KR20140138533A - 항 igf-1r 단일클론 항체 및 이를 포함하는 암치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항 IGF-1R 단일클론 항체 및 이를 포함하는 암치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 항 IGF-1R 단일클론 항체, 상기 단일클론 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 단일클론 항체를 제조하는 방법 및 상기 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인간 단일클론항체 유방암 등의 암세포에 발현된 IGF-1R에 대해서 강한 친화력을 나타내며, 기존 알려진 단일클론항체들과 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하고, 신규한 CDR 서열을 가지고 있다. 이에 따라, 인슐린 유사 성장인자(IGF)와 수용체 간의 결합을 효과적으로 저해할 뿐만 아니라, 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로 암 또는 자가면역질환과 같은 질환의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항 IGF-1R 단일클론 항체 및 이를 포함하는 암치료용 조성물{A monoclonal antibody for IGF-1R and pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 항 IGF-1R 단일클론 항체 및 이를 포함하는 암치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 항 IGF-1R 단일클론 항체, 상기 단일클론 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 단일클론 항체를 제조하는 방법 및 상기 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.

인슐린 유사 성장인자(Insulin like growth factor) 1 및 2 ("IGF-1" 및 "IGF-2")는 혈장 내에 존재하는 약 7.5 kDa 크기의 폴리펩티드로서, 대부분의 조직에서 검출되고, 매우 다양한 포유동물 세포의 분화 및 증식을 촉진한다고 알려져 있다. 상기 IGF-1 및 IGF-2는 모두 세포표면에 위치한 IGF-1 수용체(IGF-1R, Insulin-like growth factor 1 receptor)에 결합하여 세포의 다양한 작용을 조절할 뿐만 아니라 초기 분화에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

IGF-1R은 알파 서브유닛과 베타 서브유닛으로 구성되는데, 알파 서브유닛은 세포막 외부에 존재하여 IGF-1 및 IGF-2와 직접적으로 결합하는 약 130-135 kDa의 크기를 가지는 폴리펩티드이고, 베타 서브유닛은 막투과 영역과 티로신 키나제 활성을 가지는 세포질 영역으로 구성되는 약 95 kDa의 크기를 가지는 폴리펩티드이다. 기능적으로 볼 때, 상기 IGF-1R은 티로신 키나아제 성장인자 수용체 군에 속하고, 인슐린 수용체와 구조적으로 유사하다고 알려져 있다. 상기 IGF-1R은 처음에는 단일쇄(single chain) 프로수용체 (proreceptor) 폴리펩타이드로서 합성된 다음 글라이코실화, 단백질 분해에 의해 가공되며 공유결합되어 2개의 알파 서브유닛과 2개의 베타 서브유닛을 포함하는 성숙한 460 kDa 헤테로테트라머 (heterotetramer)를 형성한다.

한편, 성체에서 IGF-1, IGF-2, IGF-1R 등이 비정상적으로 활성화되는 경우에는 암의 발생과 관련성이 있는 것으로 보고되었다. 특히, IGF-1R은 유방암, 폐암, 대장암, 전립선암, 자궁암 등 다양한 암 환자의 조직에서 과발현된다고 보고되었다. 최근에 발표된 논문에 의하면 조사 대상 181명의 유방암 환자 중 절반 이상인 109명에서 IGF-1R를 과발현하고 있다고 보고하고 있다. 이와 같이, IGF-1R가 훌륭한 유방암 바이오마커 (biomarker)로 사용될 수 있을 가능성을 강하게 제시하고 있어, 항암제의 표적(target)으로 최근에 관심이 집중되고 있다. 예를 들어, WO 2002/53596, WO 2005/016967 및 WO 2006/01347 에는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체 또는 인간의 단일클론 항체 및 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물이 개시되어 있고, WO 2006/138729에는 환자에게 IGF-1R 길항제 및/또는 PDGFRα 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 골암을 치료하는 방법이 개시되어 있으며, WO 2010/066868에는 사람 IGF-1에 결합하고 IGF-2와 교차반응하여 IGF-1 수용체에 대한 IGF-1 및 IGF-2의 결합을 방해하고 IGF-1 수용체를 통한 신호전달을 억제하는 인간 항체 및 상기 인간 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 여전히 보다 효과가 좋은 항암제로 사용될 수 있는 항암용 항체의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 IGF-1R을 저해하여 항암효과를 나타내는 인간 단일클론 항체 치료제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 기존의 항체들과 상이한 에피토프를 인지하는 신규한 CDR 서열을 가지며, IGF-1R을 통한 신호전달을 저해하여 기존 항암제보다 강한 항암 효과를 가지는 인간 단일클론 항체를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 인슐린 유사 성장인자-1 수용체(IGF-1R)에 특이적으로 결합하는 신규한 인간 단일클론항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 이용하여, 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 인슐린 유사 성장인자-1 수용체(IGF-1R) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 암세포 표면 항원인 IGF-1R(Insulin like growth factor-1 Receptor)과 특이적으로 결합하는 신규한 인간 단일클론항체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "IGF-1R에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체"는 IGF-1R에 결합하여 IGF-1R의 생물학적 활성의 억제를 초래할 수 있는 항체를 의미하며, 본 발명에서 항 IGF-1R 항체와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체는 IGF-1R에 특이적으로 결합하여 IGF-1R와 IGF-1 간의 결합을 저해하는 단일클론항체라면 제한없이 포함한다. 상기 단일클론항체의 형태는 전체 항체 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 인간 단일클론항체는 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 8으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 10으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 인간 단일클론항체일 수 있다. 또한, 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 2로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 인간 단일클론항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 2로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 인간 단일클론항체를 MKJP2로 명명하였다. 상기 MKJP2에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열에 대하여 도 4에 나타내었다. 한편, 본 발명에서 MKJP2는 상기 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 8으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 10으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 인간 단일클론항체 뿐 아니라, 상기 경쇄 및 중쇄 CDR 서열을 포함하는 파아지 항체와 혼용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 또한, 상기 용어는 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 이가 및 양특이성 분자는 예를 들면, Kostelny 등 (1992, J. Immunol., 148:1547), Pack 및 Pluckthun (1992, Biochemistry, 31:1579), Hollinger 등 (1993, Supra), Gruber 등 (1994, J. Immunol., 5368), Zhu 등 (1997, Protein Sci., 6:781 등), Hu 등 (1996, Cancer Res., 56:3055), Adams 등 (1993, Cancer Res., 53:4026) 및 McCartney 등 (1995, Protein Eng., 8:301)에 기술되어 있다.

상기 항체 단편은 항원결합 능력을 가지는 단편을 의미하며, Fab', F(ab')₂, Fab, Fv, scFv 및 rIgG를 포함하는, 항체의 항원 결합 형태를 포함한다. 본 발명에서 항체 단편은 전장항체가 아닌, 항원과의 결합능을 결정하는 상보성 결정영역을 포함하는 폴리펩타이드를 폭넓게 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명의 용어, "단일클론 항체"란 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미하는데, 상기 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명의 목적상 상기 단일클론 항체는 암세포 표면항원인 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체일 수 있다. 본 발명의 암세포 표면항원인 IGF-1R에 결합할 수 있는 항체는 IGF-1R과 결합하여 항암활성을 가질 수 있다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

상기 단일클론 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgT, IgY, 단일쇄 항체 등의 천연형 항체; 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키거나, 인간화 항체와 같이 체내에서 항체에 대한 거부반응을 감소시키거나 또는 항체의 안정성을 증대시키기 위하여 천연형 항체의 일부를 변이시킨 형태의 변이항체; 상기 천연형 항체의 일부를 포함하도록 구성된 재조합 항체 등이 될 수 있다. 보다 바람직하게는 IgG 등의 천연항체, 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키도록 변이된 변이항체, 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정영역(CDR, complementarity determining region)을 포함하는 재조합 항체 등이 될 수 있다. 더 바람직하게, 상기 IgG는 다양한 isotype을 포함할 수 있으나, 가장 바람직하게는 IgG1 형태일 수 있다. 또한, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 펩타이드 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 펩타이드로 구성된 단일클론 항체일 수 있다. 또한, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 펩타이드 및/또는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 펩타이드로 구성된 단일클론 항체인 것이 바람직하다. 또한, 항체 단편이 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, 이는 3가지 이상의 잠재적인 장점을 가질 수 있다. 먼저, 이는 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다. 둘째로, 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는 이점이 있다. 셋째로, 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 이점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 인간 단일클론항체들은 IGF-1R에 대해서 강한 친화력을 나타내며, IGF-1R를 발현하고 있는 세포(예-암세포)에 IGF-1이 결합하는 것을 효과적으로 저해할 뿐 아니라, 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로, 암과 같은 질병의 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 인간 단일클론항체가 불변 영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변 영역을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그 예로, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 불변 영역으로부터 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다.

본 발명에서 용어, "하이브리드(hybrid)"란 단쇄 면역 글로불린 중쇄 불변 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하며, 그 예로 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다.

한편, IgG의 아형인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중쇄 불변영역의 조합 또는 혼성화도 가능하다. 상기 조합 및 혼성화에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 IgG1 중쇄 불변영역은 서열번호 13로 기재된 IgG1 중쇄 불변영역, IgG2 중쇄 불변영역은 서열번호 14으로 기재된 IgG2 중쇄 불변영역, IgG3 중쇄 불변영역은 서열번호 15로 기재된 IgG3 중쇄 불변영역, IgG4 중쇄 불변영역은 서열번호 16로 기재된 IgG4 중쇄 불변영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 상기 IGF-1R에 특이적인 인간 단일클론항체는 경쇄 불변영역이 람다(λ) 또는 카파(κ) 경쇄 유래일 수 있다. 상기 인간 단일클론항체의 경쇄 불변영역이 람다 경쇄 유래인 경우, 서열번호 17으로 기재된 람다 경쇄 불변영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 인간 단일클론항체는 인간 IGF-1R에 대해 평형 해리 상수값 1.0 x 10^-10 M 내지 1.0 x 10^-9M의 높은 친화도를 제공하는 것일 수 있다. 이는 비아코아를 이용한 분석을 통하여 항체와 인간 IGF-1R에 대한 결합/해리 상수(K_D value)를 구함으로써 확인할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 인간 단일클론항체 MKJP2는 평형 해리 상수값(K_D) 약 1.73 x 10^-10M 수준의 높은 결합력을 가지는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 본 발명의 항체가 IGF-1R에 대해 특이적으로 높은 결합을 할 수 있다는 것을 시사하는 것으로 IGF-1R에 대한 항원 인식을 유용하게 사용할 수 있는 임의의 적용에서 사용할 수 있다. 이에 항암 용도 뿐 아니라, IGF-1R이 과발현되는 암의 진단에도 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "인슐린 유사 성장인자 1 수용체(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)"는 인슐린 유사 성장인자와 결합하는 세포막 수용체 부류의 하나로서, 바람직하게는 인슐린 유사 성장인자 1 및 2(IGF-1 및 IGF-2)에 결합하여 IGF-1 및 IGF-2 호르몬의 신호 전달을 세포 내로 매개하는 수용체 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 IGF-1R은 포유류의 IGF-1R라면 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 인간 또는 마우스의 IGF-1R를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 IGF-1R는 암세포 세포막 과다하게 발현되어 IGF-1 또는 IGF-2에 결합하여 암의 성장을 유도할 수 있는 수용체 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 IGF-1R은 유방암(breast cancer)을 비롯한 다양한 암 세포에서 과발현되어 있으며, 암의 성장을 촉진시키거나 항암제 내성을 일으키는 신호전달에 작용하는 것이 알려져 있다(HE, Jones et al, Endocr . Relat . Cancer 2004;11 (4): 793-814). 또한, 상기 IGF-1R는 천연형 또는 변이체 IGF-1R 단백질을 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 천연형 IGF-1R 단백질이란 천연형 IGF-1R 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 일반적으로 지칭하며, 상기 천연형 IGF-1R 단백질의 아미노산 서열이란 천연 발생 IGF-1R에서 발견되는 아미노산 서열을 일반적으로 지칭한다. 상기 IGF-1R에 대한 정보는 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 NM_000875인 IGF-1R일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor)"는 인슐린과 높은 서열 유사성을 갖는 단백질로, 이들의 수용체인 IGF-1R 및 IGF-2R 단백질과 관련된 여러 기작에 관여한다. 특히, 본 발명에서는 IGF-1 또는 IGF-2 호르몬일 수 있다. 본 발명에서 용어, "인슐린 유사 성장인자 1(IGF-1)"은 somatomedin C라고도 지칭되는 유년기 성장 및 성인의 동화작용(anabolic effect)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 상기 IGF-1 또는 IGF-2는 바람직하게는 인간 또는 마우스의 IGF-1R에 결합하는 단백질을 의미할 수 있다. 상기 IGF-1 또는 IGF-2는 천연형 또는 변이체 IGF-1 또는 IGF-2 단백질을 모두 포함한다. 천연형 IGF-1 또는 IGF-2란 천연형 IGF-1 또는 IGF-2 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하며, 상기 천연형 IGF-1 또는 IGF-2 단백질의 아미노산 서열이란 천연형 발생 IGF-1 또는 IGF-2에서 발견되는 아미노산을 일반적으로 지칭할 수 있다.

본 발명에서 용어, "IGF-1 또는 IGF-2와 IGF-1R 간의 상호작용을 저해"는 본 발명의 IGF-1R에 특이적인 단일클론항체가 IGF-1R에 결합하여 IGF-1R와 그의 리간드에 해당하는 IGF-1 또는 IGF-2 간의 상호작용을 저해시키는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 IGF-1R에 특이적인 단일클론항체에 의한 IGF-1과 IGF-1R 간의 상호작용 저해를 통하여 IGF-1R의 IGF-1 결합에 의한 IGF-1R 단백질의 인산화를 저해하여, 이의 하위 신호전달기작인 AKT 및 MAPK 신호 전달의 활성화를 억제할 수 있다. 특히, 암에서 IGF-1과 IGF-1R 단백질이 결합하게 되면, 세포 생존 및 증식 관련 기작인 AKT 및 MAPK 신호전달이 활성화되어 암세포의 생존 및 증식을 향상시켜 암의 증식과 항암제에 대한 내성에 관여하는 것으로 알려져 있다 (HE, Jones et al, Endocr. Relat. Cancer 2004;11 (4): 793-814). 따라서, 암에서 IGF-1에 의한 신호전달을 차단하게 되면 암의 성장 및 항암제에 대한 내성 생성을 억제할 수 있게 된다. 따라서, IGF-1 또는 IGF-2와 IGF-1R 간의 상호작용을 효과적으로 억제하는 본 발명의 IGF-1R에 특이적인 인간 단일클론항체는 암의 치료에 있어서 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, IGF-1R에 특이적인 인간 단일클론항체 MKJP2를 제작하였으며, 상기 항체는 약 0.173 nM의 낮은 평형 해리 상수값(K_D 값)을 나타내어 IGF-1R 항원에 대한 높은 친화도를 보임을 확인하였다(표 3 및 도 7). 특히, 본 발명의 항체가 IGF-1에 의한 신호전달이 활성화되는 경우에 확인되는, IGF-1R의 인산화, AKT의 인산화, ERK의 인산화를 NICD를 대조군에 비하여 거의 완전하게 차단하는 것을 확인하여 IGF-1에 의한 세포 증식 및 생존 관련 신호전달을 억제시킬 수 있음을 확인하였다(도 9). 뿐만 아니라, 본 발명의 항체는 인간 유방암 세포 MCF-7 세포에 처리시, 처리하는 항체의 농도 의존적으로 세포의 증식을 현저히 감소시키는 결과를 보여줌으로써, 암의 치료에 있어서 효과적으로 사용될 수 있는 항체임을 나타내었다(도 8). 또한, 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 마우스에 이식한 후 본 발명의 항체를 처리한 결과 처리하지 않은 대조군에 비하여 종양의 크기가 줄거나 더 이상 성장시키지 않는 것을 확인하였다(도 10). 상기와 같은 결과들은 본 발명의 항 IGF-1R 항체가 IGF-1R에 강하게 결합하여 IGF-1과 IGF-1R 간의 결합을 저해하여 IGF-1 신호전달을 억제하므로, 암 치료에 있어서 효과적인 진단 및 치료용 항체가 될 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, IGF-1R이 다양한 암세포에서 과발현되어 있는 것을 고려하였을 때, 암의 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조방법은 본 발명의 인슐린 유사 성장인자 1 수용체(IGF-1R)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체를 발현하는 발현 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는 것 일 수 있다.

본 발명의 단일클론항체는 공지의 단일클론항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파아지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

파아지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파아지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파아지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적으로 파아지 디스플레이 기술은 1) 파아지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ (또는 pⅣ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; 4) 수용체에 결합된 펩티드-파아지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파아지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하는 단계로구성된다.

바람직하게 본 발명의 단일클론항체의 제조방법은 파아지 디스플레이 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자는 공지의 파아지 디스플레이 기술, 예를 들어 Barbas 등(METHODS : A Companion to Methods in Enzymology 2:119, 1991 및 J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9) 및 Winter 등(Ann. Rev.Immunol. 12:433, 1994) 의 논문 등에 공지된 방법을 참고하여 상기 본 발명의 제조방법의 각 단계를 용이하게 수행할 수 있다. 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파아지는, 예를 들어 필라멘트성 파아지(filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파아지가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파아지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터에는 예를 들어, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파아지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8 또는 pSEX 등의 파아지미드 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 증폭을 위한 재조합 파아지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파아지에는, 예를 들어M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 하이브리도마 유래의 단일클론항체 또는 파아지 디스플레이 클론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 그 예로, 하이브리도마 또는 파아지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 일단 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론항체를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 인간 단일클론항체의 제조 방법은 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터에서 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 포함하는, 인간 단일클론항체의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

상기 인간 단일클론항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 제공하는 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.

상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 인간 단일클론항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "도입"은 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 인간 단일클론항체는 IGF-1R에 결합하여 IGF-1에 의한 IGF-1R의 활성화를 저해함으로써 암의 성장 억제에 관여할 수 있다. 상기 IGF-1과 IGF-1R에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "암"은 본 발명의 항체에 의해 치료될 수 있는 암이라면 그 종류에 제한없이 포함하나, 그 예로 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 또는 다발성 골수종 혈액암일 수 있다. 본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 대표적으로 인간 유방암 세포주인 MCF-7에 대해서 본 발명의 인간 단일클론항체인 MKJP2를 처리하였을 때, 대조군에 비하여 농도의존적으로 세포의 증식을 감소시키는 것을 확인하여(도 8), 본 발명의 항체가 암의 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 대표적으로 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 마우스에 이식하여, IGF-1R 항체 MKJP2를 처리하였을 때, 처리하지 않은 대조군에 비하여 종양의 크기가 줄거나 더 이상 성장시키지 않는 것을 확인함으로써, 본 발명의 항체가 암의 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 9).

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 인간 단일클론항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 암을 치료하는 방법은 인간 단일클론항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 암이 발병되거나 발병 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 암을 치료하는 방법은 바람직하게는 인간 단일클론항체를 포함하는 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있다.

상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유 동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한없이 포함된다.

이때, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체를 포함할 수 있다. 상기 단일클론항체를 포함하는 약학적 조성물을 인체 내에 투여하여, 암의 발생, 증식 또는 전이를 억제시키거나 진행을 막아 암을 치료할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에 상기 인간 단일클론항체를 처리하여, IGF-1R 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 상기 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 IGF-1R 단백질 수준과 비교하여 단백질 수준이 증가하면 암으로 판단하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다. 또한, 이 방법은 암을 진단하는 방법일 수 있다.

상기 인간 단일클론항체, 암, 개체 및 IGF-1R 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 암의 진단을 위한 정보의 제공방법은 본 발명의 IGF-1R에 특이적인 인간 단일클론항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 IGF-1R 단백질을 검출할 수 있으며, 이를 통해 암의 진단을 위한 정보의 제공을 할 수 있다. 상기 IGF-1R은 유방암 및 전립선암을 비롯한 다양한 암세포에서 과발현되어 있으므로(HE, Jones et al, Endocr. Relat . Cancer 2004;11 (4): 793-814), 정상 세포 또는 조직과 같은 대조군과 IGF-1R의 발현량을 비교하여 암을 진단할 수 있으나, 암의 종류는 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 IGF-1R 단백질의 존재 또는 암의 유무를 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 시료 중의 IGF-1R 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나, 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.

검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu^{3 +}, Eu^{3 +} 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I, ¹²⁵I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA,고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 인간 단일클론항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 IGF-1R에 특이적인 단일클론항체를 포함하는 진단용 조성물을 사용하여 IGF-1R의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환 또는 IGF-1R에 의해 매개되는 질환 예컨대, 암을 진단할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상기 조성물 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 암 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 인간 단일클론항체 유방암 등의 암세포에 발현된 IGF-1R에 대해서 강한 친화력을 나타내며, 기존 알려진 단일클론항체들과 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이에 따라, 인슐린 유사 성장인자(IGF)에 의한 수용체의 활성화 또는 이후 신호전달을 효과적으로 저해할 뿐만 아니라, 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로 암 질환의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 단일클론 항체를 스크리닝한 파아지 풀(phage pool)을 이용한 ELISA 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 단일클론항체를 선별하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 단일클론항체를 선별하기 위한 FACS 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 MKJP2의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열과 CDR 분석결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 선별된 단일클론항체의 임시발현 및 분리정제 후의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 ELISA를 통하여 IGF-1R에 대한 MKJP2의 특이적 결합을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. IMC는 양성대조군 항체 IMC-A12를 의미한다.
도 7은 IGF-1R 항원에 대한 MKJP2의 결합친화도를 BIAcore로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 MKJP2의 MCF-7 세포에서의 항-증식 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 MKJP2의 MCF-7 세포에서의 IGF-1R 신호전달 억제 효과를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. IMC는 양성대조군 항체 IMC-A12를 의미한다.
도 10은 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 마우스에 이식하여 본원발명의 항체를 처리한 후 종양의 크기를 측정한 도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 라이브러리 파아지의 제조

항-인슐린 유사 성장인자-1 수용체(Insulin-like Growth Factor-1 receptor, IGF-1R) 항체를 제조하기 위하여, 인간 유래 scFv(single-chain variable fragment) 라이브러리 파아지를 이용하여 스크리닝을 수행하였다. 이때, IGF-1R 항원으로는 리간드인 IGF-1이 결합하는 부위라고 알려진 세포표면으로 노출된 도메인 (extracellular domain, ECD)인 α 체인과 β 체인의 일부분에 해당하는 아미노산 서열 (Met1-Asn932)(R&D system)을 사용하여 2번의 패닝을 한 후, IGF-1R이 과발현 되었다고 알려진 MCF-7 세포를 이용한 세포 패닝(Cell panning) 방법을 통하여 3차 패닝을 실시하였다. 본 실시예에서는 IGF-1R 단백질과 MCF-7을 이용한 세포 패닝의 방법과 결과를 기재하였다.

1-1. 인슐린 유사 성장인자-1 수용체 단백질을 이용한 패닝

면역튜브(Immunotube, Maxsorp, Cat No. 4-442-2)에 재조합 인슐린 유사 성장인자-1 수용체(IGF-1R, R&D system, 391-GR)와 Negative Selection 목적으로 사용될 BSA (Gibco, 30063-572)를 각각 10 ㎍씩 4 ℃에서 하룻밤 동안 (O/N, Overnight) 코팅하였다. 상등액을 제거한 후, 4% 탈지 우유 포함된 PBST (Tween 20 0.1%)를 3 ml 넣어 상온에서 2 시간 동안 블로킹하였다. 파아지와 4% 탈지 우유가 포함된 PBS용액을 1:1로 섞어 BSA가 코팅된 면역튜브에 넣고, 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후 BSA가 결합하지 않은 파아지를 포함한 상등액을 IGF-1R이 coating 된 면역튜브에 옮겨 상온에서 2시간 반응시켰다.

PBST로 5회 세척한 후, IGF-1R에 특이적으로 결합한 scFv-phage를 얻기위해 100 mM TEA (Sigma,T-0886) 1 ml로 용출한 후, 1M Tris (pH7.4) 0.5 ml을 넣고 상온에서 5분동안 반응시킨 후 대장균 ER2738 (OD₆₀₀=0.4~0.6)에 감염(infection)시켰다. 37 ℃에서 30분간 배양한 후, SOBAG (2xYT, 1% glucose, 10 mM MgCl₂, carbenicilin) 플레이트에 도말하였다. 2차 패닝은 위와 같은 방법으로 파아지와 반응시키되, PBST의 세척한 횟수를 표 1과 같이 하여 진행하였다.

1-2. 세포 기반 패닝( Cell based panning )

세포 패닝의 경우, IGF-1R을 과발현하는 유방암 세포주(breast cancer cell line)인 MCF-7을 사용하였다. MCF-7 세포를 1 X 106을 tube에 넣고 PBS로 2회 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다. PBS로 2회 세척한 후, 5% FBS가 함유된 PBS로 상온에서 1시간 블로킹하였다. 파아지를 5% FBS가 함유된 PBS에 1:1로 섞어 위의 MCF-7과 상온에서 2시간 반응시켰다. 5% FBS가 함유된 PBST로 10회 세척하고, PBS로 2회 추가 세척하였다. MCF-7 세포는 ER2738(OD₆₀₀=0.4~0.6)에 감염시켰다. 37 ℃에서 30분간 배양한 후, SOBAG (2xYT, 1% glucose, 10 mM MgCl₂, carbenicilin) 플레이트에 도말하였다.

1-3. 패닝 이후의 파아지 회수 파아지 적정

플레이트 상의 콜로니(colony)를 2xYT media (2% glucose, carbenicillin)에 접종 후, OD₆₀₀=0.5가 될 때까지 37 ℃에서 shaking 하며, O/N 배양하였다. 8000 rpm에서 30분간 원심분리 후 상등액에 4% PEG (Polyethylene glycol 8000,Sigma, 25322-68-3), 3% NaCl을 넣고, 얼음 위에서 1 hr 정치시킨 뒤, 8000 rpm, 30분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 응집체(pellet)를 PBS로 현탁하였다. 12000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 각 패닝 이후의 파아지를 적정하였다. 상기 패닝 조건에 따른 파아지 적정 결과는 하기 표 1과 같다.

패닝 조건 및 적정 결과

표적항원	패닝 차수	세척(Wash) 조건	초기 파아지 수	결합 파아지 수
재조합 IGF-1R	1st	PBST : 5회 PBS : 2회	7.0 x 1012	4.9 x 1012
	2nd	PBST : 10회 PBS : 2회	6.0 x 1012	3.3 x 1012
MCF-7	3rd	PBST : 10회 PBS : 2회	5.0 x 1012	1.2 x 1012

1-4. 패닝 후의 타겟 항원 IGF-1R에 대한 phage pool ELISA

상기 패닝을 진행한 후, 생성된 파아지 풀(phage pool)의 타겟 항원 IGF-1R에 결합하는 정도가 증가되었는지 확인하기 위해, Phage pool ELISA를 진행하였다. 면역 배양접시(Nunc-Immuno plate, Nunc, 44-2404-21)에 재조합 IGF-1R 100 ng을 포함한 PBS 100 ㎕을 넣고, 4 ℃에서 O/N 코팅하였다. 3% 탈지 우유가 포함된 PBST를 각 웰당 200 ㎕씩 넣어 상온에서 1시간 배양하여 블로킹하였다. 파아지를 희석하여 각 웰에 로딩 후, 상온에서 2시간 반응시켰다. PBST 300 ㎕로 4회 세척한 후, 항-M13-HRP 결합항체를 넣고 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 4회 세척하였다. TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 ㎕를 넣어 발색한 후, 1N H₂SO₄ 50 ㎕를 넣어 반응을 정지한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 도 1에서 보듯이, 패닝차수가 올라감에 따라 타겟항원 IGF-1R에 결합하는 정도가 증가함을 확인하였다.

1-5. IGF -1R에 결합하는 단일클론 항체 선별

상기 실기예 1-4 및 도 1에서 확인한 바대로, 항원에 특이적으로 친화력을 갖는 상기 생성된 파아지 풀(phage pool)로부터 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 선별하기 위해, 96 deep 웰 플레이트 (Bioneer, 90063)에 400 ㎕의 2xYT (carbenicillin) 배지를 넣고, 각 콜로니를 접종하여 37 ℃에서 shaking 하면서 O/N 배양하였다. 배양액 20 ㎕를 새로운 500 ㎕의 2xYT (carbenicillin) 배지에 접종하여 37 ℃에서 2시간 배양한 후, 1 mM IPTG (Duchefa, 367-93-1)를 첨가하여, 37 ℃에서 O/N 배양하였다. 4 ℃에서 3000 rpm 20 min 원심분리 후, 세포 응집체(cell pellet)를 1 X TES (50 mM Tris, 1mM EDTA, 20% sucrose, pH8.0) 150 ㎕에 현탁한 후, 0.2 X TES 225 ㎕를 넣고, 얼음 상에서 30 min 반응하였다. 4 ℃에서 3000 rpm 20 min 원심분리 후 상등액 (periplasm extract)을 취하여 ELISA에 사용하였다. 면역 배양접시에 재조합 IGF-1R을 웰당 100 ng 넣고, 4 ℃에서 O/N 코팅하였다. 3% 탈지 우유가 포함된 PBST를 각 웰당 200 ㎕씩 넣어 상온에서 1시간 배양하여 블로킹하였다. 상등액을 각 웰당 100 ㎕씩 로딩한 후, 상온에서 2시간 반응시켰다. PBST 300 ㎕로 4회 세척한 후, 항-HA-HRP 결합 항체를 넣고 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 4회 세척 하였다. TMB (Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 ㎕를 넣어 발색한 후, 1N H₂SO₄ 50 ㎕를 넣어 반응을 정지한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 도 2에서 보듯이, IGF-1R에 대해 발색 신호를 보이는 단일클론 항체가 존재함을 확인하였다.

1-6. FACS 를 이용한 타겟항원 IGF-1R에 결합확인

상기 실시예 1-5의 ELISA에서 항원에 결합한 상등액을 이용하여 타겟항원 IGF-1R이 과발현되어있는 MCF-7에 결합시켜, 야생형 IGF-1R에 결합하는지 분석하였다. MCF-7을 시료당 1 X 10⁵개를 준비한 후, PBS를 이용하여 1회 세척한 후, 상등액을 30 ㎕ 넣고, 4 ℃에서 30분간 반응시켜 반응시킨 후, 1% BSA (Gibco, 30063-572)가 포함되어 있는 PBS 용액 200 ㎕로 2회 세척한 후, 항-HA-FITC를 1:700으로 희석하여 100 ㎕를 로딩하여 4 ℃에서 30분간 반응시켰다.

반응 산물을 다시 한번 1% BSA가 포함되어 있는 PBS 용액으로 2회 세척한 후, 200 ㎕의 PBS로 재현탁하여 유세포 분석기 (FACS)를 사용하여 10000개 세포를 분석하였다.

그 결과 도 3에서 보듯이, 다양한 클론이 MCF-7의 surface 상에 결합함을 확인할 수 있었다. 시퀀스 분석 결과 1229 클론이 지속적으로 반복됨을 확인하였고, 이를 MKJP2라고 명명하였다.

실시예 2 : Full IgG 형태로의 클로닝

hIGF-1R에 대한 단일클론 파아지 항체인 MKJP2를 파아지에서 IgG 전체 벡터로 전환하기 위해 중쇄와 경쇄를 각각 유전자 합성하였다 (제노텍) (서열번호 3, 4).

합성된 유전자는 가변영역 앞뒤에 삽입한 NheⅠ과 BstEⅡ 제한효소 서열을 사용하여 절단하였다. 상기 제한효소 절단 결과 획득한 중쇄 가변영역 유전자를 각각 DNA-겔 추출 키트 (Qiagen)로 정제한 후, 이를 E-A12H-ID 벡터에 각각 라이게이션(ligation)을 수행하였다. 벡터 1㎕ (10 ng), 중쇄 가변영역 (50~100 ng) 15㎕, 10X Buffer 2㎕, 라이게이즈 (1U/㎕) 1 ㎕, 및 증류수를 혼합하여 실온에서 1-2시간 방치하여 상기 벡터와 연결하였다. 상기 벡터를 형질전환용 세포 (Top10)와 함께 얼음에 30분간 방치한 후, 42℃에서 90초간 열충격을 주어 형질도입하였다. 다시 얼음에 5분간 방치한 후, LB 배지 1 ㎖을 주입하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. LB Kan 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 LB Kan 액체배지 3 ㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA prep 키트(Qiagen)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 또한, 경쇄는 pEA12L-ID 벡터를 사용하여 상기와 같은 방법으로 DNA를 추출하였다.

상기 수득한 DNA의 E1a_F 프라이머(서열번호 5), IR2_R 프라이머(서열번호 6)를 이용한 염기서열 분석을 의뢰하였다(마크로젠). 그 결과, 전체 IgG로 전환한 다양한 IGF-1R에 대한 각각 클론의 중쇄와 경쇄의 서열이 파아지 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다. 상기 염기서열 분석된 중쇄(heavy chain), 경쇄(light chain)의 아미노산 서열(서열번호 1, 2)과 CDR(Complementarity determining regions)은 도 4 및 하기 표2와 같았다 (표 2).

MKJP2의 중쇄 및 경쇄의 CDR 아미노산 서열

	CDR1	CDR2	CDR3
MKJP2 중쇄	GYAMS (서열번호 7)	AISSDGGST (서열번호 8)	RDPWFSRWTAFDY (서열번호 9)
MKJP2 경쇄	SGSSSNIGNNAVN (서열번호 10)	SNSK (서열번호 11)	GTWDYSLSG (서열번호 12)

실시예 3: 항체의 일시적 발현 ( transient gene expression )

상기 실시예 2에서 클로닝된 전체 IgG 중쇄 DNA와 경쇄 DNA로부터 항체 유전자의 일시적 발현을 수행하였다. CHO-S 세포를 CD-CHO (Gibco, 10743) 배지에 1.5Ｘ10⁶ cells/ml로 농도를 맞춘후, 8% CO₂, 37 ℃에서 1일 동안 배양하였다. DNA 형질주입 당일 2.5~3Ｘ10⁶ cells/ml로 자란 세포를 1% DMSO가 포함되어 있는 CD-CHO 배지를 이용하여 2.1Ｘ10⁶ cells/ml의 농도로 준비한 후, 8% CO₂, 37 ℃에서 3 hr 배양한다. 3000 rpm 에서 15 min 원심분리 후, 상등액을 제거한 후, 2.5% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에 재현탁하였다. 중쇄와 경쇄를 발현하는 DNA를 각각 배지 ml당 1 ㎍씩 Opti-MEM 배지에 희석하고, PEI (Polysciences, 23966, stock 농도 : 1 mg/ml)는 배양 배지 ml당 8 ㎍ 희석하였다. DNA 및 PEI 혼합물을 섞어 상온에서 10 min 동안 정치한 후 세포가 포함된 플라스크에 넣은 후, 5% CO₂, 37 ℃, 100 rpm으로 4 hr 배양한 후, 배양 볼륨의 동일한 볼륨의 CD-CHO 배지를 넣어준 후, 8% CO₂, 37 ℃, 110 rpm 에서 4일 동안 배양하였다.

실시예 4 : 항체의 분리 정제

평형화 완충액(50 mM Tris-HCl, pH7.4, 100 mM NaCl)을 재조합 단백질-A 세파로즈 컬럼(Histrap rProteinA FF, 5 ml, GE healthcare)에 통과시켜 평형시킨 이후, 실시예 3의 준비된 상등액을 컬럼에 통과하여 발현된 항체가 컬럼에 결합하도록 하였다. 이 후, 0.1M Na-citrate (pH 3.0), 100 mM NaCl 용액으로 용출시킨 후, 1M Tris-HCl (pH 9.0)을 이용하여 중화시켜 최종 pH가 7.2 가 되게 하였다. 완충액을 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 교환하기 위해 투석하였다. 정제된 항체를 Bis-Tris 4-12% 농도구배 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (NuPAGE gel, Invitrogen)상에서 환원 (Reduced) 및 비환원 (Non-Reduced)상태에서 전기영동하여 purity 및 size를 확인 한 결과 비환원 상태에서 150 kDa, 비환원 상태에서 50 kDa의 중쇄와 25 kDa의 경쇄를 확인하였다 (도 5).

실시예 5: 항체의 항원 특이성 분석

IGF-1 수용체의 유사 수용체로서 IGF-Ⅱ 수용체(IGF-ⅡR)와 인슐린 수용체(Insulin receptor, IR)가 있다. 특히, IR의 경우, IGF-1R과 70% 정도의 유사율을 가지기 때문에, IGF-1R을 목적으로 하는 항체를 개발할 때, IR 및 IGF-ⅡR에도 결합하는지를 분석하는 것이 필수적이다. 이를 분석하기 위해, 면역 배양접시(Nunc-Immuno plate, Nunc, 44-2404-21)에 IGF-1R (R&D system, 391-GR), IGF-ⅡR (R&D system, 2447-GR), IR (R&D system, 1544-IR)을 웰당 100 ng 넣고, 4 ℃에서 O/N 코팅하였다. 5% BSA가 포함된 PBST를 각 웰당 300 ㎕씩 넣어 상온에서 1시간 정치하여 블로킹하였다.

MKJP2 및 음성대조군으로써 Isotype control (Sigma, I5029) 및 양성대조군인 IMC-A12를 PBS에 4 ~ 0.04 ㎍/ml로 희석한 이 후, 100 ㎕씩 각 웰에 로딩하여 상온에서 1 hr 배양한다. PBST 300 ㎕로 3회 각 웰을 세척한 후, 항-인간-Fc HRP 결합항체(Pierce. 31423)를 1:5000으로 5% BSA가 포함된 PBST에 희석한 후, 100 ㎕씩 로딩하여 37 ℃에서 1 hr 배양한다. PBST 300 ㎕로 3회 세척 후, TMB 용액(sigma, T-0440)을 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 반응시킨 후, 1N 황산(sulfuric acid) 용액 (SAMCHUN 7664-93-9)를 50 ㎕씩 넣어 반응을 종료시켜 분석하였다.

그 결과 도 6과 같이 본 발명의 IGF-1R 단일클론항체인 MKJP2는 양성 대조군인 IMC-A12과 동일하게 IGF-1R에만 특이적으로 결합하고, 다른 유사항원인 IGF-ⅡR 및 IR에는 결합하지 않음을 확인하였다.

실시예 6: 항체의 항원 친화도 분석

MKJP2 항체의 IGF-1R에 대한 친화도(Affinity)를 분석하기 위하여 SPR (Surface Plasmon Resonance) 기술을 활용한 비아코아 기기(BiaCore T200)를 사용하였다. 분석에는 센서칩 (Sensor chip CM5, BIACORE, BR-1005-30)에 항-인간 IgG Fc 항체를 고정화시킨 후 MKJP2 항체를 포획하여 분석하는 포획(capture) 방법을 적용하였다.

우선, CM5 칩을 항-인간 IgG Fc 항체로 고정화시킨 후, MKJP2 항체를 고정화된 항-인간 IgG Fc 항체에 결합시켰다. 이후, IGF-1R을 최고 농도 12.5nM에서 최저 농도 0.78nM까지 총 5개 농도로 희석하고, 희석된 IGF-1R 단백질을 duplicate로 주입하여 분석을 진행하였다. 비아코아 기기를 이용하여 항원-항체간의 결합 및 해리 반응을 유도함으로써 MKJP2 항체와 IGF-1R간의 kinetics를 분석하였고, 이를 통해 평형 해리 상수값(dissociation constant, K_D) 값을 확인하였다. 이에 대한, 결과를 도 7에 나타내었다.

친화도 분석은 1) 센서칩에 항-인간 IgG Fc 항체를 고정하는 고정화 단계, 2) 고정화된 센서칩에 MKJP2 항체를 포획시키는 포획 단계, 3) 포획된 MKJP2 항체에 서로 다른 농도의 IGF-1R를 흘려주어 친화도를 분석하는 단계로 크게 구분하여 진행하였다. 각 시험단계에 대한 구체적인 시험 조건은 다음과 같다.

1) 센서칩 고정화 단계

MKJP2 항체의 친화도는 일반적인 항체에 적용되는 포획 방식 중 하나인 항-인간 IgG Fc 항체 포획 방식을 적용하여 분석하였다. 이를 위해, Human antibody capture kit (GE, BR-1008-39)를 사용하였다. 우선, capture kit 내에 포함되어 있는 항-인간 IgG Fc 항체 stock을 10mM sodium acetate (pH5.0)로 1:20으로 희석하여 센서칩 고정화에 사용하였다. 센서칩으로는 CM5 칩(BR-1005-30)을 사용하였으며, CM5 칩에 항-인간 IgG Fc 항체를 고정화하기 위하여 amine coupling kit(BR-1000-50)를 사용하였다. Target RU는 11,000 RU로 진행하였다.

2) MKJP2 항체 포획 단계

다음 단계는 항-인간 IgG Fc 항체가 고정화되어 있는 센서칩에 MKJP2 항체를 흘려주어 포획시키는 단계로, 정제된 MKJP2 항체를 분석용 완충액인 HBS-EP 완충액(BR-1001-88)으로 희석 후 유속 3㎕/min으로 200초간 흘려주어 포획시켰다. 포획된 MKJP2 항체의 경우 센서칩에 직접 고정화한 MKJP2 항체 대비 일정한 방향성을 가지고 있다는 장점을 지니고 있다.

3) 고정화된 항-인간 Fc를 이용하여 MKJP2를 결합시키는 단계

IGF-1R과 MKJP2 항체간 평형 해리 상수값을 확인하기 위하여 IGF-1R을 서로 다른 5개의 농도로 희석하여 분석에 사용하였다. 본 분석에 사용된 IGF-1R (R&D systems, 391-GR-050) 단백질은 HBS-EP 완충액으로 희석하여 0.78 nM, 1.56 nM, 3.13 nM, 6.25 nM, 12.5 nM 5개 농도로 준비하였으며, duplicate로 주입하여 분석을 진행하였다. 분석 시 유속은 3㎕/min을 유지하였으며, 결합반응(association) 1500초, 해리반응(dissociation) 3000초의 조건으로 분석이 진행되었다. 상기 다양한 농도의 항체를 코팅된 항원 표면상에 주입하고 항원-항체 결합 및 해리를 실시간으로 모니터하였다. MKJP2 항체 분석 결과 항체의 전형적인 affinity sensogram을 얻었으며(도 7), BiaCore T200 Evaluation software (Version 1.0)를 사용하여 속도론적 분석을 수행하여 해리 상수값(K_D)을 계산하였고, 이에 대한 실험 결과를 도 7 및 하기 표 3에 나타내었다.

인간 IGF-1R 항체	Ka	Kd	KD(M)	Rmax
MKJP2	1.40x104	2.42x10-5	1.73x10-10	32.09

상기 해리상수 분석 결과 MKJP2 항체의 평형 해리 상수값은 1.73 x 10^-10M 수준인 것으로 확인되었다. 상기 결과를 통하여 본 발명의 IGF-1R에 대한 인간 단일클론항체인 MKJP2는 인간 IGF-1R에 대한 해리 상수값이 약 0.17 nM 수준으로 매우 우수한 결합력을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 7: 암세포인 MCF -7에서의 증식 억제 효과 분석

IGF-1R이 과발현되어 있는 인간 유방암 세포인 MCF-7에 IGF-1과 본 발명의 항체인 MKJP2를 동시에 처리함으로써, IGF-1에 의한 MCF-7의 증식이 억제되는지 여부를 분석하였다.

10% FBS가 포함되어있는 DMEM 배지 내에서 증식시킨 MCF-7을 같은 배지를 이용하여 100 ㎕ 배지당 0.5Ｘ 10⁴의 세포가 되도록 희석한 후, 96 웰에 100 ㎕씩 분주한 후, 5% CO₂, 37 ℃에 24 시간 배양하여 안정화시켰다. 이후, 상등액을 제거하고 혈청이 포함되지 않은 DMEM을 100 ㎕씩 분주하여 24 시간 배양하여 starvation 상태를 유도하였다. 무혈청 배지에 IGF-1의 경우 20 nM (1번 시료), MKJP2의 경우 최고농도 200 nM에서 최저농도 0.0032 nM로 희석한 후 (2번 시료), 1번 및 2번 시료를 각각 100 ㎕씩 로딩하여, 각 웰당 IGF-1의 최종농도가 10 nM, MKJP2의 경우 최고농도 100 nM에서 최저농도 0.0016 nM 이 되도록 하였다. 5% CO₂, 37 ℃에 72 hr 배양한 후, WST-8 (Dojindo, CK04)을 웰당 20 ㎕씩 로딩하여 4 hr 배양한 후 O.D 450 nm에서 분석하였다.

그 결과 도 8에서 보듯이, MKJP2의 농도 의존적으로, IGF-1에 의한 세포증식이 저해됨을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 항-IGF-1R 항체인 MKJP2를 이용하는 경우, IGF-1R이 과발현된 암세포의 성장을 억제시킬 수 있음을 직접적으로 뒷받침하는 것으로, 암치료용 항체로 이용할 수 있음을 시사한다.

실시예 8: MKJP2 에 의한 IGF-1R 신호전달경로 억제

문헌보고에 따르면, IGF-1R에 IGF-1이 결합하면, IGF-1R의 Kinase 도메인 내의 Tyr1131, Tyr1135 및 Tyr1136 부위에 인산화가 유발된 후, adaptor 단백질인 IRS-1/2, Shc의 인산화가 유발된다. 이후 하위 신호전달기작인 AKT 및 MAPK의 인산화에 의한 활성이 유발되면서 결과적으로 세포의 분화, 단백질 합성 및 세포의 증식이 촉진된다. 이러한 IGF-1에 의한 세포증식 신호 전달기작이 MKJP2의 처리에 의해서 억제되는지 여부를 알아보기 위해 다음과 같은 분석을 하였다.

1) IGF-1R을 통한 신호전달 저해 여부를 확인하기 위한 MKJP2 및 대조항체 처리

6 웰 플레이트 상에 MCF-7을 6 X 10⁵ 을 접종한 후, 5% CO₂, 37 ℃에 24 hr 배양하여 세포를 안정화시켰다. Starvation 상태를 유도하기 위해, 상등액을 제거한 후, PBS 5 ml로 2회, 무혈청(serum free) DMEM 5 ml로 1회 세척한 후, 무혈청(Serum free) DMEM 2 ml을 넣어 5% CO₂, 37 ℃에 24 hr 배양하였다. 이 후, 표 4와 같이 MKJP2 100 nM, 양성대조군 IMC-A12 100 nM 및 음성대조군 Isotype control 항체를 100 nM 4 hr 전처리한 후, IGF-1 10 nM을 각 웰에 로딩하여 15 min 처리하였다. 이때, IGF-1 및 항체를 처리하지 않은 군과 IGF-1 10 nM을 단독처리한 군을 포함하여 IGF-1에 의한 신호전달 활성을 확인하였다.

MKJP2에 의한 IGF-1R 신호전달경로 억제능을 확인하기 위한 조건

웰 number	IGF-1 처리 여부 및 시간	항체 처리 및 시간
1	-	-
2	IGF-1 10 nM, 15 min	-
3	IGF-1 10 nM, 15 min	MKJP2 100 nM, 4 hr
4	IGF-1 10 nM, 15 min	IMC-A12 100 nM, 4 hr
5	IGF-1 10 nM, 15 min	Isotype control 100 nM, 4 hr

2) 웨스턴 블랏팅을 위한 세포수득 및 용혈 방법

표 4의 정보와 동일하게 IGF-1 및 항체를 처리한 후, 상등액을 제거하였다. PBS 2 ml을 이용하여 1회 세척한 후, 각 웰당 PBS 2 ml을 다시 첨가하여 Cell lifter (Nunc, 179693)를 이용하여 세포를 수득하였다. 파이펫을 이용하여 1.5 ml E.P 튜브에 넣은 후, 3000 rpm에서 10 min 원심 분리하여 상등액을 제거하였다. 1 tube당 2XSDS sample buffer (120mM Tris-HCl(pH 6.8), 20% 글리세롤, 4% SDS, 28.8 mM 2-머캅토에탄올, 0.01% bromophenol blue)를 100 ㎕ 넣어, 파이펫팅하여 세포를 용혈시킨 후, 95 ℃ 이상에서 10 min동안 열을 가하였다.

3) 웨스턴 블랏팅 방법

NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Novex®, NP0321)에 상기 2)에서 준비한 각 시료을 20 ㎕씩 로딩한 후, 전기영동으로 분리하였다. 젤을 iblot® Geltransfer stacks PVDF mini (IB401002)를 이용하여 멤브레인에 이동시킨 다음, 멤브레인을 5% BSA가 포함되어 있는 PBST (Tween 20 0.1%) 10 ml으로 상온에서 1 hr shaking 하면서 배양하여 블로킹하였다. 이후 항-p-IGF-1R beta (Cell signaling, #3024), anti-T-IGF-1R(T-20)(Santacruz sc-713), 항-p-ERK (Cell signaling, #9021), 항-T-ERK (Cell signaling, #9102), 항-p-AKT (Ser473)(Cell signaling, #9101), 항-T-AKT (Cell signaling, #9272), 또는 항-actin (Santacruz, sc-9271)을 각각 5% BSA가 포함된 PBST (Tween 20, 0.1%)에 1:1000으로 희석하여, 4 ℃에서 shaking하면서 O/N 반응시켰다. PBST를 이용하여 10 min씩 3번 세척한 후, 2차 항체인 항-토끼 HRP 결합항체(Cell signaling, #7074)를 1:5000으로 5% BSA가 포함된 PBST 용액에 희석하여 상온에서 1.5 hr 결합시켰다. 다시 멤브레인을 PBST를 이용하여 10 min, 3회 세척하였다. 각 멤브레인에 ECL 용액(Animal Genetics Inc. LR01-01)을 넣어 1 min 동안 반응시킨 후, Image Quant Las 4000을 이용하여 분석하였다.

그 결과 도 9에서 보듯이, IGF-1 10 nM을 처리했을 경우, IGF-1R, ERK, AKT에 인산화를 유발하였으며, MKJP2를 100 nM을 처리하였을 경우, 이러한 IGF-1R, ERK, AKT에 인산화가 억제됨을 보여, MKJP2가 IGF-1R을 통한 신호전달 기작을 억제함을 증명하였다. 대조항체인 IMC-A12의 경우, T-IGF-1R의 발현양을 감소시키지만, MKJP2의 경우 이와는 달리 T-IGF-1R의 수준에는 영향이 없음을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 항체가 IGF-1R에 결합하여 IGF-1에 의한 IGF-1R의 인산화를 억제하는 것을 통하여, 하위 신호전달기작인 AKT 및 MAPK의 활성을 막아 결과적으로 세포의 분화, 단백질 합성 및 세포의 증식을 억제하는 것을 보여주며, 이를 통해 암 또는 자가면역질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 9: 인간 종양 성장에 대한 항 IGF -1R 항체의 효과와 분석

7주령 암컷 누드마우스(찰스리버 JAPAN 생산)를 대상으로 하여 인간 유방암 세포주 DMA-MB-231 세포주와 마트리겔(Matrigel, BD Bioscience, 356237)을 1:1 (v/v)로 혼합하고, 상기 혼합세포를 1.0 x 10⁷ 세포/200 ㎕/마우스의 농도로 상기 누드 마우스의 등부위에 피하이식하였다. 이식한 종양의 크기가 276.0 ± 11.3 mm³(평균 ± 표준오차)이 되는 시점(약 종양 이식 후 9일차)에 대조군(Vehicle), 항암항체인 A12 (10 mg/kg), MKJP2 (5 mg/kg), MKJP2 (10 mg/kg)를 각각 실험 동물의 정맥 내로 투여하기 시작하였다. 이후 각각 4일 1회 간격으로 총 8회 투여하였다. 종양의 크기는 주 2회 측정하였으며, 대조군, A12 또는 MKJP2가 각각 투여된 누드마우스에서 발생된 종양크기의 변화를 시간 경과에 따라 측정한 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에서 볼 수 있듯이, 10 mg/kg MKJP2를 투여한 실험군은 측정 최종일 종양크기가 325.1±69.4 mm³이였다. MKJP2와 동일 항원을 인지하는 A12를 10 mg/kg로 투여한 실험군의 종양크기는 831.5±240.0 mm³ 또한 Vehicle를 투여한 대조군의 종양크기는 688.9±91.7 mm³이었다. 상기 A12 또는 대조군의 측정 최종일의 종양크기는 10 mg/kg MKJP2 투여군 대비 약 2.5배 또는 약 2.1배 차이가 있었다. 또한, A12 투여량의 50%에 불과한 MKJP2를 투여한 5 mg/kg MKJP2 투여군은 A12 투여군보다도 종양 성장 억제 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 항체가 적은 용량에도 불구하고 기존 동일 항원에 대한 항체보다 더 뛰어난 효과를 가지는 것을 나타내는 결과이다.

즉, MKJP2 투여군를 투여한 실험군은 동량 투여한 동일 항원을 인지하는 A12 투여군과 종양크기의 차이가 2.5배가 나고, A12 투여군의 절반에 해당하는 양을 투여했을 때에도 A12 투여군보다 종양 성장 억제 효과가 더 우수한 것을 확인하였다. 더욱이, 10 mg/kg MKJP2 투여군은 투여개시 후, 아예 종양성장이 관찰되지 않았으나, A12군은 Vehicle 투여군과 유사한 경향으로 종양이 성장하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 항 IGF-1R 항체 MKJP2는 동일항원을 인지하는 기존 항체에 비해 항암효과가 현저히 우수함을 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 항 IGF-1R 항체(MKJP2)를 처리한 군에서는 종양 크기가 증가하는 대조군에 비하여 종양의 크기가 줄거나 더이상 성장시키지 않는 결과를 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 항체가 항암 치료에 있어 유용하게 이용될 수 있음을 시사하는 결과이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> A monoclonal antibody for IGF-1R and pharmaceutical composition comprising the same <130> PA131331KR <150> KR10-2013-0058959 <151> 2013-05-24 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 451 <212> PRT <213> MKJP2 heavy chain peptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Trp Phe Ser Arg Trp Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> MKJP2 light chain peptide <400> 2 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 3 <211> 1356 <212> DNA <213> MKJP2 heavy chain nucleotide <400> 3 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggcacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttctg atggtggtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcct 300 tggttttcgc ggtggacggc gttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgtcc 360 tccgcctcca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc cctcctccaa gtccacctcc 420 ggcggcaccg ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480 tcctggaact ccggcgccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagtcc 540 tccggcctgt actccctgtc ctccgtcgtg accgtgccct cctcctccct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgc cctccctgcc ccgcccccga gctgctgggc 720 ggcccctccg tgttcctgtt ccctcctaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 780 cccgaggtga cttgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accccgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agccccggga ggagcagtac 900 aactccacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcccg cccccatcga gaagaccatc 1020 tccaaggcca agggccagcc ccgggagccc caggtgtaca ccctgccccc ctcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta cccctccgac 1140 atcgccgtgg agtgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtcccgg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgtccct gtcccccggc aagtaa 1356 <210> 4 <211> 651 <212> DNA <213> MKJP2 light chain nucleotide <400> 4 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc aataatgctg tcaactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tctaatagta agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt acttgggatt atagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta ggacagccca aggccgcccc ctccgtgacc 360 ctgttccccc cctcctccga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420 tccgacttct accccggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ctgactcctc ccccgtgaag 480 gccggcgtgg agaccaccac cccctccaag cagtccaaca acaagtacgc cgcctcctcc 540 tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctactcctg ccaggtgacc 600 cacgagggct ccaccgtgga gaagaccgtg gcccccgccg agtgctcctg a 651 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E1a-F primer sequence <400> 5 caggtgtcgt gagagctctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IR2-R primer sequence <400> 6 agacccctag gaatgctcgt 20 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> MKJP2 heavy chain CDR1 <400> 7 Gly Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> MKJP2 heavy chain CDR2 <400> 8 Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> MKJP2 heavy chain CDR3 <400> 9 Arg Asp Pro Trp Phe Ser Arg Trp Thr Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> MKJP2 light chain CDR1 <400> 10 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn 1 5 10 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> MKJP2 light chain CDR2 <400> 11 Ser Asn Ser Lys 1 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> MKJP2 light chain CDR3 <400> 12 Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 13 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain constant region of IgG1 <400> 13 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 14 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain constant region of IgG2 <400> 14 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 15 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain constant region of IgG3 <400> 15 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 16 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain constant region of IgG4 <400> 16 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 17 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a constant region of lamda light chain <400> 17 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105

Claims (16)

1. 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 10으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, IGF-1R(insulin-like growth factor 1 receptor)에 특이적인 인간 단일클론항체.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체는 IGF-1(insulin-like growth factor 1)에 의한 IGF-1R의 활성화를 저해하는 것인, 인간 단일클론항체.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 인간 단일클론항체.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgT, IgY 및 단일쇄 항체를 포함하는 전장항체와 Fab', F(ab')₂, Fab, Fv, scFv (single-chain variable fragment) 및 rIgG를 포함하는 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 형태인 것인, 인간 단일클론항체.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체는 scFv 형태인 것인, 인간 단일클론항체.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체는 IgG 형태인 것인, 인간 단일클론항체.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체는 IGF-1R에 대한 평형 해리 상수값(K_D value)이 1.0 x 10^-10 M 내지 1.0 x 10^-9M인 친화력을 가지는 것인, 인간 단일클론항체.
   
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
   
9. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
   
10. 제9항의 발현 벡터가 도입된 형질전환체.
    
11. 제8항의 발현 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는, IGF-1R에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체의 제조 방법.
    
12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 인간 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
13. 제12항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
    
14. 제12항에 있어서, 상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 및 다발성 골수종 혈액암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
    
15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 인간 단일클론항체를 포함하는, 암 진단용 조성물.
    
16. 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 인간 단일클론항체를 처리하여, IGF-1R 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 IGF-1R 단백질 수준과 비교하여 단백질 수준이 증가하면 암으로 판단하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법.
    

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