KR20140085790A

KR20140085790A - Ｎｏｔｃｈ 신호전달을 효과적으로 저해하는 ｄｌｌ４에 특이적인 신규한 인간 단일클론항체

Info

Publication number: KR20140085790A
Application number: KR1020120155308A
Authority: KR
Inventors: 이동헌; 최유빈; 김동인; 강경재; 김은아; 문경덕; 박상경; 장명희; 박재은; 유석호; 박범찬; 김혜난; 박영우
Original assignee: 한화케미칼 주식회사
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2014-07-08

Abstract

본 발명은 델타 유사 리간드 4(DLL4)에 특이적으로 결합하는 신규한 인간 단일클론항체에 관한 것으로, 구체적으로는 인간 DLL4에 특이적으로 결합하여 DLL4와 노치(Notch) 수용체 간의 결합을 효과적으로 저해하는 인간 단일클론항체, 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 인간 단일클론항체의 제조방법, 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 인간단일클론항체를 이용한 암의 치료 방법, 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물, 상기 인간 단일클론항체를 이용하여 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법, 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 상기 인간 단일클론항체를 이용한 자가면역질환의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

ＮＯＴＣＨ 신호전달을 효과적으로 저해하는 ＤＬＬ４에 특이적인 신규한 인간 단일클론항체{Novel human DLL4 monoclonal antibody that potently inhibits the Notch signaling pathway}

노치(Notch) 신호전달은 척추 동물에서 무척추 동물에 이르기까지 진화론적으로 잘 보존되어 있으며 발생 초기에 세포의 운명을 결정짓는데 매우 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다. 노치 신호전달은 신경, 안구, 림프, 근육, 혈구 등의 분화과정을 조절하는 주요 인자로 알려져 있으며, 또한 혈관 발생에도 관여하고 있다. 포유류에서는 4개의 노치 수용체를 가지고 있으며(Notch 1, 2, 3 및 4), 각각의 노치 수용체는 300-350kDa 크기의 단백질로 합성되며 골지체에서 퓨린-유사 전환효소(furin-like convertase)에 의해 S1 자리가 잘리면서 세포 표면에서 이형이합체(heterodimer)를 형성한다. 또한, 포유류에는 4개의 노치 리간드(Jagged-1/2 및 델타-유사 리간드(DLL) 1/3/4)가 확인되었다.

노치 수용체와 리간드들은 모두 막 단백질로서 두 개의 근접한 세포 간에 리간드와 수용체인 노치가 결합되어 노치 신호전달이 일어난다. 세포끼리 접촉할 때 이들의 세포 바깥부분(extracellular domain)이 직접적으로 결합해서 신호 전달이 이루어지며 리간드와 수용체의 조합에 따라 다른 세포반응이 나타난다. 노치 신호전달에서 리간드와 노치 수용체가 서로 결합하면 노치 수용체의 구조적 변화를 일으켜 이후 노치 수용체는 두 번의 순차적인 단백질 가수분해를 받게 된다. 첫 번째 가수분해는 금속 단백질분해효소(metalloprotease)인 ADAM10/17(a disintegrin and metalloprotease 10/17)/TACE(TNF-α converting enzyme)에 의해 세포 바깥부분(S2 자리)이 잘리면서 시작된다. S2 자리가 잘리면 노치 수용체의 막관통영역(transmembrane domain)의 S3 자리가 가수분해된다. 두 번째 가수분해는 다섯개의 소단위체를 가지고 있는 감마-세크레타제(γ-secretase) 복합체가 담당한다. 감마-세크레타제 복합체는 프레시닐린 1(presenilin 1), 프레시닐린 2(presenilin 2), 니카스트린(nicastrin), Pen-2, 그리고 Aph1로 구성되어 있다. 두 번의 가수분해 후 노치 수용체는 세포내 부분(intracellular domain, NICD)이 분리되어 핵 안으로 이동한다. 핵 안에서 NICD는 전사 억제인자인 CSL(CBF-1/Suppressor of Hairless/Lag-1)과 결합해 이전에 CSL과 결합해있던 보조 억제인자(corepressor, CoR)를 대체하게 된다. NICD/CSL복합체는 보조 활성인자(co-activator, CoA)인 MAML(mastermind-like)나 p300을 모집해 cyclin D1, p21, NF-κB , c-Myc, pre-Ta (pre-T cell receptor alpha chain), GATA3 , NRARP, 그리고 Deltex1와 같은 노치 타겟 유전자들을 활성화시켜 발현을 유도한다.

이와 같은 노치 신호전달이 활성화되면 여러 암 모델에서 종양 형성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 활성 노치인 NICD를 쥐의 조혈세포에 발현시키는 경우 T-cell leukemia/lymphomas를 일으키는 것으로 알려져 있고, T-ALL(T-cell acute lymphoblastic leukemia)에선 활성화된 노치 1이 50% 정도 발견된바 있다(Weng AP et al., Science 2004;306:71-269). 또한, 유방암의 경우에도 MMTV(mouse mammary tumor virus)가 삽입된 쥐(Czech II)에서 활성화된 노치 4 수용체가 과발현된 것이 발견되었고 이들 쥐에서 유선종양이 발생한 것이 보고되었다(Gallahan D et al., Journal of Virology 1987;61:66-74). 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암과 같은 다양한 암에서 노치 수용체와 리간드 그리고 노치 신호 전달의 타겟이 활성화되어 있는 것이 보고되어 있고(Miele L et al., Clin Cancer Res 2006;12(4):1074-79), 노치 1 수용체가 유방암 환자에 있어 안좋은 예후에 관련되어 있고(Reedijk M et al., Cancer Reserach 2005;65:8530-7), 전립선암에서는 암 전이와 관련되어 있는 것으로 알려져 있는 것으로 알려져 있다(Santagata S et al., Cancer Research 2004;64:6854-7).

델타 유사(delta like) 4(Dl4) 또는 델타 유사 리간드 4(Delta Like Ligand 4, DLL4)(이하에서는 "DLL4")는 혈관 내피 세포에서 과발현되어 있는 노치(Notch)단백질을 수용체로 하는 리간드의 델타 부류의 하나로서, 혈관 신생을 조절하는 주요 요소로 알려져 있다. DLL4는 특히, 혈관 내피에 과발현되는 노치 1 또는 노치 4 수용체에 결합을 한다. DLL4는 정상적인 혈관에서도 발현되나, 암 혈관에서는 매우 과발현되어 있는 것으로 알려져있다(Reinacher-Schick A et al., Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2008;5(5):250-67). 혈관신생(angiogenesis)은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 기작을 의미하며, 특히 종양에 있어서 혈관신생은 암 조직의 저산소(hypoxia) 지역에서 산소와 영양분을 공급받기 위하여 VEGF와 같은 혈관 신생인자에 의하여 일어난다. 종양에 있어서 혈관신생은 종양의 성장뿐만 아니라 전이(metastasis)에 있어서도 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 종양에서 DLL4에 의한 노치 신호전달을 차단하게 되면 혈관 신생(angiogenesis)의 조절이 잘 이루어지지 않게 되므로 암의 성장을 억제할 수 있다. 또한, DLL4에 의한 노치 신호전달을 억제시키는 경우, 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg)의 수를 증가시켜 자가면역질환을 치료할 수 있는 것으로 알려져 있다(미국공개특허 제2011-0189200호). 이러한 이유로 DLL4는 암 또는 자가면역질환의 치료에 있어서 새로운 표적이 되고 있다.

이에, DLL4를 표적으로 하여 암 또는 자가면역질환을 치료하기 위하여 다양한 부분에서 노치 신호전달을 억제하기 위한 연구가 이루어졌다. 그 예로 노치/리간드 결합을 방해하는 수용체 디코이(decoy), 노치 신호전달에서 노치 단백질을 자르는데 관여하는 감마-세크레타제 억제제, 노치 신호전달에 관여하는 단백질 또는 노치 타겟 유전자를 억제하기 위한 miRNA 또는 siRNA와 같은 것이 있다. 상기와 같은 다양한 노치 신호전달을 억제하기 위한 방법 중에서도 노치 신호전달의 초기에 작용할 수 있는 노치에 대한 리간드에 결합하는 단일클론항체에 대한 연구의 중요성이 부각되어 왔으며, 특히 전임상 및 임상 연구를 위해 마우스 및 인간 DLL4에 특이적으로 교차결합이 가능하고, DLL4와 노치와의 상호작용을 효과적으로 저해하면서, 면역원성의 위험성을 최소화할 수 있는 인간 단일클론항체의 개발이 요구되어 왔다.

이에 본 발명자들은 마우스 및 인간 DLL4에 특이적으로 교차 결합이 가능하면서 DLL4와 노치 수용체와의 상호작용을 효과적으로 저해하고 면역원성의 위험성을 최소화할 수 있는 인간 단일클론항체를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 인간 항체 라이브러리로부터 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래인 인간 및 마우스 DLL4에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체를 새롭게 제작하였고, DLL4와 노치 단백질 사이의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 델타 유사 리간드 4(DLL4)에 특이적으로 결합하는 신규한 인간 단일클론항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 이용하여, 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 델타 유사 리간드 4(DLL4) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 단일클론항체를 이용하여 자가면역질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 델타 유사 리간드 4(DLL4)에 특이적으로 결합하는 신규한 인간 단일클론항체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab' F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

본 발명에서 용어, "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, 이는 3가지 이상의 잠재적인 장점을 가질 수 있다. 먼저, 이는 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다. 둘째로, 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는 이점이 있다. 셋째로, 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 이점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 인간 단일클론항체들은 DLL4에 대해서 강한 친화력을 나타내며, DLL4를 발현하고 있는 세포(예-암세포)가 노치 1 또는 노치 4 수용체에 결합하는 것을 효과적으로 저해할 뿐 아니라, 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로, 암과 같은 질병의 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "DLL4에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체"는 DLL4에 결합하여 DLL4의 생물학적 활성의 억제를 초래할 수 있는 항체를 의미하며, 본 발명에서 항 DLL4 항체와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 DLL4에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체는 DLL4에 특이적으로 결합하여 DLL4와 노치 수용체 간의 결합을 저해하는 단일클론항체라면 제한없이 포함한다. 상기 단일클론항체의 형태는 상기에서 설명한 바와 같은 전체 항체 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 인간 단일클론항체는 인간 DLL4 뿐만 아니라 마우스 DLL4에 특이적으로 결합하면서 DLL4와 노치 단백질 간의 상호작용을 저해시킬 수 있다. 이러한 단일클론항체는 인간 및 마우스에 동시에 결합 가능, 즉 교차 반응성이 있어 마우스에서의 전임상 연구가 가능한 이점을 지닌다.

바람직하게는, 상기 인간 단일클론항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 인간 단일클론항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 5로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 인간 단일클론항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 5로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 인간 단일클론항체를 mh2F로 명명하였다. 상기 mh2F에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열에 대하여 도 1에 나타내었다.

또한, 본 발명의 인간 단일클론항체가 불변 영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변 영역을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그 예로, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 불변 영역으로부터 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다.

본 발명에서 용어, "하이브리드(hybrid)"란 단쇄 면역 글로불린 중쇄 불변 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하며, 그 예로 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다.

한편, IgG의 아형인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중쇄 불변영역의 조합 또는 혼성화도 가능하다. 상기 조합 및 혼성화에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 IgG1 중쇄 불변영역은 서열번호 9로 기재된 IgG1 중쇄 불변영역, IgG2 중쇄 불변영역은 서열번호 10으로 기재된 IgG2 중쇄 불변영역, IgG3 중쇄 불변영역은 서열번호 11로 기재된 IgG3 중쇄 불변영역, IgG4 중쇄 불변영역은 서열번호 12로 기재된 IgG4 중쇄 불변영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 상기 DLL4에 특이적인 인간 단일클론항체는 경쇄 불변영역이 람다(λ) 또는 카파(κ) 경쇄 유래일 수 있다. 상기 인간 단일클론항체의 경쇄 불변영역이 람다 경쇄 유래인 경우, 서열번호 13으로 기재된 람다 경쇄 불변영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 인간 단일클론항체는 인간 DLL4에 대해 친화도를 제공하는데, 이는 비아코아를 이용한 분석을 통하여 항체와 인간 DLL4에 대한 결합/해리 상수(K_D value)를 구함으로써 확인할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 인간 단일클론항체 mh2F는 약 5nM 수준의 높은 결합력을 가지는 것을 확인하였으며(표 1), 이러한 결과는 본 발명의 항체가 DLL4에 대해 특이적으로 높은 결합을 할 수 있다는 것을 시사하는 것으로 DLL4에 대한 항원 인식을 유용하게 사용할 수 있는 임의의 적용에서 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "델타 유사 리간드 4(delta-like ligand 4, DLL4)"는 노치 단백질을 수용체로 하는 리간드의 델타 부류의 하나로서, 바람직하게는 노치 1 또는 노치 4 수용체에 결합하는 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DLL4는 포유류의 DLL4라면 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 인간 또는 마우스의 DLL4를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 DLL4는 암세포 또는 혈관내피세포에 발현되어 있는 노치 1 또는 4 수용체에 결합하여 암의 성장을 유도하거나 자가면역질환의 진행을 유도할 수 있는 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DLL4는 암의 혈관(tumor vasculature)을 비롯한 다양한 암 세포에서 과발현되어 있으며, 여러 이종이식(xenograft) 모델에서 혈관수를 감소시켜, 저산소증(hypoxia)을 막아 암의 성장을 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Ji-Liang Li et al., Cancer Res 2007;67:11244-11253). 또한, 상기 DLL4는 천연형 또는 변이체 DLL4 단백질을 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 천연형 DLL4 단백질이란 천연형 DLL4 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 일반적으로 지칭하며, 상기 천연형 DLL4 단백질의 아미노산 서열이란 천연 발생 DLL4에서 발견되는 아미노산 서열을 일반적으로 지칭한다. 상기 DLL4에 대한 정보는 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 NM_019074.3(Gene ID:54567)인 DLL4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "노치(Notch) 수용체"는 노치 신호 전달을 매개하는 단백질을 의미하며, 노치와 혼용하여 사용될 수 있다. 상기 노치 수용체는 노치 신호 전달을 매개하는 단백질이라면 제한없이 포함하나, 바람직하게는 노치 1 또는 노치 4 수용체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 노치 수용체는 포유류의 DLL4에 결합하는 단백질이라면 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 인간 또는 마우스의 DLL4에 결합하는 단백질을 의미할 수 있다. 본 발명에서 상기 노치는 천연형 노치 또는 변이체 노치 단백질을 모두 포함한다. 천연형 노치란 천연형 노치 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하며, 상기 천연형 노치 단백질의 아미노산 서열이란 천연형 발생 노치 수용체에서 발견되는 아미노산을 일반적으로 지칭할 수 있다.

본 발명에서 용어, "DLL4와 노치(Notch) 수용체 간의 상호작용을 저해"는 본 발명의 DLL4에 특이적인 단일클론항체가 DLL4에 결합하여 DLL4와 노치 수용체 간의 상호작용을 저해시키는 것을 의미하며, 바람직하게는 DLL4에 특이적인 단일클론항체가 DLL4에 결합하여 DLL4와 노치 1 또는 노치 4 수용체와의 상호작용을 저해시키는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 DLL4에 특이적인 단일클론항체에 의한 DLL4와 노치 수용체 간의 상호작용 저해를 통하여 DLL4의 노치 수용체 결합에 의한 노치 단백질의 구조적 변화를 가져오지 못하여 가수분해될 수 없어 NICD를 생성하지 않아 노치 신호전달을 가져올 수 없게 한다. 암에서 DLL4와 노치 수용체가 결합하게 되면, 기질/혈관 내피 세포 (stromal/endothelial cell)와 같은 세포들에서 노치 신호전달을 활성화시키게 되고, 혈관 크기를 증대시키며, 종양 내의 맥관 기능(vascular function)을 향상시켜 암의 증식과 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다(Ji-Liang Li et al., Cancer Res 2007;67(23):11244-53). 따라서, 암에서 DLL4에 의한 노치 신호전달을 차단하게 되면 특히 혈관 신생 조절이 잘 이루어지지 않게 되어 암의 성장을 억제할 수 있게 된다. 또한, DLL4를 차단하게 되면 혈관신생 부위 말단의 세포에서 외측 억제(lateral inhibition)의 결실이 나타나서 과도한 발아가 이루어지게 되고 그 결과로 지나치게 많으면서도 생산성은 떨어지는 혈관신생 반응이 높아지게 되며, 산소를 공급하는 관류가 나빠져서 암 주변에 저산소 상태가 유도될 수 있어 항암 효과를 가져올 수 있으며, 특히 항 VEGF 치료에서도 저항성을 보이는 암에서도 항암 효과를 나타낼 수 있다(Noquera-Troise I et al., Novartis Found Symp 2007;283:106-20). 따라서 DLL4와 노치 간의 상호작용을 효과적으로 억제하는 본 발명의 DLL4에 특이적인 인간 단일클론항체는 암의 치료에 있어서 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, DLL4에 특이적인 인간 단일클론항체 mh2F를 제작하였으며, 상기 항체는 인간 DLL4 및 마우스 DLL4 모두에 결합할 수 있는 교차 반응성을 지니고 0.025nM 내지 64nM의 낮은 항체 농도에서도 인간 및 마우스 DLL4에 강한 결합력을 나타냄을 확인하였다(도 2). 또한, 본 발명의 항체는 약 5nM의 낮은 평형 해리 상수값(K_D값)을 나타내어 DLL4 항원에 대한 높은 친화도를 보임을 확인하였고(표 1 및 도 3), 2pM 내지 35000pM의 항체 농도에서 DLL4에 강하게 결합하여 DLL4와 노치 수용체 간의 상호작용을 대부분 저해시키며, 특히 1.03nM의 낮은 농도에서 IC₅₀ 값을 나타냄을 확인하였고(도 4), 본 발명의 항체가 노치 신호전달이 활성화되면 생성되는 NICD를 대조군에 비하여 현저하게 감소시킴을 확인하여 노치 신호전달을 억제시킬 수 있음을 확인하였다(도 5). 뿐만 아니라, 본 발명의 항체는 인간 폐암 세포 A549 세포가 이식된 마우스에서 종양의 크기가 증가하는 대조군에 비하여 종양의 크기를 감소시키거나 더 이상 성장하지 않는 결과를 보여줌으로써, 암의 치료에 있어서 효과적으로 사용될 수 있는 항체임을 나타내었다(도 6). 상기와 같은 결과들은 본 발명의 항 DLL4 항체가 DLL4에 강하게 결합하여 DLL4와 노치 수용체 간의 결합을 저해하여 노치 신호전달을 억제하므로, 암세포에 과발현되어 있는 DLL4의 진단 및 암 또는 자가면역질환의 치료에 있어서 효과적인 진단 및 치료용 항체가 될 수 있음을 시사하는 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 단일클론항체는 공지의 단일클론항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파아지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

파아지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파아지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파아지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적으로 파아지 디스플레이 기술은 1) 파아지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ (또는 pⅣ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; 4) 수용체에 결합된 펩티드-파아지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파아지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하는 단계로구성된다.

바람직하게 본 발명의 단일클론항체의 제조방법은 파아지 디스플레이 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자는 공지의 파아지 디스플레이 기술, 예를 들어 Barbas 등(METHODS : A Companion to Methods in Enzymology 2:119, 1991 및 J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9) 및 Winter 등(Ann. Rev.Immunol. 12:433, 1994) 의 논문 등에 공지된 방법을 참고하여 상기 본 발명의 제조방법의 각 단계를 용이하게 수행할 수 있다. 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파아지는, 예를 들어 필라멘트성 파아지(filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파아지가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파아지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터에는 예를 들어, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파아지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8 또는 pSEX 등의 파아지미드 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 증폭을 위한 재조합 파아지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파아지에는, 예를 들어M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 하이브리도마 유래의 단일클론항체 또는 파아지 디스플레이 클론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 그 예로, 하이브리도마 또는 파아지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 일단 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론항체를 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 인간 단일클론항체의 제조 방법은 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터에서 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 포함하는, 인간 단일클론항체의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

상기 인간 단일클론항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 제공하는 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.

상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 인간 단일클론항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "도입"은 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 인간 단일클론항체는 DLL4에 결합하여 DLL4와 노치 수용체와의 결합을 저해함으로써 암의 성장 억제에 관여할 수 있다. 상기 DLL4 및 노치 수용체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "암"은 본 발명의 항체에 의해 치료될 수 있는 암이라면 그 종류에 제한없이 포함하나, 그 예로 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 또는 다발성 골수종 혈액암일 수 있다. 본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 대표적으로 인간 폐암 세포주인 A549를 이식한 마우스에서 본 발명의 인간 단일클론항체가 종양의 크기가 증가하는 대조군에 비하여 종양의 크기를 감소시키거나 더이상 성장시키지 않음을 확인하여(도 6), 본 발명의 항체가 암의 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 인간 단일클론항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 암을 치료하는 방법은 인간 단일클론항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 암이 발병되거나 발병 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 암을 치료하는 방법은 바람직하게는 인간 단일클론항체를 포함하는 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있다.

상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유 동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한없이 포함된다.

이때, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 DLL4에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체를 포함할 수 있다. 상기 단일클론항체를 포함하는 약학적 조성물을 인체 내에 투여하여, 암의 발생, 증식 또는 전이를 억제시키거나 진행을 막아 암을 치료할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 DLL4 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다. 또한, 이 방법은 암을 진단하는 방법일 수 있다.

상기 인간 단일클론항체, 암, 개체 및 DLL4 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 암의 진단을 위한 정보의 제공방법은 본 발명의 DLL4에 특이적인 인간 단일클론항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 DLL4 단백질을 검출할 수 있으며, 이를 통해 암의 진단을 위한 정보의 제공을 할 수 있다. 상기 DLL4는 난소암을 비롯한 다양한 암세포에서 과발현되어 있으므로(Wei Hu et al., Cancer Res 2011;71:6030-6039.), 정상 세포 또는 조직과 같은 대조군과 DLL4의 발현량을 비교하여 암을 진단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, (a) 상기 항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에 처리하여 DLL4 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 검출된 DLL4 단백질의 수준을 대조군과 비교하여, 대조군에 비하여 DLL4 단백질 수준이 높으면 암 환자로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법 또는 암의 진단 방법일 수 있다.

본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 DLL4 단백질의 존재 또는 암의 유무를 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 시료 중의 DLL4 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.

검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³ ⁺, Eu³ ⁺ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I, ¹²⁵I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA,고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 인간 단일클론항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 DLL4에 특이적인 단일클론항체를 포함하는 진단용 조성물을 사용하여 DLL4의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환 또는 DLL4에 의해 매개되는 질환 예컨대, 암을 진단할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상기 조성물 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 암 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 인간 단일클론항체 및 치료에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적으로 허용가능한 담체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "자가면역질환"은 병적인 개체의 자체 항원에 대한 면역 반응이 직간접적 원인으로 나타나는 질환을 총칭하는 의미로서, 그 종류에 제한없이 포함되나, 그 예로 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 뇌척수염, 섬유조직염 또는 결절성 다발성 동맥염일 수 있다.

본 발명의 DLL4에 특이적인 인간 단일클론항체는 조절 T 세포(regulatory T cell)의 발달을 촉진할 수 있으므로, 자가면역질환의 치료에 이용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 단일클론항체를 이용하여 자가면역질환을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 인간 단일클론항체는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 자가면역질환이 발병되거나 발병 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 자가면역질환, 개체 및 사용될 수 있는 담체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 자가면역질환의 치료 방법은 바람직하게는 본 발명의 단일클론항체를 포함하는 조성물을 자가면역질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환의 치료 방법일 수 있다.

본 발명에 따른 인간 단일클론항체는 DLL4에 대해서 강한 친화력을 나타내며, DLL4와 노치 수용체 간의 결합을 효과적으로 저해할 뿐 아니라, 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로 암 또는 자가면역질환과 같은 질환의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은, DLL4에 대한 단일클론 항체 mh2F의 중쇄 가변영역의 서열 정렬 및 경쇄 가변영역의 서열 정렬을 나타낸 것이다. 여기서 프레임(frame)은 구조 영역(framework region)을, CDR은 상보성 결정 영역(complementarity-determining region)을 의미한다.
도 2는, 항 DLL4 항체인 mh2F의 DLL4에 대한 결합능 어세이를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 통하여 분석한 결과를 나타낸 것으로, (a)는 인간 DLL4에 대한 결합력을 확인한 ELISA 어세이 결과이고, (b)는 마우스 DLL4에 대한 결합력을 확인한 ELISA 어세이 결과이다.
도 3은, 항 DLL4 항체인 mh2F와 항원인 DLL4와의 친화도 측정을 비아코어(BIACORE) 기기를 사용하여 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 4는, 항 DLL4 항체 mh2F에 의한 DLL4와 Notch 간의 상호작용 억제를 ELISA를 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 항 DLL4 항체 mh2F에 의한 DLL4 및 Notch의 상호작용 억제에 의한 노치 신호전달 저해를 웨스턴 블럿팅을 통하여 확인한 결과이다.
도 6은, 항 DLL4 항체 mh2F의 인간 폐암 성장에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타내는 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 라이브러리 파아지의 제조

항 DLL4 항체를 제조하기 위하여, DLL4 항원으로서는 인간 DLL4의 세포외 도메인 항원은 알앤디시스템사에서 제공된 인간 DLL4 단백질(Cat: 1506-D4/CF)을 입수하여 사용하였고, 라이브러리 파아지의 제조 과정은 하기와 같았다.

구체적으로, 다양성을 가진 인간 유래 scFv(single-chain variable fragment) 라이브러리 세포 2.7x10¹⁰세포수를 2X YT CM[Tryptone(CONDA, 1612.00) 17 g, 이스트 추출물(CONDA, 1702.00) 10 g, NaCl(sigma, S7653-5kg) 5 g, 클로람페니콜(sigma, C0857) 34 ㎍/㎖)], 2% 글루코스(sigma, G5400) 및 5 mM MgCl₂(sigma, M2393)을 포함하는 배지(3L)에서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후(OD₆₀₀=0.5~0.7), 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시켜 2X YT CMK[2X YT CM, 카나마이신(sigma, K1876) 70 ㎍/㎖, 1 mM IPTG(ELPISBIO, IPTG025)] 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상등액에 4% PEG(Fluka, 81253) 6000과 3% NaCl(sigma, S7653)을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 원심분리(8000rpm, 20분, 4℃)한 후, 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000 rpm, 10분, 4℃)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 상등액을 새 튜브에 넣어 4℃에서 보관하였다.

실시예 2: 파아지 디스플레이( phage display )를 통한 패닝( panning )

인간 DLL4 및 마우스 DLL4 모두에 결합하는 항 DLL4 항체를 선별하기 위해 패닝시, 인간 DLL4와 마우스 DLL4를 교차하여 패닝을 진행하였고, 3회(round)까지 진행하였다.

실시예 3: 항 DLL4 항체의 DLL4 에 대한 결합력 어세이

상기 실시예 1 및 2의 파이지 디스플레이를 이용하여 분리, 정제한 항체를 mh2F로 명명하였고, 이는 서열번호 1인 중쇄 가변영역과 서열번호 5인 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 확인하였다. 이와 같이 분리된 항체의 항원에 대한 친화도를 하기와 같이 분석하였다.

항 DLL4 항체-항원 결합 친화도는 ELISA-기반 용액 결합시험을 사용하여 평가하였고, 마우스 DLL4 단백질의 세포외 도메인 항원은 알앤디 시스템사에서 제공하는 DLL4 단백질(Cat: 1389-D4-050/CF)을 입수하여 사용하였다.

구체적으로, 96-웰 미세역가플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC, Rochester, NY)를 4℃에서 밤새 PBS 용액 중의 2㎍/㎖ mDLL4-His 또는 hDLL4-His 단백질로 코팅하고, 비특이적 결합부위는 BSA(Bovine Serum Albumin)로 2시간 동안 차단시켰다. 96-웰 미세역가플레이트 상에서 항체(정제된 단백질)를 항체의 일정한 농도에 따라 0nM 내지 64nM 범위의 항체를 미세역가 플레이트에 옮겼다. 옮긴 다음에 2시간 항온처리한 후에, 플레이트를 0.05%의 트윈 20(tween 20)을 포함하는 PBS로 5번 세척하고, 플레이트-결합된 DLL4 항체를 HRP-접합된 Fab 폴리클로날 항체 시약(Pierce)으로 검출하기 위해 1:10,000 비율로 하여 세척된 미세역가 플레이트 옮긴 후 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응 후 비색용 기질(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine; Sigma-Aldrich co)을 사용하여 발색시켰다. 효소반응을 0.5mol/L 황산으로 중지시키고, 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 기록하였다.

그 결과, 본 발명의 항 DLL4 항체인 mh2F가 농도 의존적으로 인간 및 마우스 DLL4 모두에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 2 (a) 및 (b)).

실시예 4: 항 DLL4 항체의 DLL4 에 대한 결합 친화도 측정

비아코어(BIACORE, GE healthcare)로 인간 DLL4 항원 및 마우스 DLL4 항원과 항체 간 결합과 해리의 실시간 모니터링을 통해 산출된 평형 해리 상수(K_D값)를 이용하여 결합 정도를 판단하였다. 이를 위해 실시간 바이오 센서 표면 플라즈몬 공명 시험(BIACORE T200)법을 사용하였다. 인간 DLL4 및 마우스 DLL4를 비아코어 칩 (BIACOREchip)표면에 코팅한 뒤 다양한 농도의 항체를 코팅된 항원 표면상에 주입하고 항원-항체 결합 및 해리를 실시간으로 모니터하였다. 속도론적 분석을 수행하여 K_D값을 계산하였고, 이에 대한 실험 결과를 도 3 및 하기 표 1에 나타내었다.

인간 DLL4 항체	Ka	Kd	K_D(M)	Chi2
mh2F	4.763x10⁵	0.002510	5.27X10^-9	5.69

상기 표 1은 인간 DLL4 항원에 특이적인 항 DLL4 인간 단일클론항체들의 항원에 대한 결합능 또는 친화도(affinity)를 나타내는 것으로서, 상기 결과를 통하여 본 발명의 인간 DLL4에 대하여 약 5nM 수준의 우수한 결합력을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 5: 항 DLL4 항체에 의한 DLL4 와 노치 수용체 간의 상호작용 억제

항-DLL4 항체에 대해 ELISA-기반 용액 경쟁시험을 사용하여 평가하였다. 96-웰 미세역가플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC, Rochester, NY)를 4℃에서 밤새 PBS 용액 중의 500ng/ml hNotch-1-hFc 단백질(R&D systems)로 코팅하고, 비특이적 결합부위는 BSA로 2시간 동안 차단시켰다.

또한, 96-웰 미세역가플레이트 상에서 항체(정제된 단백질)를 항체의 일정한 농도에 따라 2pM 내지 35nM 범위의 항체와 항원 단백질(DLL4 항원, 800ng/㎖)의 계열 희석액과 예비 혼합시켰다. 항원과 항체를 30분간 항온처리한 후에 유리 항체의 측정을 위해서 용액을 DLL4 수용체인 hNotch-1 단백질로 미리 코팅(20ng/well)된 미세역가 플레이트에 옮겼다. 옮긴 다음에 2시간 항온처리한 후에, 플레이트를 0.05% 트윈 20(tween 20)을 포함하는 PBS로 5번 세척하고, 플레이트-결합된 DLL4 항원을 HRP-접합된 His 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체 시약(Roche applied science)으로 검출하기 위해 1:500 비율로 하여 세척된 미세역가 플레이트 옮긴 후 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그 다음, 비색용 기질(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine; Sigma-Aldrich co)을 사용하여 발색시켰다. 효소반응을 0.5mol/L 황산으로 중지시키고, 450nm에서 흡광도를 기록하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항 DLL4 항체는 모두 DLL4와 인간 노치 1에 대한 결합을 1.03nM의 낮은 농도에서 50% 저해시킬 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명의 항 DLL4 항체를 이용하는 경우, DLL4와 노치 수용체 간의 결합을 효과적으로 저해시키므로, 이를 통하여 암세포의 성장을 억제시킬 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

실시예 6: 항 DLL4 항체에 의한 노치 수용체의 절단 억제

노치 신호전달에서 노치 수용체가 DLL4와 결합되면 노치 수용체의 구조적 변화를 가져와 노치 수용체가 절단되고, 노치 수용체의 세포내 부분(NICD, intracellular domain of notch)이 핵 안으로 이동되어 노치 신호전달을 매개한다. 이에 본 발명의 항 DLL4 항체가 DLL4와 노치 수용체 간의 결합을 억제하여 노치 신호전달을 막을 수 있는지 여부를 노치 수용체의 절단 억제 여부를 통하여 하기와 같이 확인하였다.

DLL4와 노치 수용체 간의 결합 억제 여부에 따른 노치 1(Notch 1) 수용체의 절단에 의한 세포 내 부분(NICD, intracellular domain of notch) 생성 여부를 웨스턴 블럿팅(Western blotting)을 통하여 확인하였다. 이때, 전체 절단된 노치 1 단백질을 검사하였다. 낮은 계대의 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells) 세포를 분석하기 하루 전에, rhDLL4(recombinant human DLL4)가 코팅된 웰을 차가운 PBS로 세척한 뒤, 항체 처리군 각 웰당 각 20㎍/㎖의 농도의 항체를 30분간 상온에서 처리하였다. 그 후 1% BSA를 포함하는 PBS 용액 1㎖로 코팅한 웰과 rhDLL4 코팅한 첫번째 웰에는 물질의 vehicle인 PBS(Phosphate buffered saline)와 2X10⁵개의 HUVEC 세포을 혼합하여 처리하였다. rhDLL4 코팅한 두 번째 웰에는 항 DLL4 항체인 mh2F 20㎍/㎖, rhDLL4 코팅한 세 번째 웰에는 γ-세크레타제(γ-secretase) 억제제인 DBZ(dibenzazepine) 0.08μM를, rhDLL4 코팅한 4번째 웰에는 아바스틴(Avastin, Bevacizumab) 20㎍/㎖를 각각 2X10⁵개의 HUVEC 세포와 혼합하여 처리한 다음, 플레이트를 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 동안 성장시킨 후에 전체 세포 추출물을 제조하여 SDS-PAGE로 분석하였다.

웨스턴 블럿팅은 브래드포드 어세이(Bradford assay)를 통해 정량된 샘플을 4 내지 12% Bis-Tris 겔(Invitrogen)에 웰당 30㎍씩 로딩(loading)하고 150V에서 100분간 러닝(running)하여 진행하였다. 트랜스퍼 기구(Transfer tool)에 스펀지 및 3M 페이퍼를 정렬한 뒤 로딩이 완료된 겔을 올려놓고, 그 위에 PVDF 멤브레인(Invitrogen)을 기포가 들어가지 않도록 올려놓고 다시 스펀지 및 3M 페이퍼를 정렬하였다. 그 다음, 25V에서 60분간 트랜스퍼하였다. 트래스퍼 직후 폰슈 S 용액(Ponceau S solution, Sigma)을 이용하여 로딩된 단백질을 확인한 뒤 1xTBS(Biorad) 및 0.1% Tween20(Invitrogen)을 포함하는 TBS-T 버퍼로 10분씩 3회 세척하였다. 그 후 5% 스킴밀크(Skim milk, BD)를 이용해 1시간 동안 차단(blocking)을 진행하였다. 그 후 TBS-T 버퍼로 10분씩 3회 세척해준 뒤 베타-액틴(C4) 마우스 단일클론 IgG(beta-actin(C4) mouse monoclonal IgG, Santa Cruz)를 5% 스킴밀크 용액에 1:2,000의 비율로 혼합하고, 토끼 항-NICD 항체(Rabbit anti-NICD antibody, cell signaling)를 5% BSA 용액에 1:1,000의 비율로 혼합하여 4℃에서 밤새(overnight, O/N) 처리하였다. 다음날 TBS-T 버퍼로 10분씩 3회 세척한 후 2차 항체인 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체(goat anti mouse IgG-HRP, Pierce) 및 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체(goat anti rabbit IgG-HRP, Invitrogen)를 스킴밀크 상에서 1:5,000의 비율로 1시간 동안 처리하였다. TBS-T 버퍼로 10분씩 3회 세척해준 뒤 ECL Plus 키트(GE healthcare)내 시약 A 및 B를 적정량 섞은 후 멤브레인에 처리해 비닐랩을 씌어 카세트(cassette)에 고정시켰다. 암실에서 필름을 꺼내 멤브레인 위에 놓은 뒤 카세트를 닫고 일정시간이 지난 뒤 카세트를 열고 필름을 꺼내 Developer(Kodak) 및 Fixer(Kodak) 용액을 이용해 현상하였다.

그 결과, 양성 대조군인 DBZ 처리군에서는 γ-세크레타제의 억제로 인하여 NICD가 생성되지 않는 것을 보여 HUVEC 세포에서의 NICD의 생성이 노치 신호전달에 의한 것임을 확인하였으며, 아바스틴(avastin) 항체를 처리한 군(레인 4)에서는 대조군에 비하여 변화를 보이지 않는 것을 확인하였다. PBS만 처리한 군(레인 2)에 비하여 본 발명의 항체(mh2F)를 처리한 군(레인 5)는 훨씬 적은 NICD 단백질 수준을 나타내어(도 5), 본 발명의 항체가 rhDLL4에 특이적으로 결합하여 HUVEC 세포의 표면의 노치 단백질과 결합을 저해함을 통하여 노치 신호전달을 저해시킬 수 있음을 나타내었다. 이러한 결과는 본 발명의 항체가 DLL4에 결합하여 노치 신호전달을 억제시키므로, 암 또는 자가면역질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 7: 인간 종양 성장에 대한 항 DLL4 항체의 효과와 분석

인간 종양 성장에 대한 본 발명의 항 DLL4 항체인 mh2F의 효과를 하기와 같이 확인하였다.

인간 폐암세포주인 A549 세포주를 마우스에 이식하여 효력시험을 진행 및 평가하였다. 각각의 마우스에 2x10⁷개의 A549 세포를 피하(Subcutaneous, SC)이식하였다. 종양이 마우스에 형성되어 정착한 후에(이식한지 7일 후에 약 250 mm³의 크기), 종양의 크기를 측정하고, 본 발명의 항체 mh2F 10mg/kg을 처리하였다. 총 3마리의 마우스에 상기 항체를 주당 2회 투여하였으며, 투여 후 1일, 4일, 8일, 12일 및 15일에 종양 크기를 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 항 DLL4 항체(mh2F)를 처리한 군에서는 종양 크기가 증가하는 대조군에 비하여 종양의 크기가 줄거나 더이상 성장시키지 않는 결과를 보였다. 이러한 결과는 본 발명의 항체가 항암 치료에 있어 유용하게 이용될 수 있음을 시사하는 결과이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> Novel human DLL4 monoclonal antibody that potently inhibits the Notch signaling pathway <130> PA120422KR <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of mh2F <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Phe Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Ala Gly Gly Thr Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Ile Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of a heavy chain variable region of mh2F <400> 2 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Leu His 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of a heavy chain variable region of mh2F <400> 3 Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Phe Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a heavy chain variable region of mh2F <400> 4 Asp Ser Ala Gly Gly Thr Leu Asp Val 1 5 <210> 5 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of mh2F <400> 5 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Gly Asn Lys Gly Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Tyr Asp Lys Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Ser Thr Val Ile 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu 100 105 110 Val Glu Arg 115 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of a light chain variable region of mh2F <400> 6 Gly Gly Asn Lys Ile Gly Asn Lys Gly Val His 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of a light chain variable region of mh2F <400> 7 Tyr Asp Lys Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a light chain variable region of mh2F <400> 8 Gln Val Trp Asp Arg Ser Thr Val Ile 1 5 <210> 9 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain constant region of IgG1 <400> 9 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 10 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain constant region of IgG2 <400> 10 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 11 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain constant region of IgG3 <400> 11 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 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Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 12 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain constant region of IgG4 <400> 12 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val 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Claims

서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, DLL4(Delta-like ligand 4)에 특이적인 인간 단일클론항체.
제1항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체는 인간 DLL4(Human DLL4) 또는 마우스 DLL4(Mouse DLL4)에 특이적으로 결합하는 것인 인간 단일클론항체.
제1항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체는 DLL4와 노치(Notch) 수용체 간의 상호작용을 저해하는 것인 인간 단일클론항체.
제1항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 5로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간 단일클론항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제6항의 발현 벡터가 도입된 형질전환체.
제6항의 발현 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는, 인간 델타 유사 리간드 4(DLL4)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체의 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인간 단일클론항체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 및 다발성 골수종 혈액암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인간 단일클론항체를 포함하는, 암 진단용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인간 단일클론항체를 이용하여, 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 델타 유사 리간드 4(DLL4) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법.