에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 치료용 암 약물의 제조를 위한 이의 용도를 제공한다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특이적 상보성-결정 영역 서열을 함유하는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 항체 또는 항원-결합 단편은 하기 장점 중 하나 이상을 갖는다: 증강된 CD25 단백질 결합 능력, 증강된 CD25 단백질 친화도, 증강된 CD25 발현 세포 사멸 능력, 약화된 PBMC 활성화 억제, 증강된 생체내 종양 성장 억제 능력, 증강된 생체내 종양 사멸 능력, 증강된 Treg 세포수 감소 능력, 또는 증강된 효과기 T 세포수 증가 능력.

Description

항-CD25 항체 및 이의 적용
본 발명은 일반적으로 생물의약 분야, 보다 구체적으로, CD25에 결합하는 항체, 및 이의 적용에 관한 것이다.
조절 T 세포(Treg)는 면역 항상성의 매개에서 중추적 역할을 담당하며, 말초 관용성의 확립 및 유지를 촉진할 수 있다. 그러나, 이의 역할은 암의 맥락에서 보다 복잡해진다. 암 세포는 이의 자체 종양-연관 항원을 발현하므로, 효과기 세포의 반응을 억제하는 Treg의 존재는 종양 진행을 촉진할 수 있다. 따라서, 확립된 종양에서 Treg의 침윤은 유효성에 대한 주요 장애 중 하나이다. 억제 기전을 사용하는 Treg는 현재의 치료법, 특히 항-종양 반응의 유도 또는 증강에 의존하는 면역치료법의 제한 그리고 심지어 실패에 상당한 기여를 하는 것으로 여겨진다(Onishi H et al., 2012 Anticanc. Res. 32, 997-1003). Treg의 종양 침윤은 또한 불량한 예후를 갖는 몇몇 인간 암과 연관된다(Shang B et al., 2015, Sci Rep. 5:15179). Treg 세포는 마우스 모델에서 종양의 확립 및 진행에 기여하고 이의 부재는 종양 진행에서의 지연을 야기하는 것으로 증명되었다. 인간에서, 높은 비율의 종양 Treg 세포의 침윤, 보다 중요하게는, 낮은 비의 효과기 T 세포(Teff) 대 Treg 세포는 다양한 인간 암의 불량한 예후와 연관된다(Shang et al., 2015).
CD25는 Treg 고갈을 달성하기 위한 잠재적 분자 표적 중 하나이다. CD25는 인터류킨-2 고친화도 수용체 알파쇄(IL-2Rα)로도 알려져 있다. CD25는 Treg 상에서 고수준으로 발현되지만, CD25는 Teff 상에 존재하지 않거나 저수준으로 발현된다.
선행 기술에서, CD25에 결합하지만 CD25에 대한 IL2의 결합을 차단하지 않는 항체, 예컨대 MA251(Rubin et al., 1985, Hybridoma 4(2) 91-102, Tanaka et al., 1986, Microbiol. Immunol 30(4), 373-388)이 존재하지만, 이들에는 여전히 결함, 예컨대 불충분한 CD25 결합 활성, PBMC 활성화의 억제, 및 일반적인 약물동력학 성능이 존재한다.
질병 치료를 위한 의약에 대한 환자 요구, 특히 항체 약물에 대한 요구에 직면하여, 여전히 더 높은 결합 활성을 갖는 항-CD25 항체를 제공할 긴급한 임상적 요구가 존재한다.
본 발명의 전체 텍스트에서, VL(경쇄 가변 영역), VH(중쇄 가변 영역), LCDR(경쇄 상보성 결정 영역), HCDR(중쇄 상보성 결정 영역), LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3에 관한 다양한 구현예는 개별적으로 또는 임의의 조합으로 구현될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 HCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14로 나타내고, HCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 15로 나타내고, HCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16으로 나타낸다. 또한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역이 추가로 포함되며, 여기서 LCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11로 나타내고, LCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12로 나타내고, LCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13으로 나타낸다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에는 SEQ ID NO: 4로 나타내는 중쇄 가변 영역이 포함되며; 바람직하게는, SEQ ID NO: 3으로 나타내는 경쇄 가변 영역이 추가로 포함된다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 3개의 경쇄 상보성 결정 영역으로서, LCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5로 나타내고, LCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6으로 나타내고, LCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7로 나타내는 경쇄 상보성 결정 영역; 및/또는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역으로서, HCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8로 나타내고, HCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9로 나타내고, HCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10으로 나타내는 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 나타내는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO: 2로 나타내는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 20이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 17이다.
구체적으로, 본 발명에서 제공되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에는 바람직하게는 SEQ ID NO: 3으로 나타내는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 4로 나타내는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 20으로 나타내는 아미노산 서열의 경쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 17로 나타내는 아미노산 서열의 중쇄 불변 영역이 포함된다.
구체적으로, 본 발명에서 제공되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에는 바람직하게는 SEQ ID NO: 1로 나타내는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 2로 나타내는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 20으로 나타내는 아미노산 서열의 경쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 17로 나타내는 아미노산 서열의 중쇄 불변 영역이 포함된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD25, 바람직하게는 인간 CD25에 결합한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv 단편, dsFv 단편 등을 포함하는 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 양태의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이거나, 벡터는 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현할 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다; 바람직하게는, 바이러스 벡터에는 비제한적으로 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등이 포함된다; 바람직하게는, 벡터는 비-바이러스 벡터일 수 있다; 바람직하게는, 벡터는 포유류 세포 발현 벡터일 수 있다; 바람직하게는, 발현 벡터는 박테리아 발현 벡터일 수 있다; 그리고 바람직하게는, 발현 벡터는 진균 발현 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 세포를 발현할 수 있는 세포에 관한 것이다. 바람직하게는 세포는 박테리아 세포이다; 바람직하게는 박테리아 세포는 대장균(E. coli) 세포 등이다; 바람직하게는 세포는 진균 세포이다; 바람직하게는 진균 세포는 효모 세포이다; 바람직하게는 효모 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포 등이다; 바람직하게는 세포는 포유류 세포이다; 바람직하게는 포유류 세포는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) 세포(CHO), 인간 배아 신장 세포(293), B 세포, T 세포, DC 세포, NK 세포 등이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터 또는 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이며, 바람직하게는 약학 조성물에는 약학적으로 허용 가능한 부형제가 추가로 포함되고, 약학적으로 허용 가능한 벡터에는 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 용매, 분산제, 첨가제, 가소제 등 중 하나 이상이 포함된다.
일부 구현예에서, 약학 조성물에는 다른 치료제가 추가로 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 다른 치료제에는 화학치료제, 면역치료제, 또는 호르몬 치료제가 포함된다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 다른 치료제의 조합된 투여는 치료제의 치료 효과를 증강시킬 수 있다.
일부 구현예에서, "치료 효과를 증강시킨다"는 다른 치료제 또는 치료법의 치료 효과 증강을 나타낸다. 본 발명에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편은 개별적으로 또는 다른 치료제 또는 치료법과 조합되어 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 다른 치료제 또는 치료법에는 화학치료제, 면역치료제, 호르몬 치료제, 방사선치료법 및 수술이 포함된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 질병의 치료 또는 예방용 약제의 제조에서의 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터 또는 세포의 적용에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 진단 또는 검출 키트의 제조에서의 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 핵산의 적용에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체에 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질병을 치료하거나 방지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체 또는 샘플에 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 핵산 또는 키트를 투여하는 단계를 포함하는, 진단 또는 검출 방법이 제공된다. 바람직하게는, 방법은 질병을 진단하거나 검출하는 방법이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 질병의 치료 또는 예방을 위한 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 검출 또는 진단을 위한 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 또는 키트의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 용도는 질병을 진단하거나 검출하기 위한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 질병은 암이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 암에는 위암, 식도암, 두부경부암, 방광암, 자궁경부암, 육종, 세포종, 폐암, 결장암, 난소암, 신장암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 흑색종, 유방암, 골수종, 교종, 백혈병, 림프종 등이 포함된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법에 관한 것이며, 여기에는 상기 벡터로 세포를 전달감염시키는 단계, 전달감염된 세포에 의해 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 단계가 포함되거나; 상기 세포로 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 단계가 포함된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명에서 제공되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 장점 중 하나 이상을 갖는다: 증강된 CD25 단백질 결합 활성, 증강된 CD25 단백질 친화도, 증강된 CD25 발현 세포 사멸 능력, 감소된 PBMC 활성화 억제, 증강된 생체내 종양 성장 억제 능력, 증강된 생체내 종양 사멸 능력, 증강된 Treg 세포수 감소 능력, 또는 증강된 효과기 T 세포수 증가 능력.
본 발명의 구체적 구현예 또는 선행 기술의 기술적 해결책을 보다 명확히 설명하기 위해, 구체적 구현예 또는 선행 기술의 설명을 위해 요구되는 도면이 아래에서 간략히 설명될 것이다. 명백하게, 하기 기재에서의 도면은 본 발명의 일부 구현예이며, 당업자는 발명의 창의적 수행 없이 이들 도면에 기반하여 다른 도면을 수득할 수 있다.
도 1은 7회 면역화(62500배 희석) 후 실시예 1에서의 면역화 방식의 BoAn-hMab1 마우스의 혈청 역가를 나타낸다;
도 2a 내지 도 2e는 실시예 3에서 ELSIA 검출에 의한 CD25 항체 및 CD25의 결합 민감도를 나타낸다;
도 3a 내지 도 3b는 실시예 3에서 후보 항체의 시뮬레이션된 사멸 활성의 검출 결과를 나타낸다;
도 4는 실시예 3에서 후보 항체의 세포 차단 활성의 검출 결과를 나타낸다;
도 5는 실시예 4에서 붉은털 원숭이의 Treg 세포의 함량 감소에 대한 CD25Q2-BA9-IgG1의 효과를 나타낸다;
도 6은 실시예 4에서 게잡이 원숭이에서의 후보 항체의 약물 대사를 나타낸다;
도 7a 내지 도 7b는 실시예 5.1에서의 B-hIL2Rα 인간화 마우스 MC38 결장암 동물 모델에서 후보 항체의 유효성 결과를 나타내며, 여기서 도 7a는 MC38 종양 모델 마우스의 체중 데이터를 나타내고, 도 7b는 MC38 종양 모델의 종양 부피 데이터를 나타낸다.
도 8a는 실시예 5.2에서 CD3에서의 CD8+ 세포(Teff)의 함량을 나타낸다.
도 8b는 실시예 5.2에서 CD3에서의 CD25+ Foxp3+ 세포(Treg)의 함량을 나타낸다.
도 8b는 실시예 5.2에서 CD4에서의 Foxp3+ 세포(Treg)의 함량을 나타낸다.
본 발명의 기술적 해결책은 도면과 관련하여 아래에서 명확하게 전체적으로 설명될 것이며, 명백하게, 기재된 구현예는 모든 구현예가 아니라, 본 발명의 구현예의 일부이다. 본 발명의 구현예에 기반하여, 발명의 창의적 수행 없이 당업자에 의해 수득된 모든 다른 구현예는 본 발명의 보호 범위 내에 속한다.
본 발명의 전체 텍스트를 통해 기재된 상이한 구현예에 연루된 기술적 특징은 서로와의 조합으로 구현될 수 있다.
실시예 1 항-CD25 모노클로날 항체의 생산
1.1 면역화 방식
CD25(Sino Biological, 카탈로그 번호 10165-H08H)를 프로인트 아주반트로 유화시켜 Boan bio의 완전 인간 항체 트랜스제닉 마우스 BoAn-hMab1(중국 특허 CN103571872B에 기재된 방법에 따라 제조됨)을 면역화한다. 첫 번째 면역화는 프로인트 완전 아주반트(Sigma, 카탈로그 번호: F5881-10ML)를 사용하며, 두 번째 면역화부터 6번째 면역화까지는 프로인트 불완전 아주반트(Sigma, 카탈로그 번호: F5506-10ML)를 사용하여, 이 때 총 14마리 마우스를 면역화하였다. 더 높은 혈청 역가를 갖는 7마리 마우스를 추가접종 면역화를 위해 선택하고, 마우스를 3일 후 희생시켜 후속 실험을 위해 비장을 제거하였다. 마우스의 혈청 역가(62500배 희석)를 도 1에 나타낸다.
1.2 파지 라이브러리의 확립
RNA를 1.1에서 면역화된 마우스의 비장 세포로부터 추출한 후, cDNA로 역전사하고, 파지 라이브러리를 확립하는 단계를 문헌[Carlos F. Barbas III, Phage display: A laboratory manual]에 기재된 방법을 참조하여 수행하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 PCR 방법에 의해 cDNA로부터 수득한 후, scFv를 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 중첩 연장 PCR에 의해 수득하고, scFv를 소화 후 플라스미드 pCOMB3x와 결찰한 후, 결찰 산물을 대장균(E. coli) TG1 적격 세포 내로 전기전달감염시키고, 인큐베이션한 후 TG1을 감염시키기 위해 파지를 첨가하고, 농축된 배양 상청액이 본 발명의 파지 라이브러리이다.
1.3 파지 라이브러리 스크리닝(2개 방법)
(1) 플레이트 스크리닝: 플레이트를 1 ㎍/웰로 CD25 단백질(Sino Biological, 10165-H08H)로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 방치하고, 다음 날 플레이트를 1 h 동안 2% BSA로 씰링하고, 파지 라이브러리(2 × 1012)에 첨가하여 2 h 동안 인큐베이션하고, 4회 내지 10회 세척한 후 CD25에 특이적으로 결합된 파지를 용출 완충액(500 ㎖의 초순수에 4.2 ㎖의 진한 염화수소산(Comeo)을 첨가하고 글리신 분말(Biotopped, BG0617-500)로 pH를 2.2로 조정함) 또는 15 ㎍/㎖ MA251로 용출한다.
(2) 자기 비드 스크리닝: CD25-Fc 단백질(Sino Biological, 10165-H02H)을 일반 단계에 따라 바이오틴화하고, Thermo 자기 비드(Invitrogen Dynabeads M-280 스트렙타비딘, 00355871)에 결합시킨 후 파지 라이브러리와 인큐베이션하고, 4회 내지 10회 세척한 후 CD25에 특이적으로 결합된 파지를 용출 완충액(pH 2.2) 또는 15 ㎍/㎖ MA251로 용출한다.
스크리닝된 파지 클론은 scFv를 발현하며, scFv 및 CD25의 결합을 검출하고, IL2/CD25 결합에 대한 scFv의 차단을 검출하고, CD25에 잘 결합하고 후속 작제를 위해 CD25를 차단하지 않는 scFv를 선택한다.
scFv 및 CD25 결합의 ELISA 검출: CBS 완충액의 제조: 1.59 g의 Na2CO3(Sinopharm, 10019260) 및 2.93 g의 NaHCO3를 칭량하고, 증류수를 1 ℓ가 되게 첨가하여 CBS 완충액을 제조하였다. CD25(10165-H08H, Sino Biological) 단백질을 pH 9.6 CBS로 0.2 ㎍/㎖로 희석하고, 효소-표지 플레이트를, 100 ㎕/웰로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다; 플레이트의 세척 후 씰링을 위해 3% 탈지 분유를 1 h 동안 37℃에서 사용하였다; 플레이트의 세척 후 80 ㎕의 PBST(PBS + 0.05% Tween20)를 첨가한 후, 20 ㎕의 scFv 원형질막공간을 첨가하여 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후 항-플래그 이차 항체(Proteintech, 카탈로그 번호: HRP-66008)를 첨가하여 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후 100 ㎕의 TMB(Makewonder, 카탈로그 번호 1001) 기질을 각각의 웰에 발색을 위해 첨가하고, 50 ㎕의 2 M H2SO4를 각각의 웰에 첨가하여 10분 후 발색을 중지시키고, OD450을 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다.
CD25/IL2 결합에 대한 scFv 차단의 ELISA 검출: CD25(10165-H08H, Sino Biological) 단백질을 pH 9.6 CBS로 0.5 ㎍/㎖로 희석하고, 효소-표지 플레이트를, 100 ㎕/웰로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다; 플레이트를 세척한 후 씰링을 위해 3% 탈지 분유를 1 h 동안 37℃에서 사용하였다. 플레이트를 세척한 후 50 ㎕의 scFv를 원형질막공간을 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 바이오틴-표지 IL2 단백질(최종 농도는 0.02 ㎍/㎖임)을, 50 ㎕/웰로 첨가하고, 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다; 플레이트를 세척한 후 PBST로 희석된 STREP/HRP를, 100 ㎕/웰로 첨가하고, 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후 100 ㎕의 TMB를 발색을 위해 각각의 웰에 첨가하고, 50 ㎕의 2 M H2SO4를 10분 후 각각의 웰에 첨가하여 발색을 중지시키고, OD450을 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다.
실시예 2 후보 항체의 분자적 작제 및 생산
자기 비드 스크리닝된 클론 CD25Q2-BA3＼BA9＼BA125, CD25Q8-BT942, CD25Q11-BA402＼BA406＼BA410＼BA415＼BA422＼BA428 및 CD25Q14-BA443＼BA448＼BA458 및 플레이트 스크리닝된 클론 CD25Q11-CA35＼CA36＼CT848 및 CD25Q14-CA705＼CA707＼CA721을 서열분석을 위해 Invitrogen Biotechnology Ltd로 보냈다. 각각의 클론의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
통상적인 분자 생물학 기법에 의해 수행된, 가변 영역 유전자 증폭(2*Phanta Max Master Mix, 제조업체: Vazyme, 아이템 번호: P515-AA, 로트 번호: TE211GB), 신호 펩티드 및 가변 영역 중첩 연장, 상동 재조합(ClonExpress II One Step 클로닝 키트, 제조업체: Vazyme, 아이템 번호: C112-01, 로트 번호: TE211L8) 등을 통해, VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 단편을 항체의 중쇄 불변 영역 아미노산 서열 SEQ ID NO: 17을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 벡터 pCDNA3.4(Life Technology) 내로 최종 삽입하고, VL을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 단편을 항체의 경쇄 불변 영역 아미노산 서열(SEQ ID NO: 20)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 벡터 pCDNA3.4(Life Technology) 내로 삽입하였다. 연결된 벡터를 HEK293 세포 내로 전달감염시키고 37℃＼8% CO2＼125 rpm 진탕기에서 인큐베이션하고, 6일 내지 7일 일시적으로 발현시킨 후, 상청액을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하여 항-CD25 항체를 수득하고, 항체 농도를 UV280 결합 소멸 계수에 의해 결정하였다.
대조군 항체의 생산: MA251 항체는 선행 기술에서 IL2 및 CD25의 결합을 차단하지 않는 항-인간 CD25 항체이며, 인간 CD25에 대해 고친화도를 갖고, IL2 및 CD25의 결합을 차단하지 않는 우수한 성능을 갖는다. MA251 항체는 IL2 및 CD25의 결합을 연구하는 전통적 항체이다. MA251 항체의 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 전체 유전자에 의해 합성한 후 벡터 pCDNA3.4 내로 삽입하고 HEK293 세포에 의해 발현하고, 생산된 항체를 CD25-MA251-IgG1로 명명한다(중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 18이며, 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 19이고, 경쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 20이고, 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 17임).
실시예 3 후보 항체의 특징화
3.1 후보 항체 및 CD25 단백질의 결합 활성의 ELISA 검출
CD25 단백질(10165-H08H, Sino Biological)을 CBS로 상이한 농도(0.08 ㎍/㎖, 0.02 ㎍/㎖, 0.005 ㎍/㎖, 0.00125 ㎍/㎖, 0.0003125 ㎍/㎖, 0.000078125 ㎍/㎖)로 희석하고, 효소-표지 플레이트를, 100 ㎕/웰로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다; 플레이트를 세척한 후 3% 탈지 분유를 1 h 동안 37℃에서 씰링을 위해 사용하였다; PBST(PBS+0.05% Tween20)로 1 ㎕/㎖로 희석된 100 ㎕의 후보 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다; 이어서 염소 항-인간 IgG/HRP(KPL, 카탈로그 번호: 5450-0009)를 첨가하고 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 10분 동안 발색한 후, OD450을 마이크로플레이트 판독기 상에서 판독하여 계산에 의해 EC50을 수득한다. 결과를 도 2a 내지 도 2e 및 표 2 내지 표 6에 나타낸다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 후보 항체 CD25Q2-BA9-IgG1 및 항원 CD25의 결합 EC50 값은 3.328이며, 이는 10.63인 대조군 CD25-MA251-IgG1의 EC50 값보다 유의미하게 더 낮고, 이는 후보 항체의 항원 결합능이 대조군 CD25-MA251-IgG1의 결합능보다 유의미하게 더 우수함을 시사한다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 후보 항체 CD25Q2-BA9-IgG1 및 항원 CD25의 결합 EC50 값은 2.26이며, 이는 24.5인 대조군 CD25-MA251-IgG1의 EC50 값보다 유의미하게 더 낮고, 이는 후보 항체의 항원 결합능이 대조군 CD25-MA251-IgG1의 결합능보다 유의미하게 더 우수함을 시사한다.
후보 항체 CD25Q2-BA9-IgG1 및 CD25Q8-BT942-IgG1은 대조군 CD25-MA251-IgG1에 비해, CD25를 발현하는 Treg 세포 상에서 더 강력한 표적화 및 결합 효과를 가지며, 더 우수한 사멸 효과를 가지고, Teff 세포 상에서 Treg 세포의 억제를 감소시키고, 더 우수한 약학 효과를 가짐이 예측된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
3.2 후보 항체의 시뮬레이션된 사멸 활성의 검출
FBS(Gibco, 카탈로그 번호: 10091-148) 및 RPMI-1640(Gibco, 카탈로그 번호: 11875-093)을 1:99에 따라 혼합하여 1% FBS RPMI-1640을 제조하고, SU-DHL-1 표적 세포를 수집하고, 1% FBS RPMI-1640을 사용하여 1.2×106 세포/㎖로 희석하고, 적절한 후보 항체를 취해서 1% FBS RPMI-1640을 사용하여 25 ㎍/㎖로 희석하고, 상기 농도를 최초 농도로 사용하였다; 향후 사용을 위해 총 8지점까지 순서대로의 구배로 4배 희석하였다; 효과기 세포 Jurkat(G7011, Promega)을 수집하고, 1% FBS RPMI-1640을 사용하여 2.4×106 세포/㎖로 희석하고, 표적 세포를 25 ㎕/웰로 흰색 96-웰 플레이트에 첨가하였다; 구배 희석된 항체를 표적 세포로 커버된 웰에, 25 ㎕/웰로 첨가하였다; 효과기 세포 Jurkat을 25 ㎕/웰로 첨가하고, 96-웰 플레이트를 세포 인큐베이터 내에 배치하여 5 h 배양하였다; 그리고 96-웰 플레이트를 제거하고 실온에 배치하여 이의 온도가 실온으로 평형화될 수 있도록 하였다; Bio-Gl 발색 용액(G7940, Promega)을 75 ㎕/웰로 첨가하고, 15분 동안 반응시키고, 발광을 Tecan 마이크로플레이트 판독기로부터 판독하여 값을 수득하였다. 결과를 도 3a 내지 도 3b 및 표 7 내지 표 8에 나타낸다.
Figure pct00008
Figure pct00009
표 7에 나타낸 바와 같이, 후보 항체 CD25Q2-BA9-IgG1의 시뮬레이션된 사멸 활성 검출의 EC50 값은 0.2356이며, 이는 0.3606인 대조군 CD25-MA251-IgG1의 EC50 값보다 낮고, 이는 SU-DHL-1에 대한 후보 항체의 사멸 능력이 대조군 CD25-MA251-IgG1의 능력보다 우수함을 시사한다.
상기 결과는 후보 항체 CD25Q2-BA9-IgG1이 CD25를 발현하는 세포 상에서 우수한 사멸 효과를 가짐을 시사하며, 이는 후보 항체가 CD25를 발현하는 Treg 세포 및 Teff 세포 상에서의 이의 억제를 감소시킬 수 있고, 이에 따라 더 우수한 약학 효과를 가짐을 시사한다.
3.3 항체 친화도의 BiaCore 검출
항체 결합 동력학은 측정을 위해 표면 플라즈몬 공명(SRP) 기술에 기반한 BIAcore8K 기기를 사용한다. 항-인간 IgG 항체 아미노를 GE 항 인간 IgG Fc 아미노 커플링 키트(GE, cat # BR-1008-39)에 의해 CM5 바이오센서 칩으로 커플링하여 대략 1000 반응 단위(RU)를 수득하였다. 동력학 측정을 위해, CD25 단백질(Sino Biological, 10165-H08H)을 50 nM에서 시작하여, 4개 농도 구배에 대해 2배 희석하고 0 농도를 설정하며, HBS-EP+ 1×(GE, BR-1008-26) 완충액으로 2배 연속해서 희석하였다. 검출할 항체: 2 ㎍/㎖, 샘플 주입 시간 70s, 유속 5 ㎕/분, 5s 동안 안정함; CD25 단백질: 60s 동안 결합, 유속 30 ㎕/분, 450s 동안 해리; 재생: 재생은 3 M MgCl2 완충액으로 30s 동안 수행하고, 스타트업은 3회였다. 연합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)는 단순한 1-대-1 랭귀어(Languir) 결합 모델(BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산하고, 평형 해리 상수(KD)는 비 kd/ka에 의해 계산하였다. 각각의 항체의 친화도 데이터를 표 9에 나타낸다.
Figure pct00010
표 9에 나타낸 바와 같이, 후보 항체 CD25Q2-BA9-IgG1의 평형 해리 상수 KD 값은 8.43E-10이며, 이는 5.19E-09인 대조군 CD25-MA251-IgG1의 KD 값보다 낮고, 이는 후보 항체 CD25Q2-BA9-IgG1의 CD25 단백질의 친화도가 대조군 CD25-MA251-IgG1의 친화도보다 우수함을 시사한다.
표 9에 나타낸 바와 같이, 후보 항체 CD25Q8-BT942-IgG1의 평형 해리 상수 KD 값은 3.79E-09이며, 이는 5.19E-09인 대조군 CD25-MA251-IgG1의 KD 값보다 낮고, 이는 후보 항체 CD25Q8-BT942-IgG1의 CD25 단백질의 친화도가 대조군 CD25-MA251-IgG1의 친화도보다 우수함을 시사한다.
상기 결과는 후보 항체 CD25Q2-BA9-IgG1 및 CD25Q8-BT942-IgG1이 대조군 CD25-MA251-IgG1에 비해, CD25를 발현하는 Treg 세포 상에서 더 강력한 표적화 및 결합 효과를 가지며, 더 우수한 사멸 효과를 갖고, Teff 세포 상에서 Treg 세포의 억제를 감소시키고, 더 우수한 약학 효과를 가짐을 예측한다.
3.4 후보 항체의 세포 차단 활성
냉동된 PBMC(말초혈 단핵 세포, 제조업체: ALLCELLS, 아이템 번호: PB003F-C)를 회수한 후, 30분 동안 96-U형 바닥 플레이트 상에서 10 ㎍/㎖의 CD25 항체와 공동-배양하고, 대조군에는 항체를 첨가하지 않고, 대조군을 NoAb로 표지한 후, IL2(0.1 U/㎖, 1 U/㎖, 10 U/㎖)를 첨가하여 10분 동안 인큐베이션하여(작용 배지: 1640+10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 10000 U/㎖ Pen-Strep 함유) 세포 현탁액을 제조하였다: 최종 세척 후, 상청액을 폐기하고 샘플을 펄스로 볼텍싱하여 펠렛을 완전 해리시켰다; 200 ㎕ Foxp3 고정/투과화 작용 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 이를 30분 내지 60분 동안 암소에서 2℃ 내지 8℃ 또는 실온에서 인큐베이션하였다; 샘플을 실온에서 5분 동안 400 g 내지 600 g에서 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다; 200 ㎕의 1X 막 파괴 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 샘플을 실온에서 5분 동안 400 g 내지 600 g에서 원심분리하고, 상청액을 폐기하고, 2회 세척하였다; (BD Phosflow™ Perm 완충액 III을 미리 -20℃에 두어 사전-냉각하고) PBS로 1회 세척하고, 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다; 빙냉 Phosflow™ Perm 완충액 III을 볼텍싱하면서 천천히 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다; 세포를 PBS로 2회 세척하고, 10분 동안 250 g에서 원심분리하여 상청액을 폐기하였다; 세포를 107 세포/㎖로 PBS 중에 재현탁하고, 100 ㎕/웰로 별도 함유시키고, 형광 표지된 항체 염색을 게속하고 유세포측정을 수행하였다; 살아있는 세포를 구별하고, CD3 양성 T 세포를 추가 구별하였다. 인산화된 신호 전달인자 및 전사 활성인자 5(PSTAT5)의 백분율이 높을수록, 차단율은 더 낮다. 결과를 도 4 및 표 10에 나타낸다.
표 10에 나타낸 바와 같이, 후보 항체 CD25Q2-BA9-IgG1의 PSTAT5% 값은 26.09이며, 이는 18.52인 대조군 CD25-MA251-IgG1의 PSTAT5% 값보다 유의미하게 더 높고, 이는 후보 항체가 IL2 및 PBMC의 결합을 차단하지 않는 데 있어서 대조군 CD25-MA251-IgG1에 비해 유의미하게 더 우수함을 시사한다. 이는 후보 항체 CD25Q2-BA9-IgG1이 대조군 CD25-MA251-IgG1에서보다 PBMC의 활성화를 더 적게 억제할 수 있음을 시사하고, 이는 후보 항체 CD25Q2-BA9-IgG1이 PBMC 면역 효과를 더 잘 달성하고 더 우수한 약학 효과/항-종양 효과를 가질 수 있음을 예측한다.
표 10에 나타낸 바와 같이, 후보 항체 CD25Q8-BT942-IgG1의 PSTAT5% 값은 16.46이며, CD25-MA251-IgG1의 PSTAT5% 값은 18.52이고, 이는 후보 항체가 IL2 및 PBMC의 결합을 차단하지 않는 데 있어서 대조군 CD25-MA251-IgG1과 기본적으로 동등함을 시사한다. 이는 후보 항체 CD25Q8-BT942-IgG1이 PBMC 면역 효과를 잘 달성하고 우수한 약학 효과/항-종양 효과를 가질 수 있음을 예측한다.
Figure pct00011
실시예 4 후보 항체의 생체내 활성
4.1 건강한 붉은털 원숭이에서 CD25Q2-BA9-IgG1의 PD 활성
CD25Q2-BA9-IgG1 항체를 10 ㎎/㎏의 용량으로 3마리 붉은털 원숭이에 정맥내 투여하고, 유세포 측정기(CytomicsTM FC500)를 사용하여 유세포측정에 따른 투여 전 및 후의 상이한 시점에 Treg 세포(CD3+CD4+CD25+FoxP3+)의 함량을 검출하고, 검출 시점은 투여 전 및 후(±1 분), 투여 후 0.5시간(±1분), 3시간(±2분), 6시간(±5분), 24시간(±10분), 48시간(±20분, 2일), 96시간(±30분, 4일), 168시간(±1시간, 7일), 336시간(±1시간, 14일)이며, 실험 결과를 도 5에 나타낸다.
도 5로부터 알 수 있듯이, CD25Q2-BA9-IgG1의 투여 후, 이는 붉은털 원숭이에서 Treg 세포의 함량을 유의미하게 감소시킬 수 있고 면역 미세환경을 효과적으로 조절할 수 있다.
4.2 게잡이 원숭이에서 후보 항체의 PK 활성
각각의 군에 2마리 게잡이 원숭이가 존재하며, 이들에 상이한 CD25 항체를 정맥내 주사하고, 전혈 샘플을 투여 전에(0 h) 및 투여 후 1분, 30분, 3 h, 6 h, 1 d, 2 d, 4 d, 7 d, 10 d, 및 14 d에 정맥내 채취하고, 혈액 샘플 수집 튜브에 넣고, 아이스 박스에서 자연 응고시키고, 혈액 샘플을 채취한 후 8 h 이내에 원심분리기에 넣고, 10분 동안 1000 g 내지 3000 g에서 원심분리하고, 혈청을 분리하고, 샘플 보관 튜브에 넣고, 게잡이 원숭이에 14일째에 다시 상이한 CD25 항체를 정맥내 주사하고, 전혈 샘플을 투여 전에(0h) 및 투여 후 1분(14 d + 1 m), 30분(14 d + 30 m), 3 h(14 d + 3 h), 6 h(14 d + 6 h), 1 d(15 d), 2 d(16 d), 4 d(18 d) 및 7 d(21 d)에 정맥내 채취하고, 혈액 샘플 수집 튜브에 넣고, 아이스 박스에서 자연 응고시키고, 혈액 샘플을 채취한 후 8 h 이내에 원심분리기에 넣고, 10분 동안 1000 g 내지 3000 g에서 원심분리하고, 혈청을 분리하고, 샘플 보관 튜브에 넣고, 게잡이 원숭이에서 항체의 대사를 ELISA에 의해 검출하고, 결과를 도 6 및 표 11에 나타낸다.
결과는 CD25Q2-BA9-IgG1 및 CD25Q8-BT942-IgG1이 대조군 항체 CD25-MA251-IgG1에 비해 더 높은 생체적합성을 가지며, 우수한 약동력학적 성능을 가짐을 시사한다.
Figure pct00012
실시예 5 생체내 종양 모델에서 후보 항체의 유효성
5.1 B-hIL2Rα 인간화 마우스 MC38 결장암 동물 모델에서 후보 항체의 유효성 평가
B-hIL2Rα 인간화 마우스(Biocytogen)를 체중에 따라 5개 군으로 구분하고, 여기서 10마리 마우스는 G1 음성 대조군에 있고 8마리 마우스는 각각 G2 내지 G4 처리군에 있었다. 개별 투여를 군 설정일부터 수행하고(10 ㎎/㎏, I.P., BIW)(10 ㎎/㎏, 복강내 주사, 1주 2회), 다음 날, PBS 중에 재현탁된 MC38 세포를 0.1 ㎖/마우스로 5×105 세포/0.1 ㎖의 농도로 B-hIL2Rα 인간화 마우스의 오른쪽에 피하 접종하였다. 종양 부피 및 동물 체중을 1주 2회 측정하고, 측정값, 종양 부피(㎣) = 0.5 × 장축 지름 × 단축 지름2을 기록하였다. 결과를 도 7a 및 도 7b 및 표 12 및 표 13에 나타낸다.
도 7a에 나타낸 바와 같이, 마우스의 체중은 지속적으로 증가하고, 이는 CD25Q2-BA9-IgG1, CD25Q8-BT942-IgG1 및 CD25Q11-CT848-IgG1(10 ㎎/㎏, IP, BIW)이 마우스 상에서 독성 및 부작용을 갖지 않음을 시사한다.
도 7b에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해, CD25Q2-BA9-IgG1, CD25Q8-BT942-IgG1 및 CD25Q11-CT848-IgG1은 마우스 MC38의 종양 성장을 유의미하게 억제할 수 있고, 그 중 CD25Q8-BT942-IgG1이 더 우수한 항-종양 효과를 나타낸다.
Figure pct00013
Figure pct00014
5.2 투여 후 MC38 종양에 대한 면역 세포의 침윤 효과 FACS 검출
5.1에서 평가 마우스의 5번째 투여(군 설정 후 16일) 후, 4마리 마우스를 음성 대조군으로부터 취하고 3마리 마우스를 각각의 처리군으로부터 취하여, 마우스를 희생시키고, 종양을 절제하여, 소화 효소를 여기에 첨가하고, 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하고 소화시키고, 여과 및 세척 후 단세포 현탁액으로 재현탁하였다. 25 ㎕의 씰링 및 사멸 그리고 생명 염색 용액 및 25 ㎕의 세포 현탁액을 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 잘 혼합하고, 4℃에서 15분 동안 암소에서 인큐베이션하였다; 50 ㎕의 표면 염료를 각각의 웰에 첨가하고, 잘 혼합하고, 4℃에서 30분 동안 암소에서 인큐베이션하였다; 150 ㎕의 FACS 용액을 각각의 웰에 첨가하고 2회 세척하고, 4℃, 500 g, 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다; 200 ㎕의 고정된 용액 재현탁된 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 잘 혼합한 후 실온에서 30분 동안 고정하였다; 고정 후, 5분 동안 4℃, 1400 g에서 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다; 200 ㎕의 막-투과 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 5분 동안 4℃, 1400 g에서 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다; 100 ㎕의 세포내 염료 용액을 각각의 웰에 실온에서 첨가하고, 30분 동안 암소에서 인큐베이션하였다; 150 ㎕의 막-투과 용액을 각각의 웰에 첨가하고 2회 세척하고, 1400 g, 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다; 세포를 250 ㎕의 PBS로 재현탁하고, CD3에서의 CD8+세포(Teff)의 함량, CD3에서의 CD25+Foxp3+세포(Treg)의 함량 및 CD4에서의 Foxp3+세포(Treg)의 함량을 기계 상에서 검출하였다. 결과를 도 8a 내지 도 8c에 나타낸다.
도 8a 내지 도 8c에 나타낸 바와 같이, 대조군 인간 IgG1 카파 이소형에 비해, CD25Q2-BA9-IgG1, CD25Q8-BT942-IgG1 및 CD25Q11-CT848-IgG1은 마우스 MC38의 종양에서 Treg 세포 비율을 감소시키고 Teff 세포의 침윤을 증가시키고, 이에 따라 종양 사멸 능력을 개선할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Shandong Boan Biotechnology Co., Ltd. <120> ANTI-CD25 ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF <150> 201910495614.4 <151> 2019-06-10 <150> 201910495626.7 <151> 2019-06-10 <160> 20 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BA9 VL <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Arg Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BA9 VH <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Glu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BT942 VL <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BT942 VH <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Asp 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Val Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Gly Asp Tyr Ser Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BA9 LCDR1 <400> 5 Gln Ser Leu Arg Ser Tyr 1 5 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BA9 LCDR2 <400> 6 Lys Ala Ser 1 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BA9 LCDR3 <400> 7 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp Thr 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BA9 HCDR1 <400> 8 Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BA9 HCDR2 <400> 9 Ile Asp His Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BA9 HCDR3 <400> 10 Ala Arg Gly Glu Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BT942 LCDR1 <400> 11 Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BT942 LCDR2 <400> 12 Trp Ala Ser 1 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BT942 LCDR3 <400> 13 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BT942 HCDR1 <400> 14 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Asp Ala 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BT942 HCDR2 <400> 15 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Val Ala 1 5 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BT942 HCDR3 <400> 16 Ala Arg Glu Arg Gly Asp Tyr Ser Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> heavy chain constant region <400> 17 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> MA251 VH <400> 18 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Tyr Gly Tyr Asp Gly Ser Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> MA251 VL <400> 19 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Asp Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> light chain constant region <400> 20 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (10)

  1. 3개의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, HCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14로 나타내고, HCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 15로 나타내고, HCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16으로 나타내는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 3개의 경쇄 상보성 결정 영역을 추가로 포함하며, LCDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11로 나타내고, LCDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12로 나타내고, LCDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13으로 나타내는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. SEQ ID NO: 4로 나타내는 중쇄 가변 영역을 포함하며; 바람직하게는 SEQ ID NO: 3으로 나타내는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단편이 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv 단편 또는 dsFv 단편을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CD25, 바람직하게는 인간 CD25에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 세포.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제6항의 핵산, 또는 제7항의 세포를 포함하는 약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제6항의 핵산을 포함하는 키트.
  10. 질병의 치료, 예방, 검출 또는 진단을 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제6항의 핵산의 용도로서, 바람직하게는 질병이 암이며; 보다 바람직하게는, 질병이 위암, 식도암, 두부경부암, 방광암, 자궁경부암, 육종, 세포종, 폐암, 결장암, 난소암, 신장암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 흑색종, 유방암, 골수종, 교종, 백혈병 및 림프종인 용도.
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