KR102487687B1 - 신규 cthrc1에 특이적 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CTHRC1에 결합하는 신규한 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 CTHRC1에 특이적 항체 및 이의 용도{Novel CTHRC1-specific antibodies and the use thereof}
본 발명은 CTHRC1에 결합하는 신규한 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
현재 임상적으로 사용하고 있는 항암제는 화학요법제와 생물요법제로 분류할 수 있다. 과거 활발히 개발되었던 화학요법제는 암세포에 독성을 나타내는 약제들로서, 암세포뿐만 아니라 정상 세포에도 독성을 나타내며, 또한 내성을 나타낸다는 문제가 있어 개발 및 사용에 한계를 보이고 있다. 이에, 최근에는 인체의 면역 기능을 회복시키거나 증가시켜 암세포의 활동력을 약화시키는 생물요법제가 그 대안으로 활발히 개발되고 있다. 현재 사용되거나 개발되고 있는 생물요법제로는 사이토카인류, 단클론 항체(monoclonal antibody) 등의 재조합 항체, 핵산분자 치료제 및 신생혈관형성 억제제 등이 있다.
상술한 생물요법제 중에서도, 치료용 단클론 항체는 표적에 대한 반응 특이성이 높아 부작용이 낮은 것이 특징이다. 항체는 여러 가지 기작으로 치료효과를 나타내는데, 해당 항원과 특이적으로 결합하여 신호전달을 저해하거나 교차 결합(cross-linking)에 의한 세포 사멸을 유도할 수 있으며, 또한 생체 내 면역 시스템을 활성화하여 그 효과를 나타낼 수도 있다. 따라서, 항암제로서의 단클론 항체는 암세포를 특이적으로 추적하여 그 활성을 억제함은 물론 면역반응을 일으켜 암세포를 효과적으로 제거할 수 있으므로, 암 치료의 주류로 자리매김해 가고 있다. 이와 관련하여, 라무시루맙(ramucirumab), 리툭시맙(rituximab), 트라스트주맙(trastuzumab) 등의 단클론 항체가 개발되어 위암, 유방암, 간암 등의 치료에 사용되고 있다.
한편, CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1)은 혈관 재형성, 뼈 형성 및 발달 형태 형성에 관여하는 분비 단백질로 알려져 있다.
최근의 연구에 의하면, 췌장암, 난소암, 유방암, 흑색종 등의 다양한 종류의 암세포에서 CTHRC1이 과발현되어 암의 증식이나 전이와 관련되어 있음이 보고되었고 이는 공격적인 종양(aggressive tumor)에서 CTHRC1이 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다. 또한 CTHRC1은 암세포 자체의 증식 및 전이를 유도할 뿐 아니라 종양미세환경내의 혈관세포를 자극해 신생혈관생성에도 관여한다고 알려져 있다(Park et al, Carcinogenesis (2013) 34:694, Lee et al, ExpMolMed (2016) 48:e261). 인간 종양 cDNA 어레이 분석에서 CTHRC1이 인간 고형암(solid tumor)에서 주로 발현하고, 전사체 분석(transcriptome analysis)에서 소엽성 유암(breast lobular carcinoma) 및 일반 췌관세포(ductal cell) 및 소엽세포(lobular cell) 사이에서 발현의 차이가 있음을 확인하였다. CTHRC1은 침습성 원발성 흑색종(primary melanomas) 및 전이성 흑색종(metastatic melanomas)에서 발현하나, 양성 모반(benign nevi) 또는 비-침습성 시료에서는 발현되지 않았다. 또한 CTHRC1 발현의 억제는 흑색종 세포주의 이동을 시험관 내에서 감소시켰다. CTHRC1은 융기성 피부섬유육종(dermatofibrosarcoma protuberans), 빈번히 전이되는 국부적으로 공격적인 신생종양(neoplasms)으로 확인되었으나, 피부육종(dermatosarcomas), 일반적인 양성의 섬유조직구 종양(benign fibrohistiocytic tumor)은 아님이 확인되었다. CTHRC1 발현은 일반 조직 또는 전구체 장애(precursor lesions)와 비교하여 유방암 조직에서 유의적으로 높고, 골 전이(bone metastasis)의 위험과 연관되어 있음이 보고되었다. 그러나, CTHRC1 단백질에 대한 결합력 및 친화력을 향상시킴과 동시에, 다양한 종류의 암 진단 및 치료에 우수한 효과를 갖는 항체의 개발이 여전히 필요한 실정이었다.
이러한 배경 하에, 난치성 암을 포함한 다양한 암의 치료를 위해 CTHRC1에 특이적으로 결합하는 항체의 개발이 지속적으로 요구되어 왔으며, 본 발명자들은 높은 친화도 및 특이도를 갖는 새로운 항체를 개발하고, 상기 항체가 다양한 암에서 항암효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1)의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CTHRC1의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 이를 포함하는 발현벡터; 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CTHRC1의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 CTHRC1 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 이용하여 암을 앓고 있는 개체의 분리된 생물학적 시료의 CTHRC1 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CTHRC1의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 CTHRC1 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 CTHRC1 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
알라닌 Ala, A 아르기닌 Arg, R
아스파라긴 Asn, N 아스파르트산 Asp, D
시스테인 Cys, C 글루탐산 Glu, E
글루타민 Gln, Q 글리신 Gly, G
히스티딘 His, H 이소류신 Ile, I
류신 Leu, L 리신 Lys, K
메티오닌 Met, M 페닐알라닌 Phe, F
프롤린 Pro, P 세린 Ser, S
트레오닌 Thr, T 트립토판 Trp, W
티로신 Tyr, Y 발린 Val, V
본 발명의 하나의 양태는 CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1)의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명에서 용어 "CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1)"은 혈관 리모델링(vascular remodeling), 골 형성(bone formation), 및 형태형성(morphogenesis)에 작용하는 수용성 단백질이고, 손상된 동맥에서 발현하여, 세포 이동을 촉진하고, 섬유아세포(fibroblasts) 및 연성근육세포(smooth muscle cell)에 있어서 콜라겐 합성을 억제하여 손상된 대동맥 리모델링의 기능이 있음이 알려져 있다. 혈관세포에서 CTHRC1의 발현은 형질전환생장인자-β(transforming growth factor-β; TGF-β)를 조절하고, 따라서, 콜라겐을 포함하는 TGF-β 표적 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한, CHTRC1 유전자 이식 쥐(transgenic mice)는 골모세포의 뼈 형성(osteoblastic bone formation), 골전구세포(osteoprogenitor cells)의 분화 및 무기화(mineralization)를 증가시키고, 또한 Wnt5a와 상호결합하여 평면 세포 극성(planar cell polarity) 경로를 활성화시켜, 발달과정 동안 형태형성의 조절에 CTHRC1의 역할을 확인할 수 있다.
본 발명의 CTHRC1 단백질은 통상적인 방법으로 재조합적으로 얻어진 것이거나, 통상의 상업적 구입처에서 구입한 것일 수 있다. 본 발명의 CTHRC1은 분리된 단백질 형태거나 다른 단백질 또는 다당류와 결합된 형태일 수 있고, 구체적으로는 세균 유래 외독소와 결합된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
CTHRC1 단백질을 특이적으로 인지하는 항체는 CTHRC1이 과발현되어 있는 암과 같은 질환의 진단, 및 예방 또는 치료에 사용될 수 있어, 본 발명자들은 인간 및 마우스 CTHRC1 단백질에 고친화적으로 결합하는 항체를 개발하였다. 본 발명의 항체는 인간 CTHRC1 단백질 모두에 고친화적으로 결합하여 CTHRC1 단백질이 과발현되어 있는 질환의 진단 분야에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 암의 예방 또는 치료 분야에 있어서도 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1)의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 또한, 상기 용어는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab') 2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab') 2 단편을 얻을 수 있다), 구체적으로는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명에서 용어, "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, 이는 3가지 이상의 잠재적인 장점을 가질 수 있다. 먼저, 이는 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다. 둘째로, 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는 이점이 있다. 셋째로, 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 이점이 있다.
또한, 상기와 같은 본 발명의 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그 예로, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 불변 영역으로부터 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다.
본 발명에서 용어, "하이브리드(hybrid)"란 단쇄 면역 글로불린 중쇄 불변 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하며, 그 예로 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다.
본 발명에서 용어, "CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1)에 특이적으로 결합하는 항체"는 CTHRC1 단백질에 결합하여 CTHRC1 단백질의 활성을 저해할 수 있는 항체를 의미한다.
본 발명의 CTHRC1에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 CTHRC1 단백질에 고친화성으로 결합하는 특성을 지닌다.
상기 항체는 (a) 서열번호 1 또는 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 2 또는 12의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3 또는 13의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 4 또는 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 5 또는 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6 또는 16의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 서열번호 7, 17, 21, 또는 25의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 서열번호 9, 19, 23또는 27의 아미노산 서열로 이루어진 상기 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 예로, CTHRC1 단백질에 대한 친화도 및 특이도가 향상된 본 발명의 항체는,
구체적으로, 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하거나,
서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 13의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 "4H5" 또는 "cCMAb45"로 명명하였고, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 "9E6" 또는 "cCMAb96"로 명명하였다.
또한, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 "4H5" 또는 "hCMAb45"로 명명하였고, 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 "9E6" 또는 "hCMAb96"로 명명하였다.
본 발명의 일 구현예에서는 CTHRC1 단백질과 결합하는 B 림프구를 스크리닝하여 가장 항원결합 활성이 높은 4개의 신규한 4H5, 9E6, 6C1, 및 1D1를 선별하였으며, 그 중 4H5, 9E6의 에피토프를 확인한 결과 CTHRC1 단백질에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 것을 확인하여, 상기 두 개의 신규한 항체를 제공한다.
이는, 본 발명의 CTHRC1 단백질에 결합하는 항체는 CTHRC1 단백질의 인지가 필요한 분야, 예를 들어 CTHRC1 단백질이 과발현된 질환의 진단 또는 치료 등에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 양태는, 상기 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체는 공지의 항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파지 디스플레이(phage display) 기술 등을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다클론항체의 제조방법은 공지의 항체 제조기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적으로 파지 디스플레이 기술은 1) 파지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ (또는 pⅣ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 물질을 처리하는 단계; 4) 상기 물질에 결합된 항체-파지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 항체의 서열을 결정하는 단계로 구성된다.
본 발명의 단일클론항체의 제조방법은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자는 공지의 파지 디스플레이 기술, 예를 들어 Barbas 등(METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2:119, 1991 및 J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9) 및 Winter 등(Ann. Rev.Immunol. 12:433, 1994)의 논문 등에 공지된 방법을 참고하여 상기 본 발명의 제조방법의 각 단계를 용이하게 수행할 수 있다. 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파지는, 예를 들어 필라멘트성 파지(filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파지가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터에는 예를 들어, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8 또는 pSEX 등의 파지미드 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 증폭을 위한 재조합 파지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파지에는, 예를 들어 M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 단일클론항체 클론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 그 예로, 파지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 일단 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론항체를 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 인간 단일클론항체의 제조 방법은 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터에서 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 포함하는, 인간 단일클론항체의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다.
상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS(원숭이 신장 섬유세포), NSO(마우스 골수종), 293T, 보우스 멜라노마(Bowes melanoma) 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트(bombardment) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 항체는 암에서 과발현되어 있으며, 암 세포의 성장 및 전이에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 CTHRC1 단백질에 고친화도로 결합하므로, CTHRC1 단백질의 활성의 억제, 중화 또는/및 세포 독성 반응을 가져와 CTHRC1 단백질이 과발현되어 있는 질환의 예방 또는 치료를 가져올 수 있다. 상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "암"은 본 발명의 항체에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암이라면 그 종류에 제한없이 포함하나, 그 예로 췌장암, 난소암, 유방암, 흑색종, 간암, 자궁경부암, 위암, 폐암, 대장암, 구강암, 및 방광암일 수 있다. 본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 조성물의 투여에 의해 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있으며, 상기 "치료"란 상기 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 암을 치료하는 방법은 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 암이 발병되거나 발명 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 암을 치료하는 방법은 구체적으로는 항체를 포함하는 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있다.
상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한없이 포함한다.
이때, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 CTHRC1 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다. 또한, 이 방법은 암을 진단하는 방법일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 이용하여 암을 앓고 있는 개체의 분리된 생물학적 시료의 CTHRC1 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 정보의 제공방법을 제공한다. 또한, 이 방법은 암을 예후 예측하는 방법일 수 있다. 상기 항체, 암, 개체 및 CTHRC1 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. CTHRC1 단백질은 여러 암에서 과발현되어 있는 것으로 알려져 있으므로, CTHRC1 단백질이 과발현된 것으로 알려진 암의 진단에 본 발명의 항체를 유용하게 사용할 수 있다. 또한, CTHRC1 단백질의 과발현이 전이와 관련 있는 EMT(epithelial-mesenchymal transition)를 유도해 암의 불량 예후와 관련되어 있음이 역시 보고되어 있으므로, 암의 예후 예측에 본 발명에 따른 항체를 유용하게 사용할 수 있다.
상기 암의 진단을 위한 정보의 제공방법 또는 암의 예후 예측을 위한 정보의 제공방법은 본 발명의 CTHRC1에 특이적인 인간 단일클론항체를 암이 의심되는 개체 또는 암을 앓고 있는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 CTHRC1 단백질을 검출할 수 있으며, 이를 통해 암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공을 할 수 있다.
구체적으로, (a) 상기 항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에 처리하여 CTHRC1 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계; (b) 상기 (a)에서 검출된 CTHRC1 단백질의 수준을 대조군과 비교하여, 대조군에 비하여 CTHRC1 단백질 수준이 높으면 암 환자로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법 또는 암의 진단 방법일 수 있다.
구체적으로, (a) 상기 항체를 암을 앓고 있는 개체의 분리된 생물학적 시료에 처리하여 CTHRC1 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계; (b) 상기 (a)에서 검출된 CTHRC1 단백질의 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 정보의 제공방법 또는 암의 예후 예측 방법일 수 있다.
본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 CTHRC1 단백질의 존재 또는 암의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 시료 중의 CTHRC1 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
구체적으로는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. ELISA에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA, 항체 결합 부위가 같은 서로 다른 항원 사이를 경쟁시키는 경쟁적 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상기 항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 CTHRC1 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 진단 또는 예후 예측용 조성물을 사용하여 CTHRC1 단백질의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환, 예컨대 암을 진단하거나, 예후 예측을 할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
상기 조성물 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 암 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1)의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 CTHRC1 단백질 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 CTHRC1의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 CTHRC1 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 CTHRC1 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 검출하는 방법은 컨쥬게이트 백신의 정량에 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있으며, 구체적으로 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있으며, 웨스턴블랏(western blotting), ELISA, 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), FACS(flow cytometry), 단백질 칩(protein chip) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 형태일 수 있고, 구체적으로 상기 키트는 전술한 항체를 포획 항체로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 ELISA는 (i) CTHRC1 에 결합하는 다클론 항체; (ii) 본 발명의 CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1)의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 형태인 포획 항체; 및 (iii) 검출표지가 결합된 IgG Fc에 결합된 항체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)"는 효소면역 측정방법이라고도 하며, 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 이의 효소와 기질의 반응을 통해 흡광도를 이용하여 정량하는 방법이다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA, 항체 결합 부위가 같은 서로 다른 항원 사이를 경쟁시키는 경쟁적 ELISA 등을 포함한다.
본 발명의 CTHRC1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체; 이를 포함하는 검출용 조성물; 키트; 및 이를 이용하여 CTHRC1 단백질을 검출하는 방법을 이용하여 극미량의 CTHRC1 단백질을 검출할 수 있으며, 검출되는 단백질의 양은 구체적으로 1mg 미만, 100ug 미만일 수 있고, 보다 구체적으로는 10ug 미만, 1ug 미만, 100ng 미만, 10ng 미만, 1ng 미만일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 CTHRC1에 특이적으로 결합하는 4H5, 9E6 항체를 포획 항체로 이용한 간접적 ELISA를 수행함으로써 수 ng 수준의 CTHRC1 단백질을 검출할 수 있음을 확인하였으며, 상기 ELISA를 수행하여 컨쥬게이트 백신 역시 검출할 수 있음을 확인하였다.
이와 같이 본 발명의 항체를 이용함으로써 기존의 CTHRC1 단백질 검출용 키트에 비해 훨씬 적은 양의 CTHRC1 단백질을 검출할 수 있으므로, 본 발명의 항체를 CTHRC1 단백질 및 이를 이용한 백신 정량화에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 신규한 항체는 미량의 CTHRC1를 검출할 수 있으며 CTHRC1 컨쥬게이트 백신 역시 검출할 수 있으므로, CTHRC1 및 CTHRC1 컨쥬게이트 백신의 정량화에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 CTHRC1에 결합력이 높은 마우스 항체 4H5 및 9E6에 대한 Indirect ELISA의 결과이다.
도 2는 마우스 항체 4H5와 9E6은 에피토프가 다르다는 것을 확인한 결과이며 이는 서로 다른 메커니즘을 통해 항암 작용을 일으킬 수 있음을 시사하는 결과이다.
도 3은 cCMAb45 및 cCMAb96이 CTHRC1 단백질에 높은 결합력을 가질 뿐 아니라 특이적으로 결합한다는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 cCMAb45 및 cCMAb96의 췌장암 이동(Migration) 억제 효과를 시험관 내(in vitro)에서 확인한 결과이다.
도 5는 cCMAb45 및 cCMAb96의 유방암 이동 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 6은 cCMAb45 및 cCMAb96의 난소암 이동 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 7은 cCMAb45 및 cCMAb96의 방광암 이동 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 8은 cCMAb45 및 cCMAb96의 췌장암 침윤(Invasion) 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 9는 cCMAb45 및 cCMAb96의 환자 유래 췌장암세포 침윤 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 10은 cCMAb45 및 cCMAb96의 유방암 침윤 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 11은 cCMAb45 및 cCMAb96의 난소암 침윤 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 12는 cCMAb45 및 cCMAb96의 방광암 침윤 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 13은 4H5 및 9E6 인간화 후보 항체들의 생산 결과이다.
도 14는 4H5 및 9E6 인간화 후보 항체들의 결합 친화도 측정 결과이다.
도 15는 췌장암 세포주 Panc-1을 이용하여 4H5 및 9E6 인간화 후보 항체들의 효능을 검증한 결과이다.
도 16은 1차로 선정된 4H5 및 9E6 인간화 후보 항체들의 결합 친화도를 재측정한 결과이다.
도 17은 1차로 선정된 4H5 및 9E6 인간화 후보 항체들의 효능을 재검증한 결과이다.
도 18은 hCMAb45와 hCMAb96이 CTHRC1 단백질에 특이적으로 결합한다는 것을 확인한 결과이다.
도 19는 hCMAb45 및 hCMAb96의 췌장암 이동 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 20은 hCMAb45 및 hCMAb96의 난소암 이동 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 21은 hCMAb45 및 hCMAb96의 유방암 이동 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 22는 hCMAb45 및 hCMAb96의 방광암, 폐암, 흑색종 이동 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 23은 hCMAb45 및 hCMAb96의 췌장암 침윤 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 24는 hCMAb45 및 hCMAb96의 난소암 침윤 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 25는 hCMAb45 및 hCMAb96의 유방암 침윤 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 26은 hCMAb45 및 hCMAb96의 방광암, 폐암, 흑색종 침윤 억제 효과를 시험관 내에서 확인한 결과이다.
도 27은 hCMAb45 및 hCMAb96의 생체 내(in vivo) 항암 효과를 확인한 결과이다. 췌장암 세포주 BxPC-3를 이용한 모델에서 대조군 그룹에 비해 감소된 종양의 부피를 보여준다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1: 마우스 항체 cCMAb45 및 cCMAb96 >
실시예 1-1: 4H5 및 9E6의 발굴
CTHRC1 단백질을 타겟으로 하는 항체를 개발하기 위해 CTHRC1 단백질에 결합하는 마우스 단일클론 항체를 발굴하였다. 구체적으로, CTHRC1 단백질을 마우스에게 주사해 CTHRC1에 대한 항체가 생성되면 마우스의 지라에서 B 림프구를 분리하였다. 분리한 B 림프구들을 CTHRC1 단백질이 코팅되어있는 96 웰 플레이트(well plate)에 하나의 림프구만이 들어가도록 희석하였다. 그 후, HRP(Horseradish peroxidase)가 표지된 항-마우스(anti-mouse) 항체를 이용하여 CTHRC1 단백질과 결합하는 B 림프구들을 스크리닝하였다.
그 결과, 4H5, 9E6, 6C1, 1D1 4종의 항-CTHRC1 마우스 단일클론 항체를 발굴하였다.
실시예 1-2: CTHRC1에 대한 친화도 확인
실시예 1-1에서 발굴한 항-CTHRC1 마우스 단일클론 항체 4종의 항체 중에서 CTHRC1 단백질에 친화도가 가장 높은 항체를 발굴하기 위해 간접적(indirect) ELISA를 수행하였다.
CTHRC1-Fc와 CTHRC1-His 단백질을 코팅한 면역(Immuno) 플레이트에 4H5, 9E6, 6C1, 1D1 4종의 항체를 농도 별로 처리하여 2시간 반응시킨 뒤 HRP가 표지 된 anti-mouse 항체를 2차 항체로 사용하여 흡광도를 측정하였다. 이 때, 흡광도(Optical density, O.D)가 높을수록 CTHRC1에 더 강력하게 결합하는 것을 의미한다.
그 결과, 4종의 항체 모두 CTHRC1 단백질의 농도에 따라 O.D값이 증가했지만 다른 항체에 비해 4H5와 9E6 두 종의 항체가 CTHRC1에 더 높은 친화도로 결합하는 것을 확인하였다(도 1).
실시예 1-3: 에피토프(Epitope) 확인
4종의 anti-CTHRC1 마우스 항체 중 친화도가 높은 4H5와 9E6의 에피토프를 확인하기 위하여 경쟁적(Competitive) ELISA를 수행하였다. 여기서 에피토프란 항체가 인식하는 항원의 위치를 말한다.
면역 플레이트에 CTHRC1 단백질을 코팅한 후 비오틴(biotin)이 표지 된 4H5, 9E6과 비오틴이 표지되지 않은 비표지 4H5, 9E6 항체를 1:0, 1:3, 1:6, 1:12.5, 1:25, 1:50, 1:100 비율로 넣어주었다. 2차 항체로는 스트렙트아비딘(Streptavidin)-HRP를 사용하여 각 항체의 O.D값을 측정하였다. 이 때, 4H5, 9E6이 유사한 에피토프를 가진다면 비표지 항체의 농도가 증가함에 따라 O.D값이 낮아지지만, 에피토프가 다른 경우는 비표지 항체의 농도가 증가하여도 O.D값은 변하지 않는다.
이를 통해, 4H5와 9E6은 서로 다른 에피토프를 가지는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 1-4 : 키메라(Chimeric) 항체 cCMAb45와 cCMAb96의 제작
CTHRC1에 특이적이고 높은 친화도를 가지는 4H5와 9E6 마우스 항체의 면역원성을 최소화하기 위해 마우스 항체의 가변영역은 유지하고 불변영역만 인간 유래의 단백질로 바꾼 키메라 항체를 제작하였다. 이를 cCMAb45와 cCMAb96으로 명명하였다.
실시예 1-5: 친화도 분석(Affinity : 간접적 ELISA)
실시예 1-3에서 제작한 항-CTHRC1 키메라 항체인 cCMAb45와 cCMAb96의 CTHRC1 단백질에 대한 친화도를 검증하였다. 항원과 항체의 친화도 테스트를 위해 간접적 ELISA를 수행하였다.
5 ㎍/㎖의 농도로 100 ul씩 CTHRC1을 면역 플레이트에 분주하고 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그 다음날, 코팅한 CTHRC1 용액을 버리고 2시간 동안 블로킹(blocking)을 실시하였다. 그 후 cCMAb45와 cCMAb96 항체를 농도 별로 처리한 뒤 상온에서 2시간 반응시켰고 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 항체를 버리고 플레이트를 세척하였다. 2차 항체로는 인간의 불변영역을 인식하는 항-인간 Fc-HRP를 사용하여 O.D값을 측정하였다. 이 때, O.D값이 높을수록 CTHRC1과 항체의 친화도가 높음을 의미한다.
그 결과, cCMAb45는 5.2 X 10-10 M, cCMAb96은 4.3 X 10-10 M의 KD 값을 보였다. 두 항체 모두 CTHRC1 단백질에 대해 매우 높은 친화도를 가지고 있는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 1-6 : 특이도 분석(Specificity : 간접적 ELISA)
cCMAb45와 cCMAb96의 CTHRC1에 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해 간접적 ELISA를 실시하였다. 친화도 분석과 마찬가지로 면역 플레이트에 CTHRC1 단백질과 다수의 불특정 항원 단백질을 코팅하였다. 그 다음날, 코팅 용액을 버리고 블로킹한 뒤 cCMAb45와 cCMAb96을 0,1,5 ㎍/㎖의 농도로 넣어 2시간 반응시켰다. 그 후 항체가 포함된 용액을 버린 뒤 결합하지 않은 항체를 배제하기 위하여 세척 과정을 거쳤다. 2차 항체로는 항-인간 카파 경쇄-HRP(kappa light chain-HRP)를 사용하여 O.D값을 측정하였다.
그 결과, cCMAb45와 cCMAb96은 CTHRC1에 높은 특이도를 가지는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 1-7 : 암세포 이동(Migration) 억제 효과 확인
cCMAb45와 cCMAb96의 치료효능을 검증하기 위해 췌장암, 유방암, 난소암, 방광암 세포주를 이용해 이동 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, cCMAb45와 cCMAb96을 1, 5 ㎍/㎖ 또는 1, 10 ㎍/㎖ 로 제조하여 세포주와 함께 무혈청 배지에 희석하여 트랜스웰(transwell) 상부 챔버에 분주하였다. 하부 챔버에는 혈청이 포함된 배지를 두어 세포가 이동할 수 있는 환경을 조성하였다. 각 세포주에 적합한 시간 동안 배양하여 이동된 세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 대조군으로 사용한 IgG에 비해 cCMAb45와 cCMAb96을 처리한 그룹에서 암세포의 이동 정도가 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 4 내지 도 7).
실시예 1-8 : 암세포 침투(Invasion) 억제 효과 확인
실시예 1-7에서 수행한 것과 마찬가지로 cCMAb45와 cCMAb96의 효능 검증을 위해 암세포 침투 억제 효과를 확인하였다. 이를 췌장암, 환자 유래 췌장암 세포주, 유방암, 난소암, 방광암에서 수행하였다.
세포외기질을 인위적으로 모사할 수 있는 마트리겔(Matrigel)을 트랜스웰의 상부 챔버에 코팅하여 암세포의 침투능을 확인할 수 있게 하였다. cCMAb45와 cCMAb96을 1, 5 ㎍/㎖ 또는 1, 10 ㎍/㎖ 로 제조하여 세포주와 함께 무혈청 배지에 희석하여 트랜스웰 상부 챔버에 분주했고 하부 챔버에는 혈청이 포함된 배지를 넣어주었다. 일정 시간을 배양한 뒤 마트리겔을 침투해 이동한 세포의 수를 측정하였다.
그 결과, IgG 대조군에 비해 cCMAb45와 cCMAb96을 처리한 그룹에서 암세포의 침투 능력이 감소한 것을 확인하였다(도 8 내지 도 12).
<실시예 2: 인간화 항체 hCMAb45 및 hCMAb96>
실시예 2-1: 인간화 항체 라이브러리의 구축
Anti-CTHRC1 chimeric 항체인 cCMAb45와 cCMAb96의 면역원성을 줄이기 위해 항원과의 결합에 가장 중요한 부분인 CDR 영역만을 제외하고 CDR 영역을 잡아주는 구조 영역(Framework region, 이하 “FR”로 명명)을 인간의 것으로 교체한 인간화 항체를 제작하였다.
CDR 접목(grafting) 기법을 이용해 cCMAb45와 cCMAb96의 CDR 영역을 포함하며 다양한 FR 영역을 가지는 인간화 항체 라이브러리를 구축하였다.
실시예 2-2: 인간화 항체 선별 및 IgG conversion
제작된 인간화 항체 라이브러리에서 CTHRC1에 특이적이며 높은 친화도를 가지는 클론들을 선별하였다. IgG 임시 발현 테스트를 HEK293F 세포에서 수행하여 4H5 및 9E6에 대한 8가지 항체를 각각 정제하고 SDS-PAGE로 순도를 확인하였다.
그 결과, 4H5 인간화 항체의 생산성은 15~67.3 mg/L이며 9E6 인간화 항체는 3.1~33.3 mg/L의 생산성을 보였다(도 13).
실시예 2-3: 인간화 항체 친화도 분석
실시예 2-2에서 생산한 4H5 8개의 후보 클론들의 친화도 분석을 위해 간접적 ELISA를 수행하였다. 면역 플레이트에 CTHRC1-His를 코팅하고 그 다음날 8개의 인간화 후보 항체들과 cCMAb45의 농도를 최고 500 ng/ml에서부터 1/3씩 단계 희석하여 넣어주었다. 2차 항체로는 항-인간 Fc-HRP를 사용하여 O.D값을 측정하였다. 친화도를 KD 값으로 나타내었다. KD값이 낮으면 낮을수록 높은 친화도를 가지는 것을 의미한다.
그 결과, 인간화 항체의 KD값은 cCMAb45와 유사하거나 낮게 측정되었다.
상기 방법과 동일하게 9E6 인간화 항체 8개의 후보 클론들에 대해서도 친화도를 분석한 결과 9E6 인간화 항체의 KD값은 cCMAb96과 유사하거나 약간 높게 측정되었다.
구체적으로, 4H5 인간화 항체의 친화도는 0.82 X 10-10 M ~ 2.5 X 10-10 M이고, 9E6 인간화 항체의 친화도는 1.61 X 10-10 M ~ 4.8 X 10-10 M임을 확인하였다(도 14).
실시예 2-4: 인간화 항체 효능 테스트
4H5와 9E6 인간화 항체 후보 클론들의 효능을 테스트하기 위해 췌장암 세포주인 Panc-1을 사용하여 이동 분석을 수행하였다. 각 항체 5 ㎍/㎖과 5 x 104 개의 세포를 무혈정 배지로 희석하여 transwell 상부 챔버에 분주하였다. 그 다음, 혈청이 포함된 배지를 하부 챔버에 두어 세포가 이동할 수 있는 환경을 조성하였다. 24시간 배양 후 이동된 세포의 수를 측정하여 후보 항체들의 효능을 평가하였다.
그 결과, 4H5 인간화 항체 후보 클론들은 대조군 IgG에 비해 세포 이동 능력을 30~50 % 감소시켰고 9E6 인간화 항체 후보들은 30~40 %의 세포 이동능을 감소시킴을 확인하였다. 결론적으로, 4H5와 9E6 인간화 항체 후보 물질 모두 cCMAb45와 cCMAb96과 유사하거나 더 우수한 효능을 갖는 것을 확인하였다(도 15).
실시예 2-5: 인간화 항체의 선택 및 친화도와 효능의 재평가
4H5 및 9E6 인간화 항체 후보 클론들의 친화도, 효능 및 수율의 3가지 기준으로 평가하여 항체 3가지씩을 선택하였다. 4H5 인간화 항체에서는 SA2759, SA2761, SA2762가 9E6 인간화 항체에서는 SA2768, SA2769, SA2770이 선정되었다.
위의 기준으로 선정된 항체의 친화도 및 효능을 재평가하기 위해 친화도는 간접적 ELISA를 이용하였으며, 효능 평가는 이동 분석을 이용하여 수행하였다. 실험 방법은 실시예 2-3과 2-4에서 기술한 것과 동일하다.
그 결과, 친화도는 첫 번째 측정과 유사하게 cCMAb45와 cCMAb96과 유사하거나 더 낮은 KD값을 보였으며 세포 이동능 또한 30~50 % 감소시키는 것을 확인하였다. 구체적으로, 선택된 4H5 인간화 항체는 수 pM의 친화도와 세포 이동능을 40 %까지 감소시키며 9E6 인간화 항체는 수십 pM의 친화도를 가지며 세포 이동능을 50 %까지 감소시키는 것을 확인하였다(도 16 및 도 17).
최종적으로, SA2765를 hCMAb45로 SA2770을 hCMAb96으로 명명하였다.
실시예 2-6: hCMAb45와 hCMAb96의 특이도 분석
hCMAb45와 hCMAb96이 CTHRC1에 특이적으로 결합하는지 알아보기 위해 간접적 ELISA를 수행하였다. 면역 플레이트에 CTHRC1-His와 다수의 불특정 항원을 코팅해주었다. 그 다음날, hCMAb45와 hCMAb96을 0,1,5 ㎍/㎖의 농도로 항원과 반응시킨 뒤 2차 항체로는 항-인간 카파 경쇄-HRP를 사용해 O.D값을 측정하였다.
그 결과, hCMAb45와 hCMAb96은 CTHRC1에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 18).
실시예 2-7: 암세포 이동(Migration) 억제 효과 확인
hCMAb45와 hCMAb96의 치료 효능 검증을 위해 암세포의 이동 억제 효과를 확인하였다. 췌장암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 악성흑색종을 사용했으며 실험 방법은 실시예 1-7에서 기술한 것과 동일하다.
그 결과, 대조군 IgG에 비해 hCMAb45와 hCMAb96을 처리한 그룹에서 암세포의 이동능이 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 19 내지 도 22).
실시예 2-8: 암세포 침투(Invasion) 억제 효과 확인
실시예 1-8에서 기술한 실험 방법과 동일하게 hCMAb45와 hCMAb96의 암세포 침투 억제 효과를 확인하였다.
그 결과, 대조군 IgG에 비해 hCMAb45와 hCMAb96을 처리한 그룹에서 암세포의 침투능이 현저하게 감소하였다(도 23 내지 도 26)
실시예 2-9: 췌장암 동물 모델에서의 생체 내(in vivo) 항암 효과 확인
상기 실시예 2-7 내지 2-8을 통해 CTHRC1 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 hCMAb45와 hCMAb96의 암세포 이동 및 침투 억제능을 시험관 내(in vitro)에서 확인하였다. 이에 따라, 생체 내에서도 동일한 항암 효과를 나타내는지 확인하였다. 구체적으로, CTHRC1이 과발현하는 췌장암 세포주 BxPC-3를 이용해 subcutaneous xenograft 마우스 모델을 제작하였다. 1 X 106 개의 세포를 마우스 오른쪽 다리 피하에 이식하고 6일 후 종양의 크기가 73-77 mm3 로 형성된 마우스를 선별하여 그룹을 나누었다. 약물은 꼬리 정맥으로 주입하였고, 대조군 IgG 그룹과 실험군 hCMAb45와 hCMAb96은 10 mg/kg의 용량으로 일주일에 2번씩 총 4주간 투여하였으며 종양의 크기는 캘리퍼를 사용하여 일주일에 2번 측정하였다. 항체를 처리하고 28일 째(8번 처리) 실험을 종료하고 대조군 IgG의 종양 크기와 비교하였다.
그 결과, 대조군 IgG를 투여한 그룹에 비해 hCMAb45와 hCMAb96을 투여한 그룹에서의 종양의 크기가 감소한 것을 확인하였다(도 27). 특히, hCMAb45을 처리한 그룹보다 hCMAb96을 처리한 그룹에서의 항암 효과가 더 우수한 것을 확인하였다.
상기의 실시예를 통해, CTHRC1에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 hCMAb45와 hCMAb96의 생체 내 항암 효과를 확인하였고, 종양의 증식 지연 또는 억제 물질로의 가능성을 검증하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCMAb45-Heavy chain <400> 8 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tgctctgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaaat attaatcctt actatggtag tactagctac 180 aatctgaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac 240 atgcagctca acagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatcgggc 300 tatggttacg acgagagtgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cCMAb45-Light chain <400> 9 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser 85 90 95 Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCMAb45-Light chain <400> 10 gatgttttga tgacccaaac tccactctct ctgcctgtca atattggaga tcaagcctct 60 atctcttgca agtctactaa gagtcttctg aatagtgatg gattcactta tttggactgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctaatat atttggtttc taatcgattt 180 tctggagttc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct tccagagtaa ctatcttcct 300 ctcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9E6-VH-CDR1 <400> 11 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9E6-VH-CDR2 <400> 12 Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Thr Thr 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9E6-VH-CDR3 <400> 13 Thr Thr Glu Ser Tyr 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9E6-VL-CDR1 <400> 14 Gln Asn Ile Asn Val Trp 1 5 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9E6-VL-CDR2 <400> 15 Lys Ala Ser 1 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9E6-VL-CDR3 <400> 16 Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 17 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cCMAb96-Heavy chain <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Glu Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 18 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCMAb96-Heavy chain <400> 18 caggtccaac tgcagcagcc tgggtctgag ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacattcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gattggaaat atttatccta gtagtggtac tactaactac 180 gatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca catcctccac cacagcctac 240 atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aacagagtct 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cCMAb96-Light chain <400> 19 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCMAb96-Light chain <400> 20 gacattgtga tgacccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60 atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120 ggaaatattc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180 aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atcctctgac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 21 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMAb45-Heavy chain <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Ile Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Val Tyr Gly Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Gly Ser Met Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMAb45-Heavy chain <400> 22 caggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tattatgggt gcggcaggcg 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagca attaatcctt actatggtag tactgtgtac 180 gggcagaagt tccagggcag actcaccatt accgcggacg ggtctatgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagatcgggc 300 tatggttacg acgagagtgc tatggactac tggggtcaag gaaccctagt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 23 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMAb45-Light chain <400> 23 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser 85 90 95 Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 24 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMAb45-Light chain <400> 24 gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctct 60 atctcttgcc ggtctagtaa gagtcttctg aatagtgatg gattcactta tttggactgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctaatat atttggtttc taatcgattt 180 tctggagttc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattattgct tccagagtaa ctatcttcct 300 ctcacgttcg gccaggggac aaagttggaa ataaaa 336 <210> 25 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMAb96-Heavy chain <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Pro Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Glu Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 26 <211> 336 <212> DNA <213> 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Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMAb96-Light chain <400> 28 gacattcaga tgacccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60 atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacagtgg cgtcccatca 180 aggtttagtg gcagtggatc tggaacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atcctctgac gttcggccag 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321

Claims (18)

  1. (a) 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 13의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    (b) 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
    을 포함하는 것인, CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1)의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 17 또는 25의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 19 또는 27의 아미노산 서열로 이루어진, 항체.
  5. 제1항 또는 제4항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  7. 제6항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주세포.
  8. 제1항 또는 제4항의 항체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 난소암, 유방암, 흑색종, 간암, 위암, 폐암, 대장암, 구강암, 자궁경부암 및 방광암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  10. 제1항 또는 제4항의 항체를 이용하여, 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 CTHRC1 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  11. 제1항 또는 제4항의 항체를 이용하여, 암을 앓고 있는 개체의 분리된 생물학적 시료의 CTHRC1 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법.
  12. 제1항 또는 제4항의 항체를 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  13. 제12항의 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트.
  14. 제1항 또는 제4항의 항체를 포함하는, CTHRC1 검출용 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 키트는 ELISA 형태인 것인, 키트.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항체는 포획 항체인 것인, 키트.
  17. 제15항에 있어서, 상기 ELISA는
    (i) CTHRC1 에 결합하는 다클론 항체;
    (ii) 제1항 또는 제4항의 항체의 형태인 포획 항체; 및
    (iii) 검출표지가 결합된 IgG Fc에 결합된 항체를 포함하는 간접적 ELISA인 것인, 키트.
  18. 제1항 또는 제4항의 항체를 이용하여 CTHRC1 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 CTHRC1 단백질을 검출하는 방법.
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