KR20140006713A - Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도 - Google Patents

Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 델타 유사 리간드 4(DLL4)에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체에 관한 것으로, 구체적으로는 인간 델타 유사 리간드 4에 특이적으로 결합하여 델타 유사 리간드 4와 노치(Notch) 수용체 간의 결합을 효과적으로 저해하는 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 단일클론항체의 제조방법, 상기 단일클론항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물, 상기 단일클론항체를 이용한 암의 진단 방법 및 상기 단일클론항체를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

DLL4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도{Novel monoclonal antibody that specifically binds to DLL4 and use thereof}
본 발명은 델타 유사 리간드 4(DLL4)에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체에 관한 것으로, 구체적으로는 인간 델타 유사 리간드 4에 특이적으로 결합하여 델타 유사 리간드 4와 노치(Notch) 수용체 간의 결합을 효과적으로 저해하는 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 단일클론항체의 제조방법, 상기 단일클론항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물, 상기 단일클론항체를 이용한 암의 진단 방법 및 상기 단일클론항체를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
노치(Notch) 신호전달은 척추 동물에서 무척추 동물에 이르기까지 진화론적으로 잘 보존되어 있으며 발생 초기에 세포의 운명을 결정짓는데 매우 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다. 노치 신호전달은 신경, 안구, 림프, 근육, 혈구 등의 분화과정을 조절하는 주요 인자로 알려져 있으며, 또한 혈관 발생에도 관여하고 있다. 포유류에서는 4개의 노치(Notch) 수용체를 가지고 있으며(Notch 1, 2, 3 및 4), 각각의 노치 수용체는 300-350kDa 크기의 단백질로 합성되며 골지체에서 퓨린-유사 전환효소(furin-like convertase)에 의해 S1 자리가 잘리면서 세포 표면에서 이형이합체(heterodimer)를 형성한다. 또한, 포유류에는 4개의 노치 리간드(Jagged-1/2 및 Delta-유사 리간드(DLL) 1/3/4)가 확인되었다.
노치 수용체와 리간드들은 모두 막 단백질로서 두 개의 근접한 세포 간에 리간드와 수용체인 노치가 결합되어 노치 신호전달이 일어난다. 세포끼리 접촉할 때 이들의 세포 바깥부분(extracellular domain)이 직접적으로 결합해서 신호 전달이 이루어지며 리간드와 수용체의 조합에 따라 다른 세포반응이 나타난다. 노치 신호전달에서 리간드와 노치 수용체가 서로 결합하면 노치 수용체의 구조적 변화를 일으켜 이후 노치 수용체는 두 번의 순차적인 단백질 가수분해를 받게 된다. 첫 번째 가수분해는 금속단백질분해효소(metalloprotease)인 ADAM10/17(a disintegrin and metalloprotease 10/17)/TACE(TNF-α converting enzyme)에 의해 세포 바깥부분(S2 자리)이 잘리면서 시작된다. S2 자리가 잘리면 노치 수용체의 막관통영역(transmembrane domain)의 S3 자리가 가수분해된다. 두 번째 가수분해는 다섯개의 소단위체를 가지고 감마-세크레타제(γ-secretase) 복합체가 담당한다. 감마-세크레타제 복합체는 프레시닐린 1(presenilin 1), 프레시닐린 2(presenilin 2), 니카스트린(nicastrin), Pen-2, 그리고 Aph1로 구성되어 있다. 두 번의 가수분해 후 노치 수용체는 세포 내 부분(intracellular domain, NICD)이 분리되어 핵 안으로 이동한다. 핵 안에서 NICD는 전사 억제인자인 CSL(CBF-1/Suppressor of Hairless/Lag-1)과 결합해 이전에 CSL과 결합해있던 보조 억제인자(corepressor, CoR)를 대체하게 된다. NICD/CSL복합체는 보조 활성인자(co-activator, CoA)인 MAML(mastermind-like)나 p300을 모집해 cyclin D1, p21, NF-κB, c-Myc, pre-Ta(pre-T cell receptor alpha chain), GATA3, NRARP, 그리고 Deltex1와 같은 노치 타겟 유전자들을 활성화시켜 발현을 유도한다.
활성화된 노치 신호전달은 여러 암 모델에서 종양형성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 활성 노치인 NICD를 쥐의 조혈세포에 발현시키는 경우 T-cell leukemia/lymphomas를 일으키고, T-ALL(T-cell acute lymphoblastic leukemia)에선 활성화된 노치 1이 50% 정도 발견되었다(Weng AP et al., Science 2004;306:71-269). 또한, 유방암의 경우에도 MMTV(mouse mammary tumor virus)가 삽입된 쥐(Czech II)에서 활성화된 노치 4 수용체가 과발현된 것이 발견되었고 이들 쥐에서 유선종양이 발생한 것이 보고되었다. 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선 암과 같은 다양한 암에서 노치 수용체와 리간드 그리고 노치 신호 전달의 타겟이 활성화되어 있는 것이 보고되어 있고(Miele L et al., Clin Cancer Res 2006;12(4):1074-79), 노치 1 수용체가 유방암 환자에 있어 좋지 않은 예후에 관련되어 있고(Reedijk M et al., Cancer Reserach 2005;65:8530-7), 전립선 암에서는 암 전이와 관련되어 있는 것으로 알려져 있다(Santagata S et al., Cancer Research 2004;64:6854-7).
델타 유사(delta like) 4(Dl4) 또는 델타 유사 리간드 4(Delta Like Ligand 4, DLL4)(이하에서는 "DLL4")는 혈관 내피 세포에서 과발현되어 있는 노치(Notch)단백질을 수용체로 하는 리간드의 델타 부류의 하나로서, 혈관 신생을 조절하는 주요 요소로 알려져 있다. DLL4는 특히, 혈관 내피에 과발현되는 노치 1 또는 노치 4 수용체에 결합을 한다. DLL4는 정상적인 혈관에서도 발현되나, 암 혈관에서는 매우 과발현되어 있는 것으로 알려져 있다(Reinacher-Schick A et al., Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2008;5(5):250-67). 혈관신생(angiogenesis)은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 기작을 의미하며, 특히 종양에 있어서 혈관신생은 암 조직의 저산소(hypoxia) 지역에서 산소와 영양분을 공급받기 위하여 VEGF와 같은 혈관 신생인자에 의해 혈관신생이 일어난다. 종양에 있어서 혈관신생은 종양의 성장뿐만 아니라 전이(metastasis)에 있어서도 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 종양에서 DLL4에 의한 노치 신호전달을 차단하게 되면 혈관 신생(angiogenesis)의 조절이 잘 이루어지지 않게 되므로 암의 성장을 억제할 수 있다. 또한, DLL4에 의한 노치 신호전달을 억제시키는 경우, 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg)의 수를 증가시켜 자가면역질환을 치료할 수 있다(미국공개특허 제2011-0189200호). 이러한 이유로 DLL4는 암 및 자가면역질환의 치료에 있어서 새로운 표적이 되고 있다.
DLL4를 표적으로 하여 암 또는 자가면역질환을 치료하기 위하여 다양한 부분에서 노치 신호전달을 억제하기 위한 연구가 이루어졌다. 그 예로 노치/리간드 결합을 방해하는 수용체 디코이(decoy), 노치 신호전달에서 노치 단백질을 자르는데 관여하는 감마-세크레타제 억제제, 노치 신호전달에 관여하는 단백질 또는 노치 타겟 유전자를 억제하기 위한 miRNA 또는 siRNA와 같은 것이 있다. 상기와 같은 다양한 노치 신호전달을 억제하기 위한 방법 중에서도 노치 신호전달의 초기에 작용할 수 있는 노치에 대한 리간드에 결합하는 단일클론항체에 대한 연구의 중요성이 부각되어 왔으며, 특히 임상 연구를 위해 인간 DLL4에 특이적으로 결합이 가능하고, DLL4와 노치와의 상호작용을 효과적으로 저해하면서, 면역원성의 위험성을 최소화할 수 있는 인간 단일클론항체의 개발이 요구되어 왔다.
이에 본 발명자들은 인간 DLL4에 특이적으로 결합하면서 DLL4와 노치 수용체와의 상호작용을 효과적으로 저해하고 면역원성의 위험성을 최소화할 수 있는 인간 단일클론항체를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 인간 항체 라이브러리로부터 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래인 인간 DLL4에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체를 새롭게 제작하였고, DLL4와 노치 단백질 사이의 상호작용을 효과적으로 차단하여 암과 같은 질병의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 인간 델타 유사 리간드 4(DLL4)에 특이적으로 결합하면서 인간 델타 유사 리간드 4와 노치(Notch) 수용체 간의 상호작용을 저해하는 신규한 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 델타 유사 리간드 4(DLL4) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 이용하여 자가면역질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 델타 유사 리간드 4(DLL4)에 특이적으로 결합하면서 인간 델타 유사 리간드 4와 노치(Notch) 수용체 간의 상호작용을 저해하는 신규한 단일클론항체, 특히 인간 단일클론항체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자(예를 들어, 양특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명에서 용어, "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, 이는 3가지 이상의 잠재적인 장점을 가질 수 있다. 먼저, 이는 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다. 둘째로, 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는 이점이 있다. 셋째로, 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 이점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 인간 단일클론항체들은 DLL4에 대해서 강한 친화력을 나타내며, DLL4를 발현하고 있는 세포(예-암세포)가 노치 1 또는 노치 4 수용체에 결합하는 것을 효과적으로 저해할 뿐 아니라, 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로, 암 또는 자가면역질환과 같은 질병의 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "인간 델타 유사 리간드 4(DLL4)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체"는 DLL4에 결합하여 DLL4의 생물학적 활성의 억제를 초래할 수 있는 항체를 의미하며, 본 발명에서 "항 DLL4 항체"와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 DLL4에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 DLL4에 특이적으로 결합하여 DLL4와 노치 수용체 간의 결합을 저해하는 단일클론항체라면 제한없이 포함한다. 상기 단일클론항체의 형태는 상기에서 설명한 바와 같이 전체 항체 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 단일클론항체는 인간 DLL4에 특이적으로 결합하면서 DLL4와 노치 단백질 간의 상호작용을 저해시켜, 노치 신호전달이 관여하는 암 또는 자가면역질환과 같은 질병의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
상기 DLL4에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 바람직하게는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1을 포함하는 DLL4에 특이적으로 결합하는 단일클론항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1을 포함하는 단일클론항체는 바람직하게는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 16으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 17로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 18로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 15로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 15로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 인간 단일클론항체를 MLCK-1으로 명명하였다.
또한, 상기 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1을 포함하는 단일클론항체는 바람직하게는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 6으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 20으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 21로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 22로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 5로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 19로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 5로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 19로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 인간 단일클론항체를 MLCK-2로 명명하였다.
또한, 상기 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1을 포함하는 단일클론항체는 바람직하게는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 10으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 24로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 25로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 26으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 8로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 23으로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 8로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 23으로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 인간 단일클론항체를 MLCK-3로 명명하였다.
또한, 상기 DLL4에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 바람직하게는 서열번호 12로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 13으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 14로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 28로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 29로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 30으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 11로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 27로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 11로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 27로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 인간 단일클론항체를 MLCK-4로 명명하였다.
상기 MLCK-1, MLCK-2, MLCK-3 및 MLCK-4에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열에 대하여 도 1에 나타내었다.
또한, 본 발명의 인간 단일클론항체가 불변 영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그 예로, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 불변 영역으로부터 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다.
본 발명에서 용어, "하이브리드(hybrid)"란 단쇄 면역 글로불린 중쇄 불변 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하며, 그 예로 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다.
한편, IgG의 아형인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중쇄 불변영역의 조합 또는 혼성화도 가능하다. 상기 조합 및 혼성화에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 IgG1 중쇄 불변영역은 서열번호 31로 기재된 IgG1 중쇄 불변영역, IgG2 중쇄 불변영역은 서열번호 32로 기재된 IgG2 중쇄 불변영역, IgG3 중쇄 불변영역은 서열번호 33으로 기재된 IgG3 중쇄 불변영역, IgG4 중쇄 불변영역은 서열번호 34로 기재된 IgG4 중쇄 불변영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 상기 DLL4에 특이적인 단일클론항체가 경쇄 불변영역을 포함하는 경우, 상기 경쇄 불변영역은 람다(λ) 또는 카파(κ) 경쇄 유래일 수 있다. 상기 단일클론항체의 경쇄 불변영역이 람다 경쇄 유래인 경우, 서열번호 35로 기재된 람다 경쇄 불변영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "델타 유사 리간드 4(delta-like ligand 4, DLL4)"는 노치 단백질을 수용체로 하는 리간드의 델타 부류의 하나로서, 바람직하게는 노치 1 또는 노치 4 수용체에 결합하는 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DLL4는 포유류의 DLL4라면 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 인간 DLL4를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 DLL4는 암세포 또는 혈관내피세포 등에 발현되어 있는 노치 1 또는 4 수용체에 결합하여 암의 성장을 유도하거나, 자가면역질환의 진행을 유도할 수 있는 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 DLL4는 암의 혈관(tumor vasculature)을 비롯한 다양한 암 세포에서 과발현되어 있으며, 암 모델에서 종양 내의 맥관 기능(vascular function)을 향상시켜 암의 증식과 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, DLL4의 억제는 자가면역질환을 치료할 수 있는 것으로 알려져 있다.
상기 DLL4 단백질은 천연형 또는 변이체 DLL4 단백질을 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 천연형 DLL4 단백질이란 천연형 DLL4 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 일반적으로 지칭하며, 상기 천연형 DLL4 단백질의 아미노산 서열이란 천연 발생 DLL4에서 발견되는 아미노산 서열을 일반적으로 지칭한다. 상기 DLL4에 대한 정보는 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 NM_019074.3(Gene ID: 54567)인 DLL4의 정보일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "노치(Notch) 수용체"는 노치 신호 전달을 매개하는 단백질을 의미하며, 노치와 혼용하여 사용될 수 있다. 상기 노치 수용체는 노치 신호 전달을 매개하는 단백질이라면 제한없이 포함하나, 바람직하게는 노치 1 또는 노치 4 수용체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 노치 수용체는 포유류의 DLL4에 결합하는 단백질이라면 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 인간의 DLL4에 결합하는 단백질을 의미할 수 있다. 본 발명에서 상기 노치는 천연형 노치 또는 변이체 노치 단백질을 모두 포함한다. 천연형 노치란 천연형 노치 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하며, 상기 천연형 노치 단백질의 아미노산 서열이란 천연형 발생 노치 수용체에서 발견되는 아미노산을 일반적으로 지칭할 수 있다.
본 발명에서 용어, "인간 델타 유사 리간드 4와 노치(Notch) 수용체 간의 상호작용을 저해"는 본 발명의 DLL4에 특이적인 단일클론항체가 DLL4에 결합하여 DLL4와 노치 수용체 간의 상호작용을 저해시키는 것을 의미하며, 바람직하게는 DLL4에 특이적인 단일클론항체가 DLL4에 결합하여 DLL4와 노치 1 또는 노치 4 수용체와의 상호작용을 저해시키는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 DLL4에 특이적인 단일클론항체는 DLL4와 노치 수용체 간의 상호작용 저해를 통하여 DLL4의 노치 수용체 결합에 의한 노치 단백질의 구조적 변화를 가져오지 못하게 하므로, 이에 따라 노치 단백질의 가수분해를 막아 노치 신호전달을 억제한다. 암에서 DLL4와 노치 수용체가 결합하게 되면, 혈관 내피 세포 간의 신호 전달, 또는 암 줄기세포(cancer stem cell)과 혈관 내피 세포 간의 노치 신호전달을 활성화시키게 되고, 혈관 크기를 증대시키며, 종양 내의 맥관 기능(vascular function)을 향상시켜 암의 증식과 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다(Ji-Liang Li et al., Cancer Res 2007;67(23):11244-53). 따라서, 암에서 DLL4에 의한 노치 신호전달을 차단하게 되면 특히 혈관 신생 조절이 잘 이루어지지 않게 되어 암의 성장을 억제할 수 있게 된다. 또한, DLL4를 차단하게 되면 혈관신생 부위 말단의 세포에서 외측 억제(lateral inhibition)의 결실이 나타나서 과도한 발아가 이루어지게 되고 그 결과로 지나치게 많으면서도 생산성은 떨어지는 혈관신생 반응이 높아지게 되며, 산소를 공급하는 관류가 나빠져서 암 주변에 저산소 상태가 유도될 수 있어 항암 효과를 가져올 수 있으며, 특히 항 VEGF 치료에서도 저항성을 보이는 암에서도 항암 효과를 나타낼 수 있다(Noquera-Troise I et al., Novartis Found Symp 2007;283:106-20). 따라서 DLL4와 노치 간의 상호작용을 효과적으로 억제하는 본 발명의 DLL4에 특이적인 인간 단일클론항체는 암의 치료에 있어서 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, DLL4의 억제가 조절 T 세포의 발달을 촉진시켜 뇌척수염과 같은 자가면역질환을 완화시킬 수 있음이 알려져 있고(Bassil et al., J Immunol 2011;187(5);2322-8), DLL4 저해제(antagonist)을 자가면역질환의 치료에 이용할 수 있음이 알려져 있으며(미국공개특허 제2011-0189200호), 항체와 같은 DLL4에 결합하는 단백질을 자가면역질환의 치료에 사용할 수 있음이 알려진바 있다(미국공개특허 제2011-0117079호). 따라서, DLL4에 효과적으로 결합하여 DLL4와 노치 수용체 간의 상호작용을 억제하는 본 발명의 항체는 자가면역질환의 치료에도 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, DLL4에 특이적인 인간 단일클론항체 MLCK-1, MLCK-2, MLCK-3 및 MLCK-4를 제작하였으며, 상기 항체들은 대조군에 비하여 인간 DLL4에 각각 47.82%, 59%, 52.85% 및 52.46%의 결합능을 나타내었으며(도 3), 0.1μM의 낮은 항체 농도에서 DLL4와 인간 노치 1 수용체와의 결합을 대부분 차단함을 확인하였다(도 4). 나아가, 본 발명의 항-DLL4 항체, MLCK-1, MLCK-2, MLCK-3 및 MLCK-4가 각각 2.63X10-7M, 1.71x10-9M, 6.96X10-9M, 및 2.13X10-6M을 나타내었다(도 5). 또한, DLL4에 의한 혈관 내피세포의 증식 저해를 농도의존적으로 차단하는 결과를 나타내었으며(도 6), 또한 DLL4-NOTCH 신호전달 활성화에 따른 NICD의 생성 역시 억제하는 결과를 나타내었다(도 7). 이러한 결과는 본 발명의 DLL4에 특이적인 인간 단일클론항체가 노치 수용체와의 결합을 효율적으로 차단하고, 노치 신호전달을 억제하여, 항암 및 자가면역질환 치료 효과를 가져올 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 단일클론항체는 공지의 단일클론항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파아지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
파아지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파아지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파아지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적으로 파아지 디스플레이 기술은 1) 파아지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ (또는 pⅣ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; 4) 수용체에 결합된 펩티드-파아지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파아지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하는 단계로 구성된다.
바람직하게 본 발명의 단일클론항체의 제조방법은 파아지 디스플레이 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자는 공지의 파아지 디스플레이 기술, 예를 들어 Barbas 등(METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2:119, 1991 및 J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9) 및 Winter 등(Ann. Rev.Immunol. 12:433, 1994)의 논문 등에 공지된 방법을 참고하여 상기 본 발명의 제조방법의 각 단계를 용이하게 수행할 수 있다. 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파아지는, 예를 들어 필라멘트성 파아지(filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파아지가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파아지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터에는 예를 들어, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파아지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8 또는 pSEX 등의 파아지미드 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 증폭을 위한 재조합 파아지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파아지에는, 예를 들어 M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 하이브리도마 유래의 단일클론항체 또는 파아지 디스플레이 클론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 그 예로, 하이브리도마 또는 파아지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 일단 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론항체을 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 인간 단일클론항체의 제조 방법은 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 증폭시키는 단계를 포함하는, 인간 단일클론항체의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
상기 단일클론항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 단일클론항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 단일클론항체는 DLL4에 결합하여 DLL4와 노치 수용체와의 결합을 저해함으로써 암의 성장 억제에 관여할 수 있다. 상기 DLL4 및 노치 수용체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "암"은 본 발명의 항체에 의하여 치료될 수 있는 암의 종류라면 특별히 제한되지 않으나, 그 예로 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 또는 다발성 골수종 혈액암일 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 조성물의 투여에 의해 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 단일클론항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 암을 치료하는 방법은 단일클론항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 암이 발병되거나 발명 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유 동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한없이 포함된다.
이때, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 델타 유사 리간드 4(DLL4) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
상기 단일클론항체, 암, 개체 및 DLL4 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 암을 진단하는 방법은 본 발명의 DLL4에 특이적인 단일클론항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 DLL4 단백질을 검출할 수 있으며, 이를 통해 암의 진단을 위한 정보의 제공 또는 암을 진단할 수 있다. 상기 DLL4는 난소암을 비롯한 다양한 암세포에서 과발현되어 있으므로(Wei Hu et al., Cancer Res 2011;71:6030-6039.), 정상 세포 또는 조직과 같은 대조군과 DLL4의 발현량을 비교하여 암을 진단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, (a) 상기 항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에 처리하여 DLL4 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 검출된 DLL4 단백질의 수준을 대조군과 비교하여, 대조군에 비하여 DLL4 단백질 수준이 높으면 암 환자로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법 또는 암의 진단 방법일 수 있다.
본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 DLL4 단백질의 존재 또는 암의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 시료 중의 DLL4 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3 +, Eu3 + 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 단일클론항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 DLL4에 특이적인 단일클론항체를 포함하는 진단용 조성물을 사용하여 DLL4의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환 또는 DLL4에 의해 매개되는 질환 예컨대, 암을 진단할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 조성물 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 상기 암 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 단일클론항체, 예방 및 치료에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "자가면역질환"은 병적인 개체의 자체 항원에 대한 면역 반응이 직간접적 원인으로 나타나는 질환을 총칭하는 의미로서, 그 종류에 제한없이 포함되나, 그 예로 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 뇌척수염, 섬유조직염 또는 결절성 다발성 동맥염일 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이 본 발명의 DLL4에 특이적인 인간 단일클론항체는 조절 T 세포(regulatory T cell)의 발달을 촉진할 수 있으므로, 자가면역질환의 치료에 이용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 이용하여 자가면역질환을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 단일클론항체는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 자가면역질환이 발병되거나 발병 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 자가면역질환, 개체 및 사용될 수 있는 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에 따른 인간 단일클론항체는 인간 DLL4에 대해서 강한 친화력을 나타내며, DLL4와 노치 수용체 간의 결합을 효과적으로 저해할 뿐 아니라, 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로 암 또는 자가면역질환과 같은 질환의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은, DLL4에 대한 단일클론항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 여기서 프레임(frame)은 구조 영역(framework region)을, CDR은 상보성 결정 영역(complementarity-determining region)을 의미한다.
도 2는, DLL4에 대한 단일클론항체의 DLL4에 대한 결합능을ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, DLL4를 인위적으로 과발현시킨 HEK293 세포에서 DLL4에 대한 단일클론항체의 DLL4에 대한 결합력을 유세포 분석기(flow cytometry)를 통하여 검출한 결과를 나타낸 것이다((a) MLCK-1; (b) MLCK-2; (c) MLCK-3; (d) MLCK-4).
도 4는, DLL에 대한 단일클론항체의 DLL4에 대한 중화효과(Neutralizing assay)를 ELISA를 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 항-DLL4 항체인 MLCK-1, MLCK-2, MLCK-3 및 MLCK-4와, 항원인 DLL4 간의 친화도 측정을 비아코어(BIACORE) 기기를 사용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은, 항-DLL4 항체인 MLCK-2가, DLL4에 의해 매개되는 HUVEC 증식 억제를 차단(block)함을 확인한 도이다.
도 7은, 항-DLL4 항체인 MLCK-2의, DLL4 및 Notch 간의 상호작용 억제를 통한 노치 신호전달 저해 효과를 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 항 DLL4 항체의 제조
실시예 1-1: DLL4 항원의 제조
인간 DLL4의 세포외 도메인 항원은 알앤디시스템사에서 제공된 인간 DLL4 단백질(Cat: 1506-D4/CF)을 입수하여 사용하였다. 상기 DLL4 항원 단백질은 27번 아미노산 내지 522번 아미노산을 포함한다. 이러한 단백질 C-말단에 히스티딘-태그에 결찰되어 있다.
그 다음, 또 다른 DLL4 세포외 도메인의 특정 영역에 대한 항원을 생산하였다. 이 특정영역은 27번 아미노산 내지 251번 아미노산을 포함한다. 이 영역은 노치 1 수용체와 결합하는 것으로 알려진 "DSL(델타/세레이트(Serrate)/lag-2)" 도메인으로 칭해지는 모티프를 함유한다(Tax et al., 1994, Nature 368:150-4). Fc 단백질에 융합된 DLL4의 세포외 도메인의 결실 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 CMV 프로모터를 포함하는 포유류 발현 플라스미드 벡터를 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성하였다. Fc 단백질에 융합된 인간 DLL4의 키메라인 DLL4의 결실 단편을 코딩하는 추가적인 구축물이 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 또한 제작하였다. Fc 단백질에 융합된 인간 DLL4 27번 내지 251번 아미노산을 포함하는 재조합 융합 단백질들을 HEK 293E 세포에서 일시적으로 형질감염시켜(transient transfection) 발현시켰고, 상기 단백질을 생산하기 위해 72시간마다 컨디셔닝 배지를 수집하였고, 이를 4번 반복하였다. 이 컨디셔닝 배지로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 1-2: 라이브러리 파아지(Library phage)의 제조
면역시험관(immunotube)에 10㎍/㎖ 농도의 재조합 인간 DLL4(알앤디시스템사) 용액을 첨가하여 4℃에서 밤새 시험관 표면에 단백질을 흡착시킨 후 BSA(Bovine serum albumin) 1% 용액을 시험관에 첨가하여 DLL4가 흡착되지 않은 표면을 보호하였다. 시험관을 비운 후 BSA 1% 용액에 분산된 1012CFU의 항체 파지 라이브러리를 넣어 항원과 결합시켰다. 비특이적으로 결합한 파지를 PBS-T(Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20) 용액으로 5회 씻어낸 후 남아있는 항원 특이적 파지항체를 100mM 트리에틸아민 용액을 이용하여 회수하였다. 회수된 파지를 1M 트리스 버퍼(pH 7.4)로 중화시킨 후 ER2537 대장균에 37℃에서 1시간 감염시키고 감염된 대장균을 카베니실린을 함유하는 LB(Luria-Bertani) 한천배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 배양된 대장균을 4㎖의 SB(superbroth)-카베니실린 배양액에 현탁하고 15% 글리세롤을 첨가하여 일부는 -80℃에 보관하고 나머지 중 50㎕를 20㎖의 SB-카베니실린 배양액에 2% 포도당용액(glucose)를 첨가하여 37℃에서 배양하였다. 배양액의 흡광도가 600nm에서 0.6이 되면 원심분리하여 배양액을 제거하고 이를 다시 20㎖의 SB-카베니실린 배양액에 현탁한 후 1012PFU의 VCSM13 헬퍼파지를 넣고 천천히 교반하며 37℃에서 배양하였다. 다음날 배양액을 원심분리한 후 배양액만 취하여 폴리에틸렌글라이콜 8000(PEG8000)을 4%, 염화나트륨(NaCl) 3%첨가하여 4℃에서 30분간 침전시킨 후 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 침전된 파지를 PBS 1㎖에 현탁시켜 이를 라이브러리로 사용하여 위의 패닝 과정을 반복함으로써 항원특이적 클론을 증폭/농축시켰다.
실시예 1-3: 파아지 디스플레이( Phage display )를 통한 패닝( panning )
인간 DLL4 단백질 내 노치 1과 결합하는 부위에 결합하는 항체를 선별하기 위해 패닝시, 인간 DLL4 단백질과 인간 DLL4 특정영역을 지칭하는 결실단편(27번 아미노산 내지 251번 아미노산)을 교차하여 패닝을 진행하였고, 3회(round)까지 진행하였다. 그 후 항체유전자를 포함하는 LB-카베니실린 한천배지에 도말, 배양하여 단일 콜로니들을 얻고 이를 400㎕ SB-카베니실린 배양액에 접종, 배양한 후 IPTG로 유도하여 scFv형태의 단백질을 대장균의 페리플라즘(periplasm)에서 발현하였다. 대장균을 TES용액(Tris, EDTA, sucrose)에 현탁한 후 4℃에서 1시간 방치 후 원심분리하여 페리플라즘을 추출하고, 이를 ELISA 기법을 사용하여 재조합 인간 DLL4 항원과 scFv와의 결합을 확인하는 데 사용하였다(Steinberger. Rader and Barbas III. 2000. Phage display vectors. In: Phage Display Laboratory Manual. 1sted. ColdSpringHarborLaboratoryPress. NY. USA. pp.11.9-11.12). 결합한 scFv는 HRP(Horseradish peroxidase)-anti-HA 항체와 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 이용하여 검출하였다. 이로부터 확인된 항원 특이적 항체 클론은 염기서열 분석법을 통해 분석하였다.
실시예 2: 항 DLL4 항체의 DLL4 에 대한 결합력 어세이
상기 실시예 1에서 분리 정제된 항체를 각각 MLCK-1, MLCK-2, MLCK-3 및 MLCK-4로 명명하였고, 각각 서열번호 1인 중쇄 가변영역과 서열번호 15인 경쇄 가변영역(MLCK-1), 서열번호 5인 중쇄 가변영역과 서열번호 19인 경쇄 가변영역(MLCK-2), 서열번호 8인 중쇄 가변영역과 서열번호 23인 경쇄 가변영역(MLCK-3) 및 서열번호 11인 중쇄 가변영역과 서열번호 27인 경쇄 가변영역(MLCK-4)을 포함하는 것을 확인하였다. 이와 같이 분리된 항체의 항원에 대한 친화도를 하기와 같이 분석하였다.
항 DLL4 항체-항원 결합 친화도는 ELISA-기반 용액 결합시험을 사용하여 평가하였다. 96-웰 미세역가 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC, Rochester, NY)를 4℃에서 밤새 PBS 용액 중의 2㎍/㎖ 농도의 hDLL4-His 단백질로 코팅하고, 비특이적 결합부위는 BSA(bovine serum albumin)로 2시간 동안 차단시켰다. 96-웰 미세역가플레이트 상에서 항 DLL4 항체(정제된 단백질)를 항체의 일정한 농도에 따라 0nM 내지 128nM 범위로 미세역가 플레이트에 옮겼다. 옮긴 다음, 2시간 항온처리한 후에, 플레이트를 0.05%의 트윈 20(tween 20)을 포함하는 PBS로 5번 세척하고, 플레이트-결합된 DLL4 항체를 HRP-접합된 Fab 다중클로날 항체 시약(Pierce)으로 검출하기 위해 1:10,000 비율로 하여 세척된 미세역가 플레이트 옮긴 후 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응 후 비색용 기질(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine; Sigma-Aldrich co)을 사용하여 발색시켰다. 효소반응을 0.5 mol/l의 황산 의해서 중지시키고, 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 기록하였다. 그 결과, 각각의 항체 모두 농도 의존적으로 DLL4에 대한 결합력이 증가하는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 3: 항 DLL4 항체의 DLL4 리간드에 대한 결합능 측정
ELISA 결과와 함께 FACS 분석을 통하여 항 DLL4 항체가 DLL4에 결합하는 능력을 측정하였다.
이 실험을 위하여, 인간 DLL4를 안정적으로 발현시키는 인간 배아 신장세포(HEK 293)를 제조하였고, 상기 제조된 세포와 FACSCalibur(BD Biosciences) 기기를 이용하여 항 DLL4 항체와 DLL4의 결합된 정도를 측정하였다. DLL4를 안정적으로 발현시키는 HEK293세포를 해리시키고 PBS에서 세척한 후, 세포수를 계수하여 1x105 cells/200㎕ PBS로 맞춘 뒤, 각각의 DLL4 단일클론 항체를 10㎍처리 후 실온에서 30분간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척한 뒤 FITC 라벨링 된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체(Goat anti-human IgG FITC conjugate, Fc specific, Sigma, F9512, 농도: 2.0mg/ml)를 5㎕/1x105cells/200㎕ PBS로 현탁하여 4℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척하고 FACSCalibur 기기상에서 판독하였다. 대조군은 FITC 라벨링된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체만 처리하였다. 각각의 DLL4 단일클론항체를 처리한 실험군에서 인간 DLL4-단일클론항체-FITC 결합에 의한 이동된 판독 결과를 대조군 결합과 비교하였다.
그 결과인 각각의 단일 클론 항체들이 인간 DLL4 항원에 결합한 정도를 도 3에 나타내었다. 결합 정도는 대조군과 비교하여 MLCK-1 47.82%(a); MLCK-2 는 59%(b); MLCK-3 52.85%(c), MLCK-4 52.46%(d)를 나타내었다(도 3).
이러한 결과는 본 발명의 MLCK-1, MLCK-2, MLCK-3 및 MLCK-4 항체가 인간 DLL4에 대하여 우수한 결합능을 가지는 것을 나타내는 것이다.
실시예 4: 항 DLL4 항체의 중화효과 어세이
항 DLL4 항체에 대해 ELISA-기반 용액 경쟁시험을 사용하여 항 DLL4 항체의 중화효과를 평가하였다.
96-웰 미세역가 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC, Rochester, NY)를 4℃에서 밤새 500ng/㎖ 농도의 hNotch-1-hFc 단백질(R&D systems)(PBS에 희석)로 웰 당 100㎕씩 코팅하고, 비특이적 결합부위는 BSA로 2시간 동안 차단시켰다.
96-웰 미세역가 플레이트 상에서 항 DLL4 항체(정제된 단백질)를 0nM 내지 140nM 범위의 농도에서 항체를 항원 단백질(DLL4 항원, 600ng/㎖)의 계열 희석액과 예비 혼합시켰다. 상기 항원과 항체를 30분간 항온 처리한 후에 유리 항체의 측정을 위해서 상기 혼합 용액을 DLL4 수용체인 hNotch-1 단백질로 미리 코팅(50ng/well)된 미세역가 플레이트에 옮겼다. 그 다음, 상기 플레이트를 2시간 항온처리하고 0.05% 트윈 20(tween 20)을 포함하는 PBS로 5번 세척하고, 플레이트에 결합된 DLL4 항원을 HRP-접합된 His 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체 시약(Roche applied science)으로 검출하기 위해 1:500 비율로 상기 HRP-접합된 His 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체를 세척된 미세역가 플레이트에 처리한 다음, 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그 다음, 비색용 기질(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine; Sigma-Aldrich co)을 사용하여 발색시키고, 효소반응을 0.5mol/l 황산으로 중지시켰다. 450nm에서 흡광도를 기록하여 그 결과를 도 4에 나타내었으며, 플레이트-코팅된 노치 1-Fc에 결합된 인간 DLL4-His의 50% 감소를 달성하는데 필요한 항체의 양(IC50)을 하기 표 1에 나타내었다.
클론(clone) IC50(nM)
MLCK-1 1.32
MLCK-2 0.41
MLCK-3 0.38
MLCK-4 3.72
그 결과, 본 발명의 4가지 항체 모두는 0.4 내지 3.7 nM의 IC50 값을 나타내어, DLL4 리간드인 인간 노치-1에 대한 결합을 아주 낮은 농도에서 저해 시킬 수 있음을 나타내었다(도 4 및 표 1). 이러한 결과는 본 발명의 4가지 항체가 DLL4 리간드와 Notch와의 결합을 억제시킴을 통하여 암세포의 성장을 억제시킬 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
실시예 5: 항- DLL4 항체의 결합능 분석
항 DLL4항체의 결합능을 알아보기 위하여 BIACORE 어세이를 실시하였다.
구체적으로, SPR 분석은 T200을 사용하였고, 러닝 완충액(running buffer)은 HBS-EP(10 mM HEPES, pH7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.15% surfactant P20)를 사용하였다. 표면 준비는 위자드 프로그램(wizard program)의 표면 준비_표적 고정화(surface preparation_target immobilization; condition: 25℃, 5 ㎕/min)를 이용하여, 리간드인 hDLL4를 10 mM 소듐 아세테이트(sodium acetate, pH 4.5)에 10 ㎍/㎖이 되도록 희석한 다음, CM5 칩 표면에 각 실험이 목표로 하는 타겟 고정화 레벨만큼 고정시켰다. 고정화는 2개의 유로(Fc, flow cell)가 하나의 셋트로 진행되며 본 실험에서 첫 번째 유로는 blank로 지정하고, 두 번째 유로는 hDLL4로 고정화하였다. 첫 번째 유로는 비특이적인 결합 및 버퍼에 의한 변화 수치를 보이는 레퍼런스(reference)로, 실험 결과는 Fc2-Fc1의 수치를 사용하였다. hDLL4와 결합하는 물질로 항-DLL4 항체인 MLCK1, MLCK2, MLCK-3, MLCK4를 몰 농도로 환산하여 러닝 완충액(running buffer)으로 100 nM로 희석한 뒤, 1/2 연속 희석하여 5 농도 구간에서 분석하였다. 분석 시료는 최소 희석 배수 100 이상이 되도록 고순도/고농도로 준비하여 완충액 변화에 의한 영향(Buffer effect)을 최소화하였다. 모든 분석은 위자드 프로그램을 이용하여, 한 시료에 대하여 2 배수로 진행되었으며 모든 분석 간에는 재생 단계(regeneration step)를 두어 실험의 기준선이 일정하게 유지될 수 있도록 하였다. 결과는 Biaevaluation software 4.0 version으로 분석하였다. 이때, Fc2-Fc1, Fc4-Fc3 결과에서 baseline을 0으로 설정한 다음, 완충액 주입(buffer injection) (analyte 0 nM) 부분을 전체 sensorgram에서 뺀 후에, 결과를 1:1 binding model로 결합 친화도 분석을 하였다. 분석 항목은 ka(M-1s-1), kd(s-1), Ka(1/M), KD(M)였다. 여기서, ka는 친화도(recognition)를 나타내는 결합 상수(association constant)이고, kd는 안전성(stability)을 나타내는 해리 상수(dissociation constant)이다. 평형해리상수인 KD(M)는 kd/ka로 환산하였다
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 인간 DLL4에 대한 MLCK-1 항체의 KD(M)는 2.63X10-7M, MLCK-2 항체의 KD(M)는 1.71x10-9M, MLCK-3 항체의 KD(M)는 6.96X10-9M, 및 MLCK-4 항체의 KD(M)는 2.13X10-6M을 나타내었다.
실시예 6: DLL4 항체의 혈관내피세포 ( HUVEC ) 증식에 대한 영향 분석
DLL4 에 결합하는 항체의 혈관내피세포 (HUVEC) 증식에 대한 영향을 분석하기 위하여 대표적인 항-DLL4 항체인 MLCK-2 항체를 이용하여 혈관 내피세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였다.
구체적으로, 혈관 내피세포(HUVEC, Human umbilical vein endothelial cell)를 Lonza 사에서 구매하여 실험에 사용하였다. 또한, 1% 젤라틴(Sigma)이 용해된 PBS 완충 용액(Gibco)으로 T-플라스크(Nunc)를 상온에서 4 내지 6시간 코팅시킨 후 PBS로 세척하여 이를 HUVEC의 배양에 사용하였다. 사용된 배지는 EGM-2 Single Quot(Lonza)가 포함된 EBM-2(Lonza)로, 세포 배양은 밀집도가 80%가 넘지 않도록 하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 계대 배양을 진행하였고, 계대(passage) 6이내의 세포들을 이용하여 실험하였다. 혈관 내피 세포 증식 어세이(HUVEC proliferation assay)는 다음과 같은 방법으로 진행하였다. hDLL4가 코팅된 플레이트를 준비하기 위하여, 실험 전날 96-웰 플레이트(BD)에 rhDLL4 (R&D systems)를 1㎍/ml로 카보네이트(Carbonate) 완충 용액을 사용하여 희석시킨 후, 100 ㎕/웰로 웰에 접종하여 4℃에서 밤샘 정치시켜 놓았다. 또한 HUVEC은 0.1% FBS가 첨가된 EBM-2 최소 배지에서 24시간 동안 방치하여 혈청에 의한 효과를 최소화하고자 하였다. 실험 당일 rhDLL4가 코팅된 플레이트는 각각의 웰을 PBS로 2회 세척 후, 각각의 실험군별로 hVEGF(50ng/ml), MLCK-2 mAb(20㎍/ml)를 앞서 사용한 EBM-2 최소 배지로 희석하여 처리(triplicate)하고 상온에서 20분간 정치시켰다. 전날부터 24 시간 동안 굶주림(starvation)된 HUVEC을 단일 세포화시킨 후, EBM-2 최소배지를 사용하여 4 x 103 cells/웰이 되도록 희석하였다. 희석된 세포를 항체가 처리된 웰에 접종하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 96시간 동안 정치하였다. 세포증식이 종료되었을 때 cell counting kit-8(CCK-8, Dojino)를 각 웰에 10㎕씩 처리하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 5시간 동안 정치하였다. SpectraMax 190(molecular Devices) 기기를 이용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 세포의 증식 정도를 각 군별로 비교하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 대표적인 항-DLL4 항체는 DLL4에 의한 HUVEC 증식 억제를 농도의존적으로 해제시키는 결과를 나타내었다.
실시예 7: 항 DLL4 항체의 DLL4 / Notch 신호 전달 경로 억제 활성 분석
노치 신호전달에서 노치 수용체가 DLL4와 결합되면 노치 수용체의 구조적 변화를 가져와 노치 수용체가 절단되고, 노치 수용체의 세포내 부분(NICD, intracellular domain of notch)이 핵 안으로 이동되어 노치 신호전달을 매개한다. 이에 본 발명의 항 DLL4 항체가 DLL4와 노치 수용체 간의 결합을 억제하여 노치 신호전달을 막을 수 있는지 여부를 노치 수용체의 절단 억제 여부를 통하여 하기와 같이 확인하였다.
구체적으로, DLL4 에 결합하는 항체의 DLL4/Notch 신호 전달 경로 억제 활성을 알아보기 위하여 HUVEC 세포를 이용하여, 신호 전달 경로 억제 여부를 확인하였다. 실험 전날 6 웰 플레이트(BD)에 재조합 인간 DLL4(rhDLL4, recombinant human DLL4, R&D systems)를 1㎍/ml로 카보네이트 완충 용액을 사용 희석시킨 후 1 ml/웰로 첨가한 다음 4℃에서 밤샘 정치시켰다. rhDLL4를 처리하지 않는 대조 실험군에는 카보네이트 완충 용액 단독으로 1ml/웰로 처리하여 동일하게 4℃에서 밤새 정치시켰다. 다음날, 4℃ 냉장고에서 DLL4가 코팅된 플레이트를 꺼내어 PBS로 1회 세척한 후, EGM-2 배지를 각 웰에 1ml씩 처리하고, 각 웰 별로 항체(Anti-VEGF mAb: 20㎍/ml, DBZ: 0.08 nM, MLCK-2 mAb: 20 ㎍/ml)를 처리하였다. 최종 배양액의 양은 2 ml이므로 항체 처리를 2배로 하여 상온에서 20분간 정치하였다. 항체 처리시간 동안 passage(#2 ~#5)의, 75T 플레이트에서 배양된 HUVEC을 꺼내어 배지 제거 후 단일 세포화시켰다. 원심분리 과정을 통하여 세포를 세척하고 신선한 EGM-2 배지를 사용하여 재부유시키고, 세포의 개수를 세어 5 x 105 cells/ml로 희석한 다음 각각에 웰에 1 ml씩 접종하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다. 0.2% FBS가 포함된 EBM-2 최소배지를 준비하고, 하룻동안 배양된 HUVEC의 각 웰에서 배지를 제거하고, PBS 1회 세척 후 0.2% FBS가 포함된 EBM-2 최소배지를 2 ml 처리하였다. 또한, 각각의 웰에 전날 처리한 동일한 농도의 항체(Anti-VEGF mAb: 20㎍/ml, DBZ: 0.08 nM, MLCK-2 mAb: 20㎍/ml)를 처리하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 하룻동안 배양하였다. 항체가 처리된 HUVEC들의 각 웰에 hVEGF (R&D systems)를 100 ng/ml로 처리하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 5분간 반응시킨 다음 플레이트를 꺼내어 재빨리 배지를 버리고, PBS 1회 세척한 후, 세포 용해 완충 용액(1% NP-40, 20 mM Tris, 137 mM NaCl, 10% Glycerol, 2 mM EDTA, 1 mM Sodium orthovanabate, 1x Protease & phosphatase inhibitor cocktail)을 준비하여 각각의 웰에 150 ㎕를 첨가한 다음 고루 퍼지도록 흔들어 주었다.
그 다음, 이 플레이트를 얼음 위에 얹고 스크립퍼로 각각의 웰의 HUVEC들을 긁어 모은 후 1.5 ml 튜브에 모은 다음, 얼음에 정치시켜 놓았다. 5분 단위로 얼음에서 1.5 ml 튜브를 꺼내어 Vortexing 3회 후 다시 얼음에 담구어 놓아 세포 용해를 진행한 다음, 이것을 원심분리(4℃, 14000 rpm, 10분)하고 상등액을 새로운 튜브로 옮긴 후 정량을 진행하고, 5 x SDS 샘플 완충액에 섞고 100℃에서 10분간 끓인 후 SDS-PAGE 분석을 진행하였다. 이때, 준비된 단백질 시료를 4% 내지 12% bis-TRIS 젤을 통하여 SDS-PAGE를 진행하였고, 크기별로 분리시킨 후 NICD(Cell signaling), P-ERK(Cell signaling), ERK(Cell signaling), VEGFR2(Cell signaling), P-VEGFR2(Cell signaling), Actin (Santa Cruz) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 진행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 대표적인 MLCK-2 단일클론항체의 처리에 따라, DLL4 처리에 의하여 증가한 NICD(레인4 및 5)를 감소시키는 결과를 나타내었다(레인 7).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> Novel monoclonal antibody that specifically binds to DLL4 and use thereof <130> PA130539KR <150> KR 10-2012-0071996 <151> 2012-07-02 <160> 35 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of MLCK-1 <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asp Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of a heavy chain variable region of MLCK-1, 2, 3 <400> 2 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of a heavy chain variable region of MLCK-1 <400> 3 Trp Ile Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a heavy chain variable region of MLCK-1 <400> 4 Ala Asp Pro Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of MLCK-2 <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asp Trp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of a heavy chain variable region of MLCK-2 <400> 6 Trp Ile Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a heavy chain variable region of MLCK-2 <400> 7 Ala Asp Trp Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of MLCK-3 <400> 8 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asp Leu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 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Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 35 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a constant region of lamda light chain <400> 35 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105

Claims (19)

  1. 인간 델타 유사 리간드 4(DLL4)에 특이적으로 결합하면서 인간 델타 유사 리간드 4와 노치(Notch) 수용체 간의 상호작용을 저해하는 단일클론항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 16으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 17로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 18로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 15로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 6으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 20으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 21로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 22로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 5로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 19로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 10으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 24로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 25로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 26으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 8로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 23으로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 12로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 13으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 14로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 28로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 29로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 30으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 11로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 27로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항의 발현 벡터가 도입된 형질전환체.
  13. 제11항의 발현 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는, 인간 델타 유사 리간드 4(DLL4)에 특이적으로 결합하면서 인간 델타 유사 리간드 4와 노치(Notch) 수용체 간의 상호작용을 저해하는 단일클론항체의 제조 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 및 다발성 골수종 혈액암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 포함하는, 암 진단용 조성물.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 델타 유사 리간드 4(DLL4) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 뇌척수염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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