CN115698287A - 靶向MyD88的RNAi制剂以及其用途 - Google Patents

靶向MyD88的RNAi制剂以及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115698287A
CN115698287A CN202080101422.1A CN202080101422A CN115698287A CN 115698287 A CN115698287 A CN 115698287A CN 202080101422 A CN202080101422 A CN 202080101422A CN 115698287 A CN115698287 A CN 115698287A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
rnai
acid molecule
sense strand
antisense strand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080101422.1A
Other languages
English (en)
Inventor
洪善宇
朴峻贤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Olix Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Olix Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Olix Pharmaceuticals Inc filed Critical Olix Pharmaceuticals Inc
Publication of CN115698287A publication Critical patent/CN115698287A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol

Abstract

本申请涉及靶向髓样分化初级应答基因88的RNAi制剂以及其用途，提供一种用于抑制髓样分化初级应答基因88(Myeloid differentiation primary response gene 88；MyD88)的表达的RNAi诱导用核酸分子，以及一种用于预防或治疗老年性黄斑变性的药物组合物，其包括所述RNAi诱导用核酸分子作为有效成分。

Description

靶向MyD88的RNAi制剂以及其用途
技术领域
本申请涉及一种通过RNA干扰现象预防或治疗疾病的核酸分子，以及其用途。
背景技术
老年性黄斑变性(Aged-related Macular Degeneration；AMD)是由眼的黄斑中的视网膜色素上皮内层的变形造成而导致视力丧失的疾病。黄斑是视网膜中的一个小区域，由覆盖眼的内部的感光组织组成，并且在中央视觉中起关键作用。AMD是全世界失明的主要起因之一。AMD以“湿性”和“干性”的形式发生。湿性AMD是视网膜中异常的血管生长的结果。对湿性AMD而言，血管内皮生长因子(VEGF)量的增加有助于这种新血管形成，因此治疗选择包含使用VEGF抑制剂。然而，许多用VEGF抑制剂治疗的患者发展为地图样萎缩(geographicatrophy；GA)，地图样萎缩是从开始治疗后的几年内晚期干性黄斑变性的主要症状。干性AMD的疾病发生机制不清楚，并且目前没有可用于干性AMD的医学治疗。因此，需要可以治疗干性黄斑变性和湿性黄斑变性两者的治疗剂的开发。因此需要研发对干性AMD和湿性AMD同时显示效果的治疗剂，但这种开发实际上仍然不完善。
于是，本发明人为了开发一种能够治疗干性AMD和湿性AMD患者的安全的新型药物而努力研究，结果开发了一种使用RNA干扰技术的RNA制剂。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供靶向MyD88的RNAi制剂。
本发明的另一个目的在于提供一种用于治疗干性和/或湿性AMD的RNAi制剂以及其医药用途。
本申请的其它目的和益处将根据所附的权利要求书和附图以及下面的详细描述理解为更加清楚。凡是本申请所属领域或类似领域的技术人员能够充分认识并类推没有记载于本说明书中的内容，因此对其省略详细描述。
技术方案
为了实现所述目的，一方面提供靶向MyD88的双链RNAi诱导用核酸分子。
另一方面提供一种用于预防或治疗干性和/或湿性AMD的药物组合物，所述药物组合物包括所述RNAi诱导用核酸分子作为有效成分。
有益效果
根据一方面的siRNA可以在缓和非特异性免疫反应、脱靶效应等副作用的同时结合至编码MyD88的mRNA并降解所述mRNA来抑制所述MyD88的表达。所述MyD88是一种与AMD即眼球疾病有关的蛋白。因此，根据一方面的核酸分子可以用作用于预防和治疗干性和/或湿性AMD的药物组合物的有效成分。
附图简单说明
图1a至图1c示出通过处理细胞的OLX301A-110-21、OLX301A-110-22、以及OLX301A-110-23，即根据本发明的siRNA，来引起的细胞中MyD88mRNA水平的变化。
图2a和图2b示出通过使用根据本发明的siRNA即OLX301A-110-21、OLX301A-110-22以及OLX301A-110-23对正常小鼠模型进行处理而引起的MyD88蛋白水平的变化。
图3a和图3b示出通过使用根据本发明的siRNA即OLX301A-110-21、OLX301A-110-22以及OLX301A-110-23对通过激光固化诱导脉络膜新生血管(Laser-induced choroidalneovascularization；CNV)小鼠模型进行处理而引起的MyD88蛋白水平的变化。
图4示出通过对CNV小鼠模型施用根据本发明的siRNA即OLX301A-110-21、OLX301A-110-22以及OLX301A-110-23而引起的CNV体积的变化。
具体实施方式
在本申请中公开的各组成要素的描述和实施方式也可以应用于所述各组成要素的其它描述和实施方式。换言之，在本申请中公开的各种组成要素的所有组合属于本申请的范围。并且，本申请的范围不限于下面记载的具体叙述。
一方面提供一种RNAi诱导用核酸分子，其为包括有义链和反义链的一种双链RNAi诱导用核酸分子，
其中，所述有义链具有15nt至17nt的长度，所述有义链内至少15个相邻的核苷酸与反义链互补；
所述有义链包括至少一个化学修饰(chemical modification)；并且
所述反义链选自由以下(A)至(D)组成的组(5’→3’)：
(A)P-mUGGUCUGGAAGmUmCAmC*A*mU*mU*mC，
(B)P-mUfGmGfUmCfUmGfGmAfAmGfUmCfAmC*fA*mU*fU*mC，
(C)P-mUGmGUCUmGmGmAmAmGUCAC*mA*U*U*C，以及
(D)P-mUGGfUfCfUGGAAGfUfCAfC*A*fU*fU*fC，
在上文中，*是指被硫代磷酸酯键修饰，m是指被2’-O-甲基取代，f是被2’-氟取代，P是指5’-磷酸键。
另一方面提供一种RNAi诱导用核酸分子，其为包括有义链和反义链的一种双链RNAi诱导用核酸分子，
其中，所述反义链具有19nt至21nt的长度，在所述反义链内至少15个相邻的核苷酸与有义链互补，所述反义链包括至少一个化学修饰；以及
所述有义链选自由以下的(a)至(c)组成的组(5’→3’)：
(a)mUmGUGACUUCCAGAC*mC*mA*Lp，
(b)mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*Lp，以及
(c)mUGmUGAmCmUmUmCmCAGAmC*mC*A*Lp，
在上文中，*是指被硫代磷酸酯键修饰，m是指被2’-O-甲基取代，以及Lp是指亲油性部分的导入。
另一方面提供一种包括双链siRNA的RNAi诱导用核酸分子，其抑制MyD88表达，
其中，所述双链siRNA包括：具有序列号1的碱基序列(5’-UGGUCUGGAAGUCACAUUC-3’)的反义链；以及具有序列号2的碱基序列(5’-UGUGACUUCCAGACCA-3’)的有义链，
所述反义链和有义链互补性结合，反义链的5’端和有义链的3’端形成钝端(bluntend)，并且，
在所述有义链的3’末端导入一种亲油性部分，其选自由胆固醇、生育酚、硬脂酸、视黄酸、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid；DHA)、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸，以及具有至少10个碳原子的长链脂肪酸组成的组。
RNAi诱导用核酸分子
在本说明书中，术语“RNA干扰(RNA interference)”或“RNAi”是指一种本领域公知的生物学过程，其通常通过引起特定靶RNA的破坏且被序列特异性核酸分子介导来抑制或下调细胞中的基因表达。并且，术语“RNAi”可以为用于描述转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制，或者实验胚胎学(epigenetics)等序列特异性RNA干扰的其它术语的等同物。例如，所述siRNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平使基因沉默。根据非限制性例子，通过siRNA分子的基因表达的调节可以由通过RISC对mRNA的siRNA介导的切割而引起。
在本说明书中，术语“RNAi诱导用核酸分子”、“小型干扰RNA(short interferingRNA)”、“siRNA分子”或“siRNA”是指一种能够通过根据序列特异性方式介导所述RNA干扰来抑制或下调基因表达或病毒复制的任意核酸分子。所述术语可以指称个别核酸分子，复数个所述核酸分子，或者所述核酸分子的资源(pool)。所述siRNA可以是一种不对称双链核酸分子，其包括自补的(self-complementary)有义链和反义链。
在本说明书中的术语“基因”应被视为最广的意义，所述基因可以编码结构蛋白或调节蛋白。此时，调节蛋白是指转录因子、热冲击蛋白或参与DNA/RNA复制、转录和/或翻译的蛋白。在本发明中，需要抑制其表达的靶基因内含于病毒基因组中，且可以合并于动物基因中或以染色体外组成要素存在。
在本说明书中的术语“反义链(antisense strand)”是指在本领域中通常允许的意义。关于记载于本说明书中的siRNA分子，所述术语可以指称与MyD88 RNA具有互补性的siRNA分子的核苷酸序列。并且，所述siRNA分子的反义链可以包括与siRNA分子的有义链(sense strand)具有互补性的核酸序列。所述siRNA分子的反义链可以称为反义区(antisense region)或引导链(guide strand)。
在本说明书中的术语“有义链(sense strand)”是指在本领域中通常允许的意义。关于记载于本说明书中的siRNA分子，所述术语可以指称与siRNA分子的反义链具有互补性的所述siRNA分子的核苷酸序列。并且，siRNA分子的有义链可以包括与靶核酸序列具有同源性或序列同一性的核酸序列。并且，根据一个具体实施例，siRNA分子的有义链可以被指称为有义区(sense region)或随从链(passenger strand)。
在本说明书中的术语“互补性(complementarity)”或互补的(complementary)”是指在本领域中通常允许的意义。所述术语通常可以指称经常规的瓦特生-克里克(Watson-Crick)或在本说明书中描述的其它非常规类型的配对发生的、在一个核酸序列和其它核酸序列之间的氢键的形成和存在。完全的互补性可以是指核酸序列中所有相邻的残基与第二核酸序列中的相同数量的相邻残基形成氢键。部分互补性可以在核酸分子内包括各种错配(mismatch)或非碱基配对核苷酸(non-based paired nucleotides)(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多错配、非核苷酸连接子(non-nucleotide linker)、或非碱基配对核苷酸)。所述部分互补性可能在核酸分子的有义链或有义区与反义链或反义区之间、或核酸分子的反义链或反义区与相应的靶核酸分子之间引起隆起(bulges)、圆圈(loops)、悬挂(overhang)，或钝端(blunt end)。
本说明书中的术语“钝端(blunt end)”是指在本领域中通常允许的意义。关于本说明书中的核酸分子，所述用于可以指称不包括悬挂的核苷酸的、双链siRNA分子的末端。在本说明书中记载的siRNA分子中，反义链的5’-端和有义链的3’-末端可以形成钝端(blunt end)。
用于抑制MyD88表达的RNAi诱导用核酸分子
“MyD88(Myeloid differentiation primary response gene88)”也称为髓样分化初级应答基因88或天然免疫信号转导适配器(innate immune signal transductionadaptor)。已知，所述MyD88有助于免疫细胞内信号传递，且与诸如黄斑变性的眼球疾病有密切的关系。所述MyD88蛋白可以被解释为包括天然存在的野生型MyD88或其功能性变体，并且，可以从美国国家卫生研究院的GenBank等公知的数据库获得所述MyD88蛋白或编码所述MyD88蛋白的基因的序列。
本说明书中的术语“表达(expression)”是指在本领域中通常允许的意义。所述术语通常可以是指基因最终生成蛋白的过程。所述表达包括但不限于转录、铰接、转录后修改，或翻译。如本说明书中的记载，可以根据mRNA水平或蛋白水平的检测来确定或监督表达水平。
“抑制”或“减少”，作为关于在受试者中的MyD88基因表达使用的术语，是指相比于未处理组或正常对照组统计上有义的减少。所述减少例如可以为至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，或95％或更多，但根据检测或测定方法，可以等于或低于检测水平。
siRNA，即小型干扰RNA(small interfering RNA)，参与RNAi(RNA interference)作用。RNAi为在1998年于Caenorhabditis elegans最初发现的细胞内基因调节机制，已知其作用机制中由于投入细胞内的RNA双链中的反义链与靶基因的mRNA互补性结合来诱导靶基因分解，且为最近受到最热关注的新药开发候选技术。
然而，与这种可能性相反，继续有关于siRNA的副作用和缺点的报告。为了实现基于RNAi的治疗剂的开发，仍然需要克服如下的障碍：1)不存在有效传递系统；2)脱靶效应；3)诱导免疫反应；以及4)细胞内RNAi组织的饱和。虽然siRNA为可以直接调节靶基因表达的有效方法，由于上述的问题，仍然难以开发治疗剂。在这方面，不对称siRNA(asymmetricshorter duplex siRNA；asiRNA)为不对称RNAi诱导结构，其双螺旋长度小于常规的siRNA的19+2结构的双螺旋长度。这是一种已克服在现有的siRNA结构技术中确认的脱靶效应、RNAi机制的饱和、由于TLR3引起的免疫反应等问题的技术，由此可以开发副作用程度较低的RNAi新药。
基于此，本实施例公开一种不对称siRNA(asiRNA)，其包括有义链和与所述有义链互补的反义链。根据一实施例的siRNA不会引起脱靶效应、RNAi机制饱和等问题，因此可以在稳定地维持高传递效率的情况下以所期望的程度有效地抑制MyD88基因的表达。
在一实施例中，设计并制作了靶向MyD88的不对称siRNA(asiRNA)，并将所述asiRNA转染于表达MyD88的细胞，然后筛选了具有优异的敲低效率(knockdownefficiency)的RNAi诱导用核酸分子，即MyD88asiRNA。
根据一个具体实施例，所述RNAi诱导用核酸分子包括序列号1的反义链和序列号2的有义链，并且，可以在各链中导入有化学修饰。
并且，所述反义链的5’端和有义链的3’端可以形成钝端(blunt end)。
导入化学修饰的RNAi诱导用核酸分子
在所述RNAi诱导用核酸分子中，所述有义链或反义链可以包括至少一个化学修饰(chemical modification)。
通常的siRNA由于起因于磷酸盐骨干结构的高负电荷和高分子量等的理由无法穿透细胞膜，在血液中迅速地被降解并消除，因此，难以向实际靶部位传递足以诱导RNAi的量。目前，对于离体传递而言，已开发了使用阴离子脂质体(cationic lipids)和阴离子高分子(cationic polymers)的高效率的传递方法。然而，对于活体传递而言，难以以近似于离体传递效率的高效率传递siRNA，并且，由于与活体内的各种蛋白之间的相互作用，siRNA传递效率减少。
因此，在本实施例中，通过向不对称siRNA结构导入化学修饰来提示具有细胞穿透能(cell-penetrating ability)的RNAi诱导用核酸分子，更具体地，提出一种能够没有额外的传递物的情况下有效地进行细胞内传递的不对称siRNA(asiRNA)结构体(cellpenetrating asymmetric siRNA；cp-asiRNA)。
一方面，上述的化学修饰可以赋予如下的功能：
(1)通过在有义链3’端导入亲油性部分，可以使siRNA容易穿透细胞膜，(2)用硫代磷酸酯(phosphorothioate)等取代与有义链或反义链末端相邻的磷酸盐骨干赋予对核酸外水解酶的抵抗性，且可以实现向细胞的吸收和在活体内siRNA的生物学利用。(3)在糖结构的2’碳位置用甲基、甲氧基等取代-OH基团可以赋予对核酸水解酶的抵抗性，降低siRNA免疫原性(immunogenicity)，减少脱靶效应，(4)在糖结构的2’碳位置用氟取代-OH基团可以给双链赋予稳定性，提高在血清中的稳定性，且实现在离体和活体内有效的沉默。
根据一个具体实施例，所述反义链包括以下(A)至(D)中任一个序列(5’→3’)，其中，*是指被硫代磷酸酯键修饰，m是指被2’-O-甲基取代，f是指被2’氟取代，以及P是指5’磷酸键。
(A)P-mUGGUCUGGAAGmUmCAmC*A*mU*mU*mC，
(B)P-mUfGmGfUmCfUmGfGmAfAmGfUmCfAmC*fA*mU*fU*mC，
(C)P-mUGmGUCUmGmGmAmAmGUCAC*mA*U*U*C，或
(D)P-mUGGfUfCfUGGAAGfUfCAfC*A*fU*fU*fC。
根据一个具体实施例，所述有义链可以具有15nt至17nt的长度，所述有义链内至少15个相邻的核苷酸与反义链互补；所述有义链可以包括至少一个化学修饰(chemicalmodification)。所述有义链包括以下(a)至(c)中的任一个序列(5’→3’)，其中，*是指被硫代磷酸酯键修饰，m是指被2’-O-甲基取代，以及Lp是指亲油性部分的导入。
(a)mUmGUGACUUCCAGAC*mC*mA*Lp，
(b)mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*Lp，或
(c)mUGmUGAmCmUmUmCmCAGAmC*mC*A*Lp。
所述亲油性部分可以选自由胆固醇、生育酚、硬脂酸(stearic acid)、视黄酸(retinoic acid)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、棕榈酸(palmiticacid)、亚油酸(linoleic acid)、亚麻酸(linolenic acid)、以及具有至少10个碳原子的长链脂肪酸，优选地可以为胆固醇、DHA，或棕榈酸。最优选，所述亲油性部分为棕榈酸。
根据一个具体实施例，所述有义链包括选自以下(d)至(i)中的任一个有义链，其中，*是指被硫代磷酸酯键修饰，m是指被2’-O-甲基取代，chol是指3’-胆固醇键，以及PA是指3’-棕榈酸(Palmitic acid)键。
(d)mUmGUGACUUCCAGAC*mC*mA*chol，
(e)mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*chol，
(f)mUGmUGAmCmUmUmCmCAGAmC*mC*A*chol，
(g)mUmGUGACUUCCAGAC*mC*mA*PA，
(h)mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*PA，或
(i)mUGmUGAmCmUmUmCmCAGAmC*mC*A*PA。
另一方面提供一种用于预防或治疗眼球疾病的药物组合物，其包括RNAi诱导用核酸分子作为有效成分。
所述药物组合物直接包括或利用上述的RNAi诱导用核酸分子，因此，为了避免本说明书过于复杂，省略所述药物组合物和RNAi诱导用核酸分子之间共同的内容的记载。
眼球疾病
所述药物组合物具有通过抑制MyD88基因的表达来阻碍异常的新生血管的功能，由此可以用作药物组合物的有效成分，所述药物组合物用于预防或治疗伴随血管异常的眼球疾病。
所述眼球疾病例如可以为黄斑变性，在此，“黄斑变性”为一种眼球疾病，其中，新生血管的异常生长引起黄斑受损，并伴有影响视力的症状。黄斑变性主要在50岁或更高的年龄层发生，且分为非渗出性(干性类型)黄斑变性或渗出性(湿性类型)黄斑变性。尤其，对湿性黄斑变性而言，可能引起失明，虽然还没有正确地表明湿性黄斑变性的原因，已知年龄为危险因素，作为环境因素可以列举吸烟、高血压、肥胖、遗传素质、对紫外线的过多露出、较低的血中抗氧化剂浓度等。
药物组合物
在本说明书中，术语“有效成分(effective ingredient)”是指对有益或优选的临床或生物化学结果有影响的、合适的有效量的成分。具体地，可以是指有效量的制剂、活性剂，或核酸分子。
所述有效量为可以施用一次或更多次的量，且可以为用于预防疾病或非限制性地缓和病状、减小疾病范围、稳定化疾病状态(即防止疾病恶化)、拖延疾病的进展或减少其速度，或改善、暂时缓和、减轻疾病状态(部分或整体上)的合适的剂量。
本说明书中的术语“预防(prevention)”是指提前阻断疾病的发生、抑制疾病或拖延疾病进展的所有举动。例如，是指防止发生所述眼球疾病或其特性的发生、阻碍发生、或从所述眼球疾病或其特性的发生的防御或保护。
在本说明书中，术语“治疗(treatment)”包括治疗学处理、预防性方法或预防处理方法。并且，是指使疾病症状好转或变得有益的所有举动。例如，预防、减少或改善所述眼球疾病或其特性，或拖延(弱化)受试者中所述眼球疾病或其特性的进展。
本说明书中的术语“有效量(effective amount)”是指在本领域中通常允许的意义。所述术语通常可以是指引发研究人、兽医师、医生、或其它临床医生等所追求的细胞、组织、系统、动物、或人的所需的生物学反应(例如，有益的反应)的分子、化合物，或组合物的量。具体地，“治疗有效量(therapeutically effective amount)”例如可以是指分子、化合物、或组合物的量，所述量能够在与疾病或障碍相关的可测量的参数方面诱导治疗相关变化而可以被视为特定临床治疗有效的优选医学反应。用于治疗所述疾病或障碍的药物的治疗有效量可以是为了在所述参数中引起治疗相关变化所需的量。
包括根据本发明的核酸分子的药物组合物可以适用于眼内(intraocular)。所述核酸分子的眼内施用可以通过对眼睛进行注射或直接(例如，局部)施用来实现，只要该施用途径引导所述核酸分子进入眼睛即可。除了上述的向眼睛的局部施用途径之外，合适的眼内施用途径包括玻璃体内(intravitreal)、网膜内、网膜下、tenon囊下(subtenon)、眶周(peri-orbital)、眶后(retro-orbital)、结膜囊内、结膜下、经角膜(trans-corneal)和经巩膜(trans-scleral)施用。
所述“药学上可接受的组合物”或“药学上可接受的剂型”可以指称组合物或剂型，其可以将所述核酸分子有效地分配至最适合发挥所需的活性的物理位置。
另一方面提供一种治疗眼球疾病的方法，其包括将治疗学有效量的所述药物组合物施用于个体。
由于所述治疗所述眼球疾病的方法直接包括或利用所述RNAi诱导用核酸分子或药物组合物，为了避免本说明书变得过于复杂，将省略对共同内容的记载。
在本说明书中，术语“个体”是指需要对疾病、具体地眼球疾病的治疗的对象，更具体地，可以包括人或非人类灵长类、小鼠(mouse)、狗、马、牛、羊、猪、山羊、骆驼、羚羊等哺乳类。
下面，通过实施例更加详细描述本发明。然而，这些实施例仅用于本发明的示例性说明，本发明的范围并不限于这些实施例。
实施例1siRNA序列和合成
在本实施例中对靶向MyD88的siRNA进行合成，通过诱导各种化学修饰(2’OMe、PS、Fluoro)并将诸如胆固醇、棕榈酸的亲油性部分导入有义链的3’端来制备了siRNA(参照表1)，这种方法是本技术领域公知的方法。具体地，为了导入作为亲油性部分的胆固醇和PA，在本实施例中分别使用了胆固醇-TEG-CPG(由LGC Prime Synthesis制备)和PA-连接子-CPG(由LGC LINK制备，参照以下表3)。
[表1]
Figure BDA0003963473770000101
Figure BDA0003963473770000111
在所述表1中由“*”、“m”、“f”、“chol”以及“PA”标记的化学修饰如表2所示，并且，由“chol”以及“PA”标记的化学修饰分别是指将胆固醇和棕榈酸(palmitic acid，以棕榈酰形式导入)至3’端的形式。
[表2]
标记法 化学修饰
* 硫代磷酸酯键
m 2’-O-甲基
f 2’-氟
chol 胆固醇
PA 棕榈酸-以棕榈酰形式导入
[表3]
Figure BDA0003963473770000112
实施例2.通过cp-asiRNA处理的MyD88 mRNA水平评估-离体敲低分析
(1)通通OLX301A-110-3、OLX301A-110-5、OLX301A-110-7、OLX301A-110-13以及 OLX301A-110-14处理的分析
为了确认对MyD88 mRNA的表达抑制效果，使用各100nM的siRNA即OLX301A-110-3、OLX301A-110-5、OLX301A-110-7、OLX301A-110-13以及OLX301A-110-14处理ARPE-19细胞，对其进行孵育(free uptake)，并使用Realtime qPCR测定了MyD88 mRNA的表达水平。具体地，ARPE-19细胞以3×104细胞/孔接种于24孔板，在24小时后，向其添加100nM的cp-siRNA，然后在Opti-MEM media条件下孵育细胞。在24小时后，使用Tri-RNA reagent(FAVORGEN)提取总RNA，并使用High-capacity cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems)合成了cDNA。然后，使用TB Green Premix Ex Taq(Takara，RR420A)和表4中的引物由CFX Connect实时荧光定量PCR检测系统(BioRad)确认了MyD88基因的表达水平。(参照表5)
[表4]
Figure BDA0003963473770000121
[表5]
Figure BDA0003963473770000122
(2)根据OLX301A-110-21、OLX301A-110-22以及OLX301A-110-23处理的分析
执行如下的试验以确认在实施例1中合成的siRNA即OLX301A-110-21、OLX301A-110-22以及OLX301A-110-23是否抑制MyD88的表达。
使用各(25、50、100、500、1000)nM的siRNA处理Y79细胞，对其进行孵育(freeuptake)，然后使用实时定量聚合酶链式反应(Realtime quantitative PCR；RealtimeqPCR)测定了MyD88 mRNA的表达水平。具体地，将Y79细胞以6×104细胞/孔接种于24孔板，在24小时后，向其添加25、50、100、500、1000nM的siRNA，并在Opti-MEM media条件下，即在RPMI1640(10％FBS)培养基中孵育细胞。在24小时后，使用Tri-RNA reagent(FAVORGEN)提取total RNA，并使用High-capacity cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems)合成了cDNA。然后，使用TB Green Premix Ex Tag(Takara，RR420A)和表6中的引物由CFX Connect实时荧光定量PCR检测系统(BioRad)确认了MyD88基因的表达水平。(参照表7、图1a至1c)
[表6]
Figure BDA0003963473770000131
[表7]
Figure BDA0003963473770000132
实施例3.根据siRNA处理的MyD88蛋白水平评估
(1)根据OLX301A-110-3、OLX301A-110-5、OLX301A-110-7、OLX301A-110-13、 OLX301A-110-14处理的分析
为了确认在实施例1中的合成的siRNA对MyD88蛋白的表达抑制效果，将各1nM的siRNA转染于ARPE-19细胞(ATCC)，并通过蛋白免疫印迹(western blot)测定了MyD88蛋白的表达水平。具体地，将ARPE-19细胞以5×104细胞/孔接种于12孔板，在24小时后，向其添加2μM的siRNA，然后在Opti-MEM media条件下孵育细胞。在24小时后，将培养基更换为添加10％胎牛血清(FBS，Gibco)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F-12 NutrientMixture Ham(DMEM/F-12)1：1Mixtures(Gibco)，在48小时后，测量了MyD88蛋白的表达水平。
[表8]
Figure BDA0003963473770000141
结果，如表8所示，确认根据所述siRNA处理的MyD88蛋白的表达抑制效果。尤其，显示相对优异的MyD88蛋白表达抑制效率。
(2)通过OLX301A-110-21、OLX301A-110-22以及OLX301A-23的处理的MyD88蛋白的 体内敲低分析
1)在正常小鼠中对MyD88蛋白表达的抑制效能
在本实施例中执行了如下的试验以确认在实施例1中的体内合成的siRNA即OLX301A-110-21、OLX301A-110-22以及OLX301A-110A-23是否能抑制MyD88蛋白的表达。为了确认在正常小鼠中对MyD88蛋白表达的抑制效能，制备了0.8μl的10mM PBS混合液，其包括各8μg的OLX301A-110-21、OLX301A-110-22、以及OLX301A-110-23，并将所述PBS混合液以玻璃体内注射(intravitreal injection，IVT)(第0天)方式施用于9周龄的雄性C57BL/6小鼠(各组3只，六个眼球)。在施用第7天，从小鼠中分离出视网膜色素上皮细胞(RPE)，向其添加RIPA缓冲剂(SIGMA，R0278)，并使用tissue grinder pestle(Scienceware，199230001)和sonicator(Sonics，VC505)进行均匀化。然后，通过使用BCA Protein Assay Kit(Thermo，23225)从通过离心分离获得的上清定量蛋白，使用8％至16％的预制凝胶(Precast Gel)(Bio-rad，456-1106)对各样品中的20μg的蛋白进行电泳，并将所述蛋白转录至PVDFmembrane(Bio-rad，1620117)。使用SuperblockTM(TBS)blocking buffer(Thermo，37535)进行封闭(blocking)，并使用MyD88抗体(1：500；Cell signaling，4283)和纽带蛋白(Vinculin)抗体(1：2，000；圣克鲁斯，sc-73614)、HRP-共聚anti-rabbit和抗小鼠IgG(1：5，000；圣克鲁斯，sc-2357和Bethyl laboratories，A90-116P)根据各制造商的规格进行反应。通过ECL(Thermo，34580，或34095)处理，使用ChemiDocXRS+(Bio-Rad，1708265)确认了MyD88和Vinculin蛋白表达程度。将scrambled cp-asiRNA(SCR)施用组用作该试验的阴性对照组。结果，确认MyD88蛋白的水平降低了约35％至45％。(参照表9、图2a和图2b)
[表9]
Figure BDA0003963473770000151
2)在Laser-induced CNV小鼠模型中对MyD88蛋白表达的抑制效能
为了确认OLX301A-110-21、OLX301A-110-22以及OLX301A-110-23在通过激光固化诱导脉络膜新生血管(Laser-induced CNV)的小鼠模型中对MyD88蛋白表达的抑制效果，对9周龄的雄性C57BL/6小鼠(各组6只小鼠，12个眼球)施加激光损伤(能量：130mW，期间：80ms，尺寸：75μm，6条激光/眼球)，立即制备0.8μl的10mM PBS混合液，所述PBS混合液包括各4μg的OLX301A-110-21、OLX301A-110-22，以及OLX301A-110-23，并将所述PBS混合溶液以玻璃体内注射(intravitreal injection，IVT)(第0天)施用于所述9周龄雄性C57BL/6小鼠。在施用第7天，根据如上所述的方法分离出小鼠RPE，并对各样品中的20μg的蛋白进行免疫印迹分析，以测量MyD88蛋白的表达水平。将scrambled cp-asiRNA(SCR)施用组用作该试验的阴性对照组。结果，确认MyD88蛋白的水平降低了约30％至35％。(参照表10、图3a和图3b)
[表10]
Figure BDA0003963473770000152
3)确认在CNV模型中CNV体积的减小
在本实施例中，对通过激光固化诱导脉络膜新生血管(Choroidalneovascularization：CNV)的小鼠中根据OLX301A-110-21、OLX301A-110-22以及OLX301A-110-23的施用的治疗效能。具体地，对9周龄的雄性C57BL/6小鼠(各组8只，8个眼球)诱导激光固化(能量：130mW、期间：80ms、尺寸：75μm、4条激光/眼球)，立即制备了0.8μl的10mM PBS混合液，其包括1μg和2μg的OLX301A-110-21、OLX301A-110-22以及OLX301A-110-23，并以玻璃体内注射(intravitreal injection，IVT)将所述PBS混合溶液施用于所述C57BL/6小鼠。在此后第6天，通过使用与血管内皮细胞具有特异性的Isolectin B4(Vectorlaboratories，FL-1201)进行荧光染色。然后，通过使用共聚焦显微镜(Leica，TCS SP8)从开始观察荧光的起点到终点进行摄影。根据通过Image J software摄影的图像中对经IB4染色的区域进行数值化来测量CNV体积，并通过与阴性对照组的相对％比较来评估治疗效能。将10mM PBS施用组用作该试验的阴性对照组，1μg和2μg OLX10020施用组用作阳性对照组。结果，确认CNV体积减少约30％至40％，相对于阳性对照组也显示更优异的效能。(参照表11、图4)
[表11]
Figure BDA0003963473770000161
本发明中的描述仅用于提供示例，并且，本发明所述领域的普通技术人员应当可以理解在不改变本发明技术思想或必须特征的情况下可以将本发明容易变更为其它具体形式。因此，应当理解在上文中描述的实施例从所述角度来看尽是示例性的，而不是限制性的。
<110> 奥利克斯医药有限公司
<120> 靶向MyD88的RNAi制剂以及其用途
<130> PX062884PCT
<150> KR 10-2020-0063281
<151> 2020-05-26
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MyD88 siRNA_反义链（MyD88 siRNA_antisense）
<400> 1
uggucuggaa gucacauuc 19
<210> 2
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MyD88 siRNA_有义链（MyD88 siRNA_sense）
<400> 2
ugugacuucc agacca 16
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MyD88正向引物（MyD88 Forward primer）
<400> 3
gctcatcgaa aagaggtgcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MyD88反向引物（MyD88 Reverse primer）
<400> 4
ggttggtgta gtcgcagaca 20

Claims (8)

1.一种包括有义链和反义链的双链RNAi诱导用核酸分子，其中，
所述有义链具有15nt至17nt的长度，在所述有义链内至少15个相邻的核苷酸与反义链互补，所述有义链包括至少一个化学修饰；并且，
所述反义链选自由以下(A)至(D)组成的组中(5'→3')：
(A)P-mUGGUCUGGAAGmUmCAmC*A*mU*mU*mC,
(B)P-mUfGmGfUmCfUmGfGmAfAmGfUmCfAmC*fA*mU*fU*mC,
(C)P-mUGmGUCUmGmGmAmAmGUCAC*mA*U*U*C，以及
(D)P-mUGGfUfCfUGGAAGfUfCAfC*A*fU*fU*fC，
在上文中，*是指被硫代磷酸酯键修饰、m是指被2'-O-甲基取代，f是指被2'-氟取代，P是指5'-磷酸键。
2.一种包括有义链和反义链的双链RNAi诱导用核酸分子，其中，
其中，所述反义链具有19nt至21nt的长度，在所述反义链内至少15个相邻的核苷酸与有义链互补，所述反义链包括一个以上的化学修饰；以及
所述有义链选自由以下的(a)至(c)组成的组中(5'→3')：
(a)mUmGUGACUUCCAGAC*mC*mA*Lp,
(b)mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*Lp以及
(c)mUGmUGAmCmUmUmCmCAGAmC*mC*A*Lp,
其中，*是指被硫代磷酸酯键修饰，m是指被2'-O-甲基取代，Lp是亲油性部分。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的RNAi诱导用核酸分子，其中，所述RNAi诱导用核酸分子为siRNA。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的RNAi诱导用核酸分子，其中，所述化学修饰包括：
一个或更多核苷酸键被修饰为硫代磷酸酯键；
在一个或更多核苷酸内糖结构中的2'碳位置的-OH基被-O-甲基取代；或者
导入一种亲油性部分，所述亲油性部分选自由胆固醇、生育酚、硬脂酸、视黄酸、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid；DHA)、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸，以及具有至少10个碳原子的长链脂肪酸组成的组。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的RNA诱导用核酸分子，其中，所述RNAi诱导用核酸分子形成不对称双链结构，并且，所述反义链的5'端和有义链的3'端形成钝端。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的RNA诱导用核酸分子，其中，所述RNAi诱导用核酸分子抑制髓样分化初级应答基因88的表达。
7.一种用于预防或治疗老年性黄斑变性的药物组合物，其包括根据权利要求1或2所述的RNAi诱导用核酸分子作为有效成分。
8.一种包括双链siRNA的RNAi诱导用核酸分子，其抑制MyD88的表达，其中，所述双链siRNA包括：具有序列号1的碱基序列(5'-UGGUCUGGAAGUCACAUUC-3')的反义链；以及具有序列号2的碱基序列(5'-UGUGACUUCCAGACCA-3')的有义链，
所述反义链和有义链彼此互补性结合，反义链的5'端和有义链的3'端形成钝端，并且，
在所述有义链的3'端导入一种亲油性部分，所述亲油性部分选自由胆固醇、生育酚、硬脂酸、视黄酸、二十二碳六烯酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、以及具有至少10个碳原子的长链脂肪酸组成的组。
CN202080101422.1A 2020-05-26 2020-08-13 靶向MyD88的RNAi制剂以及其用途 Pending CN115698287A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20200063281 2020-05-26
KR10-2020-0063281 2020-05-26
PCT/KR2020/010787 WO2021241803A1 (ko) 2020-05-26 2020-08-13 MyD88을 표적으로 하는 RNAi 제제 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115698287A true CN115698287A (zh) 2023-02-03

Family

ID=78744887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080101422.1A Pending CN115698287A (zh) 2020-05-26 2020-08-13 靶向MyD88的RNAi制剂以及其用途

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240093188A1 (zh)
EP (1) EP4159858A1 (zh)
JP (1) JP2023528593A (zh)
KR (3) KR102421751B1 (zh)
CN (1) CN115698287A (zh)
AU (1) AU2020450890A1 (zh)
CA (1) CA3179876A1 (zh)
WO (2) WO2021241803A1 (zh)

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006006948A2 (en) * 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
TWI386225B (zh) * 2004-12-23 2013-02-21 Alcon Inc 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子（ＣＴＧＦ）ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制技術
JP2010507387A (ja) * 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
EP2548962B1 (en) * 2007-09-19 2016-01-13 Applied Biosystems, LLC Sirna sequence-independent modification formats for reducing off-target phenotypic effects in rnai, and stabilized forms thereof
KR100949791B1 (ko) * 2007-12-18 2010-03-30 이동기 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도
CA2733059A1 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of myeloid differentation primary response gene 88 (myd88) expression by antisense oligonucleotides
KR20180044433A (ko) * 2010-03-24 2018-05-02 알엑스아이 파마슈티칼스 코포레이션 진피 및 섬유증성 적응증에서의 ｒｎａ 간섭
CA2818024C (en) * 2010-12-06 2019-09-24 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising positional modifications
CN104450710B (zh) 2014-11-28 2018-06-05 广州市锐博生物科技有限公司 抑制myd88基因的寡聚核酸及其应用
KR20180071362A (ko) * 2015-11-16 2018-06-27 올릭스 주식회사 MyD88 또는 TLR3을 타겟팅하는 RNA 복합체를 이용한 연령-관련 황반 변성의 치료
CA3020487C (en) * 2016-04-11 2022-05-31 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using rna complexes that target connective tissue growth factor
KR20190037166A (ko) * 2017-09-28 2019-04-05 올릭스 주식회사 결합 조직 성장 인자를 표적으로 하는 rna 복합체를 함유하는 노인성 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
CA3179876A1 (en) 2021-12-02
KR102421750B1 (ko) 2022-07-19
KR20220116378A (ko) 2022-08-22
AU2020450890A1 (en) 2023-02-02
KR102421751B1 (ko) 2022-07-19
WO2021241803A1 (ko) 2021-12-02
KR20210146196A (ko) 2021-12-03
KR102643127B1 (ko) 2024-03-06
KR20210146195A (ko) 2021-12-03
WO2021241802A1 (ko) 2021-12-02
EP4159858A1 (en) 2023-04-05
US20240093188A1 (en) 2024-03-21
JP2023528593A (ja) 2023-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8901097B2 (en) Methods for delivery of siRNA to the spinal cord and therapies arising therefrom
KR20190108167A (ko) Rna 간섭을 위한 긴 이중가닥 rna
KR101553753B1 (ko) Ｒｈｏａ에 대한 이중 가닥 ｒｎａ 및 그의 용도
US11497762B2 (en) MiRNA molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation
JP2023144029A (ja) ＮＲＡＲＰ遺伝子の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡ、並びにそのための方法及び組成物におけるそれらの使用
CN115698287A (zh) 靶向MyD88的RNAi制剂以及其用途
WO2017042239A1 (en) siRNA and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the CHI3L1 gene
JP2023551223A (ja) Ｍｓｕｔ２を抑制するための組成物及び方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination