CN114632090A - siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途 - Google Patents

siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114632090A
CN114632090A CN202210139558.2A CN202210139558A CN114632090A CN 114632090 A CN114632090 A CN 114632090A CN 202210139558 A CN202210139558 A CN 202210139558A CN 114632090 A CN114632090 A CN 114632090A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sirna
pharmaceutical composition
cells
sense strand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210139558.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114632090B (zh
Inventor
安娜·伊莎贝尔·希门尼斯
科瓦东加·帕内达
塔玛拉·马丁内斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sylentis SA
Original Assignee
Sylentis SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sylentis SA filed Critical Sylentis SA
Priority to CN202210139558.2A priority Critical patent/CN114632090B/zh
Publication of CN114632090A publication Critical patent/CN114632090A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114632090B publication Critical patent/CN114632090B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/14Type of nucleic acid interfering N.A.
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/31Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315Phosphorothioates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/32Chemical structure of the sugar
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/32Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/3212'-O-R Modification
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/32Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/3222'-R Modification
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/32Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3235Chemical structure of the sugar modified ring structure having the O of the ribose replaced by another atom
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/33Chemical structure of the base
    • C12N2310/335Modified T or U
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/34Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/35Nature of the modification
    • C12N2310/352Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521Methyl
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/35Nature of the modification
    • C12N2310/353Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533Halogen
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00Applications; Uses
    • C12N2320/30Special therapeutic applications
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00Applications; Uses
    • C12N2320/30Special therapeutic applications
    • C12N2320/33Alteration of splicing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及siRNA分子及其在用于抑制NRARP基因表达的方法和药物组合物中的用途。本发明还涉及所述siRNA分子在治疗和/或预防特征为增加的NRARP基因表达和/或活性的与新血管形成相关的疾病或病症中的用途,所述眼部病症选自包含以下各项的组:年龄相关性黄斑变性(AMD),缺血性视网膜病变,糖尿病黄斑水肿(DME),增生性糖尿病视网膜病变(PDR),糖尿病视网膜缺血(DRI),糖尿病视网膜水肿(DRE)和早产儿视网膜病变(ROP)及其组合。

Description

siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途
本申请是国际申请日为2016年9月7日、国际申请号为PCT/EP2016/071122于2018年3月8日进入中国国家阶段、申请号201680052073.2、发明名称“siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途”的申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及以下领域:siRNA产品及其在用于治疗和/或预防与新血管形成相关的视网膜病变,并且更特别地用于治疗和/或预防与NRARP基因的高水平表达和/或活性相关的与新血管形成相关的视网膜病变的方法和组合物中的用途。
发明背景
健康的视网膜是好的视力所必需的。视网膜病变症可以导致视力的部分或全部丧失。许多视网膜疾病具有共同的症状和治疗,但是各自具有独特的特性。视网膜疾病治疗的目标是停止或减缓疾病进展和保护或恢复丧失的视力。
神经视网膜是复杂的神经组织,其由八个互连的细胞层的网络组成,负责将视觉光转化为机电信息,所述机电信息通过视神经被发送至脑并由其解释。视网膜内的神经细胞的布置需要光通过大多数细胞层以到达位于视网膜后部的光感受器;之后光感受器将信息传输至视网膜神经元用于视觉信息的本地处理和向视皮层的传输。有两种类型的光感受器,视杆和视锥。两种类型的光感受器存在于整个视网膜中,但是视杆在外围占优而视锥在视网膜中心最密集。视网膜的中心,也被称为黄斑黄斑,是视网膜的专门化的区域,其具有密集的视锥和高浓度的色素,此处的视力最为敏锐。视网膜的主要特性之一是它的透明性。透明性允许光到达视网膜的最外层(光感受器位于其中)。该透明性要求暗示了滋养和支持视网膜所需的血管系统是极端专门化的。向视网膜的供血由两个主要来源提供:视网膜血管系统和脉络膜。脉络膜是高度血管化的、具有色素的组织,其位于视网膜和巩膜之间。脉络膜通过经由脉络膜毛细血管的扩散向视网膜提供营养物,代谢物和气体交换。视网膜色素上皮(RPE)是位于神经视网膜和脉络膜之间的单层的色素细胞。RPE细胞保护,支持并且饲养对光敏感的视网膜。神经视网膜的特殊环境由血液-视网膜屏障(BRB,也被称为血-视网膜屏障)保持。BRB由内部血液-视网膜屏障和外部血液-视网膜屏障组成。内部血液-视网膜屏障由视网膜血管系统的毛细血管内皮细胞间的紧密连接形成。外部血液-视网膜屏障由RPE细胞的紧密连接组成。RPE细胞间的紧密连接对于控制通过BRB的液体和可溶性化合物的运输以及避免毒性物质进入视网膜是必要的。
血管主要通过两个过程在视网膜中形成:血管化或血管发生。血管化因为已经存在于组织中的前体细胞分化成有助于血管形成的内皮细胞而发生。血管发生的不同之处在于通过从已经存在的血管系统中萌发而产生新的血管。血管发生需要内皮细胞的增殖,迁移和分化;以及新形成的血管的成熟。生物成体中的内皮细胞数目通常稳定;内皮中的稳定性由血管生成和抗-血管生成因子的浓度的平衡来控制。因子平衡的改变导致引起或抑制血管发生。血管化和血管发生是在发育及其他事件如愈合期间发生的自然过程;但是这些过程也参与某些疾病的发病。病理性新血管形成通常暗示血管化和血管发生两者的组合。有两种类型的新血管形成在视网膜中发生,并且两者都可能导致视力丧失:视网膜新血管形成(RNV),其中新的血管自视网膜毛细血管萌出并且侵入玻璃体和神经视网膜层,以及脉络膜新血管形成(CNV),其中新的血管自脉络膜血管系统萌出并且侵入视网膜下空间。虽然RNV和CNV源于不同的血管网络并且侵入视网膜的不同层,但是共有的分子机制促进两者的进展。RNV和CNV是发达国家中严重视力丧失的最常见病因并且需要新的治疗。
血管内皮生长因子(VEGF),是最重要的血管发生介质之一,其在RNV和CNV期间被上调。在过去十年,科学家们已经开发出了若干种新的″抗-VEGF″药物。其有助于阻断异常血管,减缓其渗漏,并且有助于减小视力丧失。利用抗-VEGF药物的治疗通过玻璃体内注射进行。
玻璃体内(IVT)注射是最常用的将药物递送至眼睛后部的方法,其可用于所有目前被批准用于治疗视网膜疾病的药物,除了维替泊芬(verteporfin)。维替泊芬通过静脉内注射给药,之后是激光治疗,但是用于现代抗-VEGF治疗的上市其使用显著减少。IVT注射扩大使用的原因在于递送药物的效率,视网膜医生的熟悉水平和医生控制治疗依从性的能力(Rowe-Rendleman等2014)。然而,该方法也具有其自身的一系列非常明确的缺点,包括患者不适,眼内炎的风险,白内障形成和视网膜脱离以及由于基于诊室的施用所致的高昂的相关费用。其他施用方法包括眼周注射,脉络膜上注射,筋膜下(sub-tenon)注射并且还包括滴眼液。然而,对于利用滴眼液是否能够实现足够的效力以治疗视网膜病变症存在一定的怀疑,因为活性成分需要从角膜递送至其在视网膜中的作用位点。存在显著的障碍和排除途径阻碍将药物递送至眼睛后部。首先,施用的药物中仅有1-7%被眼睛吸收;大部分作为滴眼液施用的药物从眼睛排出或经由鼻泪管被吸收至体循环。此外,药物被从玻璃体液快速清除。存在两种自后腔清除的途径,在前的和在后的。前者通过眼房水(AH)流动并且之后通过经由前房角的AH外流对前房进行清除。后者意味着通过血液-视网膜屏障的排除。因此,能够轻易地渗透通过血液-视网膜屏障的药物在玻璃体液中将具有非常短的半衰期。
用于治疗与新血管形成相关的视网膜疾病的抗-VEGF药物的备选物是基于RNA干扰(RNAi)的药物。
RNAi是存在于大多数真核细胞中的天然发生的转录后调节机制,其使用小的双链RNA(dsRNA)分子来指引依赖于同源性的基因沉默。其由Fire和Mello在线虫(C.elegans)中发现{Fire等1998},这在2006年被授予诺贝尔奖。在其被首次描述后,很快地证明借助于21个核苷酸长度的双链小干扰RNA(siRNA),RNAi也发生在哺乳动物细胞中{Elbashir等2001}。
RNA干扰的过程被认为是用于阻止外源基因表达的在进化上保守的细胞防御机制并且为不同的门和植物群所共有,其中其被称为转录后基因沉默。因为RNAi机制的发现,爆发了揭示可通过寻靶选择性地改变基因表达以作为治疗人类疾病的新方式的在涉及小分子或蛋白质的常规药物方法的情况下是″不可作为药物的″新化合物的研究。
根据目前的知识,RNAi的机制始于被称为Dicer的RNA酶III样蛋白质加工长的双链RNA。Dicer蛋白典型地含有N端RNA解旋酶结构域,结合RNA的所谓的Piwi/Argonaute/Zwille(PAZ)结构域,两个RNA酶III结构域和双链RNA结合结构域(dsRBD){Collins等2005}并且其活性导致长的双链RNA被加工成具有2碱基3’突出端和5’磷酸酯和3’羟基的21-24个核苷酸的双链siRNA。所得的siRNA双链体然后被结合到被称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的效应复合物,其中在通过RNA解旋酶活性以依赖三磷酸腺苷(ATP)的方式将双链siRNA分子解旋后{Nykanen等2001},siRNA的反义或引导链引导RISC识别并切割靶mRNA序列{Elbashir等2001}。导致mRNA降解的RISC的催化活性由核酸内切酶Argonaute 2(AGO2)介导{Liu等2004;Song等2004}。AGO2属于高度保守的Argonaute蛋白家族。Argonaute蛋白为~100KDa高度碱性的蛋白,其包含两个共有的结构域,即PIWI和PAZ结构域{Cerutti等2000}。PIWI结构域对于与Dicer的相互作用是重要的并且含有负责切割mRNA的核酸酶活性。AGO2使用siRNA双链体的一条链作为引导以发现含互补序列的信使RNA并且在相对于引导链的5’端的碱基10和11之间切割磷酸二酯主链{Elbashir等2001}。RISC激活期间的重要步骤是由AGO2切割正义或乘客链,将该链从复合物除去{Rand等2005}。分析siRNA引导链和PIWI结构域间的相互作用的晶体学研究揭示了,仅核苷酸2至8构成引导通过RISC的靶mRNA识别的″种子序列″,并且该序列中的单个核苷酸错配可以显著影响所述分子的沉默能力{Ma等2005;Doench等2004;Lewis等2003}。在mRNA被切割后,由于在片段中存在不受保护的RNA端,所述mRNA被细胞内的核酸酶进一步切割和降解并且将不再被翻译成蛋白{Orban等2005},同时RISC将再循环以用于随后的循环{Hutvagner等2002}。这构成导致特定mRNA分子及相应的蛋白选择性减少的催化过程。可能的是通过将siRNA效应物直接递送到细胞或组织中将此基因沉默的天然机制开发用于调节任何目的基因,其中所述siRNA效应物将激活RISC并产生靶mRNA的有效且特异性的沉默。RNAi已被应用于生物医药研究,如治疗HIV,病毒性肝炎,心血管和脑血管疾病,代谢疾病,神经退行性疾病和癌症{Angaji SA等2010}。
已经公布了许多研究,其描述了为了实现最大的有效性siRNA应当具有的关于长度,结构,化学组成和序列的理想特征。siRNA设计的初始参数由Tuschl及同事在WO02/44321中陈述,但是之后公布了许多随后的研究,算法和/或改进。因为力学细节的显露,siRNA选择方法变得更加复杂,此外现有的和新的数据的进一步分析可以提供关于这些方法的进一步精化的额外的信息{Walton SP等2010}。备选地,若干最近的研究报道了不同于典型的19+2siRNA结构并且在突出端,长度或对称性方面与典型的siRNA的关键特征不一致的新的RNAi-触发结构的设计和分析,其讨论了RNAi机制在哺乳动物细胞中的适应性{Chang CI等2011}。
此外,考虑到RNA酶在生物液体中的普遍性质,已进行了很多努力以增强siRNA稳定性,因为这被预期为是基于siRNA的疗法的主要障碍之一。siRNA分子的另一个固有问题在于其免疫原性,其中发现siRNA引起先天免疫系统的非特异性激活。非目的基因(mRNA)的敲低是已知的siRNA介导的基因沉默的副作用。其由siRNA与目的靶标以外的mRNA之间的部分互补性所致并且导致来自与任一siRNA链具有序列互补性的基因的脱靶效应(OTE)。遵循的用于稳定性增强和OTE减少的主要策略之一是使用修饰的核苷酸如2’-O-甲基核苷酸,2’-氨基核苷酸,或含2’-O或4’-C亚甲基桥的核苷酸。此外,已经描述了连接邻近的核苷酸的核糖核苷酸主链的修饰,主要是通过引入硫代磷酸酯修饰的核苷酸。似乎增强的稳定性和/或免疫原性的减小通常与效力成反比{Parrish,2000},并且仅特定数量,位置和/或组合的修饰的核苷酸可能产生稳定且无免疫原性的沉默化合物。因为这是基于siRNA的治疗的重要障碍,已经公布了不同的研究,其描述了显示良好结果的一些修饰模式,其实例包括EP1527176,WO2008/050329,WO2008/104978或WO2009/044392,在文献中可以发现更多{Sanghvi YS.2011;Deleavey等2012}。
眼睛是相对分离的组织区室,这为将基于siRNA的药物用于治疗与新血管形成相关的视网膜疾病提供了优势。将siRNA用于治疗CNV的可行性已经使用通过玻璃体内注射施用的针对VEGF或VEGF受体1(VEGFR1)的siRNA被证明{Campochiaro PA.2006}。通过局部滴注将siRNA递送至后段是非常有挑战性的,因为在siRNA到达视网膜前其需要通过较长距离的玻璃体{Guzman-Aranguez A等2013}。此外,限制性血眼屏障如血房水屏障(BAB)和BRB也使影响眼睛后段的视网膜疾病的药物治疗具有挑战性,所述屏障将眼睛与体循环分开。此外,眼睛的区室化结构限制了siRNA从前房通至眼睛的后段{Duvvuri S等2003}。最后,在siRNA成功进入眼睛的后部后,有效的清除机制起作用以快速清除递送的分子{Del Amo EM等2008}。因此,直接向玻璃体腔中注射成为将基于siRNA的治疗剂递送到眼睛的后段中的最有效的方式{Edelhauser HF等2010}。siRNA的玻璃体内注射实现视网膜组织局部可用的高浓度的siRNA,同时限制了全身暴露。然而,由于通过玻璃体核酸内切酶的分解和/或经由穿过BRB的渗透以及通过穿过玻璃体向前房的扩散,siRNA的浓度从后段快速减少。因此,需要多次玻璃体内注射以在眼睛后段保持最优的siRNA浓度。该给药模式的主要缺点在于多次玻璃体内注射与升高的眼内压,玻璃体或视网膜出血,视网膜脱离,视网膜撕裂,眼内炎,白内障,悬浮物和短暂的视力模糊相关{Edelhauser HF等2010}。因此,虽然玻璃体内注射保证了将高浓度的siRNA递送至视网膜,但是该给药方法也具有其自身的一系列特殊的风险。因此,siRNA的局部施用能够降低风险并且提供对患者更友好的给药方法。
无修饰的siRNA已显示在局部施用后到达特定区域,但是达到更深层的区域如视网膜的最内层和有效的细胞摄取需要开发保证足够浓度的化合物到达位于靶区域中的细胞的细胞质并且促进所需的生理学或治疗反应的策略。递送siRNA穿过角质层屏障包括微针显微操作针(Chong,Gonzalez-Gonzalez等,2013),皮内注射(Leachman,Hickerson等,2010),电穿孔(Nakai,Kishida等,2007),离子透入法(Kigasawa,Kajimoto等,2010)等。所述分子和/或制剂的修饰也可以使得所述分子能够穿透到所需的区域中并提高细胞摄取。
已经描述了局部施用基于siRNA的治疗剂以用于治疗视网膜疾病;例如,US20130123330公开了通过施用至少与编码VEGF或VEGFR2的mRNA分子结合的siRNA双链体,或将靶向基因VEGF和VEGFR2两者的siRNA双链体组合的混合物来治疗糖尿病视网膜病变和其他眼新血管形成疾病。该专利申请描述了可以局部,在结膜下或在玻璃体内将siRNA双链体施用至眼。然而,说明书仅包括了在玻璃体内或在结膜下施用的化合物的实例。WO2010048352(Quark Pharmaceuticals)公开了将化学修饰的siRNA化合物用于治疗与视网膜神经节细胞的变性或死亡相关的眼睛的疾病,病症和损伤,包括色素性视网膜炎(RP),糖尿病视网膜病变(DR),糖尿病黄斑水肿(DME)和年龄相关性黄斑变性(AMD)。虽然已证明将下调与这些细胞的损失相关的靶基因(如CASP2,RTP801,TIGASEII和p53基因)的表达的siRNA化合物局部递送至视网膜组织,仅靶向Caspase 2的siRNA化合物被证明通过增加视网膜神经节细胞的存活提供眼的神经保护作用。
在用基于siRNA的治疗剂治疗和/或预防与新血管形成相关的视网膜疾病时,靶基因选择起重要作用。Notch调节的锚定蛋白重复蛋白(NRARP)由Notch在新形成的分支点处诱导,其中其不同地调节Notch和Wnt信号转导活性以平衡柄(stalk)增殖和血管稳定性。HUVEC中siRNA介导的NRARP的下调与Notch的增加相关,其在柄细胞中被翻译为血管逆行而增加的Notch导致形成新的端细胞{Phng LK,Potente M等2009}。因此,可能的是,在视网膜组织中,NRARP在血管发生和/或新血管形成过程的调节中起重要作用。
基于siRNA的治疗剂能够减缓和阻止视网膜疾病中RNV和CNV的进展,但是无效的siRNA递送和siRNA生物利用度的有限的持续时间可能减小治疗益处,这需要重复的玻璃体内注射的延长的治疗方案。因此,必须设计靶向新的和具有创造性的靶基因的改进的和非倾入性的基于siRNA的治疗剂以用于治疗和/或预防与新血管形成相关的视网膜疾病。
发明概述
本发明提供用于减少NRARP表达并且因此减少与新血管形成相关的视网膜疾病的改进的产品。与常规的抗-血管生成治疗剂相比,利用siRNA产品治疗与新血管形成相关的视网膜疾病的优点之一在于基于siRNA的治疗具有更长的持续效果。该特征是由于siRNA阻断靶蛋白的合成。当暂停治疗时,细胞需要重新合成新的靶蛋白;而在常规的治疗中靶蛋白是未受损的,在不存在抑制剂后其易于再次具有活性。另一个优点可以是通过使用不同siRNA的组合增加治疗病症的效力;这可以通过以下方式实现:将靶向NRARP的siRNA与NRARP的其他调质和/或新血管形成的其他分子介质(如VEGF或VEGFR2)组合。siRNA的作用机制使得在活性分子到达细胞质后,相同的分子可被用于介导多种mRNA分子的降解,而在抗体的情况下并非如此,抗体需要1∶1化学计量。因此预期,仅需要更低剂量的化合物来实现相同的临床效力,由此显著降低副作用。
附图描述
图1:显示被选择作为本发明的siRNA的靶序列的NRARP的靶基因序列的短片段。
图2:显示本发明包括的靶向NRARP的本发明的siRNA分子的寡核苷酸序列。图中给出的SEQ ID NO涉及正义(5’->3’)链;典型地siRNA将作为dsRNA被施用,因此siRNA将包括正义链及其互补的反义链两者。SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.18是分别靶向SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9的siRNA。通常,siRNA将包括正义链和反义链,并且还可以包括3’二核苷酸突出端(例如,dTdT)。然而,这不是必要的。
图3:靶向NRARP的修饰的siRNA。SEQ ID NO 19至SEQ ID NO 40涉及靶向NRARP基因的序列SEQ ID NO 1的siRNA SEQ ID NO 10的修饰的正义(5’->3’)链和修饰的反义链(5’->3’)。图注:正义链(S),反义链(AS),小写(2’OMe核糖核苷酸),*(PS或硫代磷酸酯键),小写(4’硫代核糖或4’S),pU或5pU(5-丙炔基尿嘧啶3’),大写(2’F核糖核苷酸),小写(5’-甲基尿苷或5mU),dT(脱氧胸腺嘧啶o2’H胸腺嘧啶)。
图4:在人HeLa细胞中转染靶向NRARP的以下siRNA之一后的体外NRARP基因表达水平:SEQ ID NO.10(SYL136001),SEQ ID NO.11(SYL136005),SEQ ID NO.12(SYL136003)和SEQ ID NO.13(SYL136004)。
图5:在人HeLa细胞中转染靶向NRARP的以下siRNA之一后的体外细胞生存力:SEQID NO.10(SYL136001),SEQ ID NO.11(SYL136005),SEQ ID NO.12(SYL136003)和SEQ IDNO.13(SYL136004)。
图6:在人HeLa细胞中转染靶向NRARP的siRNA SEQ ID NO.10及其以下的修饰的对应物后的体外NRARP基因表达水平:SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQ IDNO.27,SEQ ID NO.29,SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39。
图7:在人BEAS-2B细胞中转染靶向NRARP的siRNA SEQ ID NO.10及其以下的修饰的对应物后的体外NRARP基因表达水平:SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQID NO.27,SEQ ID NO.29,SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39。
图8:在小鼠C2C12细胞中转染SEQ ID NO.10及其以下的修饰的对应物后的体外NRARP基因表达水平:SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.27,SEQ IDNO.29,SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39。
图9:在大鼠ARL6细胞中转染SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.37后的体外NRARP基因表达水平。
图10:在人HeLa细胞中转染SEQ ID NO.10及其以下的修饰的对应物后的体外细胞生存力:SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.27,SEQ ID NO.29,SEQID NO.31,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39。
图11:在人BEAS-2B细胞中转染SEQ ID NO.10及其以下的修饰的对应物后的体外细胞生存力:SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.27,SEQ ID NO.29,SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39。
图12:在小鼠C2C12细胞中转染SEQ ID NO.10及其以下的修饰的对应物后的体外细胞生存力:SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.27,SEQ ID NO.29,SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39。
图13:在大鼠ARL6细胞中转染SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.37后的体外细胞生存力。
图14:在通过激光诱导CNV后视网膜中的NRARP mRNA水平。数据表示每个时间点三只动物(六个眼睛)的平均值±s.e.m。
图15:在通过激光诱导CNV后脉络膜/RPE中的NRARP mRNA水平。数据表示每个时间点两只动物(四个眼睛)的平均值±s.e.m。
图16:在局部施用载体或SEQ ID NO.37(5mg/mL)或在玻璃体内注射抗-VEGF(5μg/眼)的情况下在激光处理后三周进行的病变测量的柱状图。通过使用计算机辅助图像分析软件定量(以像素2计)的荧光素血管造影术确定病变的面积,排除病变中心的无血管化区域。数据表示每个时间点六只动物(十二个眼)的平均值±s.e.m。
图17:研究的用于评估结构的变量:1.-主连接的数目;2.-主区段的数目;3.-总的主区段长度;4.-网孔的数目;5.-总网孔面积。
图18:研究的不同参数响应于完全培养基的变化。表示以下参数:主连接数目;主区段数目;主区段的总长度;网孔的数目;网孔的总面积。结果获得自在覆盖有基质胶使用以下的培养皿上铺板的细胞:作为阴性对照的没有补充物的EBM培养基(基底),或具有补充物和10%FCS的完全培养基(阳性对照)。
图19:响应于SEQ ID NO.37或KDR siRNA的研究的不同参数的分析。
图20:响应于不同条件形成的结构的照片。
图21:A.响应于不同浓度的VEGF的HUVEC细胞的增殖。B.bevabizumab对VEGF诱导的增殖的抑制。
图22:在HUVEC细胞中抗-KDR siRNA或siRNA SEQ ID NO.37对由完全培养基(10%FCS和100ng/ml VEGF)诱导的增殖的作用。
图23:响应于增加的VEGF剂量的HUVEC细胞的迁移。
图24:抗-KDR siRNA或siRNA SEQ ID NO.37对由没有补充物的培养基和完全培养基(10%FCS+100ng/ml VEGF)诱导的HUVEC细胞迁移的作用。
图25:响应于不同条件(迁移)的上室中的细胞的照片。
图26:A.基底条件下和响应于10ng/ml VEGF的伤口愈合的量化。B.在0时刻和诱导后24h的时间的病变的照片。
图27:基底条件下和响应于完全培养基(10%FCS和100ng/ml VEGF)的伤口愈合的量化。
图28:显示在测定的不同条件下在0时刻和诱导后16h的病变的照片。
图29:HUVEC细胞中NRARP的mRNA水平。
本发明详述
在第一方面,本发明涉及提供在治疗和/或预防特征为增加的NRARP表达和/或活性的眼部病症中用作药物的siRNA分子,其中所述分子特异性靶向选自由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成或包含SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9的组的序列并且在被引入到细胞中时减少NRARP基因表达。优选地,靶序列包含SEQ ID NO.1或由其组成。
当例如根据本发明的siRNA分子选择性地减少或抑制基因的表达时,所述基因被根据本发明的siRNA″靶向″。当在本文中使用时,短语″选择性地减少或抑制″包括影响一个基因(在本例中是NRARP)的表达的siRNA。备选地,当siRNA(的一条链)在严格条件下与基因转录本(即其mRNA)杂交时,所述siRNA靶向所述基因。″在严格条件下″杂交表示在倾向于不利于杂交的标准条件(例如,高温和/或低盐含量)下,退火至靶mRNA区域。合适的方案(涉及0.1xSSC,68℃,持续2小时)被描述于Maniatis,T.等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,1982,387-389页。
除非另外说明,则本文中提及的核酸序列以5’至3’方向书写。术语“核酸”是指DNA或RNA或其修饰形式,其包含存在于DNA中的(腺嘌呤″A″,胞嘧啶″C″,鸟嘌呤″G″,胸腺嘧啶″T″)或存在于RNA中的(腺嘌呤″A″,胞嘧啶″C″,鸟嘌呤″G″,尿嘧啶″U″)嘌呤或嘧啶碱基。本文中提供的干扰RNA可以包含″T″碱基,例如在3’端,即使″T″碱基并不天然出现在RNA中。在一些情况中,这些碱基可以作为″dT″出现以区分存在于核糖核苷酸链中的脱氧核糖核苷酸。
当用于限定用于设计siRNA的数据库中的转录本变体时,如以上限定的靶序列被描述为靶DNA序列,而使用的具体化合物将是如此限定的RNA序列。
本领域技术人员能够通过公共数据库评估任何靶基因序列。例如,对应于人NRARPmRNA的GenBank登录号为NP_001004354.1和NM_001004354.2(Gene ID:441478)。此外,ENSEMBL(MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute)具有以下NRARP人登录号:ENSG00000198435。该信息全部在免费接入的Ensembl数据库中。
通过本发明鉴定的所述优化的靶区域包含至少一个选自SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.9的序列或由其组成。
在优选的实施方案中,所述优选的靶区域包含SEQ ID NO.1或由其组成。
这些序列在以下物种间呈现100%同源性:人(Homo sapiens),小鼠(Musmusculus),大鼠(Rattus norvegicus),家犬(Canis 1upus familiaris)和家猪(Susscrofa domestica)。
在RNAi领域,当体外研究证明人siRNA不能够引起动物模型基因的敲低时,合成替代化合物(动物活性类似物)以分析siRNA在相关动物模型中的效力。该替代物被设计成针对与人siRNA相同的区域,因此两种siRNA除了一些核苷酸以外(这取决于人和动物靶基因之间的同源性)具有相同的序列。该方法已被广泛用于开发其他寡核苷酸,特别是用于毒理学和效力研究{Kornbrust D等2013}。
在更优选的实施方案中,所述优选的靶区域包含SEQ ID NO.1(5’-CACCAGGACATCGTGCTCT-3’)或由其组成。
因此,根据本发明的数个方面的siRNA将优选地包含双链RNA分子,所述双链RNA分子的反义链将包含与至少一个由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成的序列基本上互补的RNA序列,并且其正义链将包含与所述反义链互补的RNA序列,其中两条链通过核苷酸之间的标准碱基配对杂交。更优选地,根据本发明的数个方面的siRNA将优选地包含双链RNA分子,所述双链RNA分子的反义链将包含与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9基本上互补的RNA序列,并且甚至更优选地,所述反义链包含与SEQ ID NO.1基本上互补的RNA序列或由其组成。
在本发明的语义中,与靶mRNA序列″基本上互补″也可以被理解为与所述靶序列″基本上相同″。如本领域技术人员所知道的,″同一性″是如通过在序列之间进行核苷酸次序和同一性的匹配确定的核苷酸序列之间序列亲缘关系的程度。在一个实施方案中,与靶mRNA序列具有85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%互补性的siRNA的反义链被认为是基本互补的并且可用于本发明。互补性百分比描述了第一核酸分子中可以在Watson-Crick意义上与第二核酸分子中的一组连续核苷酸碱基配对的连续核苷酸的百分比。在优选的实施方案中,反义siRNA链与靶mRNA序列100%互补,并且在siRNA的双链部分正义链与反义链100%互补。siRNA也可以包括未配对的突出端,例如,3’二核苷酸突出端,优选为dTdT。
在优选的实施方案中,本发明鉴定的所述眼部病症(优选地视网膜眼部病症)是与新血管形成相关的疾病或病症。更优选地,所述眼部病症选自年龄相关性黄斑变性(AMD),缺血性视网膜病变,糖尿病黄斑水肿(DME),增生性糖尿病视网膜病变(PDR),糖尿病视网膜缺血(DRI),糖尿病视网膜水肿(DRE),近视新血管形成和早产儿视网膜病变(ROP)及其组合。
如现有技术中已知的,许多不同的结构已被建议用于实现RNA干扰。通常这些分子的长度为约19至约25个核苷酸,并且包括平端的结构以及具有突出端的那些。突出端已被描述为是有利的并且可以存在于任一条链的5’端或3’端上,因为其减少RNA酶的识别并且模仿Dicer的天然底物。一些作者建议在分子的两个3’端都包含突出端,而其他认为一个突出端是足够的。其他描述了使用具有特殊修饰模式的平端结构(EP1527176,WO2005062937,WO2008104978,EP2322617,EP2348133,US20130130377等等)。
突出端可以由1至5个核苷酸组成;典型地突出端由两个核苷酸形成。本领域中使用的典型分子,包含19个核苷酸的双链分子,其还包含3’二核苷酸突出端,所述突出端优选地包含脱氧核苷酸,如Tuschl的初始研究所教导的(WO0244321)。据说这些突出端进一步增强对核酸酶(RNA酶)分解的抗性。之后,Kim等2005描述了21体产品(含二核苷酸突出端)对于加载到RISC上是必要的。此外,Bramsen等2009描述了将可能的去稳定化修饰引入至突出端以进一步增加沉默效率。
因此,本发明的不同方面的优选的实施方案涉及靶向至少一个选自由SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.9组成的组的序列的siRNA分子,其包含至少一个突出端,优选地在正义链和/或反义链中的3’突出端。更优选地,所述siRNA分子靶向SEQ ID NO.1。当本发明涉及靶向至少一个选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9的序列的siRNA分子时,所述siRNA将包含与靶标具有相等长度并且互补的反义链以及与所述反义链具有相等长度并且互补的正义链。所述反义链和正义链还可以包括不与另一条链或靶标互补和/或不在siRNA的双链部分配对的额外的碱基。例如,SEQ ID NO 1是19个核苷酸序列;siRNA可以包含19个bp的双链区域(在该部分具有序列同一性)以及额外的二核苷酸突出端。
本发明的不同方面的优选的实施方案涉及靶向至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成的组的序列的siRNA分子,其中双链siRNA分子的各条链的长度为约18至约28个以上(例如,约18,19,20,21,22,23,24,25,26,27或28个以上)的核苷酸。
本发明的不同方面的另一个优选的实施方案涉及长度为18-28个核苷酸以上并且包含选自由SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.18组成的组的核苷酸序列的siRNA分子。更优选地,双链siRNA分子的长度为至少19个核苷酸并且选自由SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.18组成的组。
本发明的不同方面的另一个备选的实施方案提供平端的分子。
此外,本发明的优选的实施方案涉及靶向至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.9组成的组的序列的包含19个核苷酸的双链结构或由其组成的siRNA。更优选地,靶向至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成的组的序列,并且甚至更优选地靶向SEQ IDNO.1的包含19个核苷酸的双链结构或由其组成的siRNA。
本发明的一个特别的实施方案涉及靶向至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.9组成的组的序列的19个核苷酸的双链平端的siRNA。更优选地,所述siRNA靶向至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成的组的序列,并且甚至更优选地所述siRNA靶向SEQ ID NO.1。在另一个特别的实施方案中,该化合物包含至少一个选自由SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.18组成的组的序列或由其组成。在另一个优选的实施方案中,该siRNA的反义链与至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成的组的序列至少80%,优选地至少90%互补。
在优选的实施方案中,该化合物包含至少一个选自由SEQ ID NO.10至SEQ IDNO.18组成的组的序列或由其组成。
在另一个优选的实施方案中,该化合物包含正义链和与所述正义链互补的反义链或由其组成,所述正义链包含至少一个选自由SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.18组成的组的序列或由其组成。
在更优选的实施方案中,该化合物包含SEQ ID NO.10(5’-CACCAGGACAUCGUGCUCU-3’正义链和5’-AGAGCACGAUGUCCUGGUG-3’反义链,这对应于名称为SYL136001的我们的参比化合物)或由其组成。
此外,如发明背景部分中所述,siRNA分子的重要问题是由于RNA酶的普遍性导致其在生物液体中的不稳定性。因此,已经描述了将多种不同的化学修饰用于核苷酸以增强化合物稳定性。
siRNA分子的另一固有问题是其免疫原性,其中发现siRNA引起先天免疫系统的非特异性激活,包括上调某些细胞因子,例如I型和/或II型干扰素以及IL-12,IL-6和/或TNF-α生产。据信这些作用的起因是siRNA激活Toll样受体如TLR7,TLR8和/或TLR3。
这两种作用,RNA酶识别和免疫原性,也都已经被描述为是依赖于序列的。
一些通过减小对RNA酶的敏感性来增强化合物稳定性的化学修饰也能够减少引起免疫识别并且因此减少随后的免疫应答。然而,在siRNA中插入化学修饰的核苷酸也可能导致如之前的部分中所述的减小的沉默效力,并且因此必须谨慎接近。
因此,在本发明不同方面的优选的实施方案中,siRNA还包含至少一个具有化学修饰的核苷酸。
增强稳定性并且减小免疫原性作用的优选的化学修饰包括2’-O-甲基核苷酸,2’-氟核苷酸,2’-氨基核苷酸,2’-脱氧核苷酸,或含2’-O或4’-C亚甲基桥的核苷酸。用于核酸外切酶保护的其他优选的化学修饰包括ExoEndoLight修饰方式(EEL):将正义链中的所有嘧啶修饰成2’-O-甲基残基,以及将反义链中的5’-UA-3’或5’-CA-3’基序中的所有嘧啶修饰成2’-O-甲基残基。此外,正义链的位置1也可以变成2’-O-甲基以防止正义链的5’-磷酸化并且因此增加siRNA的链特异性。此外,正义链也可以在位置14包含2’-O-甲基修饰,因为该位置处的2’-O-Me残基使正义链失活并且因此增加siRNA的链特异性。此外,用于核酸酶保护的其他优选的化学修饰包括甲基-氟修饰方式(MEF):交替的2’-氟和2’-O-甲基修饰,在正义链上以2’-F开始(5’端)并且在反义链上以2’-O-Me开始。此外,正义链的位置1也可以被变为2’-O-Me并且反义链的位置1也可以被变为2’-F(因为2’F残基与5’-磷酸化相容而2’O-Me残基体积大并且通常破坏磷酸化)。该修饰方式不仅使所述分子稳定而且还使RISC不能够使用正义链,由此促进链特异性。此外,核糖核苷酸主链的修饰可以通过使用硫代磷酸酯键代替磷酸二酯连接来结合核苷酸而进行。本发明的含义内的另一个优选的化学修饰涉及:4’硫代核糖,5-丙炔基尿嘧啶3’,5’-甲基尿苷或用脱氧胸苷(脱氧核糖核苷酸)置换尿嘧啶核糖核苷酸。在本发明的另一个优选的实施方案中,核糖核苷酸主链中的至少一个化学修饰的核苷酸和/或至少一个化学修饰在正义链上,在反义链上或在siRNA的两条链上。
因此,在一个实施方案中,siRNA包含至少一个具有正义链和/或选自由SEQ IDNO.19至SEQ ID NO.66组成的组的反义链或由其组成。
在优选的实施方案中,siRNA包含正义链和与所述正义链互补的反义链或由其组成,分别地,所述正义链包含至少一个选自由以下组成的组的序列或由其组成:SEQ IDNO.19,SEQ ID NO.21,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.27,SEQ ID NO.29,SEQ IDNO.31,SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37,SEQ ID NO.39,SEQ ID NO.41,SEQ IDNO.43,SEQ ID NO.45,SEQ ID NO.47,SEQ ID NO.49,SEQ ID NO.51,SEQ ID NO.53,SEQ IDNO.55,SEQ ID NO.57,SEQ ID NO.59,SEQ ID NO.61,SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.65,所述反义链选自由以下组成的组:SEQ ID NO.20,SEQ ID NO.22,SEQ ID NO.24,SEQ ID NO.26,SEQ ID NO.28,SEQ ID NO.30,SEQ ID NO.32,SEQ ID NO.34,SEQ ID NO.36,SEQ IDNO.38,SEQ ID NO.40,SEQ ID NO.42,SEQ ID NO.44,SEQ ID NO.46,SEQ ID NO.48,SEQ IDNO.50,SEQ ID NO.52,SEQ ID NO.54,SEQ ID NO.56,SEQ ID NO.58,SEQ ID NO.60,SEQ IDNO.62,SEQ ID NO.64和SEQ ID NO.66。
如上所述的siRNA分子可以使用本领域中已知的方法以其天然结构递送至细胞内部。例如,当研究体外基因沉默时,使用标准转染试剂施用这些化合物。为了实现体内作用,这些化合物也可以裸露地(naked)或使用递送增强剂如例如脂质体,与特定部分缀合等施用,尽管多种不同的备选方案是本领域中已知的,并且根据体内所需的靶位点而被差异性使用。
备选地,本发明的不同方面的siRNA分子可以自真核启动子在细胞内表达。能够表达siRNA分子的重组载体可以被递送并保留在靶细胞中。备选地,可以使用提供核酸分子的瞬时表达的载体。如果需要,此种载体可以被重复施用。在表达后,所述siRNA分子与靶mRNA相互作用并产生RNA干扰反应。以此方式产生的siRNA分子通常被称为shRNA(短发夹RNA),因为其正义链和反义链通过小的核苷酸环连接。表达siRNA分子的载体的递送可以是全身性的,如通过静脉内或肌肉内施用,通过施用至从受试者中外植的靶细胞继之以重新引入所述受试者中,或通过任何其他允许引入到所需的靶细胞中的方式。
本发明的另一个方面涉及将靶向至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成的组的序列的siRNA用于制备药物,所述药物用于治疗特征为增加的NRARP表达和/或活性的眼部病症的方法中。更优选地,所述序列是SEQ ID NO.1。所述方法包括抑制NRARP在患者中的表达。术语抑制用于表示表达或活性的下降或下调。优选地,所述眼部病症是与新血管形成相关的疾病或病症。在一个实施方案中,所述眼部病症选自包含以下各项的组:年龄相关性黄斑变性(AMD),缺血性视网膜病变,糖尿病黄斑水肿(DME),增生性糖尿病视网膜病变(PDR),糖尿病视网膜缺血(DRI),糖尿病视网膜水肿(DRE),近视脉络膜新血管形成(通常也被称为视网膜下新血管形成,富克斯斑(Fuchs’spot)或福-富二氏视网膜斑(Forster-Fuchs’retinal spot),以及病理性近视中的盘状变性)和早产儿视网膜病变(ROP)及其组合。
还提供治疗特征为增加的NRARP表达和/或活性的眼部病症的方法。所述方法包括抑制NRARP在患者中的表达。所述方法可以包括施用靶向至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成的组的序列的siRNA。更优选地,所述序列是SEQ ID NO.1。
预期利用针对NRARP mRNA的siRNA的治疗性治疗与常规的抗-血管生成治疗剂相比具有益处,这是由于其特异性,稳定性,效力,天然作用机制,以及与靶向相同或不同的基因靶标的其他siRNA试剂一致的化学性质(因为其区别仅在于核苷酸序列)。基于siRNA的治疗阻断靶蛋白的合成,这将促进NRARP基因表达的持续下降以及可以避免玻璃体内注射的后果的更长的持续作用。这在如与新血管形成相关的疾病或病症的情况中尤为重要,所述疾病或病症包括但不限于年龄相关性黄斑变性(AMD),缺血性视网膜病变,糖尿病黄斑水肿(DME),增生性糖尿病视网膜病变(PDR),糖尿病视网膜缺血(DRI),糖尿病视网膜水肿(DRE),近视新血管形成和早产儿视网膜病变(ROP),因为它们通常是慢性病症,在其治疗期间需要多次玻璃体内注射。重复的眼内注射增加有害副作用的风险,所述有害副作用尤其包括增加的眼内压,炎症,出血,感染,视网膜或周围神经或结构的损伤,视力丧失,而且还有来自在所述过程期间使用的药物的副作用,如来源于抗生素或扩瞳药的使用的那些。此外,siRNA可以被改造(少至一个核苷酸)以沉默不同于野生型等位基因的突变体等位基因的表达。因此,通过选择性地使疾病突变体等位基因失活同时允许野生型蛋白继续表达,基于siRNA的治疗可以有利地调节具有点突变的基因的表达以减缓或甚至预防疾病。
要记住,在此种药物的制备中,本发明的不同方面的siRNA可以被配制成药物组合物。优选地,所述siRNA的组合物和制剂可以被局部施用于目的器官。在甚至更优选的实施方案中,其可以被配制成用于局部施用至眼睛,优选地施用至眼睛的角膜表面。向角膜表面的施用可以例如以滴眼液,凝胶,洗液,膏剂或眼用嵌入剂的形式。向眼施用的其他形式可以包括向眼睛中注射。
本发明的不同方面的另一个优选的实施方案涉及如前文中所述的特异性靶向至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成的组的序列的siRNA,其用作用于治疗特征为增加的NRARP表达和/或活性的眼部病症的药物。更优选地,所述序列是SEQ ID NO.1。如上所述,其可以是包含靶向至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成的组的序列的19个核苷酸的双链结构或由其组成的siRNA。该siRNA可以是平端的。优选地,所述siRNA包含至少一个选自由SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.18组成的组的序列或由其组成。用于根据本发明的用途的其他siRNA包含至少一个具有正义链和/或选自由SEQ ID NO.19至SEQ IDNO.66组成的组的反义链的序列或由其组成。
在本发明的语境中,为了″特异性靶向″一个序列,本发明的siRNA优选地包含至少相同的种序列(seed sequence)。因此,特异性靶向至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.9组成的组的序列的任何根据本发明的序列优选地在反义链的位置2-8处是相同的。更优选地,所述选择的被特异性靶向的序列是SEQ ID NO.1。
不同于以上,本发明的不同方面的siRNA还可以用于沉默除眼睛以外的组织中的NRARP表达。因此,所述siRNA应当据此配制。
例如,siRNA分子可以包含递送载体,包括脂质体,以用于施用至受试者。载体和稀释剂及其盐可存在于药用制剂中。核酸分子可以通过本领域技术人员已知的多种方法施用至细胞,所述方法包括但不限于,囊封在脂质体中,通过离子透入法,或通过结合到其他载体中,如可生物降解的聚合物,水凝胶,环糊精聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和PLCA微球体,可生物降解的纳米囊,和生物粘合剂微球体,或通过蛋白质载体。细胞内递送组件也可以是病毒组件,其包括但不限于,破坏内体从而允许核酸避免溶酶体分解的成融病毒肽,维持表达的病毒蛋白(例如整合酶,LTR元件,rep蛋白,oriP和EBNA-1蛋白)或与细胞表面蛋白相互作用的病毒组件)。合适的病毒细胞内递送组件包括但不限于,反转录病毒,单纯疱疹病毒,腺病毒和优选地腺病毒伴随病毒(AAV)。在一个实施方案中,siRNA分子通过将病毒和脂质体组件结合的细胞特异性siRNA载体递送。在另一个实施方案中,本发明的核酸分子也可以与聚乙烯亚胺及其衍生物,如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物配制或复合在一起。本发明的优选的组合物是水溶液,特别是盐水溶液如具有约7.0至约7.4的pH范围,优选地具有7.2±0.5的pH的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
本发明的siRNA分子可以与破膜剂和/或阳离子脂质或辅助脂质分子复合在一起。
可与本发明一起使用的递送系统包括,例如,含水的和不含水的凝胶,膏剂,复合型乳剂,微乳剂,脂质体,软膏,水溶液和非水溶液,洗液,气溶胶,烃类基质和粉剂,并且可以含有赋形剂如增溶剂,渗透增强剂(例如,脂肪酸,脂肪酸酯,脂肪醇和氨基酸),和亲水性聚合物(例如,聚卡波非和聚维酮)。在一个实施方案中,所述药用载体是脂质体或经皮增强剂。
本发明的药物制剂的形式适用于施用,例如,全身或局部施用到细胞或受试者(包括例如人)中。合适的形式部分取决于用途或进入途径,例如口服,经皮或通过注射。其他因素是本领域中已知的,并且包括需要考虑的事项如毒性和阻止组合物或制剂发挥其作用的形式。
本发明还包括制备成用于储存或施用的组合物,其包含在药用载体或稀释剂中的药物有效量的所需化合物。可用于治疗用途的载体或稀释剂是药物领域中已知的。例如,可以提供防腐剂,稳定剂,染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠,山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。此外,可以使用抗氧化剂和助悬剂。
药物有效剂量是预防疾病状态,抑制疾病状态的发生或治疗(在一定程度上减轻症状,优选地全部症状)疾病状态所需的剂量。药物有效剂量通常取决于疾病的类型,所用的组合物,给药途径,受治的哺乳动物类型,考虑的具体哺乳动物的身体特性,伴随的药物治疗,以及本领域技术人员认可的其他因素。
治疗有效量也可以是指足以延缓或最小化与新血管形成(优选地,脉络膜或视网膜的新血管形成)相关的眼部病症的发作的siRNA的量。治疗有效量也可以是指在与新血管形成(优选地,脉络膜或视网膜的新血管形成)相关的眼部病症的治疗或处理中提供治疗益处的治疗剂的量。此外,关于本发明的siRNA的治疗有效量表示在与新血管形成(优选地,脉络膜或视网膜的新血管形成)相关的眼部病症的治疗或处理中提供治疗益处的治疗剂(单独地或与其他治疗组合)的量。在与本发明的siRNA的量一起使用时,该术语可以包括改善整体治疗,减少或避免非所需的作用,或增强另一种治疗剂的治疗效力或与另一种治疗剂具有协同效应的量。
与新血管形成相关的眼部病症的治疗或处理中的治疗益处是新血管形成的持续减少。已知siRNA将减少NRARP在细胞内的水平,在治疗停止后,细胞必须重新合成新的蛋白质。因此,与使用被设计成用于抑制NRARP或阻断VEGF受体或与新血管形成相关的其他蛋白的功能的小分子所预期的效果相比,基于siRNA治疗的疗法将具有更持续的效果。这被认为是治疗效力的显著增强。
使用siRNA的另一个益处是通常与若干基于滴眼液的治疗相关的源于其在体循环中的存在的副作用或毒性的最小可能性。这是由于当所述化合物进入血流时,其将被存在于血液中的RNA酶快速分解。
另一方面,可以将siRNA分子以单剂量小瓶出售的事实意味着可以避免向制剂中添加抗菌防腐剂。这些防腐剂可能在某些患者中产生不耐性,从而使得需要停止治疗。
优选的给药途径之一是局部给药,通过直接向眼睛滴注,优选地使用滴眼液。考虑到绝大部分目前批准的用于治疗视网膜疾病的药物是通过玻璃体内注射递送的,预期患者的生活品质也会提高,因为滴眼液导致较小的不适并且比玻璃体内注射的副作用少。
然而,如以上说明的,也可以使用除直接向眼睛给药以外的给药途径。制剂中采用的精确剂量和给药时间安排也将取决于给药途径。技术人员将理解,采用的精确剂量和给药时间安排还取决于病症的严重性,并且应当根据医生的判断和各患者的情况来决定。同样被理解的是,任何特定受试者的具体剂量水平取决于多种因素,包括采用的具体化合物的活性,年龄,体重,总体健康,性别,饮食,给药时间,给药途径,和排泄率,药物组合和进行治疗的特定疾病的严重性。
本发明的和本文中所述的制剂或siRNA可以含常规无毒性药用载体,助剂和/或赋形剂的单位剂量制剂施用。制剂的形式可适用于口服使用,例如,作为片剂,锭剂(troch),锭剂(lozenge),水或油混悬剂,可分散粉剂或粒剂,乳液,硬或软胶囊,或糖浆或酏剂。用于口服使用的组合物可以根据本领域中任何已知的用于制备药物组合物的方法制备并且此种组合物可以包含一种更多种此种增甜剂,调味剂,着色剂或防腐剂以提供药学上好的且适口的制剂。片剂含有与适用于制备片剂的无毒性药用赋形剂混合的活性成分。
这些赋形剂可以例如是惰性稀释剂;如碳酸钙,碳酸钠,乳糖,磷酸钙或磷酸钠;粒化剂和崩解剂,例如,玉米淀粉,或藻酸;粘合剂,例如淀粉,明胶或阿拉伯树胶;和润滑剂,例如硬脂酸镁,硬脂酸或滑石。片剂可以是无涂层的或者可以通过已知技术使其具有涂层。在一些情况中,可以通过已知技术制备此种涂层以延迟在胃肠道中的崩解和吸收并且由此提供长时间的持续作用。例如,可以使用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服用制剂也可以呈现为硬明胶胶囊,其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如,碳酸钙,磷酸钙或高岭土)混合,或呈现为软明胶胶囊,其中活性成分与水或油介质(例如花生油,液体石蜡或橄榄油)混合。
水性混悬液包含与适于制备水性混悬液的赋形剂混合的活性物质。所述赋形剂是混悬剂,例如,羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶;分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂(phosphatide),例如,卵磷脂,或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物,例如,聚氧乙烯硬脂酸酯,或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物,例如,十七乙烯氧基鲸蜡醇,或环氧乙烷与来源于脂肪酸与己糖醇的偏酯的缩合产物,如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯,或环氧乙烷与来源于脂肪酸与己糖醇酐的偏酯的缩合产物,例如,聚乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬液还可以包含一种或多种防腐剂,例如,乙基-或正丙基-对羟基苯甲酸酯,一种或多种着色剂,一种或多种调味剂,和一种或多种增甜剂,如蔗糖或糖精。
油性混悬液可以通过将活性成分混悬在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或在矿物油(如液体石蜡)中而配制。油性混悬液可以包含增稠剂,例如,蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入增甜剂和调味剂以提供可食用的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸进行保存。
适于通过加入水来制备水性混悬液的分散的粉剂和颗粒剂提供与分散剂或润湿剂、混悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散剂或润湿剂或混悬剂例如上文已经提及的那些。也可以存在另外的赋形剂,例如,增甜剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以以水包油乳液的形式存在。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。适当的乳化剂可以是天然存在的树胶,例如,阿拉伯树胶或黄蓍树胶,天然存在的磷脂,例如大豆、卵磷脂,和来源于脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯或偏酯,例如,失水山梨糖醇单油酸酯,和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物,例如,聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。乳液还可以包含增甜剂和调味剂。
糖浆和酏剂可以用增甜剂进行配制,所述增甜剂例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖。所述制剂还可以包含缓和剂、防腐剂和调味剂和着色剂。本发明的和本文所述的药物组合物或siRNA可以以无菌注射用水性或油脂性混悬液的形式存在。
这种混悬液可以按照已知技术使用上文已经提及的那些适当的分散剂或润湿剂和混悬剂来配制。
无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可用的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液,例如,作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的赋形剂和溶剂是水、Ringer′s溶液和等渗氯化钠溶液。另外,无菌不挥发的油常用作溶剂或混悬介质。为了这一目的,可以使用任意温和的不挥发的油,包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外,脂肪酸,如油酸,也用于制备注射剂。
在优选的实施方案中,本发明的组合物配制在溶液中,优选地配制在缓冲的盐水溶液中,如PBS,或在用于局部给药到眼睛的凝胶中,如例如,以滴眼剂的形式。在此类实施方案中,所述制剂可以是阳离子乳液和/或包含生物聚合物,包括,但不限于,聚(丙交酯-共-乙交酯),卡波普、透明质酸和聚丙烯酸。
本发明的核酸分子还可以以栓剂的形式给药,例如,用于药物的直肠给药。这些组合物可以通过将药物与适当的无刺激性赋形剂混合而制备,所述赋形剂在常温是固体的但是在直肠温度是液体的,并且因此在直肠中熔融以释放药物。此类物质包括可可脂和聚乙二醇。
本发明的核酸分子可以在无菌介质中肠胃外给药。取决于所用的赋形剂和浓度,药物可以混悬或溶解在赋形剂中。有利地,辅药,如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂,可以溶解在赋形剂中。
由此,本发明的另一个优选的实施方案涉及药物组合物,其中所述组合物至少包含靶向至少一个选自由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成的组的序列的siRNA,如在前述段落中所述。更优选地,所述序列是SEQ ID NO.1。
本发明的核酸分子还可以与其他治疗性化合物组合施用给受试者,以增加整体治疗效果。使用多种化合物来治疗适应证可以增加有益的效果同时减少副作用的存在。
包含以下定义以有助于理解本发明。
通过″治疗″,申请人意在涉及医学上的治疗。该术语包括施用本发明的化合物以减轻视网膜疾病的症状,如伴随黄斑变性的视觉敏锐度下降,以及处理与疾病相关的生理变化,如伴随所述病症的异常血管生长。
术语″视网膜疾病″表示由多种和不同的病因所致的任何其中视网膜受影响的疾病。
术语″血管化″是指具有红血球灌注的功能性微血管网络的形成过程。
术语″血管发生″是指毛细血管芽(bud或sprout)从现有的血管中突出和长出。
术语″视网膜新血管形成(RNV)″是指新的血管在视网膜中的萌发。
术语″脉络膜新血管形成(CNV)″是指新的血管从脉络膜血管系统中萌发。
术语″与新血管形成相关的疾病或病症″涉及产生上述病理性新血管的任何疾病或病症。对于此种疾病或病症,可以提及年龄相关性黄斑变性(AMD),缺血性视网膜病变,糖尿病黄斑水肿(DME),增生性糖尿病视网膜病变(PDR),糖尿病视网膜缺血(DRI),糖尿病视网膜水肿(DRE),近视新血管形成,视网膜中央静脉闭塞(CRVO)和早产儿视网膜病变(ROP)等等,但是不限于此。与新血管形成相关的其他眼睛疾病或病症包括,例如,虹膜新血管形成(Rubeosis iridis)和角膜新血管形成(CN)。虹膜新血管形成通常与糖尿病,视网膜母细胞瘤,视网膜中央静脉闭塞,眼缺陷综合征或慢性视网膜脱离相关。角膜新血管形成通常由佩戴隐形眼镜所致,尽管其也与创伤或损伤所致的以及源自眼睑炎,葡萄膜炎或角膜炎,角膜溃疡,青光眼和其他眼表疾病如红斑痤疮或狼疮的炎症相关。
黄斑变性,也被称为年龄相关性黄斑变性(AMD),是在美国在50岁以上的人中视力丧失的最常见的原因,并且其普遍性随年龄而增加。AMD的根本病因似乎是视网膜的光感受器的外部的更新过程所产生的残余物质在视网膜色素上皮(RPE)中累积。此未分解的物质在RPE中的累积(被称为玻璃疣)导致产生炎性介质,所述炎性介质导致视网膜中央(或黄斑)中的光感受器变性(Bird AC,2010)。黄斑的中央,被称为小窝(fovea),介导高敏锐度视力;因此其变性导致严重的视力丧失。在所述疾病的早期,玻璃疣的累积是小的并且通常与RPE的色素减退或色素沉着过度一起被观察到。随着所述疾病的进展,玻璃疣的尺寸和数量都增加。AMD被分类为湿性(新生血管)或干性(非新生血管)。该疾病的干性形式是最常见的。其在视网膜中央变形,着色或最常见的,变薄(与视网膜色素上皮萎缩和黄斑光感受器损失相关的过程)时发生。结果是中央地图形萎缩。所述疾病的湿性形式比干性形式更严重并且导致严重的视力丧失。湿性形式通常与老化相关,但是其他可以导致湿性黄斑变性的疾病包括重度近视和一些眼内感染如组织胞浆菌病(histoplasmosis),其在患有AIDS的个体中可能加重。湿性形式特征为通过视网膜色素上皮的异常血管生长,其导致出血,渗出,结瘢或视网膜脱离。
缺血性视网膜病变是CNV和RNV两者发病的常见组成。缺血导致细胞缺氧,这激活细胞信号转导途径以上调血管生成刺激物如血管内皮生长因子(VEGF)的表达。VEGF是一种分泌的糖蛋白,其具有潜在的促血管生成活性。VEGF结合内皮细胞上的VEGF受体(VEGFR)以刺激细胞增殖和迁移。许多研究已经证明在CNV和RNV发病期间VEGF被上调,并且VEGF是CNV和RNV发病的关键介质。
糖尿病视网膜病变(DR)仍然是发达国家中工作年龄的个体失明的最重要原因。增生性糖尿病视网膜病变(PDR)是1型糖尿病中最常见的威胁视力的病变,而糖尿病黄斑水肿(DME)是2型糖尿病中不良视力敏锐度的主要原因。由于2型糖尿病的高的普遍性,DME是糖尿病患者中视力受损的主要原因。在基于大群体的研究中,在10年的时间里,DME的发病率在患有1型糖尿病的患者中为20%而在患有2型糖尿病的患者中该比率为几乎40%。此外,当在2型糖尿病患者中检测到PDR时,几乎一定存在DME。重度近视所致的新血管形成是PDR的标志,而由于BRB破损所致的血管渗漏是DME发病中涉及的主要事件。
早产儿视网膜病变(ROP)发生于在视网膜发育的血管生成期结束前暴露于相对高氧的早产婴儿中。这是有问题的,因为视网膜发育的血管生成期通常由子宫中的低氧驱动。因此,在ROP中正常的血管生成视网膜发育被妨碍,从而导致血管消除(vaso-obliteration)和形成在很大程度上无血管的视网膜。在没有充足血液供应的情况下,无血管视网膜缺血,这促进破坏性RNV,并且可能导致视网膜脱离和瘢痕组织形成,从而导致永久性视力丧失。
术语“患者”用在本文中是指动物,包括哺乳动物,优选人。
在下述非限制性实施例中将进一步描述本发明。
实施例
1.体外分析
1.1,转染SEQ ID NO.10,SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13后NRARP的基因表达水平。
利用作为转染剂的Lipofectamine 2000将人HeLa细胞转染以100nM的19bp平端dsRNA之一,所述dsRNA由正义链和互补的反义链组成,所述正义链由以下序列之一组成:SEQ ID NO.10(SYL136001),SEQ ID NO.11(SYL136005),SEQ ID NO.12(SYL136003)和SEQID NO.13(SYL136004)。各SEQ ID NO.后的SYL索引涉及对dsRNA化合物的索引。注意,在这些实施例中(除非上下文中明确另有所指),当提及施用或转染特定的SEQ ID NO时,这指示施用或转染19bp dsRNA,所述dsRNA由正义链和互补的反义链组成,所述正义链由SEQ IDNO组成,如图2和3中所示。遵循标准的生产商说明进行所有转染。在相同的实验中,乱序(scrambled)siRNA序列被用作干扰特异性的对照。将细胞沉淀物收集并处理以评估作为siRNA作用机制的结果的mRNA水平的可能的变化。通过实时PGR使用相对定量方法,比较阈值2-ΔΔCT法来量化RNA水平。{Livak和Schmittgen,2001}。所有实时定量PGR实验一式三份地进行并且在三个独立实验中重复。计算平均值和SEM并且显示在图中。如图4所示,在三个研究的时间点,响应于SEQ ID NO.10,SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的转染,人HeLa细胞中的NRARP mRNA水平显著下降(50-60%)。如预期的,在任何研究的时间点,乱序siRNA序列都不调节NRARP表达水平。
1.2转染本发明的siRNA后人细胞系的细胞生存力。
为了分析转染本发明的siRNA后的细胞生存力,在利用作为转染剂的Lipofectamine 2000在人HeLa细胞中转染100nM的以下序列之一后研究体外毒性:SEQ IDNO.10,SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13。遵循标准的生产商说明进行所有转染。在相同的实验中,乱序siRNA序列被用作干扰特异性的对照。在转染后的24,48和72小时收集细胞沉淀物并处理以评估细胞生存力的可能的变化。使用来自Promega的CellTiter
Figure BDA0003505417530000273
Aqueous Non-Radiactive Cell Proliferation Assay来测量细胞生存力。该方法是基于活细胞将MTS四唑
Figure BDA0003505417530000274
还原成甲
Figure BDA0003505417530000275
的能力。通过测量490nm处的吸光度来量化甲
Figure BDA0003505417530000276
的量。计算平均值和SEM并标绘在图5中。图5显示,不存在响应于任一以下序列的转染的细胞生存力的变化:SEQ ID NO.10,SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13。概言之,发现本发明的siRNA是无毒性的并且被很好地耐受。
1.3在不同细胞系中转染本发明的未修饰的和化学修饰的siRNA后的NRARP表达水平。
为了提高本发明的siRNA的稳定性并且保证没有免疫原性激活,将不同的siRNA优化化学修饰引入到标准的SEQ ID NO.10序列(SYL136001)中;由此获得以下新的化学修饰的实体:SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.27,SEQ ID NO.29,SEQID NO.31,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39。将新的化学修饰的序列分别转染到人,小鼠和大鼠细胞中以分析其降低NRARP mRNA水平的能力。化学修饰详述在图3中。选择人HeLa,人BEAS-2B和小鼠C2C12细胞,因为这些细胞表达高水平的NRARP并且被认为是用于研究siRNA对NRARP表达的作用的良好模型。利用Lipofectamine(HeLa细胞),MirusTransit-X2(BEAS-2B),Dharmarfect 3(C2C12)和siPORT NeoFX(ARL6)作为转染剂将细胞分别转染以100nM的以下序列之一:SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQID NO.27,SEQ ID NO.29,SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39。在转染后在三个时间点(24,48和72小时)分析基因表达。遵循标准的生产商说明进行所有转染。在相同的实验中,乱序siRNA序列被用作干扰特异性的对照。通过实时PGR使用相对定量方法,比较阈值2-ΔΔCT法来量化RNA水平{Livak和Schmittgen,2001}。所有实时定量PGR实验一式三份地进行并且在三个独立实验中重复。计算平均值和SEM并标绘在图6-9中显示的图表中。图6显示在HeLa细胞中获得的结果。在该细胞系中,SEQ ID NO.10(SYL136001)使NRARP mRNA水平降低60%(转染后24小时)和50%(转染后48和72小时)。化学修饰的SEQ IDNO.19使NRARP mRNA水平降低60%(转染后24小时)和40%(转染后48小时);在转染后72小时,基底水平完全恢复。SEQ ID NO.23使NRARP mRNA水平降低40%(转染后24-48小时)和10%(转染后72小时)。SEQ ID NO.25使NRARP mRNA水平降低50-60%(转染后24-48小时)和20%(转染后72小时)。SEQ ID NO.27使NRARP mRNA水平降低30%(转染后24-48小时)并且在转染后72小时基底水平恢复。SEQ ID NO.29非常有效地使NRARP mRNA水平降低。响应于该序列,在转染后24-48小时观察到约80%的下降;之后mRNA水平提高但是在转染后72h仍然低于基底水平40%。SEQ ID NO.31有效降低NRARP水平,在研究的三个时间点观察到与基底水平相比60%的降低。SEQ ID NO.35使NRARP mRNA水平降低60%(转染后24-48小时);在转染后72小时观察到mRNA水平的迅速恢复,由此NRARP mRNA水平比基底水平低10%。SEQID NO.37是引起NRARP mRNA水平最大下降的化合物。在转染该化合物后24,48和72小时观察到90%,80%和70%的下降。SEQ ID NO.39使NRARP mRNA水平降低70%(转染后24小时)和50%(转染后48小时),之后mRNA水平迅速增加但是在转染后72小时基底水平未完全恢复。图7显示在人BEAS-2B细胞中获得的结果。在该细胞系中,SEQ ID NO.10(SYL136001)和SEQ ID NO.19使NRARP水平降低70%(转染后24小时),之后mRNA水平缓慢增加但是在研究的时限内基底水平未完全恢复,NRARP mRNA水平比基底水平仍然低50%(转染后48小时)和40%-50%(转染后72小时)。SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.27使人BEAS-2B细胞中的NRARPmRNA水平轻微降低,在研究的三个时间点下降为约20-30%;在转染后72小时基底水平未完全恢复。SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.39逐渐地并且以依赖于时间的方式使NRARP mRNA水平降低,在转染后72小时达到50%-60%的最大下降。SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.35有效地使NRARP mRNA水平降低;在研究的三个时间点,响应于任一化合物,mRNA水平比基底水平低约60-70%。SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.37是最有效的产品,其使该细胞系中的NRARP mRNA水平降低,在研究的三个时间点分别导致约80%和90%的迅速且持续的降低。如预期的,在任何研究的时间点,乱序siRNA序列都不使NRARP表达水平降低。图8显示在小鼠C2C12细胞中获得的结果。SEQ ID NO.10(SYL136001)使NRARP水平降低60%(转染后24小时),之后mRNA水平缓慢增加但是在转染后72小时基底水平未完全恢复;在该时间点NARP mRNA水平仍然比基底水平低40%。SEQ ID NO.19使mRNA NRARP水平降低约30%(转染后24小时),在转染后48小时观察到80%的显著降低,之后水平增加但是在转染后72小时NARP mRNA水平仍然比基底水平低40%。SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.27使mRNA NRARP水平轻微降低,在研究的三个时间点观察到的响应于这些序列中的每种的转染的降低为约20-40%。SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.39在转染后24和48小时有效地使mRNA NRARP水平降低,所述时间点的水平分别比基底水平低50%和60%。在转染后72小时对两种序列的响应相对于在前的时间点增加,但是在该时间点基底水平仍未恢复。SEQ ID NO.31在转染后24小时使mRNANRARP水平降低约40%,在转染后48小时发现70%的极大降低,之后水平增加但是在转染后72小时NRARP mRNA水平仍比基底水平低40%。SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.37是在该细胞系中引起NRARP mRNA水平最大下降的化合物,其中SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.37使NRARP mRNA水平降低60%(转染后24小时)和约80%(转染后48小时)。在转染后72小时发生基底水平的部分恢复。再次,如预期的,在研究的任一时间点,乱序siRNA序列都不使C2C12细胞中的NRARP mRNA水平降低。图9显示在大鼠ARL6细胞中获得的结果。SEQ ID NO.10(SYL136001)使NRARP mRNA水平降低50%(转染后24-48小时)和60%(转染后72小时)。SEQID NO.37使NRARP水平降低50%(转染后24小时),60%(转染后48小时)和70%(转染后72小时)。
1.4在不同细胞系中转染本发明的未修饰的siRNA和化学修饰的siRNA后人细胞系的细胞生存力。
为了分析转染本发明的siRNA后的细胞生存力,在分别利用Lipofectamine 2000,Mirus Transit-X2,Dharmafect3作为转染剂在人HeLa和BEAS-2B细胞以及在小鼠C2C12细胞中转染100nM的以下序列之一后进行体外毒性研究:SEQ ID NO.10(SYL13600),SEQ IDNO.19,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.27,SEQ ID NO.29,SEQ ID NO.31,SEQ IDNO.35,SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39。遵循标准的生产商说明进行所有转染。在相同的实验中,乱序siRNA序列被用作干扰特异性的对照。在转染后24,48和72小时收集细胞沉淀物并处理以评估作为siRNA转染的结果的细胞生存力的可能的变化。使用来自Promega的CellTiter
Figure BDA0003505417530000302
Aqueous Non-Radiactive Cell Proliferation Assay来测量细胞生存力。该方法是基于活细胞将MTS四唑
Figure BDA0003505417530000303
化合物还原成甲
Figure BDA0003505417530000304
(其通过490nm处的吸光度测量)的能力。计算每个实验的平均值和SEM并且标绘在图10-12中。图10,11和12显示,在所用的任何细胞系中都不存在响应于任一以下序列的转染的细胞生存力的变化:SEQ ID NO.10(SYL13600),SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.27,SEQ ID NO.29,SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39。此外,还评估在大鼠ARL6细胞中响应于以下序列之一的转染的细胞生存力水平:SEQ ID NO.10(SYL136001)和SEQ IDNO.37,其中使用siPORT NeoFX作为转染剂。图13显示在ARL6细胞中不存在响应于任一受试序列的细胞生存力的显著变化。因此,我们的结论是:所有本发明的siRNA都是无毒性的并且被很好地耐受。
1.5本发明的siRNA对HUVEC细胞的体外模型中的血管发生的效力。
为了研究本发明的siRNA对血管发生的作用,进行这些细胞中的利用HUVEC细胞的实验和NRARP表达的分析。
特别地,这组研究的目的是研究在HUVEC细胞的体外模型中修饰的NRARP siRNASEQ ID NO.37(19bp平端dsRNA,被化学修饰,具有由序列SEQ ID NO.37组成的正义链和互补的由序列SEQ ID NO.38组成的反义链)的抗血管生成作用。
1.5.1引言.
血管发生是从现有的血管中形成新的血管。该过程(在发育和若干其他病理过程期间是必要的)可能在眼中失调从而导致不同类型的视网膜疾病,如年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病视网膜病变(DR)。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)是在自初始来源材料传代1-3次后保存的原代细胞。响应于血管生成剂如VEGF,这些细胞可被诱导形成管状结构。
1.5.2材料.
Multiscribe反转录酶50U/ml(Applied Biosystems P/N 4311235)。
RNA酶抑制剂20U/μl(Applied Biosystems P/N N8080119)。
TaqMan 2X Universal Master Mix。
Qiagen″RNeasy
Figure BDA0003505417530000311
74004。
Human Nrarp探针:Taqman基因表达测定Hs01104102_s1。
GAPDH内源性对照:Taqman基因表达测定Hs00266705_g1。
Rat Nrarp探针:Taqman基因表达测定Rn 03810258_s1
18S内源性对照:Taqman基因表达测定Hs99999901_s1。
1.5.3方法.
i)细胞
HUVEC细胞(Ref:CC-2519/批号:000191772)获得自Lonza。所有实验利用传代6-9次的同一批次细胞进行并且培养物的细胞密度为75-85%。转染使用siPORT NeoFXTM遵循标准程序进行。对于电穿孔,遵循“Hernandez JL等,2004.Angiogenesis.7:235-241”中公布的程序,简言之,通过使用cell
Figure BDA0003505417530000312
600(BTX)以1200μF施加20ms脉冲对1x106个细胞进行电穿孔。每次电穿孔使用2μg的遗传材料进行。
对于效力研究,使用电穿孔方案来转染细胞并且允许恢复24h的时间;之后将细胞以30.000个细胞/孔的密度铺板于96孔板中并且在铺板后6h分析以上提及的参数。在结构分析后,将细胞,培养基和基质胶转移到无RNA酶的管中并加入600μL的缓冲液RLT+β-巯基乙醇。
ii)靶基因表达分析
(1)RNA分离和逆转录
使用RNeasy RNA提取试剂盒(Invitrogen,CA,USA)自细胞培养物分离总RNA。使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,USA)根据生产商的说明将4μg的总RNA逆转录。
(2)qPCR
使用Stepone plus检测系统(Applied Biosystems)进行qPCR。在TaqMan 2XUniversal Master Mix中在以下条件下扩增50纳克的各样品:95℃达10min,之后95℃ 15s和60℃ 1min的40个循环。
1.5.4结果.
考虑到将siRNA引入HUVEC细胞中的电穿孔的成功结果,将该方法用于随后的研究,其中在基质胶上的毛细血管结构的形成,迁移,伤口愈合和增殖测定中评估修饰的NRARP siRNA SEQ ID NO.37的作用。
i)毛细血管结构的形成.
(1)测定设定,
将进行剥夺达4h的时间的15.000个细胞/孔铺板在覆盖有基质胶的96孔板上。将没有补充物的内皮细胞基础培养基(EBM)用作阴性对照(无结构形成)而将具有补充物(hEGF,氢化可的松,牛脑提取物,庆大霉素,肝素)和10%FCS的完全培养基用作阳性对照,其诱导最大数目的管状结构。在3-6个独立实验中一式三份地进行测定。在铺板后24h分析培养物。
此外,已经建立了用于分析结构的新方法。该方法是基于使用由GillesCarpentier为NIH开发的Angiogenesis Analyzer软件ImageJ的5个变量的量化。该软件提供血管生成过程的整体视图。研究的变量显示在图17中。
图18显示响应于完全培养基(补充物+10%FCS)的研究的变量的变化。如图中所示,完全培养基显著增加形成的结构的数量而不改变结构的总面积。
(2)siRNA SEQ ID NO.37的效力.
通过电穿孔转染细胞并且允许在完全培养基中恢复24h并且再进行血清剥夺达两小时;之后将细胞以30.000个细胞/孔的细胞密度铺板在覆盖有基质胶的96孔板上以允许结构形成。在接种后6h和24h分析形成的结构。测定以下条件以测试SEQ ID NO.37的效力:
-未转化的细胞
-伪(sham)电穿孔的细胞
-转染有1μM siRNA抗-KDR(Life Technologies,Ref:145034)的细胞-转染有1μMsiRNA SEQ ID NO:37的细胞。
在没有补充物的培养基中以及在具有10%FCS和100ng/ml VEGF的培养基中测定所有条件。
利用在将细胞接种到基质胶上之前已经在无血清培养基中被剥夺达2h的细胞进行第一测定。该程序轻微地使结构不稳定并且因此在没有剥夺(deprivation)步骤的情况下重复。后面的研究的结果显示在图19和20中。
概言之,电穿孔严重影响细胞功能;因此在伪电穿孔条件和实验条件之间进行比较。在没有补充物的情况下,siRNA-KDR和siRNA-NRARPSEQ ID NO.37都使血管生成结构的形成减少;siRNA-KDR的效果大于siRNA SEQ ID NO.37的效果。在6h时间点,两种siRNA对血管生成结构形成的抑制作用在存在具有补充物的完全培养基的情况下更明显;这可能是由于以下事实,即剥夺细胞的血清和补充物可以降低细胞生存力。将细胞接种在基质胶上后24h进行的分析不是结论性的,因为结构已经开始分解。
ii)对增殖的作用.
(1)设定测定.
将剥夺了24h的细胞以3000个细胞/孔的密度铺板在96孔板中并且在不同条件下培养。五天后,通过MTT测定来评估增殖。使用的条件如下:2%FCS和不同浓度的VEGF(20-30-50ng/ml)。需要2%FCS以使细胞保持基础增殖速率并且避免培养进入细胞捕获(arrest)。图21A显示响应于VEGF(不管测试的浓度如何)的3倍细胞增殖诱导。为了分析抗-VEGF试剂的抑制作用,在存在30ng/ml VEGF和浓度递减(1:2稀释液,从12nM开始)的Bevabizumab(Avastin)的情况下培养细胞以确定IC50。如图21B中所示,发现bevacizumab的IC50为0.85nM。
(2)siRNA SEQ ID NO.37的效力.
将细胞电穿孔并以5000个细胞/孔的密度铺板在涂覆有1%明胶的96孔板中;之后允许细胞恢复24h。在恢复后,将细胞并且培养在补充有10%FCS和100ng/ml VEGF的基础培养基中。铺板后三天,通过MTT分析细胞增殖。测试的条件如下:
-未转化的细胞
-伪电穿孔的细胞
-转染有1μM siRNA抗-KDR(Life Technologies,Ref:145034)的细胞-转染有1μMsiRNA SEQ ID NO.37的细胞。
图22中显示的结果指示,与伪电穿孔的细胞相比,siRNA抗-KDR和siRNA SEQ IDNO.37两者都使VEGF诱导的增殖速率降低约40%。
iii)对迁移的作用.
(1)设定测定.
在具有8μm不透明滤膜的24转移小室(transwell)系统平板(Transwell HTSFluroBlokTM Multiwell Insert System de Becton Dickinson)中进行这些研究。在37℃在2h期间用浓度为15μg/ml的I型胶原蛋白覆盖膜的两面以促进细胞吸附。将细胞以50.000个细胞/孔的浓度铺板并用4h的时间剥夺血清,之后添加迁移刺激物。在转移小室的下部添加刺激物后24h,在用Calcein-AM染色后,分析迁移到上部区室的细胞的数目。
将完全培养基(10%FCS和补充物)中的迁移细胞的数量用作细胞迁移的阳性对照并将该响应与由浓度递增的VEGF(1-10-100ng/ml)所产生的响应相比。
如图23中所示,VEGF诱导迁移到上部区室的细胞的数目的剂量依赖性的增加。响应于最大浓度的VEGF(100ng/ml)观察到对VEGF的响应的最大增加并且响应的程度是基底条件的约5-6倍。
(2)siRNA SEQ ID NO.37的效力.
将细胞电穿孔并且允许其恢复24h;之后将细胞以10.000个细胞/孔的密度铺板于具有涂布有15μg/ml胶原蛋白的8μm不透明滤膜的96转移小室平板上。在存在基础培养基和完全培养基(补充有10%FCS和100ng/ml VEGF)的情况下测定所有测试的条件。测试的条件如下,并且在铺板并用calcein-AM将细胞染色后24h对迁移进行分析:
-未转化的细胞
-伪电穿孔的细胞
-转染有1μM siRNA抗-KDR(Life Technologies,Ref:145034)的细胞-转染有1μMsiRNA SEQ ID NO.37的细胞。
获得的结果指示,电穿孔对细胞的迁移能力具有不利作用;因此将测试的细胞与伪电穿孔条件相比以便排除电穿孔的作用。基础培养基中的细胞不迁移,而10%FCS和100ng/ml VEGF的存在使得细胞迁移至转移小室系统中的相对的孔中。siRNA SEQ IDNO.37或抗-KDR siRNA的电穿孔部分阻断(30%)10%FCS和100ng/ml VEGF的作用(图24和25)。
iv)伤口愈合研究.
(1)设定测定.
将细胞以50.000个细胞/孔的密度铺板在涂覆有1%明胶的96孔板中并且在基础培养基中培养24h。之后,通过刮去培养物的一个狭窄区域来进行病变并且向培养物添加10ng/ml VEGF。借助NIH ImageJ软件在进行病变后立即或在之后24h测量面积并进行比较。愈合面积的百分比量化如下:
伤口愈合(%)=最终的面积/初始面积x 100
如图26所示,与未处理的条件相比,10ng/ml VEGF使得伤口愈合速率增加2.5倍。
(2)siRNA SEQ ID NO.37的效力.
将细胞电穿孔并且允许其恢复24h,之后将细胞以70.000个细胞/孔的密度铺板在涂覆有1%明胶的96孔板中。铺板后24h,通过刮去细胞的一个狭窄区域来引起病变并在引起病变后16h对培养物进行分析。通过用10μM calceine-AM将细胞染色并分析刮去的面积和再次被细胞覆盖的面积的百分比来进行分析。在存在基础培养基和完全培养基(补充有10%FCS和100ng/ml VEGF)的情况下测定所有测试的条件。测试的条件如下并且在铺板后24h对迁移进行分析:
-未转化的细胞
-伪电穿孔的细胞
-转染有1μM siRNA抗-KDR(Life Technologies,Ref:145034)的细胞
-转染有1μM siRNA SEQ ID NO.37的细胞。
如之前的实验,结果显示电穿孔对伤口愈合的不利作用,出于该原因,所有条件都与伪电穿孔的细胞进行比较。如图27和28中所示,siRNA SEQ ID NO.37非常有效地降低基础培养基中的伤口愈合速率。siRNA SEQ ID NO.37的效果甚至要强于阳性对照抗-KDRsiRNA的效果。然而,当在完全培养基中培养细胞时,这种对伤口愈合的作用被掩蔽,最可能是由于FCS对细胞迁移的潜在作用。
v)来自以上提及的实验的细胞中的NRARP mRNA水平.
收集来自以上提及的研究的HUVEC细胞并提取总RNA以通过qPCR分析NRARP靶基因的水平。图29显示响应于siRNA SEQ ID NO.37的电穿孔NRARP mRNA水平下降。
将本研究中呈现的结果放在一起,我们的结论是:如通过增殖,迁移和毛细血管结构的形成的减少所示的,siRNA SEQ ID NO.37在HUVEC细胞中显示抗血管生成作用。
2.体内分析
2.1在通过激光诱导的脉络膜新血管形成的大鼠模型中NRARP在视网膜和脉络膜中的表达
2.1.1目的
本研究的目的是评估在其中通过激光引起CNV的Norway Brown大鼠的视网膜和脉络膜中在不同时间点NRARP的表达。对该靶基因的表达进行分析有两个目的:i)评估NRARP是否响应于CNV而被上调以便研究该靶标是否是以开发用于治疗与新血管形成相关的视网膜疾病的新化合物为目标而被沉默的候选,ii)研究NRARP随时间的表达以确定通过沉默靶基因来治疗动物的最佳时间。
2.1.2引言
CNV是若干脉络膜视网膜疾病共有的非特异性病变。这些病变特征为包括以下的一系列事件:Brunch膜的破裂或破坏,引起炎症和具有脉络膜毛细血管内皮细胞的侵入的血管发生,外膜细胞(perycite)和炎性细胞进入视网膜下空间和/或视网膜下色素上皮{Grossniklaus HE等2010}。脉络膜毛细血管穿透到视网膜下空间中是若干视网膜疾病的共有标志。这些疾病的一些实例包括AMD,PDR或DRE。
可以通过在Brunch膜中引起病变在动物模型中诱导CNV;该病变引发分子事件从而导致特征为增加的血管生成因子和炎性介质的完全爆发的CNV。
我们已将在EyeCRO被验证的Brown Norway大鼠中的激光诱导的CNV模型用于分析所选的靶标在引起病变后的不同时间点的表达。为此目的,在18只动物的每个眼中引起三处病变,然后将所述动物处死并将眼睛收集并送至Sylentis用于进一步分析。分析的靶标为NRARP。NRARP是与血管内皮细胞的激活相关的糖蛋白。该基因在所有癌症中都过表达并且其过表达与转移和低的存活率相关。此外,该基因在人乳腺癌中的表达水平与血管形成相关并且已经发现由该基因编码的蛋白在不依赖于VEGF的情况下在内皮细胞迁移和血管系统生成中起作用{Faibish MR等2011}。
2.1.3方法
i)动物
表1.动物
Figure BDA0003505417530000371
ii)实验组
表2-实验组
Figure BDA0003505417530000372
Figure BDA0003505417530000381
iii)排除标准
在激光施用后在3处激光病变中的≥2个中立即出现出血的任意眼。
所有组织样品都置于具有适当标注的冷冻管(criotube)中,并且立即在液氮中冷冻。冷冻管被标注以实验条件并在干冰上被运至Sylentis。
iv)靶基因表达的分析
(1)RNA分离和逆转录
使用RNeasy RNA提取试剂盒(Invitrogen,CA,USA)自视网膜和脉络膜分离总RNA。使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,USA)根据生产商的说明对4μg的总RNA进行逆转录。
(2)qPCR
使用Stepone plus检测系统(Applied Biosystems)进行qPCR。在TaqMan 2XUniversal Master Mix中在以下条件下扩增500纳克的各样品:95℃达10min,之后95℃15s和60℃ 1min的40个循环。所有qPCR扩增一式三份地进行并且在至少两个独立的实验中重复,所述实验总是包括反转录对照和无模板对照。
2.1.4结果-NRARP的表达
在通过激光引起CNV后的不同时间点在视网膜和RPE/脉络膜中分析NRARP的表达。获得的结果显示在引起激光病变后24h在视网膜中NRARP mRNA水平轻微下降。引起病变后72h,NRARP mRNA水平轻微增加(是时刻=0的1.5倍)。在研究结束时(t=504h),NRARP的水平与在引起病变前观察到的水平相当(图14)。
在引起CNV后6h,在脉络膜/RPE中,NRARP的mRNA水平显著上调(~2.7倍)并且之后开始缓慢下降。在研究的时限内未恢复基底水平(图15)。
2.1.5结论
将该研究的结果放在一起,可以得到这样的结论,即NRARP是有效的靶标,可以开发针对其的治疗以控制视网膜中的新血管形成。视网膜和脉络膜中的表达样式指示,在已知其在本研究中使用的模型中的表达的显著诱导及其在血管发生中的作用的情况下,其可以是良好的沉默候选。
2.2关于激光诱导的脉络膜新血管形成的大鼠模型中病变尺寸和渗漏的减少评估靶向NRARP的siRNA。
2.2.1目的
确定在激光诱导的脉络膜新血管形成的大鼠模型(激光CNV)中局部施用后一种测试试剂(siRNA SEQ ID NO.37)的抗-血管生成/血管破坏作用。
2.2.2研究概要
利用雌性Brown Norway大鼠来进行一项26天的研究以确定在激光诱导的脉络膜新血管形成的模型中局部淌注SEQ ID NO:37的抗-血管生成/血管破坏作用。
将总计18只大鼠分成3组,每组6只大鼠。在第1-26天,第1组和第3组接受载体(第1组)或5mg/ml SEQ ID NO:37(第3组)的每天一次的局部滴注。在第7天,第3组接受5μg/眼的抗-VEGF的双侧玻璃体内注射(阳性对照)。
在第3天,使用520nm热激光进行激光处理以产生总计3处病变/眼。
在第26天(激光处理后3周),进行荧光素血管造影术并且使用图像分析软件(ImageJ)来确定病变尺寸面积。接受5μg/眼的抗-VEGF Ab或5mg/ml SEQ ID NO:37的局部滴注的大鼠与其相应的载体对照组相比显示病变尺寸的显著减小。
2.2.3材料和方法
2.2.3.1大鼠中激光诱导的脉络膜新血管形成(CNV)
第1-26天:局部滴注载体或测试剂,QD(第1组,第2组)
第5天:双侧激光处理以产生3处病变/眼
第7天:双侧玻璃体内注射阳性对照(第3组)
第26天:体内荧光素血管造影术
第26天:摘出眼睛并且分别收集视网膜和RPE/脉络膜
研究组
2.2.3.2研究组
表3.组分配
Figure BDA0003505417530000401
2.2.3.3动物
品种:Brown Norway
性别:雌性
年龄范围:6-8周龄
重量范围:120-150g
供应商:Charles River Laboratories
研究动物的数量:18
2.2.3.4笼养要求
在标准动物看护条件下,所有动物以3只为一组笼养在保持在通风架中的大笼子里。
2.2.3.5制剂制备和储存
USP(美国药典)材料和无菌容器用于所有制剂,使用以下等分部分的测试测量:
局部载体-26个等分部分/各130μl+2个额外的。
siRNA SEQ ID NO.375mg/ml-26个等分部分/各130μl+2个额外的。
所有制剂储存在4±3℃。
2.2.3.6麻醉
使用U-100注射器将氯胺酮(Ketamine)和赛拉嗪(Xylazine)混合,使用20单位的氯胺酮(100mg/ml)和100单位的赛拉嗪(20mg/ml)。经由腹膜内(IP)注射以1μl/g(体重)施用麻醉混合物。
2.2.3.7产生CNV病变的激光施用
将动物眼睛用1%环喷托酯(Cyclogyl)溶液扩张并避光。在可见的扩张后,用氯胺酮/赛拉嗪使动物镇静。使用Micron III小动物眼底镜(Phoenix Research)观察并记录镇静下来的动物的眼底。使用通过Micron III定制激光附件连接的热激光进行激光处理。使用520nm的波长,每只眼放置总计3处病变。将所得的眼底图像记录并评估以确认激光已经成功地产生了通过Bruch膜的气泡。
2.2.3.8玻璃体内施用
将动物用氯胺酮/赛拉嗪麻醉并且通过局部施用环喷托酯和/或托吡卡胺(Tropicamide)来进行扩瞳。在镇静和扩瞳后,使用Hamilton注射器和33规针将5μl/眼的总体积注射到玻璃体中睫状环处。
2.2.3.9排除
将在激光施用或玻璃体内注射后显示出出血迹象的任何眼从分析中排除。
2.2.3.10荧光素血管造影术
将动物用氯胺酮/赛拉嗪麻醉,然后接受1μl/克体重的10%荧光素钠的IP注射。眼底图像被捕获为8-位TIFF文件,使用Micron III和用于488nm的靶波长的激发器/屏障滤器。还捕获每只眼的标准彩色眼底照片。
2.2.3.11成像和病变量化
使用计算机辅助图像分析软件(ImageJ,NIH,USA)来量化所有TIFF图像。自由地对病变进行分别追踪以量化以像素计的面积并且将彩色眼底照片用作参比以定位病变。将病变中央的无血管化区域从面积计算中排除。如果存在出血或另个病变重叠,则将这些病变从分析中排除。
2.2.3.12组织收集
将动物用氯胺酮/赛拉嗪(80/10mg/kg)麻醉,然后通过IP施用200mg/kg的Euthasol(戊巴比妥)进行安乐死。在安乐死后,摘出眼睛并分别固定在4%多聚甲醛中。在固定后,将所有眼睛储存在分别的2mL拧盖聚丙烯管中。
2.2.3.13统计分析
利用Graphpad Prism软件(版本4.0)使用双尾Mann-Whitney t-检验来进行统计分析。仅p-值<0.05的变化被认为是统计学上显著的。
2.2.4结果
在激光诱导的CNV的大鼠模型中评估局部滴注施用SEQ ID NO:37的效果。在激光处理后3周,进行荧光素血管造影术以量化大鼠眼睛中CNV病变的大小(以像素计的面积)。
相对于单独的载体滴注,局部施用5mg/ml的SEQ ID NO:37减小了大鼠眼睛中的病变尺寸。相对于载体组的平均病变尺寸差异是显著的(图16;*,p≤0.05,未配对t-检验以及双尾Mann-Whitney事后检验)。
相对于对照,阳性对照抗-VEGF的双侧玻璃体内注射显著减小病变尺寸(图16;**,p≤0.01,未配对t-检验以及双尾Mann-Whitney事后检验)。
2.2.5结论
在脉络膜新血管形成的大鼠模型中,相对于局部滴注单独的载体,局部滴注5mg/ml SEQ ID NO.37显著减小病变尺寸。
REFERENCES
·Angaji S.A,Hedayati S.S,Poor R.H等″Application of RNA interferencein treating human diseases″J Genet.2010.Vol.89.4.527-37.
·Bird AC.″Therapeutic targets in age-related macular disease″.J ClinInvest.2010 Sep;120(9):3033-41.
·Bramsen J.B.,Laursen M.B.,Nielsen A.F等″A large-scale chemicalmodification screen identifies design rules to generate siRNAs with highactivity,high stability and low toxicity″Nucleic Acids Res 2009 Vol.37 Issue:9 Pages:2867-81.
·Campochiaro PA.″Potential applications for RNAi to probepathogenesis and develop new treatments for ocular disorders″.Gene Ther.2006Mar;13(6):559-62.
·Cerutti,L.,N.Mian等″Domains in gene silencing and celldifferentiation proteins:the novel PAZ domain and redefinition of the Piwidomain.″Trends Biochem Sci.2000 25(10):481-2.
·Collins,R.E.和X.Cheng.″Structural domains in RNAi.″FEES Lett 2005579(26):5841-9.
·Chang C.I,Kim H.A,Dua P等″Structural Diversity Repertoire of GeneSilencing Small Interfering RNAs″Nucleic Acid Ther.2011.Vol.21.3.125-31.
·Chong RH,Gonzalez-Gonzalez E等″Gene silencing following siRNAdelivery to skin via coated steel microneedles:In vitro and in vivo proof-of-concept″.J Control Release 2013,166:211-9.
·Del Amo EM和Ortti A.″Current and future ophthalmic drug deliverysystems.A shift to the posterior segment″.Drug Discov Today 2008,13:135-143.
·Deleavey G.F和Damha M.J.″Designing chemically modifiedoligonucleotides for targeted gene silencing″.Chem Biol.2012 Vol.19.8.937-54.
·Duwuri S,Majumdar S,Mitra AK.″Drug delivery to the retina:challenges and opportunities″.Expert Opin Biol Ther 2003,3:45-56.
·Edelhauser HF,Rowe-endleman CL,Robinson MR,Dawson DG等″Ophthalmicdrug delivery systems for the treatment of retinal diseases:basic research toclinical applications″.Invest Ophthalmol Vis Sci 2010,51:5403-5420.
·Elbashir,S.M.,W.Lendeckel等″RNA interference is mediated by 21-and22-nucleotide RNAs.″Genes Dev.2001 15(2):188-200.
·Faibish M,Francescone R,Bentley B等″A YKL-40-Neutralizing AntibodyBlocks Tumor Angiogenesis and Progression:A Potential Therapeutic Agent inCancers″.Mol Cancer Ther 2011;10:742-751.
·Fire A,Xu S等″Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.″Nature.1998 391(6669):806-11.
·Grossniklaus HE,Kang SJ等″Animal models of choroidal and retinalneovascularization″Prog Retin Eye Res 2010 29(6):500-19.
·Guzman-Aranguez A,Loma P和Pintor J.″Small-interfering RNAs(siRNAs)as a promising tool for ocular therapy″.British Journal ofPharmacology.2013.170 730-747.
·Hutvagner G和Zamore PD.″A microRNA in a multiple-turnover RNAienzyme complex.″Science.2002.297(5589):2056-60.
·Kigasawa K,Kajimoto K等″Noninvasive delivery of siRNA into theepidermis by iontophoresis using an atopic dermatitis-like model rat″.Int JPharm 2010,383:157-60.
·Kim DH,Behlke MA,Rose SD等″Synthetic dsRNA Dicer substrates enhanceRNAi potency and efficacy″Nat Biotechnol 2005.Vol.23 Issue:2 Pages:222-6.
·Kornbrust D,Cavagnaro J,Levin A等″Oligo safety working groupexaggerated pharmacology subcommittee consensus document″Nucleic Acid Ther2013 Vol.23,1,Pag:21-8.
·Leachman SA,Hickerson RP等″First-in-human mutation-targeted siRNAphase Ib trial of an inherited skin disorder″.Mol Ther 2010,18:442-6.
·Lewis BP,Shih I等″Prediction of mammalian micro RNA targets.″Cell.2003 115:787-798.
·Liu J,Carmell MA等″Argonaute2 is the catalytic engine of mammalianRNAi.″Science.2004 305(5689):1437-41.
·Livak KJ和Schmittgen TD.″Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PGR and the 2(-Delta Delta C(T))Method″Methods.2001;Vol:25,Issue:4,Pages:402-8.
·Ma JB,Yuan YR等″Structural basis for 5′-end-specific recognition ofguide RNA by the A.fulgidus Piwi.
·Maniatis T等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,1982,at pages 387-389.
·Nakai N,Kishida T等″Therapeutic RNA interference of malignantmelanoma by electrotransfer of small interfering RNA targeting Mitf″.GeneTher 2007,14:357-65.
·Nykanen A,Haley B等″ATP requirements and small interfering RNAstructure in the RNA interference pathway.″Cell 2001 107(3):309-21.
·Orban TI和Izaurralde E.″Decay of mRNAs targeted by RISC requiresXRN1,the Ski complex,and the exosome.″Rna.2005 11(4):459-69.
·Phng LK,Potente M等″Nrarp coordinates endothelial Notch and Wntsignaling to control vessel density in angiogenesis.″Dev Cell 2009 16(1):70-82.
·Rand TA,Petersen S等″Argonaute2 cleaves the anti-guide strand ofsiRNA during RISC activation.″Cell.2005 123(4):621-9.
·Rowe-Rendleman CL,Durazo SA等″Drug and gene delivery to the back ofthe eye:from bench to bedside.″Investigative ophthalmology&visualscience.2014 55(4):2714-30.
·Sanghvi YS.″A status update of modified oligonucleotides forchemotherapeutics applications″Curr Protoc Nucleic Acid Chem.2011 Vol.4.4 11-22.
·Song JJ,Smith SK等″Crystal structure of Argonaute and itsimplications for RISC slicer activity.″Science.2004 305(5689):1434-7.
·Walton SP,Wu M,Gredell JA和Chan C.″Designing highly active siRNAsfor therapeutic applications″FEBS J._2010.Vol.277.23.4806-13.
Figure IDA0003505417600000011
Figure IDA0003505417600000021
Figure IDA0003505417600000031
Figure IDA0003505417600000041
Figure IDA0003505417600000051
Figure IDA0003505417600000061
Figure IDA0003505417600000071
Figure IDA0003505417600000081
Figure IDA0003505417600000091
Figure IDA0003505417600000101
Figure IDA0003505417600000111
Figure IDA0003505417600000121
Figure IDA0003505417600000131
Figure IDA0003505417600000141
Figure IDA0003505417600000151
Figure IDA0003505417600000161
Figure IDA0003505417600000171
Figure IDA0003505417600000181
Figure IDA0003505417600000191
Figure IDA0003505417600000201
Figure IDA0003505417600000211
Figure IDA0003505417600000221
Figure IDA0003505417600000231

Claims (20)

1.滴眼液形式的药物组合物,其包含特异性靶向选自由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9组成的组中的至少一个序列的siRNA分子。
2.根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述siRNA包含19个核苷酸的双链区。
3.根据权利要求2所述的药物组合物,其中所述siRNA是平端的。
4.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物,其中,所述siRNA包含选自由SEQ IDNO.10至SEQ ID NO.18组成的组的至少一个序列或由其组成。
5.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物,其中所述siRNA包含正义链和与所述正义链互补的反义链或由其组成,其中所述正义链包含选自由SEQ ID NO.10至SEQ IDNO.18组成的组的至少一个序列或由其组成。
6.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物,其中至少一个核苷酸包含化学修饰。
7.根据权利要求6所述的药物组合物,其中核苷酸的所述化学修饰选自:2′-O-甲基修饰,2′-氟修饰,引入硫代磷酸酯修饰的核苷酸,用5-丙炔基尿嘧啶置换尿嘧啶,用5′-甲基尿苷置换尿嘧啶,用4′-硫代核糖置换尿嘧啶核糖核苷酸和用脱氧胸苷核苷酸置换尿嘧啶核糖核苷酸,及其组合。
8.根据权利要求6或7所述的药物组合物,其中所述化学修饰在正义链上,在反义链上或在两条链上。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的药物组合物,其中所述siRNA包含至少一个选自由SEQ ID NO.19至SEQ ID NO.66组成的组的序列。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的药物组合物,其中所述siRNA包含正义链和与所述正义链互补的反义链或由其组成,其中所述正义链包含至少一个选自由以下组成的组的序列或由其组成:SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.21,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQ IDNO.27,SEQ ID NO.29,SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37,SEQ IDNO.39,SEQ ID NO.41,SEQ ID NO.43,SEQ ID NO.45,SEQ ID NO.47,SEQ ID NO.49,SEQ IDNO.51,SEQ ID NO.53,SEQ ID NO.55,SEQ ID NO.57,SEQ ID NO.59,SEQ ID NO.61,SEQ IDNO.63和SEQ ID NO.65,所述反义链选自由以下组成的组:SEQ ID NO.20,SEQ ID NO.22,SEQ ID NO.24,SEQ ID NO.26,SEQ ID NO.28,SEQ ID NO.30,SEQ ID NO.32,SEQ IDNO.34,SEQ ID NO.36,SEQ ID NO.38,SEQ ID NO.40,SEQ ID NO.42,SEQ ID NO.44,SEQ IDNO.46,SEQ ID NO.48,SEQ ID NO.50,SEQ ID NO.52,SEQ ID NO.54,SEQ ID NO.56,SEQ IDNO.58,SEQ ID NO.60,SEQ ID NO.62,SEQ ID NO.64和SEQ ID NO.66。
11.根据权利要求10所述的药物组合物,其中所述siRNA包含正义链和与所述正义链互补的反义链或由其组成,其中所述正义链包含SEQ ID NO.37的核苷酸序列或由其组成,所述反义链包含SEQ ID NO.38的核苷酸序列或由其组成。
12.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物,其进一步包含缓冲盐水溶液。
13.根据权利要求12所述的药物组合物,其具有约7.0至约7.4的pH。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的药物组合物,其为凝胶形式。
15.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物,其进一步包含一种或多种选自聚(丙交酯-共-乙交酯)、卡波普、透明质酸和聚丙烯酸的生物聚合物。
16.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物,其中所述siRNA在被引入到细胞中时减少NRARP基因的表达。
17.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物,其中所述组合物用于治疗和/或预防视网膜新血管形成。
18.包含siRNA的药物组合物,其中所述siRNA具有正义链和与所述正义链互补的反义链,其中所述正义链包含SEQ ID NO.37的核苷酸序列或由其组成。
19.siRNA,其具有正义链和与所述正义链互补的反义链,其中所述正义链包含SEQ IDNO.37的核苷酸序列或由其组成。
20.根据权利要求19所述的siRNA,其中所述反义链包含SEQ ID NO.38的核苷酸序列或由其组成。
CN202210139558.2A 2015-09-08 2016-09-07 siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途 Active CN114632090B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210139558.2A CN114632090B (zh) 2015-09-08 2016-09-07 siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15382440.4 2015-09-08
EP15382440 2015-09-08
CN201680052073.2A CN108026530B (zh) 2015-09-08 2016-09-07 siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途
PCT/EP2016/071122 WO2017042238A1 (en) 2015-09-08 2016-09-07 Sirna and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the nrarp gene
CN202210139558.2A CN114632090B (zh) 2015-09-08 2016-09-07 siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680052073.2A Division CN108026530B (zh) 2015-09-08 2016-09-07 siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114632090A true CN114632090A (zh) 2022-06-17
CN114632090B CN114632090B (zh) 2023-09-29

Family

ID=54199152

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680052073.2A Active CN108026530B (zh) 2015-09-08 2016-09-07 siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途
CN202210139558.2A Active CN114632090B (zh) 2015-09-08 2016-09-07 siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680052073.2A Active CN108026530B (zh) 2015-09-08 2016-09-07 siRNA及其在抑制NRARP基因表达的方法和组合物中的用途

Country Status (16)

Country Link
US (1) US10752896B2 (zh)
EP (1) EP3347470A1 (zh)
JP (3) JP6946297B2 (zh)
KR (2) KR20180039760A (zh)
CN (2) CN108026530B (zh)
AU (1) AU2016319072B2 (zh)
CA (1) CA2997648A1 (zh)
CO (1) CO2018003596A2 (zh)
HK (1) HK1257658A1 (zh)
IL (2) IL295206B2 (zh)
MA (1) MA44908A (zh)
MX (2) MX2018002857A (zh)
MY (1) MY185638A (zh)
RU (1) RU2738971C2 (zh)
SG (1) SG10202002084UA (zh)
WO (1) WO2017042238A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6577599B2 (ja) 2015-12-15 2019-09-18 日立オートモティブシステムズ株式会社 車両用制御装置

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102272307A (zh) * 2008-11-21 2011-12-07 利莱恩斯生命科学有限公司 siNA介导的VEGF-C和RhoA的敲低对VEGF-A分泌、血管生成和/或新血管生成的抑制
CN102575298A (zh) * 2009-08-14 2012-07-11 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于监测患者对vegf拮抗剂的响应的生物学标志物
WO2012140234A1 (en) * 2011-04-13 2012-10-18 Vib Vzw Modulation of mirna in diseases with aberrant angiogenesis
CN102918157A (zh) * 2010-05-27 2013-02-06 西伦蒂斯私人股份公司 siRNA及其在治疗和/或预防眼病的方法和组合物中的用途
KR20140085790A (ko) * 2012-12-27 2014-07-08 한화케미칼 주식회사 Notch 신호전달을 효과적으로 저해하는 dll4에 특이적인 신규한 인간 단일클론항체
CN104428319A (zh) * 2012-07-02 2015-03-18 韩华石油化学株式会社 特异性结合到dll4的新型单克隆抗体及其应用
CN105624159A (zh) * 2016-02-22 2016-06-01 中国人民解放军第二军医大学 一种针对人EDIL3基因的siRNA及其应用
CN105899662A (zh) * 2013-10-22 2016-08-24 西伦蒂斯私人股份公司 siRNA及其在用于抑制PDK1基因表达的方法和组合物中的应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
HU230458B1 (hu) 2000-12-01 2016-07-28 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) Az RNS interferenciát közvetítő kis RNS molekulák
US20060040262A1 (en) * 2002-12-27 2006-02-23 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
WO2003068961A2 (en) * 2002-02-13 2003-08-21 Axordia Limited Method to modify differentiation of pluripotential stem cells
AU2003260370B2 (en) 2002-08-05 2008-05-22 Silence Therapeutics Gmbh Further novel forms of interfering RNA molecules
JP2006507841A (ja) * 2002-11-14 2006-03-09 ダーマコン, インコーポレイテッド 機能的siRNAおよび超機能的siRNA
WO2005062937A2 (en) 2003-12-22 2005-07-14 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended sirna
GB0521716D0 (en) 2005-10-25 2005-11-30 Genomica Sau Modulation of 11beta-hydroxysteriod dehydrogenase 1 expression for the treatment of ocular diseases
GB0608838D0 (en) 2006-05-04 2006-06-14 Novartis Ag Organic compounds
JP2010507387A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のsiRNAおよびその使用方法
US20100292301A1 (en) 2007-02-28 2010-11-18 Elena Feinstein Novel sirna structures
EP2231168A4 (en) 2007-10-03 2012-01-04 Quark Pharmaceuticals Inc NEW STRUCTURES OF ARNSI
NZ591391A (en) 2008-10-22 2012-10-26 Quark Pharmaceuticals Inc Non-invasive methods for treating eye disorders using a topical oligonucleotide composition
US9260470B2 (en) 2009-11-04 2016-02-16 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration SiRNA structure for minimizing off-target effects caused by antisense strands, and use thereof
US20130123330A1 (en) 2011-07-15 2013-05-16 Patrick Y. Lu Dual Targeted siRNA Therapeutics for Treatment of Diabetic Retinopathy and Other Ocular Neovascularization Diseases
EP2865758A1 (en) * 2013-10-22 2015-04-29 Sylentis, S.A.U. siRNA and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the ORAI1 gene
EP2865756A1 (en) * 2013-10-22 2015-04-29 Sylentis, S.A.U. siRNA and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the FLAP gene.

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102272307A (zh) * 2008-11-21 2011-12-07 利莱恩斯生命科学有限公司 siNA介导的VEGF-C和RhoA的敲低对VEGF-A分泌、血管生成和/或新血管生成的抑制
CN102575298A (zh) * 2009-08-14 2012-07-11 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于监测患者对vegf拮抗剂的响应的生物学标志物
CN102918157A (zh) * 2010-05-27 2013-02-06 西伦蒂斯私人股份公司 siRNA及其在治疗和/或预防眼病的方法和组合物中的用途
WO2012140234A1 (en) * 2011-04-13 2012-10-18 Vib Vzw Modulation of mirna in diseases with aberrant angiogenesis
CN104428319A (zh) * 2012-07-02 2015-03-18 韩华石油化学株式会社 特异性结合到dll4的新型单克隆抗体及其应用
KR20140085790A (ko) * 2012-12-27 2014-07-08 한화케미칼 주식회사 Notch 신호전달을 효과적으로 저해하는 dll4에 특이적인 신규한 인간 단일클론항체
CN105899662A (zh) * 2013-10-22 2016-08-24 西伦蒂斯私人股份公司 siRNA及其在用于抑制PDK1基因表达的方法和组合物中的应用
CN105624159A (zh) * 2016-02-22 2016-06-01 中国人民解放军第二军医大学 一种针对人EDIL3基因的siRNA及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LKUN PHNG, ET AL.: ""Nrarp coordinates endothelial Notch and Wnt signaling to control vessel density in angiogenesis"", 《DEVELONMENTAL CELL》, vol. 16, no. 1, pages 70 - 82, XP028774201, DOI: 10.1016/j.devcel.2008.12.009 *
POTENTE M, ET AL.: ""Involvement of Foxo transcription factors in angiogenesis and postnatal neovascularization"", 《THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION》, vol. 115, no. 9, pages 2382 - 2392 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016319072A1 (en) 2018-03-15
JP2022000035A (ja) 2022-01-04
CA2997648A1 (en) 2017-03-16
JP2023144029A (ja) 2023-10-06
US10752896B2 (en) 2020-08-25
JP6946297B2 (ja) 2021-10-06
IL257524A (en) 2018-04-30
RU2018112453A3 (zh) 2020-05-18
IL295206B2 (en) 2024-02-01
MY185638A (en) 2021-05-27
AU2016319072B2 (en) 2022-03-17
IL295206B1 (en) 2023-10-01
SG10202002084UA (en) 2020-05-28
KR20180039760A (ko) 2018-04-18
MX2018002857A (es) 2018-09-12
JP2018526031A (ja) 2018-09-13
CN108026530B (zh) 2022-03-04
KR20240000615A (ko) 2024-01-02
MX2022000554A (es) 2022-02-10
CO2018003596A2 (es) 2018-08-31
RU2018112453A (ru) 2019-10-10
CN108026530A (zh) 2018-05-11
JP7394815B2 (ja) 2023-12-08
MA44908A (fr) 2018-07-18
RU2738971C2 (ru) 2020-12-21
IL295206A (en) 2022-10-01
HK1257658A1 (zh) 2019-10-25
EP3347470A1 (en) 2018-07-18
IL257524B1 (en) 2023-09-01
IL257524B2 (en) 2024-01-01
WO2017042238A1 (en) 2017-03-16
US20180340177A1 (en) 2018-11-29
CN114632090B (zh) 2023-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5592892B2 (ja) 眼障害の治療方法
JP5824515B2 (ja) Rhoaに対する二本鎖rna化合物およびその使用
CA2800412A1 (en) Sirna and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions
JP2023144029A (ja) NRARP遺伝子の発現を阻害するためのsiRNA、並びにそのための方法及び組成物におけるそれらの使用
EP2893019A1 (en) Sirna and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions
US20140323549A1 (en) Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the nervous system
KR20190037166A (ko) 결합 조직 성장 인자를 표적으로 하는 rna 복합체를 함유하는 노인성 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN103221540A (zh) 病毒基因组中的高度保守区序列作为设计治疗性sliRNA模板的应用
AU2014339037A1 (en) siRNA and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the PDK1 gene
WO2017042239A1 (en) siRNA and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the CHI3L1 gene
CN115698287A (zh) 靶向MyD88的RNAi制剂以及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant