KR100863405B1

KR100863405B1 - 암 진단 마커 및 이의 이용

Info

Publication number: KR100863405B1
Application number: KR20050084864A
Authority: KR
Inventors: 신인경; 박현진; 최주영; 현해정; 신경선; 박승국
Original assignee: 주식회사 대웅
Priority date: 2005-09-12
Filing date: 2005-09-12
Publication date: 2008-10-14
Also published as: EP2177628A2; WO2007032631A1; KR20070030084A; EP1937816A1; EP1937816A4; US20090028863A1; JP2009507515A; EP2177628A3

Abstract

본 발명은 유방암 또는 대장암에서 과발현되는 암 진단 마커 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101을 제공하고, 상기 마커의 발현을 검출하여 암을 진단하는 방법 및 마커 의 발현과 활성을 저해하여 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

유방암, 대장암, CTHRC1, CANP, KIAA0101, 암특이적 발현, 암유전자, 암진단

Description

암 진단 마커 및 이의 이용{Markers for Diagnosis of Cancer and Its Use}

도 1은 DDRT PCR 젤 전개도를 나타낸 것이다

도 2는 DNA chip 혼성화 이미지를 나타낸 것이다.

도 3은 Real time PCR 결과를 도표로 나타낸 것이다.

도 4는 동물에서의 종양형성을 살펴본 결과이다.

도 5는 RNAi를 이용한 특이적인 유전자 억제를 mRNA 수준 변화로 살펴본 결과이다.

도 6은 RNAi를 이용한 특이적인 유전자 억제를 세포사멸 유도 및 세포증식 변화로 살펴본 결과이다.

도 7은 RNAi를 이용한 특이적인 유전자 억제를 DNA 분절(fragmentation) 으로 살펴본 결과이다.

도 8은 RNAi를 이용한 특이적인 유전자 억제를 caspase 활성으로 살펴본 결과이다.

도 9는 RNAi를 이용한 특이적인 유전자 억제를 세포막 변화 측정으로 살펴본 결과이다.

도 10은 RNAi를 이용한 특이적인 유전자 억제를 세포 주기 변화로 살펴본 결 과이다.

본 발명은 유방암 또는 대장암에서 과발현되는 암 진단 마커 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 진단 마커의 발현을 검출하여 암을 진단하는 방법 및 상기 진단 마커의 발현과 활성을 저해하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

세계적으로 2003년 한해 암 발병 환자의 수는 300만명이 넘고, 국내에서의 발병율도 해마다 증가하여 2002년에는 한해 10만명에 이르고 있다. 그 중 폐암, 대장암, 유방암이 전체의 40%를 차지하고 있으며 식생활의 서구화로 국내 대장암, 유방암, 폐암의 발병율도 점차 증가하고 있는 추세이다.

지난 수년간 암에 대한 집중적인 연구가 이루어졌음에도 불구하고, 아직까지 암(특히 진행성 암)을 효과적으로 치료할 수 있는 확실한 치료제가 없는 상태로, 암을 초기 단계에 발견하여 외과적 수술로 암세포를 제거하는 것이 장기 생존율을 높이는 가장 효과적인 방법이라 할 수 있다.

기존 항암제는 작용 기작에 따라 크게 항암치료보조제(Adjunct therapies)와, cytotoxics, 호르몬제로 나뉘어 진다. 항암치료보조제는 암세포를 타겟하는 것이 아니라 항암 치료 중에 빈번하게 발생하는 부작용을 줄이기 위한 보조적인 치료 방법으로, Anti-emetics, 비스포스포네이트(bisphosphonates), 조혈성장인자(hematopoietic growth factors), 진통제(analgesics) 등을 포함한다. 사이토톡신 치료(Cytotoxic therapies)는 분열 속도가 빠른 세포에 작용하여 세포 사멸을 유도하는 것으로, 작용 기작에 따라 alykylating agents, 항대사 물질(anti-metabolites), 비카 알카로이드(vika alkaloids), 엔트라사이클린/에토포시드(nthracyclines/etoposides) 등으로 구분된다. 사이토톡신 치료는 첫 항암 치료제로 사용된 이래 50여년 동안 여러 종류의 암 치료에 광범위하게 쓰여 왔다. 그러나, 비특이적인 작용 기작에 의해 암세포 외에 분열 속도가 비교적 빠른 다른 장기의 세포에 강한 독성을 나타내고, 심각한 부작용을 초래하는 문제가 있다. 호르몬제(Hormonal agent)는 유방, 전립선 등 호르몬에 민감한 조직 내 종양을 치료하기 위하여 개발되었다. 유방, 전립선 등의 조직 내 암세포들은 특정 호르몬에 의해 분열이 촉진되는 경향을 보인다. 따라서 이러한 호르몬의 기작을 억제할 경우 암 진행을 억제할 수 있다. 호르몬 치료는 사이토톡신 치료에 비해 낮은 독성을 가지나 호르몬 억제에 의한 부작용이 나타나고 장기 투여시 호르몬제에 대한 내성을 가지는 난치성 암이 발생하는 문제가 대두되고 있다.

이러한 기존 항암제의 부작용 및 내성을 극복하기 위한 대안으로 암 특이적인 타겟을 대상으로 하는 새로운 기작의 치료제들이 개발되고 있다. Innovative therapies의 작용 기작은 매우 다양하지만, 정상세포가 암화되어 가는 과정에 나타나는 암 특이적 마커(cancer specific marker)나 유전적 이상(genetic abnormality)을 이용하여 종양 세포에만 특이적으로 작용하는 치료제라는 공통점을 가진다. 현재 개발 중인 치료제들은 암치료 기작에 따라 크게 혈관 신생 억제제(angiogenesis inhibitors), 면역증강제(immunostimulators), 종양-타겟제제(tumor-targeted agents)로 나눌 수 있다. 항암제에 의한 독성을 최소화하기 위한 방안으로 떠오르는 암 타겟팅 치료(cancer targeted therapy)의 가장 중요한 포인트는 암세포 특이적인 유전자를 찾아내는 것이다. 이를 위하여 세계 유수의 바이오텍 회사들은 유전자 발현 프로파일(gene expression profiling), 유전자 매핑(gene mapping), 프로테오믹스(proteomics), 인실리코 분석(in silico analysis) 등을 통하여 새로운 타겟 유전자를 찾는 작업을 진행 중이다. 일례로, 선두 바이오텍 중의 하나인 Genentech은 지난 27년간 genomics를 이용한 신규 타겟 발견(novel target discovery)을 위한 프로젝트를 진행하여 1,200여 개의 질병 관련 유전자 특허를 보유하고 있다. 최근에는 SPDI(Secreted Protein Discovery Initiative) 프로젝트를 진행하여(1996년-2001년) 250여개의 신규 단백질을 포함하여 1,000개 이상의 분비 단백질을 확보하였다.

이런 배경하에, 본 발명자는 신규 암 진단 및 치료제 개발을 위한 타겟으로 작용하는 유전자를 발굴하고자, 유방암, 대장암, 폐암 조직과 정상 조직 간에 발현 차이를 스크리닝하여 최종적으로 유방암 또는 대장암 환자의 암조직에서만 특이적으로 과발현되어 암세포의 생존 및 증식에 중요한 기능을 하는 신규 암 마커 유전자 3종, CTHRC1, CANP, KIAA0101을 확보하였다. 이들 유전자의 발현을 억제시킬 경우, 어폽토시스가 유도되고 세포 증식은 감소되는 것을 확인함으로써, 상기 유전자를 암 진단 마커뿐만 아니라 암 치료를 위한 타겟으로 사용할 수 있다는 것을 밝히고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), CANP(Cancer-Associated Nucleoprotein) 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 유방암 또는 대장암 진단 마커를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 유방암 또는 대장암 진단 마커를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 물질을 포함하는 유방암 또는 대장암 진단 마커 검출용 키트를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 유방암 또는 대장암 진단 마커 검출용 키트를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 시료의 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현수준을 대조구 시료의 발현 수준과 비교하여 유방암 또는 대장암 진단 마커를 검출하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥과 이에 상보적인 센스 RNA 가닥을 포함하는, 상기 유전자 특이적 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 siRNA (small interfering RNA)를 포함하는 유방암 또는 대장암 치료용 조성물 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 유방암 또는 대장암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 세포내 mRNA와 단백질 수준, 또는 단백질 활성을 감소시켜 유방암 또는 대장암 세포의 증식을 억제하거나 사멸을 유도하는 방법을 제공하기 위함이다

하나의 양태로서, 본 발명은 CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), CANP(Cancer-Associated Nucleoprotein) 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 포함하는 유방암 또는 대장암 진단 마커에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 유방암 또는 대장암 진단 마커의 발현 유부를 확인하여 유방암 또는 대장암의 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, “진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 유방암 또는 대장암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하고, 정상 세포에 비하여 유방암 또는 대장암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 유방암 또는 대장암 진단 마커는 정상 세포에 비해 유방암 또는 대장암을 가진 세포에서 증가하는 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 유전자와 단백질이다.

CTHRC1 (Collagen Triple Helix Repeat Containing 1; GeneID 115908 NM_138455)는 인간 게놈 프로젝트 완료 이후인 2003년에 클로닝된 유전자로(Clark et al, 2003; Zhang and Henzel, 2004), 동맥 손상시 발현이 증가하고 콜라겐 매트릭스의 축적을 저해하여 세포의 이동을 촉진시킨다고 보고되었으나(Pyagay et al, 2005), 정확한 기능은 아직 규명되지 않았다.

CANP(Cancer-Associated Nucleoprotein; GeneID 374393 NM_198947) 유전자는 Liu 등에 의해 간암에서 클로닝된 것으로 등록되어 있고 Full length clone은 Strausberg 등에 의해 발굴되었다(Strausberg et al, 2002). CANP의 기능 및 암과의 연관성은 전혀 알려지지 않았다.

KIAA0101(KIAA0101; GeneID 9768 NM_014736)은 ORF(open reading frame)만 보고되었고(Nagase et al,. 1995) 기능은 알려지지 않았다. Millennium Pharmaceuticals, Inc이 전립선암 마커로서 특허를 출원하였고(US 6,355,430) Mizutani 등은 악성 갑상선암에서 KIAA0101이 과발현된다는 것을 보고하였다(Mizutani et al, 2005). 그러나 KIAA0101이 유방암 또는 대장암에서의 과발현은 보고된 바가 없으며 KIAA0101의 암 유발능에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명자는 CTHRC1은 mRNA 발현량이 정상 세포에 비하여 유방암 세포에서 10.9배, 대장암에는 22배, CANP는 mRNA 발현량이 정상 세포에 비하여 유방암 세포에서 11배, 대장암에서는 2배, KIAA0101는 mRNA 발현량이 유방암에서 12.8배, 대장암에서는 2.2배 증가함을 확인하였다.

따라서, CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 유전자의 발현 수준을 확인함으로써, 유방암 또는 대장암 여부를 확인할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 물질을 포함하는 유방암 또는 대장암 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 유방암 또는 대장암 진단 마커 검출용 키트는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함한다.

유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브로, 이들 유전자의 핵산 서열이 CTHRC1 유전자의 경우 NM_138455(NCBI), CANP 유전자의 경우 NM_198947(NCBI), KIAA0101 유전자의 경우 NM_014736(NCBI)에 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 CTHRC1, CANP 또는 KIAA0101에 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어,³²P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.

본 발명에서 프라이머 쌍은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이 머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다. 본 발명에서 용어, “비특이적 증폭”이란 표적 서열 이외의 핵산 서열에 프라이머가 하이브리드되어, 프라이머 연장의 기질로서 작용함으로써 일어나는 표적 서열 이외의 핵산 증폭을 지칭하는 말이다.

본 발명에서 용어 “프로브”란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

표적 유전자 서열을 이미 밝혔으므로, 당 분야의 전문가는 기존의 데이터베 이스를 토대로 표적 유전자내 서열간의 혼성화 정도 등의 변수를 고려하여, 특이성 및 민감성이 높은 다양한 프라이머 쌍의 조합을 쉽게 결정할 수 있다. 본 발명의 구체적인 양태에서는, CTHRC1은 서열번호 5와 6, CANP는 서열번호 7과 8 및 KIAA0101은 서열번호 9와 10의 프라이머를 이용하여 유전자의 발현을 mRNA 수준에서 검출하였다.

본 발명의 검출용 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.

바람직하게는, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 유방암 또는 대장암 진단 키트에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 유방암 또는 대장암 진단 마커 검출용 키트는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다.

단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체로, 상기한 바와 같이 마커 단백질 CTHRC1, CANP 또는 KIAA0101이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명에서, 항체란 CTHRC1, CANP 또는 KIAA0101 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

다클론 항체는 상기한 CTHRC1, CANP 또는 KIAA0101 단백질을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 마커 검출용 키트에 관한 것으로, 상기 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다

또 다른 양태로서, 본 발명은 생물학적 시료의 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 대조구 시료의 발현 수준과 비교하여 유방암 또는 대장암 진단 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어 “생물학적 시료”란 대장암 또는 유방암 마커 유전자, CTHRC1, CANP 및/또는 KIAA0101의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR , 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 유방암 또는 대장암 의심환자에서의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 유방암 또는 대장암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다.

또 다른 양태로서 본 발명은 CTHRC1, CANP 또는 KIAA0101 특이적으로 작용하는 siRNA에 관한 것이다.

구체적인 양태로서, 본 발명은 CTHRC1의 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥과 이에 상동인 센스 RNA 가닥을 포함하는, CTHRC1 특이적 RNA 간섭(RNA interference)를 유도하는 siRNA(small interfering RNA)에 관한 것이다. 또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 CANP의 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥과 이에 상동인 센스 RNA 가닥을 포함하는, CANP 특이적 RNA 간섭을 유도하는 siRNA에 관한 것이다. 또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 KIAA0101의 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥과 이에 상동인 센스 RNA 가닥을 포함하는, KIAA0101 특이적 RNA 간섭을 유도하는 siRNA에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “siRNA”는 표적 유전자의 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 의미하고, 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법 또는 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-derived siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection) 시키는 방법이 있다.

본 발명에서, 용어 “특이적” 또는 “특이적인”은 세포내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 표적 유전자만 억제하는 능력을 의미하고, 본 발명에서는 CTHRC1, CANP 또는 KIAA0101 특이적이다.

본 발명의 siRNA는 CTHRC1, CANP 또는 KIAA0101의 mRNA를 특이적으로 감소시킬 수 있으면 서열과 길이는 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 구체적 실시에서는 CTHRC1의 경우 서열번호 17 및 서열번호 18로 기재되는 핵산서열, CANP의 경우 서열번호 19 및 서열번호 20로 기재되는 핵산서열, KIAA0101의 경우 서열번호 21 및 서열번호 22로 기재되는 핵산서열을 제작하였으며, 각 siRNA는 각각의 특이적인 유전자의 세포내 수준을 감소시키고 어팝토시스를 유도하고 세포 증식을 억제시키는 것을 확인하였다. 따라서, 상기의 siRNA는 유방암 또는 대장암의 예방 또는 치료 활성을 가지는 것을 알 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA에 특이적으로 작용하는 siRNA를 포함하는 유방암 또는 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 조성물은 세포사멸을 억제하는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또한 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있다. 예들 들어, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수도 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 단백질에 대하여 특이적인 항체를 포함하는 유방암 또는 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

치료용 항체로 사용될 경우, 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다.

항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종(radionuclide), 약제, 림포카인, 독소, 이형가능성 항체 등이 있으나 이로 제한되지는 않는다. (1) ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁰⁵Rh, ⁴⁷Sc, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹¹At, ⁶⁷Ga, ¹²⁵I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ¹⁵³Sm, ¹²³I, ¹¹¹In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide) (2) 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물 (3) 리신, 아브린, 드프테리아 등과 같은 독소 (4) 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체, (5) 자연적인, 즉 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 세포내 mRNA와 단백질 수준, 또는 단백질 활성을 감소시켜 유방암 또는 대장암 세포의 증식을 억제하거나 사멸을 유도하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법을 통하여 유방암 또는 대장암을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명자는 CTHRC1, KIAA0101, CANP 유전자를 과발현하는 세포주를 누드 마우스에 주입하면 종양이 형성되었고, 이를 통하여 CTHRC1, KIAA0101, CANP 유전자는 암 유발 및 암세포의 생존과 증식에 직접적이고 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다. 또한, 암세포에서 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준, 또는 단백질 활성을 억제시킬 경우 어팝토시스가 유도되고 세포증식이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 유전자의 세포내 mRNA와 단백질 수준, 또는 단백질 활성을 억제시키는 물질에는 CTHRC1, CANP 또는 KIAA0101 특이적으로 작용하는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물; 단백질(예들 들어, 항체), 탄수화물, 핵산분자(예들 들어, 안티센스 핵산, siRNA) 및 지질과 같은 고분자 화합물; 리보자임(ribozyme); 및 복수의 화합물의 복합체 등을 포함한다.

보다 구체적인 양태로서, 본 발명은 CTHRC1, CANP 또는 KIAA0101 특이적으로 작용하는 siRNA 또는 항체를 포함하는 조성물을 투여하여 세포의 증식을 억제하거나 사멸을 유도함으로써 유방암 또는 대장암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

상기 siRNA 또는 항체를 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼, 주사제 등으로 다양하게 제형화될 수 있다.

상기 유전자의 세포내 mRNA와 단백질 수준, 또는 단백질 활성을 억제시키는 물질은 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 유전자의 세포내 mRNA와 단백질 수준, 또는 단백질 활성을 억제시키는 물질은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 감별전개 ( DD RT - PCR ; differential display RT - PCR ) 기법을 이용한 암 관련 부분 유전자 발굴

유방암, 대장암, 폐암과 관련된 신규 암 관련 유전인자를 발굴하기 위하여 암 환자의 암 조직과 정상 조직 내 유전자 발현 패턴을 감별전개 기법을 이용하여 비교하고, 발현 차이를 보이는 유전자만을 선별적으로 분리하였다(도 1). 유방암 관련 클론 1495개, 대장암 관련 클론 1183개, 폐암 관련 클론 597개를 발굴하였다.

단계1) 조직 샘플의 획득

대장암 조직 샘플은 다양한 병기의 9명의 한국인 성인 남자와 6명의 성인 여자로부터 회수하였다(성모병원). 유방암 조직 샘플은 14명의 한국인 성인 여자 유방암 환자로부터 회수하였다(성모병원). 폐암 조직 샘플은 7명의 NSCLC(non-small cell lung cancer) 한국인 성인 남자로부터 회수하였다(성모병원). 각각의 환자에서 종양 조직 생검 샘플과 종양 조직 주변의 정상 조직 생검 샘플을 세트로 회수하였다.

단계2) 총(total) RNA 분리

세포의 총 RNA는 QIAGEN사 키트(RNeasy Midi 키트, cat#75144; RNeasy mini 키트, cat#74104)를 사용하여 분리하였다. 먼저 차갑게 유지시킨 막자 사발과 막자를 이용하여 액체질소(LN2)에 보관된 조직을 잘게 부순 후 10㎕의 베타 머캅토에탄올(beta-Mercaptoethanol)을 첨가한 1mL의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 동량의 70% 에탄올(ethanol)을 첨가하여 잘 섞은 후 키트 내 컬럼(Column)에 넣고 총 RNA를 부착시켰다. 160㎕의 RNase가 제거된 물을 첨가하여 총 RNA를 용출, 분리시켰다. 분리된 RNA는 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 260nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였다.

단계3) 역전사 반응

상기 단계2에서 얻은 각 시료의 총 RNA 각 2㎍을 random primer와 혼합하여 70도에서 5분간 반응시키고 역전사 혼합 반응액[2.5mM dNTP, 50U RNase Inhibitor, 200U M-MuLV 역전사 효소(Reverse Transcriptase, MBI fermentas, cat#EP0442), 1X M-MuLV 반응버퍼]에 넣어 42도에서 2시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

단계4) DD-PCR(Differential Display Polymerase Chain Reaction) 과정

발현에 차이가 나는 유전자를 분리하기 위해 각각의 cDNA를 200nM의 arbitrary primer(GenHunter Corporation, cat#H-AP)와 200nM의 anchored primer(GenHunter Corporation, cat#H101-S)를 사용하여 1U의 Taq polymerase(TaKaRa, cat#R001A)를 통해 증폭하였다. 이때 [³⁵S]dATP(PerkinElmer, cat#NEG734H) 방사성 동위원소로 표지하였다. 증폭된 PCR 산물은 98% 포름아마이드(formamide) 정지 dye를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 80도에서 5분간 가열시킨 다음 7M urea/6% polyacrylamide 젤(gel)에 1700V로 3시간 동안 전기 영동하여 3MM Whatman paper에 젤을 옮겨 말린 후 X-ray film에 감광시켜 현상한 다음 판독하였다.

단계5) DD-PCR 산물의 염기 서열 확인

DD-PCR 결과, 정상 조직 대비 암 조직에서 특이적으로 발현이 증폭되었거나 감소한 밴드를 선택하였다. 밴드를 젤에서 오려낸 후 증류수로 정제하고 에탄올 침전시켜서 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA는 DD-PCR에서 사용된 것과 동일한 프라 이머를 사용하여 다시 재증폭하였다. 증폭된 DNA는 클로닝 벡터(cloning vector)인 pGEM-T Easy vector system(Promega, cat#A1360)을 사용하여 클로닝하여 LB-한천배지에서 대장균(DH5a)에 형질전환(transformation)시키고 콜로니(colony)를 분리한 다음 LB 배지에서 재증폭시켰다. 재증폭된 대장균에서 QIAGEN사 키트(QIAprep plasmid miniprep 키트, cat#27104)를 사용하여 플라스미드를 분리하였다. 이를 EcoRI 제한효소로 처리하여 삽입체(insert)의 크기를 확인하였다. Big Dye sequencing reaction (ABI)를 사용하여 ABI 3700 자동염기서열분석기로 염기 서열을 분석하였다. 염기서열 정보를 바탕으로 NCBI Gene Bank와 human EST Data Base에 등록되어 있는 유전자들과의 유사성을 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. 1990; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용하여 검색하여, 클론별 유전자 정보를 확인하였다.

실시예 2: Microarray 를 이용한 유전자 발현 분석

DD-PCR을 통해 발굴한 약 3000여 종의 유전자 중 높은 암 조직 특이적 발현을 가지는 유전자만을 선별하기 위하여 대규모 환자군을 대상으로 2차 스크리닝을 수행하였다. DD RT-PCR로 발굴한 유전자 단편들이 집적된 human 3K cDNA chip을 제작하여 유방암 58예와 대장암 32예의 임상시료를 대상으로 DNA chip 스크리닝을 진행하였다. 유방암 환자 58예와 대장암 환자 32예에 대한 칩 결과에서 암조직과 정상조직 간에 유의적으로 2배 이상의 발현차를 보이는 유전자들을 선별하였다(도 2).

단계1) 칩(Chip) 제작

칩 제작을 위한 cDNA probe는 기존에 널리 알려진 PCR 반응을 통해 합성하였다. 원하는 부위만을 증폭시키기 위한 프라이머의 염기서열은 forward primer 5'-CCG CGG GAA TTC GAT T-3'(서열번호 1)이고 reverse primer 5'-GCC GCG AAT TCA CTA GTG-3'(서열번호 2)이다. 모든 부분 유전자가 동일하게 증폭되도록 하기 위해 PCR 혼합 반응액(0.3pmole forward primer, 0.3pmole reverse primer, 200 mM dNTP, 1 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 150 mM MgCl₂, 2.5unit Taq polymerase, ultra pure water)을 준비하여 96 웰 PCR 플레이트에 일괄적으로 분주한 다음 유전자 클론들이 클로닝되어 있는 플라스미드 DNA 주형을 0.5 ml씩 첨가하였다. 이를 DNA thermal cycler에 넣고 94도에서 5분간 반응시키고 94도 30초, 55도 30초, 72도 45초의 반응을 40회 수행하여 cDNA를 증폭시켰다. 72도에서 5분간 반응시켜 완성되지 않은 증폭을 마무리하였다. Millipore의 384웰 PCR purification filter를 사용하여 PCR 산물을 정제(Clean-up)하였다.

정제 과정을 거친 cDNA를 BioRobotics사의 Microgrid II spotter를 이용하여 Corning사의 GAPS II slide에 집적하였다(디지털지노믹스사에 DNA칩 제작 의뢰함).

제작한 칩은 syto61 staining을 수행하여 결과를 분석함으로써 칩 품질(chip quality)을 결정하였다. 염색할 슬라이드는 0.1% SDS를 처리하여 여분의 프로브를 제거한 다음, 100도에서 2분간 처리해 프로브를 변성시켜 syto61 dye가 잘 끼어 들 어갈 수 있도록 한 후 syto61 dye로 5분 동안 염색하고 증류수로 5분씩 두 번 씻어내 여분의 dye를 제거하였다. 염색된 슬라이드는 Axon laser scanner를 이용하여 635nm의 파장에서 그 값을 읽어 이미지를 분석해 칩이 제대로 제작되었는지 판단하였다.

단계2) 조직 샘플의 획득

대장암 조직 샘플은 40세에서 77세의 20명의 한국인 성인 남자와 12명의 성인 여자로부터 회수하였다(랩지노믹스). 유방암 조직 샘플은 28세에서 71세의 58명의한국인 성인 여자로부터 회수하였다(랩지노믹스). 각각의 환자에서 종양 조직 생검 샘플과 종양 조직 주변의 정상 조직 생검 샘플을 세트로 회수하였다.

단계3) 총 RNA 분리

차갑게 유지시킨 막사 사발과 막자를 이용하여 액체질소(LN2)에 보관된 조직을 잘게 부순 후 조직시료 100mg당 TriZol 시약(Invitrogen, cat# 15596-018)을 1ml씩 첨가하였다. 이후의 RNA 분리 과정은 TriZol 시약의 제조사에서 제공한 실험 방법에 따라 진행하였다. RNA를 분리한 후 순도를 더 높이기 위하여 QIAGEN사 키트(RNeasy Midi 키트, cat#75144; RNeasy mini 키트, cat#74104)를 이용하여 제조사가 제공한 실험방법에 따라 RNA를 추가 정제하였다. 분리된 RNA는 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 260nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였다.

단계4) 시료 준비와 표지

DNA 칩 혼성화(hybridization)란 검체 RNA로부터 cDNA를 합성한 후 유리판에 집적된 DNA, 즉 칩과 반응시키는 과정이다. 마이크로어레이를 위해서 20~50㎍의 고순도 RNA를 Cy3 또는 Cy5의 형광물질로 표지하여 역전사 시켰다. 표지는 Cy dye가 붙어있는 dUTP를 사용하여 PCR 과정 중 직접적으로 표지하였다. 정상, 암조직간 혼성화시 대조군으로 사용하기 위해 reference RNA를 제작하였다. 유방암, 대장암, 폐암 세포주 중 암조직 특성을 고려하여 각각 5종씩(유방암 세포주 SK-BR-3, Hs578T, MCF-7, ZR-75-1, MDA-MB-231, 대장암 세포주 COLO205, LoVo, WiDr, HT-29, DLD-1, 폐암 세포주 NCI-H23, NCI-H146, NCI-H69, NIH226, A549)을 선별한 후 총 RNA를 추출하여 동량을 섞어 만든 대웅 고유의 reference RNA를 사용하였다. 본 실험에서는 대조군으로 대웅 reference RNA를 Cy3로 표지하고 실험군으로 유방암, 대장암 정상, 암 조직 RNA를 Cy5로 표지하였다. QIAquick PCR purification kit(QIAGEN, cat#28106)를 이용하여 역전사 시킨 cDNA로부터 염(salt), primer, detergent, PCR에 쓰인 단백질(효소), RNA 주형 등을 제거하였다. 정제된 labeled cDNA를 3K chip에 첨가하여 65도에서 16시간 동안 혼성화 시켰다. 이때 labeling 되지 않은 Cot-1 DNA, poly A RNA 등을 비특이적 경쟁물(non-specific competitor)로 함께 첨가하여 비특이적 결합을 억제하였다. 혼성화 반응 후 비특이적 혼성화를 제거하기 위하여 SSC를 포함하는 세척 용액을 이용하여 DNA 칩을 세척하였다.

단계5) 칩 이미지 획득과 정량화

칩 혼성화 과정 후 그 결과를 보기 위해서 Axon사의 GenePix 4000B 스캐너(scanner)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. Scanning 결과는 Cy3, Cy5 영역에서 각기 얻어진 녹색과 적색의 파장에서 얻은 수치를 서로 비교해 상대적인 비를 얻어 실험군이 대조군에 비해 유전자 발현이 몇 배 증가하였다 또는 감소하였다 하는 양상으로 분석하였다.

단계6) 유전자 발현 분석

DNA 칩 결과를 분석 및 해석하기 위해서는 유전자 각각에 대한 강도(intensity) 값들을 필요로 한다. 스캐너를 통해 얻어진 이미지를 수치로 변환하기 위해서 Axon사가 제공하는 GenePix 프로그램을 사용하였다. 혼성화 실험 결과에서는 각 스팟의 강도 값을 읽는데, 오류가 있는 스팟들은 자동 또는 수동으로 제거하고, 유전자 스팟의 통계적인 수치를 획득하였다. 또한 매 실험마다 혼성화 과정이 원활히 수행되었는지 알아보기 위해 cy3와 cy5의 laser power인 PMT 값, 시그널과 background간의 차이, 강도 값의 표준편차, block간 강도 값, 모든 스팟의 강도 값, NF(not found feature) 항목에 대하여 어레이 품질 제어(quality control, QC)를 시행하였다.

Cy5/Cy3간의 dye bias를 가지지 않도록 Lowess normalization 방법을 이용하여 전체 데이터 값을 보정하고(Cleveland WS et al, 1992), 20% 이상 missing된 유 전자들을 제외한 유방암 2213개 유전자와 대장암 1940개 유전자에 대해 분석을 진행하였다.

조직 시료 유래와 칩 실험의 정확성을 검증하기 위해 BRB array tools 프로그램(http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html)을 이용하여 조직시료 간 clustering analysis를 시행하였다. 그 결과 1 개의 유방암 조직시료와 2개의 대장암 조직시료를 제외하고 모든 조직 시료들이 암조직과 정상조직별로 두 개의 node로 나뉘는 것을 확인하였다. 이러한 결과로서 본 연구에 이용한 임상 시료들이 정상 조직과 암 조직 간의 구별이 명확한 우수한 시료임을 확인할 수 있었고 칩 실험도 정확히 이루어졌다는 것을 확인할 수 있었다.

유방암 및 대장암 임상 시료에서 암조직과 정상조직 간 유의한 발현차이를 보이는 유전자를 선별하기 위하여 SAM(significance analysis of microarrays; http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/) 분석을 실행하였다. SAM은 칩 실험에서 단순한 variation에 의해 나타날 수 있는 발현 차이보다 실험 결과가 더 큰 차이를 보이는 유전자를 선별하는 방법으로 오차 범위 이상의 유의한 차이를 나타내는 유전자만을 골라낼 수 있다. 이때 99% 이상의 신뢰도를 기준으로 FDR(false discovery rate)가 0이 되도록 함으로써 통계적인 오류로 인한 유전자 선별 가능성을 최대한 배제하였다.

실시예 3: Real time PCR 을 이용한 암 특이적 유전자 발현 검증

DNA 칩에서 선별한 유전자들 중 높은 암 조직 특이성을 가지는 신규 암 유전 자 후보 CANP, CTHRC1과 KIAA0101을 선별하였다. 이들 유전자를 대상으로 유방암 및 대장암 임상 시료, 다양한 정상 조직과 암세포주에서의 상대적 발현량을 비교함으로써 암조직 특이적인 발현을 검증하였다(도 3). 실험은 유방암 조직과 대장암 조직, 20종의 정상 조직(adrenal gland, brain, fetal brain, fetal liver, heart, kidney, liver, lung, placenta, prostate, salivary gland, skeletal muscle, spleen, testis, thymus, thyroid gland, trachea, uterus, small intestine, spinal cord), 유방암 세포주, 대장암 세포주, 폐암 세포주에서의 상대적인 유전자 발현을 비교하는 방식을 진행하였다.

Class	Gene	Cancer	Average expression ratio of tumor vs. normal	tumor over-expression fraction( ＞2 folds)
Hypothetic Oncogene	CTHRC1	Breast	10.9	88%
	CTHRC1	Colorectal	22.0	90%
	CANP	Breast	11.0	81%
	CANP	Colorectal	2.0	50%
	KIAA0101	Breast	12.8	69%
	KIAA0101	Colorectal	2.2	50%

Real time PCR 결과 CTHRC1은 유방암과 대장암의 암조직에서 평균 10배 이상 과발현되었고 정상 조직에서는 거의 발현되지 않았다. 유방암 환자와 대장암 환자의 80% 이상이 정상 조직 대비 암 조직에서 CTHRC1을 2배 이상 과발현하였다. CANP는 유방암과 대장암의 암조직 및 암 세포주에서 높게 발현되었고 다른 정상 조직에서는 거의 발현되지 않았다. 유방암 환자의 80% 이상이 정상 조직 대비 암 조직에서 CANP를 2배 이상 과발현하였고(평균 11배 이상 과발현), 대장암 환자의 경우에도 2배 이상 과발현하는 환자의 비율이 50% 이상이었다. 암 조직 및 다양한 암 세포주에서의 발현량이 높은 것으로 볼 때, CANP는 세포의 증식에 관여하는 유전자일 것으로 추측되었다.

KIAA0101은 유방암과 대장암 환자의 암조직 및 암 세포주에서 높게 발현되었다. 유방암 환자와 대장암 환자의 50% 이상이 정상 조직 대비 암조직에서 KIAA0101을 2배 이상 과발현하는 것으로 확인되었다. 다른 정상 조직에서는 흉선(thymus), 태아 간(fetal liver), 소장(small intestine)에서만 대장암 환자의 정상조직 수준으로 발현되고 다른 기관에서는 거의 발현되지 않았다. 전반적으로 KIAA0101과 CANP의 발현 양상이 유사한 경향을 보였는데 이것은 KIAA0101과 CANP가 기능적으로 연관성이 있을 것이라는 추측을 할 수 있다.

단계1) 시료의 준비

DNA 칩 스크리닝에 이용한 유방암 RNA 시료 56쌍과 대장암 RNA 시료 32쌍에서 암 발생 부위 및 암 진행 단계, 생화학적 검사 소견 등의 임상정보와 DNA 칩상의 발현 결과를 바탕으로 유방암 시료 26쌍과 대장암 시료 20쌍을 선별하여 사용하였다. 암 발생 기관이 아닌 다른 정상 기관에서의 유전자 발현량을 측정하기 위하여 20종의 정상 조직 RNA들로 구성되어 있는 tissue panel (Clontech Cat. # 636643)을 구입하여 사용하였다. 유방암 세포주 Hs578T, SK-BR-3, MCF7, 대장암 세포주 COLO205, LOVO, WoDr, 폐암 세포주 A549, NCI-H146, NIH226에서 추출한 RNA를 사용하여 다양한 암세포주에서의 유전자 발현량을 측정하였다.

임상 조직 시료 및 다양한 암세포주, 다양한 정상 조직에서 추출한 RNA로부터 Oligo(dT)20VN primer와 SuperScript III (Invitrogen Cat. # 18080-044)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 역전사 반응은 RNA 시료 1mg, Oligo(dT)20VN primer 2.5M, dNTP 0.5mM, MgCl₂5mM, 10mN DTT, 50U RNase Inhibitor, 200U SuperScript III, 1X RT buffer(SuperScript III kit내 포함)의 조건으로 수행하였다. 50도에서 1시간 반응하여 cDNA를 합성한 후, 85도에서 5분 동안 열을 가하여 반응을 중지시켰다. 합성한 cDNA는 소량으로 분주하여 -70도에 보관하였다.

단계2) 프라이머 준비

CANP, CTHRC1, KIAA0101 유전자의 cDNA 염기서열 정보를 바탕으로 CTHRC1, CANP, KIAA0101 각 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 디자인하였다. 내부 대조구(Endogenous control)로 사용할 베타-액틴(beta-actin) 유전자(ACTB)에 대한 프라이머는 NCBI의 GeneBank에서 검색한 mRNA 염기서열(NM_001101)을 바탕으로 디자인하였다. 프라이머 쌍은 Applied Biosystems사가 제공하는 Primer Express 프로그램을 이용하여, 일반적으로 PCR 프라이머 요건을 따르되 증폭산물의 길이가 100bp 내외이고 Tm값이 80도 내외가 되도록 디자인하였다. 유전자별 사용한 프라이머는 다음과 같다.

ACTB-for: 5'-GGCATTGCCGACAGGATG-3' (서열번호 3)

ACTB-rev: 5'-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3' (서열번호 4)

CTHRC1-for: 5'-TTGGGAAAATTGCGGAGTGT-3' (서열번호 5)

CTHRC1-rev: 5'-GCCGAAGTGAGCCACTGAAC-3' (서열번호 6)

CANP-for: 5'-TCGGTCTGACATAGGTGAATTTGA-3' (서열번호 7)

CANP-rev: 5'-TCATCCACCATGGACTGTTTTC-3' (서열번호 8)

KIAA0101-for: 5'-TCATCGAGGAAAGCTGAAAATA-3' (서열번호 9)

KIAA0101-rev: 5'-AATTCCTTTTTGCCACTTGG-3' (서열번호 10)

단계3) 반응 조건 확립

SYBR Green assay는 SYBR Green PCR master mix(Applied Biosystems Cat. # 4309155) 12.5㎕에 cDNA, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머를 각각 첨가하여 총 25ml로 진행하였다.

cDNA는 RT때 사용한 total RNA 기준으로 50ng의 양이 되도록 첨가하였다. 프라이머는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머에 대한 100nM, 300nM, 900nM의 3×3 농도 조합 중 비특이적 합성 없이 유전자 증폭이 가장 잘 이루어지는 농도를 결정하여 사용하였다. beta-actin, CTHRC1, CANP, KIAA0101에 대해 결정된 프라이머의 농도는 모두 300nM이었다. 모든 프라이머 쌍 종류에 대하여 cDNA를 넣지 않은 음성 대조군 시료를 같이 준비하여 비특이적 생성물의 유무를 확인하였다. 또한 동일 실험을 2-3번 반복하여 pipetting error, 웰 간 변이(variation) 등에 의한 실험적 오차를 줄였다. PCR 반응은 50도 1분, 95도 10분의 초기 반응 후, 95도 15초 60도 1분 cycle을 40-50회 반복하였다. 반응 후에는 기기에서 제공하는 프로토콜에 따라 dissociation 실험을 수행하여 비특이적 증폭 유무를 확인하였다.

단계4) 상대적 유전자 발현량 측정

테스트하는 임상 시료의 Ct(cycle of threshold) 값이 스탠다드 커브(Standard curve)를 벗어나지 않도록 적당한 cDNA 농도 범위를 결정하여 사용하였다. 스탠다드 커브용 시료는 조직 시료에서 추출한 RNA들을 혼합한 후 cDNA를 합성한 것을 사용하였다. 매 반응마다 스탠다드용 실험을 동일 플레이트 내에서 3회 반복하여 진행하고, 세 반응 중 현저한 차이를 나타내는 것을 제외한 나머지 2-3 반응의 평균 Ct 값을 이용하여 스탠다드 커브를 그렸다. 이때 스탠다드 커브의 correlation coefficient(R2) 값이 1과 가깝게 되고 기울기의 값이 3.3과 가깝게 되도록 역치(threshold) 값을 조정하였다.

스탠다드로 사용한 cDNA내의 특정 유전자의 정확한 양을 모르기 때문에 본 어세이로 결정하는 유전자량은 스탠다드 시료에 대한 상대적인 발현량이라 할 수 있다. 먼저 스탠다드 커브를 그릴 때 결정한 역치 값을 사용하여 각 시료 별로 Ct 값을 결정하고 Ct 값을 스탠다드 커브와 비교하여 유전자량을 구하였다. 시료별 cDNA 농도 차이를 보정하여 각 시료의 상대적 유전자 발현량을 결정하였다.

각 시료간 cDNA 농도 차이는 주로 역전사 반응 효율의 차이에 기인한다. 즉 동일한 조건으로 역전사 반응을 수행하더라도 PCR 기기의 웰 간 variation으로 합성되는 cDNA 양이 약간씩 달라지게 된다. 역전사 후 cDNA만을 분리하거나 농도를 측정하는 단계가 없기 때문에 RT 효율에 의한 시료간 cDNA 농도 차이는 내부 대조구를 사용하여 보정하였다. 내부 대조구는 house keeping 유전자 베타-액틴을 사용하였다. 위에서 언급한 방법을 이용하여 각 cDNA 별로 내부 대조구의 상대적 농도를 결정한 후 시료별 normalization fold를 계산하였다. 내부 대조구는 각 시료 별로 발현량이 같다고 가정하였으므로 각 cDNA의 상대적인 양은 내부 대조구의 발현량에 비례하게 된다. 따라서 cDNA 차이를 보정하기 위한 normalization fold는 내부 대조구의 상대적 발현량의 역수가 된다.

DNA의 농도 차이를 보정할 때에는 구해진 스탠다드 커브를 이용하여 구한 유전자량에 normalization fold를 곱하여 상대적 유전자 발현량을 구하였다.

실시예 4. 과발현이 세포에 미치는 영향 분석

암조직 특이적으로 발현되는 것을 확인한 CTHRC1, KIAA0101, CANP 유전자의 과발현이 암 유발에 미치는 영향을 알아보기 위하여 해당 유전자를 과발현하는 세포주를 제작하였다. 형질 전환된 세포주를 누드마우스에 주입한 결과 암 유전자가 과발현된 세포를 주입한 부위에 1.5-2cm의 뚜렷한 종양을 형성하였다(도 4). 이러한 결과는 해당 유전자의 과발현이 종양 형성에 중요한 역할을 한다는 것으로 의미한다.

단계1) 완전장 유전자 클로닝

1-1. CTHRC1 완전장 유전자 클로닝

CTHRC1은 732bp의 단일한 ORF(open reading frame)으로 이루어져 있다. 이를 PCR 하기 위하여 전체 ORF 서열이 포함되며 CTHRC1에 특이적인 프라이머를 유전자 서열 NM_138455(NCBI)을 근거로 제작하였다.

CTHRC1-For 3'-CTGACCACGTTCCTCTCCTCGGTCT-5' (서열번호 11)

CTHRC1-Rev 3'-TGTCATTTAAGTGAACCATTCCAAGGCA-5' (서열번호 12)

CTHRC1이 높게 발현되는 유방암 조직의 total RNA로부터 합성한 cDNA library를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 template cDNA 100ng에 5' 프라이머, 3' 프라이머를 각각 10 pmoles 씩 첨가하였고, 94도 30초, 68도 2분, 72도 7분으로 35 cycles 수행하였다. PCR 결과 얻어진 DNA는 1.5% 아가로즈 젤 전기 영동으로 크기를 확인하고, CTHRC1 내부에 존재하는 제한 효소들을 처리하여 원하는 유전자가 올바르게 증폭되었는지 확인하였다. 증폭된 완전장 cDNA를 pGEM T easy 벡터(Promega, Cat#A1360)에 클로닝하여 전장 유전자를 확보하였다.

1-2. CANP 완전장 유전자 확보

CANP는 2205bp의 단일한 ORF로 이루어져 있다. 이를 PCR 하기 위하여 전체 ORF 서열이 포함되며 CANP에 특이적인 프라이머를 유전자 서열 NM_198947(NCBI)을 근거로 제작하였다.

CANP-For 5'-CCTTGTTTCTCCATCTTATCGAGT-3' (서열번호 13)

CANP-Rev 5'-ATTTTCTCCCATTCCGTAGGTTGT-3' (서열번호 14)

유방암 조직의 total RNA로부터 합성한 cDNA 라이브리를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 템플레이트 cDNA 100ng에 5' 프라이머, 3' 프라이머를 각각 10 pmoles 씩 첨가하였고, 94도 30초, 68도 2분, 72도 7분으로 35 cycles 수행하였다. PCR 결과 얻어진 DNA 는 1.5% 아가로즈 젤 전기 영동으로 크기를 확인하고, CANP 내부에 존재하는 제한 효소들을 처리하여 원하는 유전자가 올바르게 증폭되었는지 확인하였다. 증폭된 완전장 cDNA를 pGEM T easy 벡터(Promega, Cat#A1360)에 클로닝하여 전장 유전자를 확보하였다.

1-3. KIAA0101 유전자 클로닝

KIAA0101은 336bp의 단일한 ORF로 이루어져 있다. 이를 PCR 하기 위하여 전체 ORF 서열이 포함되며 KIAA0101에 특이적인 프라이머를 유전자 서열 NM_014736(NCBI)을 근거로 제작하였다.

KIAA0101 For 5'-CTCGGCTGGGAAGTCAGTTCGTTCTC-3' (서열번호 15)

KIAA0101 Rev 5'-AAGCCACTGTGCCCACCATGATTCTAT-3' (서열번호 16)

유방암 조직의 total RNA로부터 합성한 완전장 cDNA 라이브리를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 템플레이트 cDNA 100ng에 5' 프라이머, 3' 프라이머를 각각 10 pmoles 씩 첨가하였고, 94도 30초, 68도 2분, 72도 7분으로 35 cycles 수행하였다. PCR 결과 얻어진 DNA 는 1.5% 아가로즈 전기 영동으로 크기를 확인하고, KIAA0101 내부에 존재하는 제한 효소들을 처리하여 원하는 유전자가 올바르게 증폭되었는지 확인하였다. 증폭된 완전장 cDNA를 pGEM T easy 벡터(Promega, Cat#A1360)에 클로닝하여 전장 유전자를 확보하였다.

단계2) 발현 벡터의 제조

제한효소 절단패턴을 확인한 CTHRC1, CANP, KIAA0101 유전자들의 cDNA를 pDOR221 벡터(Invitrogen, Cat# 12535-019)에 클로닝하기 위해 29bp의 attB 부위를 PCR 산물의 양 말단에 각각 연결하였다. Gateway Technology manual (Invitrogen, 22 September 2003, 25-0522)에 따라 두 번에 나누어 PCR을 실시함으로써 attB 어답터(adapter)를 연결하였다. QIAGEN PCR purification kit(QIAGEN, Cat# 28106)를 이용하여 attB-PCR 산물을 정제한 후, 정제된 PCR 산물은 BP Clonase Enzyme(Invitrogen, Cat# 11789-013)을 사용하여 attP-containing donor (pDONR221) 벡터에 클로닝하였다. 전체 유전자에 대한 염기서열을 분석하여 각 유전자의 코딩 영역이 정확하게 클로닝되었음을 확인하였다. pDONR221 벡터에 클로닝된 유전자를 LR Clonase(Invitrogen, Cat# 11791-019)을 사용하여 형질 전환 세포 제조용 pcDNA-DEST40(Invitrogen, Cat# 12274-015) Gateway vector로 옮겼다.

단계3) 형질 전환된 세포의 제조

암 특이 유전자가 포함된 pcDNA-DEST40/CANP, pcDNA-DEST40/KIAA0101, pcDNA-DEST40/CTHRC1 플라스미드를 LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, cat#11668-027)을 사용하여 293 인간 태생기 신장 상피세포(ATCC, cat#CRL1573)에 도입시키고, 약 3주 동안 Geneticin(Invitrogen, cat#11811-023)을 처리하여 플라스미드가 도입되어 내성을 나타내는 세포만 증식이 가능하도록 하였다. 단일 세포가 자라 형성된 콜로니를 취하여 다음 96웰 플레이트에 옮겨 배양하였다.

도입된 발현벡터에 의한 단백질 발현을 확인하기 위하여 각 플라스미드를 도입한 세포주의 단백질을 추출한 후 웨스턴 블랏을 수행하였다. 각 목적 단백질은 V5 epitope와 6x His tag이 붙어 있으므로, 이들 융합 파트너를 검출할 수 있는 항체 Anti-V5-HRP 항체(Invitrogen, cat# R961-25)와 Anti-His(C-term)-HRP 항체(Invitrogen, cat# R931-25)를 사용하여 V5 epitope와 6xHis tag의 발현량을 측정함으로써 목적 단백질이 세포 내에서 발현되고 있는 것을 간접적으로 확인하였다.

발현률이 일정하게 유지되는 세포주를 확보하기 위하여 선정된 과발현 세포를 한 웰에 1개의 세포가 나뉘어지도록 희석한 후 96 웰 플레이트에 분주하였다. 2-3일간 배양한 후 현미경 하에서 관찰하여 각 웰의 클론 수를 측정하였다. 한 웰에 한 개의 클론을 형성한 웰을 표시한 후 일주일 동안 더 배양하였다. 트립신을 처리하여 표시된 웰에 있는 클론을 떼어낸 후 48웰, 24웰, 6웰 등으로 옮겨 다수의 세포를 확보하였다.

단계4) 동물에서 종양 형성능 조사

단계3 과정을 통하여 제조한 과발현 세포를 생후 5주된 10마리의 누드 마우스의 피하에 주입하였다. 약 20일 후 10마리의 마우스 모두가 암 유전자가 과발현된 세포를 주입한 부위에 1.5-2cm의 뚜렷한 종양을 형성하였다.

실시예 5: RNAi ( RNA interference ) 방법을 이용한 암 특이 유전자 기능 분석

암 조직에서 특이적으로 발현한 유전자들이 암세포의 기능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 real time PCR로 암 특이적인 발현이 검증된 유전자들에 대해 유전자의 발현을 RNA interference(RNAi)를 이용하여 특이적으로 억제 시킨 후 세포에 미치는 영향을 분석하였다.

1. RNAi를 이용한 특이적 유전자 억제

Real time PCR을 이용하여 siRNA 도입에 의해 해당 유전자가 특이적으로 넉다운 되는 것을 확인하였다(도 5). CTHRC1, CANP, KIAA0101 각 유전자 특이적인 siRNA를 도입한 처리군과 해당 유전자에 특이성을 갖지 않는 scrambled negative siRNA를 도입한 세포 및 아무것도 처리하지 않은 세포를 대조군으로 하여 비교하였을 때, 유전자 특이적인 siRNA를 도입한 시료의 경우에만 해당 유전자가 특이적으로 억제되었다. CTHRC1 siRNA를 처리하였을 때 처리 후 6시간에 대조군 대비 30% 정도 CTHRC1 mRNA 수준이 다운되었고 24시간이 지나자 80% 이상의 넉다운 효과를 보였다. CANP siRNA의 경우 처리 후 6시간이 지나자 대조군에 비해 70% 정도로 CANP mRNA가 넉다운었고, KIAA0101 siRNA는 12시간대부터 80% 이상의 KIAA0101 넉다운 효과를 나타내었다. siRNA에 의한 특이적인 유전자 넉다운 효과는 48시간 이상까지 유지되었고, negative siRNA를 처리한 경우에는 해당 유전자들의 mRNA 수준이 아무것도 처리하지 않는 대조군과 거의 차이를 보이지 않았다.

2. 유전자억제에 의한 세포사멸 유도 및 세포증식 감소 효과

세포 내 도입(transfection)에 따른 독성(toxicity)과 유전자 넉다운에 따른 효과를 관찰하기 위해 죽은 세포만 선택적으로 염색하는 EthD-1 형광 dye를 이용해 viability를 관찰하였다(도 6A). 또한, 시간대별 살아있는 세포의 수를 개수하여 유전자 억제가 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하였다(도 6B).

죽은 세포를 특이적으로 염색하는 EthD-1 형광 dye를 이용하여 죽은 세포의 양을 형광이미지로 확인하였을 때, CTHRC1 유전자 억제 시 대조군 대비 최고 50%의 세포가 세포사멸을 일으켰다. 아무것도 처리하지 않은 대조군의 경우 72시간대에 0시간 대비 3배 이상으로 세포의 수가 증가한 것에 반해, CTHRC1 유전자 억제시 72시간까지 세포 증식이 거의 일어나지 않았다. 이러한 결과는 CTHRC1 유전자 억제시 세포 사멸(cell death)이 유도되고 세포의 증식이 억제된다는 것을 의미한다.

CANP 유전자를 억제하였을 때 siRNA 처리 후 6시간에서부터 세포사멸이 조금씩 증가하여 24시간대에는 대조군 대비 40% 이상의 세포가 세포사멸을 일으켰다. 또한, 아무것도 처리하지 않은 대조군의 경우 72시간대에 0시간 대비 3배 이상으로 세포의 수가 증가한 것에 반해, CANP 유전자 억제시 72시간까지 세포 증식이 거의 일어나지 않았다. 이러한 결과는 CANP 유전자 억제시 세포 사멸이 유도되고 세포의 증식이 억제된다는 것을 의미한다.

KIAA0101 siRNA 처리의 경우, 현저한 mRNA 수준 변화는 12시간 이후부터 관찰할 수 있었으나 EthD-1 염색 결과 6시간에서부터 세포사멸이 일어나기 시작하는 것을 확인할 수 있었다. KIAA0101 유전자 억제시 30% 이상의 세포가 세포사멸을 일으켰고, 72시간까지 세포의 증식이 거의 일어나지 않았다. 이러한 결과는 KIAA0101 유전자 억제시 세포 사멸이 유도되고 세포의 증식이 억제된다는 것을 의미한다.

Negative siRNA를 처리한 시료의 경우 siRNA 도입에 따른 세포의 사멸이 거의 일어나지 않았고 대조군과 거의 동일한 세포 증식을 보여 CTHRC1, CANP, KIAA0101 siRNA 도입에 의한 세포 사멸 유도 및 세포 증식 억제가 각 유전자의 억제에 의해 특이적으로 일어난 것임을 확인할 수 있었다.

3. 유전자 억제에 의한 어팝토시스 유도

유전자 억제에 의해 유도되는 세포사멸의 형태를 확인하기 위하여 어팝토시스 관련 효소인 caspase 활성(도 8)을 측정하고 DNA 분절(fragmentation) 정도(도 7)와 세포막 변화(membrane alteration)를 측정하여 시간대별 어팝토시스 및 네크로시스 발생 정도를 측정하였다(도 9).

CTHRC1 유전자 억제시 siRNA 도입 이후부터 caspase의 활성이 증가하기 시작하여 세포사멸이 최고조에 이르는 24시간에는 caspase의 활성이 대조군 대비 4배 이상 증가하였고, DNA 분절도 서서히 증가하여 72시간에는 대조군 대비 5배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 어팝토시스가 증가함에 따라 세포막의 PS(phosphatidyl serine)가 외부로 노출되었다.

CANP 유전자 억제시에는 siRNA 도입 6시간 이후부터 caspase 활성이 증가하여 24시간에는 대조군 대비 4배 이상 증가하였고, DNA 분절도 함께 증가하여 72시간에는 대조군 대비 8배 이상 증가하였다. 또한 어팝토시스가 증가함에 따라 세포막의 PS도 외부로 노출되었다.

KIAA0101 유전자 억제시에는 siRNA 도입 직후부터 caspase 활성이 증가하여 24시간에는 대조군 대비 45배 이상 증가하였고, DNA 분절도 함께 증가하여 72시간에는 대조군 대비 3배 이상 증가하였다. 또한 어팝토시스가 증가함에 따라 세포막의 PS도 외부로 노출되었다.

Caspase 효소 활성 및 DNA 분절과 세포막 변화로 확인한 어팝토시스 정도는 KIAA0101, CANP, CTHRC1의 순으로 높게 나타났다. 또한 negative siRNA를 처리한 시료의 경우 siRNA 도입에 따른 세포 사멸 징후가 거의 나타나지 않아 CTHRC1, CANP, KIAA0101 siRNA 도입에 의한 세포 사멸 유도가 각 유전자의 억제에 의해 특이적으로 일어나는 것임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 신규 암유전자 CTHRC1, CANP, KIAA0101의 발현 억제시 어팝토시스로 예측되는 세포사멸을 일으킨다는 것을 보여주는 것으로, 신규 암유전자 CTHRC1, CANP, KIAA0101이 세포의 생존에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

4. 유전자억제가 세포분열에 미치는 영향

유전자 억제에 의해 유도되는 세포 증식 억제 효과를 확인하기 위해 PI(propidium iodide)를 이용하여 세포 주기 변화를 측정하였다(도 10).

CTHRC1 siRNA를 처리한 세포에서는 대조군에 비해 3시간부터 S기와 G2/M기가 20%가량 감소하며 G0/G1기가 20% 증가하였다. 또한 CANP siRNA를 처리한 세포에서는 대조군에 비해 S기는 최대 120%까지 감소되고 G2/M기는 60%까지 감소한 반면, G0/G1기는 최소 5%에서 30%까지 증가하였다. KIAA0101 siRNA를 처리한 세포에서는 대조군에 비해 S기는 최대 125%까지 감소되었고 G2/M기는 50%까지 감소하였으며, G0/G1기는 최소 10%에서 40% 까지 증가하였다.

CTHRC1, CANP, KIAA0101 유전자가 저발현되면 어팝토시스가 유발되어 세포들이 세포주기의 G1기에 정지(arrest)됨으로써 세포의 증식이 억제되는 것으로 판단된다. Negative siRNA를 처리한 시료의 경우 siRNA 도입에 따른 세포 증식 억제나 사멸 효과가 거의 나타나지 않아 CTHRC1, CANP, KIAA0101 siRNA 도입에 의한 세포 주기의 변화가 각 유전자의 억제에 의해 특이적으로 일어난 것임을 확인할 수 있었다.

단계1) siRNA(small interfering RNA) 제작

NCBI GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)를 이용하여 CTHRC1, CANP, KIAA0101 유전자 전체 mRNA 서열을 확보하였다. siRNA는 Invitrogen사의 Block-IT^TM RNAi designer(http://www.invitrogen.com/)를 이용하여 디자인하고 Invitrogen사에서 합성하였다. 유전자별 siRNA 염기서열은 다음과 같다.

Gene	Accession number	siRNA sequence (5' to 3') forward/reverse
CTHRC1	NM138455	UUAUAGCUUCAAUGGGAAGAGGUCC (서열번호 17)/ GGACCUCUUCCCAUUGAAGCUAUAA (서열번호 18)
CANP	NM198947	CCAGAGUCUGAUACAGUCUAAGAAA (서열번호 19)/ UUUCUUAGACUGUAUCAGACUCUGG (서열번호 20)
KIAA0101	NM014736	AUGAAACUGAUGUCGAAUUAGUGGC (서열번호 21)/ GCCACUAAUUCGACAUCAGUUUCAU (서열번호 22)

단계2) siRNA의 세포 내 도입

유방암 세포주 MCF-7과 SK-BR3와 대장암 세포주 WiDr과 HCT116, 폐암 세포주 A549에 대한 실험을 진행하였다. 세포주를 웰당 3×10⁴개의 세포수로 48 웰 배양 플레이트애 분주하고 16 시간 후에 각 유전자의 siRNA 또는 음성 대조구siRNA(Invitrogen, cat#12935-100)를 fluorescent oligo(Invitrogen, cat#13750-062)와 함께 LipofectamineTM 2000(Invitrogen, cat#11668-027)과 혼합하여 세포주가 자라고 있는 배양 배지 안에 넣었다. 24, 48, 72 시간마다 농도 및 시간에 따른 도입 결과를 관찰하였다. siRNA와 fluorescent oligo는 20mM 스탁 용액을 100mM KOAc, 30mM HEPES-KOH, 2mM MgOAc로 이루어진 pH7.4의 버퍼로 희석하여 사용하였다.

단계3) 유전자 넉다운에 의한 mRNA 변화 측정

RNAi 기법에 의한 mRNA 넉다운 결과를 측정하기 위해 세포주를 웰당 2×10⁵개의 세포수로 12 웰 배양 플레이트에 분주하고 16 시간 동안 배양하였다. 이후 10, 20, 50, 100nM의 siRNA를 lipofectamine 1ml와 혼합하여 세포주가 자라고 있는 배양 배지 안에 넣고 6, 12, 24, 48 시간 후에 total RNA를 추출하였다. RNA는 RNeasymicro kit(QIAGEN, cat#74004)를 이용하여 추출하였다. RNA를 추출한 후DNase(QIAGEN, cat#79254)를 처리하여 RNA 시료에 포함되어 있는 미량의 genomic DNA를 제거하였다.

Quantitative real time PCR을 이용하여 RNAi에 의한 유전자 넉다운 효과를 측정하였다. 추출된 RNA를 SuperScript III reverse transcriptase(Invitrogen, cat#18080-044)와 poly dT primer를 이용하여 역전사(RT, reverse transcription) 반응을 수행하였다. PCR은 SYBR green assay로 수행하였다. SYBR green PCR master mix(Applied Biosystems, cat#4309155) 12.5ul에 cDNA, forward 프라이머, reverse 프라이머를 각각 첨가하여 총 25ul로 진행하였다. cDNA는 역전사 반응 때 사용한 총 RNA 기준으로 50ng의 양이 되도록 첨가하였고 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 각각 300nM이 되도록 첨가하였다. 역전사 반응 효율에 의한 시료 간 cDNA 농도 차이는 내부 대조구인 베타-액틴을 사용하여 상대적 농도를 결정, 보정하였다.

단계4) 유전자 넉다운에 의한 세포 표현형 변화 관찰

세포 내 도입(transfection)에 따른 독성(toxicity)과 유전자 넉다운에 따른 효과를 관찰하기 위해 죽은 세포만 선택적으로 염색하는 EthD-1(Ethidium homodimer-1, Sigma, cat#E1169)을 이용해 viability 변화를 관찰하였다. EthD-1은 세포에 2mM으로 처리해 염색하였다. siRNA의 세포 내 도입 결과를 보기 위해서 형광 현미경(Olympus IX51)을 사용하였다. Fluorescent oligo는 FITC 파장(ex=494nm, em=519nm)에서, EthD-1은 Texas-Red 파장(ex=528nm, em=617nm)에서 형광 이미지를 얻었다.

단계5) 유전자 넉다운에 의한 세포 증식 변화 측정

세포주를 웰당 3×10³개의 세포수로 96 웰 배양 플레이트에 분주하고 16 시간 동안 배양하였다. 이후 10, 20, 50, 100nM의 유전자별 siRNA, 음성 대조구 siRNA를 0.1ml의 리포펙타민과 혼합하여 세포주가 자라고 있는 배양 배지 안에 넣고 24, 48, 72 시간 후에 세포 카운팅 어세이를 수행하였다. siRNA가 형질전환(transfection)된 세포를 50㎕의 트립신(trypsin; GIBCO, cat#15090-046)으로 떼어내고 50㎕의 trypan blue stain(GIBCO, cat#15250-061)을 넣어 damaged cell을 염색하여 hemocytometer로 viable cell 만을 계수하였다.

단계6) 자가 세포 사멸(Apoptosis) 측정

6-1. DNA 분절 측정

어팝토시스와 네크로시스(necrosis)를 일으킨 세포의 분해된 DNA를 측정하는 방법으로 Roche사의 Cell death detection ELISA kit를 이용하였다(Roche, cat#1774425). 세포주에 siRNA를 도입시켜 RNAi를 수행한 후 네크로시스된 세포를 포함하고 있는 상등액(supernatant)를 분리하고, 나머지 세포는 파괴(lysis)시켜 어팝토시스가 일어난 세포의 DNA를 유리 시켰다. 이들을 스트랍타비딘(straptavidin)이 코팅된 마이크로플레이트에 넣고 anti-histon biotin antibody와 anti-DNA POD antibody와 반응시켰다. 퍼록시다제(Peroxidase) 기질인 ABTS를 넣고 발색 시킨 후 405nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다. 결과 분석은 각각의 흡광도 값에서 background 값을 제한 후 enrichment factor(cytoplasm으로 유리된 mono/oligonucleosome 값)를 구해 유전자 넉다운에 의한 세포의 사멸 정도를 구하였다.

6-2. 캐스파제 활성(Caspase activity) 측정

어팝토시스를 일으킨 세포의 캐스파제 활성을 측정하기 위해 Roche사의 Homogeneous caspases assay kit를 사용하였다(Roche, cat#3005372). 세포주에 siRNA를 도입시켜 RNAi를 수행한 후 형광 물질인 로다민 110(Rhodamine 110)이 붙어있는 캐스파제 기질 DEVD-R110과 반응시켰다. 이를 470-500nm(excitation wavelength)의 필터와 500-560nm(emission wavelength)의 필터가 있는 형광분석기(fluorimetric reader)로 측정하였다. 결과 분석은 각각의 형광 값에서 blanc값을 제한 후(relative fluorescence units, RFU) induction factor(IF, 대조군에 대한 caspase 활성비)를 구해 유전자 넉다운에 의한 캐스파제 활성 변화를 구하였다.

6-3. 세포막 변화 (Membrane alteration) 측정

어팝토시스를 일으킨 세포에서는 PS(phosphatidyl serine)이 세포막 외부로 노출된다. 이를 PS에 특이적으로 붙는 Annexin-V로 검출하는데 BD사의Annexin V-FITC apoptosis kit를 사용하였다(BD, cat#K2025-1). 세포주에 siRNA를 도입시켜 세포 사멸을 유도한 후 형광 물질인 FITC가 붙은 Annexin-V와 반응시켜 BectonCoulter사의 플로 사이토미터(flow cytometer)로 측정하였다. 이때 DNA 특이적인 물질인 PI(propidium iodide)를 함께 반응시켜 후기 단계(late stage)의 어팝토시스 세포와 네크로시스 세포를 구분해내었다.

단계7) 세포 주기 변화 측정

세포주에 siRNA를 도입시켜 유전자를 넉다운시킨 후 70% 에탄올로 고정시켰다. DNA 특이적인 물질인 PI(propidium iodide) 염색하여 플로 사이토미터로 측정하였다. DNA 양의 변화에 따라 세포 주기를 구분하였다.

상기에서 기술한 바와 같이, CTHRC1, CANP 및 KIAA0101 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 검출하여 유방암 또는 대장암을 유의적으로 진단할 수 있을 뿐만 아니라 상기 유전자의 발현과 활성을 저해하여 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

<110> DAEWOONG CO., LTD. <120> Markers for Diagnosis of Cancer and Its Use <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ccgcgggaat tcgatt 16 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gccgcgaatt cactagtg 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB-specific froward primer <400> 3 ggcattgccg acaggatg 18 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB-specific reverse primer <400> 4 ctcaggagga gcaatgatct tgat 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1-specific forward primer <400> 5 ttgggaaaat tgcggagtgt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1-specific reverse primer <400> 6 gccgaagtga gccactgaac 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CANP-specific forward primer <400> 7 tcggtctgac ataggtgaat ttga 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CANP-specific reverse primer <400> 8 tcatccacca tggactgttt tc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIAA0101-specific forward primer <400> 9 tcatcgagga aagctgaaaa ta 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIAA0101-specific reverse primer <400> 10 aattcctttt tgccacttgg 20 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for cloning of CTHRC1 <400> 11 tctggctcct ctccttgcac cagtc 25 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for cloning of CTHRC1 <400> 12 acggaacctt accaagtgaa tttactgt 28 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for cloning of CANP1 <400> 13 ccttgtttct ccatcttatc gagt 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for cloning of CANP1 <400> 14 attttctccc attccgtagg ttgt 24 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for cloning of KIAA0101 <400> 15 ctcggctggg aagtcagttc gttctc 26 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for cloning of KIAA0101 <400> 16 aagccactgt gcccaccatg attctat 27 <210> 17 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1-specific siRNA <400> 17 uuauagcuuc aaugggaaga ggucc 25 <210> 18 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1-specific siRNA <400> 18 ggaccucuuc ccauugaagc uauaa 25 <210> 19 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CANP-specific siRNA <400> 19 ccagagucug auacagucua agaaa 25 <210> 20 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CANP-specific siRNA <400> 20 uuucuuagac uguaucagac ucugg 25 <210> 21 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIAA0101-specific siRNA <400> 21 augaaacuga ugucgaauua guggc 25 <210> 22 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIAA0101-specific siRNA <400> 22 gccacuaauu cgacaucagu uucau 25

Claims

CANP(암-연관 핵단백질, Cancer-Associated Nucleoprotein: NCBI 허가번호 NM_198947); CANP 및 CTHRC1(콜라겐 삼중 나선 반복-함유 1, Collagen Triple Helix Repeat Containing 1: NCBI 허가번호 NM_138455); CANP 및 KIAA0101(NCBI 허가번호 NM_014738); 및 CANP, CTHRC1 및 KIAA0101로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자로 이루어진 유방암 또는 대장암 진단 마커.
CANP; CANP 및 CTHRC1; CANP 및 KIAA0101; 및 CANP, CTHRC1 및 KIAA0101로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자로부터 코딩되는 단백질로 이루어진 유방암 또는 대장암 진단 마커.
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