KR102421750B1 - MyD88을 표적으로 하는 RNAi 제제 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 골수 분화 일차 반응 유전자 88을 표적으로 하는 RNAi 제제 및 이의 용도에 관한 것으로서, MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88)의 발현을 억제하기 위한 RNAi 유도용 핵산 분자, 및 상기 RNAi 유도용 핵산 분자를 유효 성분을 포함하는 노인성 황반변성의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
Description
본 출원은 RNA 간섭 현상을 통해 질병을 예방 또는 치료하는 핵산 분자 및 이의 용도에 관한 것이다.
노인성 황반변성(Aged-related Macular Degeneration, AMD)은 눈의 황반 내의 망막 색소 상피 내벽의 변성으로부터 야기되어, 시력 상실을 유도하는 질병이다. 황반은 눈의 안쪽을 덮고 있는 광-민감성 조직으로 구성된 망막 내의 작은 영역이며 중심시에서 중요한 역할을 한다. AMD는 전세계적으로 실명의 주요 원인 중 하나이다. AMD는 "습성" 및 "건성" 형태로 발생한다. 습성 AMD는 망막에서의 비정상적인 혈관 성장의 결과이다. 습성 AMD에서는, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 양의 증가가 이러한 신혈관형성에 기여하여, 치료 옵션은 VEGF 억제제의 사용을 포함한다. 하지만, VEGF 억제제로 치료받은 많은 환자가 지도모양망막위축(geographic atrophy)(GA)을 일으키며, 이는 치료 수년 이내에 후기 건성 황반 변성의 주요 증상이다. 건성 AMD의 질병 발병기전은 명확하지 않으며 건성 AMD를 위해 이용가능한 의학적 치료가 현재로서는 없다. 따라서, 건성 황반변성 및 습성 황반변성 둘 모두를 치료할 수 있는 치료제의 개발이 필요하다. 이에, 건성 황반변성 및 습성 노인성 황반변성에 동시에 효력이 나타내는 치료제의 개발이 필요한 실정이나 아직은 미비한 실정이다.
이에 본 발명자들은 건성 황반변성 나아가 습성 황반변성 환자를 치료할 수 있는 새로운 안전한 약물을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, RNA 간섭 기술을 이용한 RNA 제제를 개발하였다.
본 발명의 목적은 MyD88을 표적화하는 RNAi 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 건성 및/또는 습성 노인성 황반변성의 치료를 위한 RNAi 제제 및 이의 의약적 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 양상은 MyD88을 표적화하는 이중 가닥의 RNAi 유도용 핵산 분자를 제공한다.
다른 양상은 상기 RNAi 유도용 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 건성 및/또는 습성 황반변성의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
일 양상에 따른 siRNA에 따르면, 비특이적 면역반응, 오프 타겟 효과와 같은 부작용을 완화하면서, 안구 질환인 노인성 황반변성과 관련된 단백질인 MyD88을 인코딩하는 mRNA에 결합하여 이를 분해함으로써 상기 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 핵산 분자는 건성 및/또는 습성 노인성 황반변성을 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 본 발명에 따른 siRNA인 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23의 처리에 따른 MyD88 mRNA 수준의 변화를 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 정상 마우스 모델에 본 발명에 따른 siRNA인 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23의 처리에 따른 MyD88 단백질 수준의 변화를 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 Laser-injury 마우스 모델에 본 발명에 따른 siRNA인 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23의 처리에 따른 MyD88 단백질 수준의 변화를 보여준다.
도 4는 CNV 마우스 모델에 본 발명에 따른 siRNA인 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23의 투여에 따른 CNV 부피의 변화를 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 정상 마우스 모델에 본 발명에 따른 siRNA인 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23의 처리에 따른 MyD88 단백질 수준의 변화를 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 Laser-injury 마우스 모델에 본 발명에 따른 siRNA인 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23의 처리에 따른 MyD88 단백질 수준의 변화를 보여준다.
도 4는 CNV 마우스 모델에 본 발명에 따른 siRNA인 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23의 투여에 따른 CNV 부피의 변화를 보여준다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥의 RNAi 유도용 핵산 분자로서,
상기 센스 가닥은 15 내지 17nt의 길이를 가지고, 상기 센스 가닥 내 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드는 안티센스 가닥과 상보적이며;
상기 센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하고; 그리고
상기 안티센스 가닥은 하기 (A) 내지 (D)로 이루어진 그룹으로서 선택되는 것이며(5'->3'):
(A) P-mUGGUCUGGAAGmUmCAmC*A*mU*mU*mC,
(B) P-mUfGmGfUmCfUmGfGmAfAmGfUmCfAmC*fA*mU*fU*mC,
(C) P-mUGmGUCUmGmGmAmAmGUCAC*mA*U*U*C, 및
(D) P-mUGGfUfCfUGGAAGfUfCAfC*A*fU*fU*fC,
상기에서, *는 포스포로티오에이트 결합으로의 변형, m은 2'-O-메틸로의 치환, f는 2'-플루오르로의 치환, 및 P는 5'-인산기의 결합을 의미하는 것인, RNAi 유도용 핵산 분자를 제공한다.
다른 양상은, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥의 RNAi 유도용 핵산 분자로서,
상기 안티센스 가닥은 19 내지 21nt의 길이를 가지고, 상기 안티센스 가닥 내 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드는 센스 가닥과 상보적이며, 상기 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형을 포함하고; 및
상기 센스 가닥은 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이며(5'->3'):
(a) mUmGUGACUUCCAGAC*mC*mA*Lp,
(b) mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*Lp, 및
(c) mUGmUGAmCmUmUmCmCAGAmC*mC*A*Lp,
상기에서, *는 포스포로티오에이트 결합으로의 변형, m은 2'-O-메틸로의 치환, 및 Lp은 친유성 모이어티의 도입인, RNAi 유도용 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 양상은, MyD88의 발현을 억제하는, 이중 가닥의 siRNA를 포함하는 RNAi 유도용 핵산 분자로서,
상기 이중 가닥의 siRNA는 서열번호:1의 염기서열(5'-UGGUCUGGAAGUCACAUUC-3')을 갖는 안티센스 가닥 및 서열번호 2의 염기서열(5'-UGUGACUUCCAGACCA-3')을 갖는 센스 가닥을 포함하며,
상기 안티센스 가닥과 센스 가닥은 서로 상보적으로 결합하여, 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하며,
상기 센스 가닥의 3' 말단에는 콜레스테롤, 토코페롤, 스테아르산, 레티노산, DHA, 팔미트산, 리놀레산, 리놀렌산 및 탄소수 10개 이상의 장쇄 지방산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 친유성 모이어티가 도입된, RNAi 유도용 핵산 분자를 제공한다.
RNAi 유도용 핵산 분자
본 명세서에서 용어, "RNA 간섭 (RNA interference)" 또는 "RNAi"는 일반적으로 특정 표적 RNA의 파괴를 유발하고 서열-특이적 핵산 분자에 의해 매개됨으로써 세포에서 유전자 발현을 억제 또는 하향 조절하는 기술 분야에서 일반적으로 알려진 생물학적 과정을 지칭한다. 또한, RNAi라는 용어는 전사 후 유전자 침묵, 번역 억제, 전사 억제, 또는 후성 유전학 (epigenetics)과 같은 서열 특이적 RNA 간섭을 기술하기 위해 사용된 다른 용어와 동등한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 siRNA 분자는 전사 후 수준 또는 전사 전 수준에서 유전자를 침묵시키는데 사용될 수 있다. 비 제한적인 예에서, siRNA 분자에 의한 유전자 발현의 조절은, RISC를 통한 mRNA의 siRNA-매개된 절단으로부터 초래될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "RNAi 유도용 핵산 분자", "짧은 간섭 RNA (short interfering RNA)", "siRNA 분자" 또는 "siRNA"는, 서열-특이적 방식으로 상기 RNA 간섭을 매개함으로써 유전자 발현 또는 바이러스 복제를 억제 또는 하향 조절할 수 있는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 개별 핵산 분자, 복수의 상기 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자의 풀 (pool) 모두를 지칭할 수 있다. 상기 siRNA는 자가-상보적인(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 비대칭 이중 가닥 핵산 분자일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 목적 유전자는 바이러스 게놈에 내재된 것으로, 동물 유전자로 통합되거나 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "안티센스 가닥 (antisense strand)"은 당업계에서 일반적으로 허용되는 의미를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 siRNA 분자와 관련하여, 상기 용어는 MyD88 RNA에 상보성을 갖는 siRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. 또한, 상기 siRNA 분자의 안티센스 가닥은 siRNA 분자의 센스 가닥 (sense strand)에 상보성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 siRNA 분자의 안티센스 가닥은 안티센스 영역 (antisense region) 또는 가이드 가닥 (guide strand)으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "센스 가닥 (sense strand)"은 당업계에서 일반적으로 허용되는 의미를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 siRNA 분자와 관련하여, 상기 용어는 siRNA 분자의 안티센스 가닥에 상보성을 갖는, 상기 siRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. 또한, siRNA 분자의 센스 가닥은 표적 핵산 서열과 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 일 구체예에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 센스 영역(sense region) 또는 패신저 가닥 (passenger strand)으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "상보성(complementarity)" 또는 "상보적인(complementary)"은 당업계에서 일반적으로 허용되는 의미를 지칭한다. 상기 용어는 일반적으로 전통적인 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 또는 본 명세서에 기술된 다른 비-전통적 유형의 결합에 의해, 하나의 핵산 서열과 다른 핵산 서열 사이에서의 수소 결합(들)의 형성 또는 존재를 지칭할 수 있다. 완벽한 상보성은 핵산 서열의 모든 인접 잔기가 제 2 핵산 서열에서 동일한 수의 인접 잔기와 수소 결합한다는 것을 의미할 수 있다. 부분 상보성은 핵산 분자 내에서, 다양한 미스매치 (mismatch) 또는 비-염기쌍 뉴클레오티드 (non-based paired nucleotides) (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 이상의 미스매치, 비-뉴클레오티드 링커(non-nucleotide linker), 또는 비-염기쌍 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 상기 부분 상보성은, 핵산 분자의 센스 가닥 또는 센스 영역과, 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역 사이에서, 또는 핵산 분자의 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역과, 이와 상응하는 표적 핵산 분자 사이에서, 벌지 (bulges), 루프 (loops), 돌출 (overhang), 또는 블런트 말단(blunt end)을 초래할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "블런트 말단 (blunt end)"은 당업계에서 일반적으로 허용되는 의미를 지칭한다. 본 명세서의 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 돌출 뉴클레오티드가 없는, 이중 가닥 siRNA 분자의 말단을 지칭할 수 있다. 본 명세서에 기재된 siRNA 분자는 안티센스 가닥의 5'- 말단, 및 센스 가닥의 3'- 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것일 수 있다.
MyD88의 발현을 억제하기 위한 RNAi 유도용 핵산 분자
"MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88)"은 골수 분화 일차 반응 유전자 88 또는 선천성 면역 신호 변환 어뎁터(innate immune signal transduction adaptor)로도 지칭된다. 상기 MyD88는 면역 세포 내 신호 전달에 기여하며, 황반 변성과 같은 안구 질환과 밀접한 관련성이 있는 것으로 알려져 있다. 상기 MyD88 단백질은 천연적으로 존재하는 야생형 MyD88 및 그의 기능적 변이체를 포함하는 것으로 해석될 수 있고, 상기 MyD88 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 서열은 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 수득할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "발현(expression)"은 당업계에서 일반적으로 허용되는 의미를 지칭한다. 상기 용어는 일반적으로, 유전자가 궁극적으로 단백질을 생성하는 과정을 의미할 수 있다. 상기 발현은 전사, 스플라이싱, 전사 후 변형, 또는 번역을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 발현 수준은 mRNA 수준 또는 단백질 수준의 검출에 의해 결정되거나 모니터링될 수 있다.
대상체에서의 MyD88 유전자 발현과 관련하여 사용된 용어, "억제" 또는 "감소"는 비처리군 또는 정상 대조군 대비 통계적으로 유의미한 감소를 지칭한다. 상기 감소는 예를 들어, 최소 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상일 수 있으나, 이는 검출 또는 측정 방법에 따라, 검출 수준 이하일 수도 있다.
siRNA는 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA)로 RNAi(RNA interference) 작용에 관여한다. RNAi는 1998년 Caenorthabditis elegans에서 최초로 발견된 세포 내 유전자 조절 기작으로 작용기전은 세포 내로 투입된 RNA 이중 가닥 중 안티센스 가닥이 표적 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합함으로써 표적 유전자 분해를 유도한다고 알려져 있으며, 최근 가장 각광받는 신약 개발 후보 기술이다.
다만, 이러한 가능성과 반대로 siRNA의 부작용 및 단점이 계속적으로 보고되어 있다. RNAi 기반 치료제의 개발이 이루어지기 위해서는 1) 효과적인 전달시스템의 부재 2) 오프타겟 효과 3) 면역반응 유도 4) 세포 내 RNAi 기구 포화와 같은 장벽을 극복해야 할 필요성이 있다. siRNA가 표적 유전자의 발현을 직접적으로 조절할 수 있는 효과적인 방법임에도 불구하고 이와 같은 문제들로 인해 치료제 개발에 어려움을 겪고 있다. 이와 관련하여, 비대칭 siRNA(asymmetric shorter duplex siRNA, asiRNA)는 종래의 siRNA가 가지는 19+2 구조에 비해 짧은 이중나선 길이를 갖는 비대칭 RNAi 유도 구조이다. 기존 siRNA 구조 기술에서 확인되는 오프-타겟 효과, RNAi 기작의 포화, TLR3에 의한 면역반응 등의 문제점들을 극복한 기술이며, 이에 따라 부작용이 낮은 RNAi 신약 개발이 가능하다.
이를 바탕으로, 본 실시예에서 센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 비대칭 siRNA를 제시하며, 일 실시예에 따른 siRNA는 오프-타겟 효과, RNAi 기작의 포화 등의 문제를 일으키지 않아 안정적으로 높은 전달 효율을 유지하면서, 목적하는 정도로 유효하게 MyD88 유전자에 대한 발현을 억제할 수 있다.
일 실시예에서는 MyD88을 표적으로 하는 비대칭 siRNA (asymmetric siRNA: asiRNA)를 디자인 및 제작하였으며, MyD88을 발현하는 세포에 상기 asiRNA를 transfection한 뒤, knockdown efficiency가 우수한 RNAi 유도용 핵산 분자, 즉 MyD88 asiRNA를 선별하였다.
일 구체예에서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는 서열번호 1의 안티센스 가닥 및 서열번호 2의 센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 화학적 변형이 도입되어 있는 것일 수 있다.
또한, 상기 안티센스 가닥의 5'- 말단, 및 센스 가닥의 3'- 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것일 수 있다.
화학적인 변형이 도입된 RNAi 유도용 핵산 분자
상기 RNAi 유도용 핵산 분자에서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것일 수 있다.
일반적인 siRNA는 포스페이트 백본 구조에 의한 높은 음전하 및 높은 분자량 등의 이유로 세포막을 통과할 수 없고 혈액에서의 빠른 분해 및 제거되어 실제 표적 부위에 RNAi 유도를 위한 충분한 양을 전달하는데 어려움이 있다. 현재 in vitro 전달의 경우 cationic lipids와 cationic polymers들을 이용한 높은 효율의 delivery 방법이 많이 개발되어 있지만, in vivo의 경우에는 in vitro 만큼의 높은 효율로 siRNA를 전달하기 어렵고, 생체 내에 존재하는 다양한 단백질들과 상호작용에 의하여 siRNA 전달 효율이 감소하는 문제점이 있다.
이에, 본 실시예에서는 비대칭 siRNA 구조에 화학적 변형을 도입하여 세포 침투능(cell-penetrating ability)을 가지는 RNAi 유도용 핵산 분자를 제시하여, 보다 구체적으로, 별도의 전달체 없이 효과적이고 세포 내 전달을 할 수 있는 비대칭 siRNA 구조체(cell penetrating asymmetric siRNA, cp-asiRNA)를 제시한다.
한편, 상기 언급된 화학적 변형은 아래와 같은 기능성을 부여할 수 있다:
(ⅰ) 센스 가닥 3' 말단에 친유성 모이어티의 도입은 siRNA가 세포막을 용이하게 투과하도록 할 수 있으며, (ⅱ) 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단에 인접한 phosphate backbone을 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 등으로의 치환은 핵산외부가수분해 효소에 대한 저항성을 부여하며, 세포로의 흡수와 in vivo에서 siRNA의 생물학적 이용을 가능하게 할 수 있다. (ⅲ) 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기에 대한 메틸, 메톡시 등으로의 치환은 핵산가수분해 효소에 대한 저항성을 부여하고, siRNA immunogenicity를 낮추어 주며 off-target 효과를 감소시켜 줄 수 있으며, (ⅳ) 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기에 대한 fluoro로의 치환은 이중 가닥에 안정성을 부여하며, 혈청에서의 안정성을 높이고 in vitro와 in vivo에서 효율적인 silencing이 가능하게 할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 안티센스 가닥은 하기 (A) 내지 (D)중 어느 하나의 서열을 포함하며(5'-> 3'), 여기서, *는 포스포로티오에이트 결합으로의 변형, m은 2'-O-메틸로의 치환, f는 2'-플루오르로의 치환, 및 P는 5'-인산기의 결합의 결합을 의미한다:
(A) P-mUGGUCUGGAAGmUmCAmC*A*mU*mU*mC,
(B) P-mUfGmGfUmCfUmGfGmAfAmGfUmCfAmC*fA*mU*fU*mC,
(C) P-mUGmGUCUmGmGmAmAmGUCAC*mA*U*U*C, 또는
(D) P-mUGGfUfCfUGGAAGfUfCAfC*A*fU*fU*fC.
일 구체예에서, 상기 센스 가닥은 15 내지 17nt의 길이를 가지고, 상기 센스 가닥 내 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드는 안티센스 가닥과 상보적이며; 상기 센스 가닥은 적어도 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함할 수 있다. 상기 센스 가닥은 하기 (a) 내지 (c)중 어느 하나의 서열을 포함하며(5'-> 3'), 여기서, *는 포스포로티오에이트 결합으로의 변형, m은 2'-O-메틸로의 치환, 및 Lp은 친유성 모이어티의 도입을 의미한다:
(a) mUmGUGACUUCCAGAC*mC*mA*Lp,
(b) mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*Lp, 또는
(c) mUGmUGAmCmUmUmCmCAGAmC*mC*A*Lp.
상기 친유성 모이어티는 콜레스테롤, 토코페롤, 스테아르산(stearic acid), 레티노산(retinoic acid), DHA(docosahexaenoic acid), 팔미트산(palmitic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(Linolenic acid) 및 탄소수 10개 이상의 장쇄 지방산으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 콜레스테롤, DHA, 또는 팔미트산일 수 있다. 가장 바람직하게는 팔미트산이다.
일 구체예에서, 상기 센스 가닥은 하기로부터 선택되는 어느 하나의 센스 가닥을 포함하며, 여기서, *는 포스포로티오에이트 결합으로의 변형, m은 2'-O-메틸로의 치환, chol은 3'-콜레스테롤의 결합, 및 PA는 3'- 팔미트산(Palmitic acid)의 결합을 의미한다:
(d) mUmGUGACUUCCAGAC*mC*mA*chol,
(e) mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*chol,
(f) mUGmUGAmCmUmUmCmCAGAmC*mC*A*chol,
(g) mUmGUGACUUCCAGAC*mC*mA*PA,
(h) mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*PA, 또는
(i) mUGmUGAmCmUmUmCmCAGAmC*mC*A*PA.
다른 양상은 RNAi 유도용 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 조성물은 전술한 RNAi 유도용 핵산 분자를 그대로 포함하거나 이를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
안구 질환
상기 약제학적 조성물은 MyD88 유전자의 발현을 억제함으로써 비정상적인 혈관신생을 저해하는 기능을 가지므로 혈관 이상을 수반하는 안구질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다.
상기 안구 질환은 예를 들어, 황반변성일 수 있고, 여기서, "황반변성”은 신생 혈관이 비정상적으로 자라나 황반이 손상을 입게 되어 시력에 영향을 미치는 증상을 수반하는 안구 질환이다. 황반변성은 50세 이상의 연령층에서 주로 발생하며, 비삼출성(건성 유형) 또는 삼출성(습성 유형)으로 나뉜다. 특히, 습성 황반변성의 경우는 실명을 유발할 수 있으며, 그 원인에 대해서는 아직 정확히 밝혀지지는 않았으나 위험인자로 알려져 있는 것은 나이이며, 환경적 요인으로는 흡연, 고혈압, 비만, 유전적 소인, 과도한 자외선 노출, 낮은 혈중 항산화제 농도 등이 있다.
약제학적 조성물
본 명세서에서 용어, "유효성분 (effective ingredient)"은 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 유효량의 성분을 의미한다. 구체적으로는, 유효량의 제제, 활성제, 또는 핵산 분자를 의미할 수 있다.
상기 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있고, 질병을 예방하거나, 질병 상태를 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 또는 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로)을 위한 적절한 양일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "예방 (prevention)"은 질환의 발생을 미리 차단하거나, 질환을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 예를 들어, 상기 안구 질환 또는 이의 특징적인 특성의 발생을 막거나, 발생을 방해하거나, 상기 안구 질환 또는 이의 특징적인 특성의 발생으로부터 방어 또는 보호하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 용어, "치료 (treatment)"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 의미한다. 또한, 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 예를 들어, 상기 안구 질환 또는 이의 특징적인 특성을 예방, 감소 또는 개선하거나, 또는 대상체에서 상기 안구 질환 또는 이의 특징적인 특성의 진행을 지연 (약화)시키는 것이다.
본 명세서에서 용어, "유효량 (effective amount)"은 당업계에서 일반적으로 허용되는 의미를 지칭한다. 상기 용어는 일반적으로 연구자, 수의사, 의사, 또는 기타 임상의사 등이 추구하는 세포, 조직, 시스템, 동물, 또는 인간의 의도된 생물학적 반응 (예: 유익한 반응)을 이끌어낼 분자, 화합물, 또는 구성물의 양을 의미할 수 있다. 구체적으로, "치료학적 유효량 (therapeutically effective amount)"은 예컨대, 질병이나 장애와 관련된 측정 가능한 파라미터에 있어서 치료적으로 관련된 변화가 있어 특정 임상적 치료가 효과적이라고 간주될 수 있는 정도의 바람직한 의학적 반응을 이끌어낼 수 있는 분자, 화합물, 또는 구성물의 양을 의미할 수 있다. 상기 질병 또는 장애의 치료를 위한 약물의 치료학적 유효량은 상기 파라미터에서 치료적으로 관련된 변화를 초래하는데 필요한 양일 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 안구내(intraocular) 투여될 수 있다. 상기 핵산 분자의 안구내 투여는, 당해 투여 경로가 상기 핵산 분자를 눈으로 들어가도록 하는 한, 눈에 대한 주사 또는 직접(예를 들어, 국소) 투여에 의해 이루어질 수 있다. 상기한 눈으로의 국소 투여 경로 이외에, 적합한 안구내 투여 경로는 유리체내(intravitreal), 망막내, 망막하, 테논낭하(subtenon), 안구주위(peri-orbital) 및 안구후방(retro-orbital), 결막낭내, 결막하, 각막통과(trans-corneal) 및 공막통과(trans-scleral) 투여를 포함한다
상기 "제약상 허용되는 조성물" 또는 "제약상 허용되는 제형"은 상기 핵산 분자가 목적하는 활성을 발휘하는데 가장 적합한 물리적 위치로 효과적으로 분배되게 할 수 있는, 조성물 또는 제형을 지칭할 수 있다.
다른 양상은 치료학적 유효량의 상기 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안구 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 안구 질환을 치료하는 방법은 전술한 RNAi 유도용 핵산 분자 또는 약제학적 조성물을 그대로 포함하거나 이를 이용하기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어, "개체"는 질병, 구체적으로 안구 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양 등의 포유류를 모두 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. siRNA 서열 및 합성
본 실시예에서는 MyD88을 표적으로 하는 siRNA를 합성하였는데, 다양한 화학적 변형(2'OMe, PS, Fluoro)과 센스 가닥의 3'말단에 콜레스테롤, 팔미트산과 같은 친유성 모이어티를 도입한 siRNA를 제조하였는데(표 1 참조), 이러한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 구체적으로, 본 실시예에서는 친유성 모이어티인 콜레스테롤 및 PA를 도입하기 위해, 콜레스테롤-TEG-CPG (LGC Prime Synthesis사 제조) 및 PA-링커-CPG (LGC LINK사 제조, 하기 표 3 참조)를 각각 사용하였다.
한편, 상기 표 1에 "*", "m", "f", "chol"및 "PA"로 표기된 화학적 변형은 표 2에 나타낸 바와 같고 "chol" 및 "PA"로 표기된 화학적 변형은 각각 3'-말단에 콜레스테롤 및 팔미트산(Palmitic acid, 팔미토일 형태로 도입)가 첨가된 형태를 의미한다.
실시예 2. siRNA 처리에 따른 MyD88 mRNA 수준 평가 -
in vitro
녹다운 분석
(1) OLX301A-110-3, OLX301A-110-5, OLX301A-110-7, OLX301A-110-13 및 OLX301A-110-14 처리에 따른 분석
MyD88 mRNA에 대한 발현 억제 효과를 확인하기 위하여, 각각 100 nM의 siRNA인 OLX301A-110-3, OLX301A-110-5, OLX301A-110-7, OLX301A-110-13 및 OLX301A-110-14 각각을 ARPE-19 세포에 처리하고, 이를 인큐베이션(free uptake)한 후, Realtime qPCR로 MyD88 mRNA의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, ARPE-19 세포는 24-웰 플레이트에 3 x 104 cells/well로 씨딩되었고, 이로부터 24시간 후, 여기에 100 nM의 cp-siRNA를 첨가한 후, Opti-MEM media 조건에서 세포를 인큐베이션하였다. 이로부터 24시간 후, Tri-RNA reagent (FAVORGEN)을 이용하여 total RNA를 추출한 후, High-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이후, TB Green Premix Ex Taq (Takara, RR420A)와 표 4의 프라이머를 이용하여 CFX Connect Real-Time PCR Detection System (BioRad)으로 MyD88 유전자의 발현 수준을 확인하였다. (표 5 참조)
(2) OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23 처리에 따른 분석
실시예 1에서 합성된 siRNA인 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 OLX301A-110-23의 MyD88 발현을 억제하는 지 알아보기 위해 아래와 같은 실험을 수행하였다.
각각 (25, 50, 100, 500, 1000) nM의 siRNA를 Y79 세포에 처리하고, 이를 인큐베이션(free uptake)한 다음, Realtime qPCR로 MyD88 mRNA의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, Y79 세포는 24-웰 플레이트에 6 x 104 cells/well로 씨딩되었고, 이로부터 24시간 후, 여기에 25, 50, 100, 500, 1000 nM의 siRNA를 첨가한 후, Opti-MEM media 조건, 즉 RPMI 1640 (10% FBS)에서 세포를 인큐베이션하였다. 이로부터 24시간 후, Tri-RNA reagent (FAVORGEN)을 이용하여 total RNA를 추출한 후, High-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이후, TB Green Premix Ex Taq (Takara, RR420A)와 표 6의 프라이머를 이용하여 CFX Connect Real-Time PCR Detection System (BioRad)으로 MyD88 유전자의 발현 수준을 확인하였다. (표 7, 도 1a 내지 도 1c 참조)
실시예 3. siRNA 처리에 따른 MyD88 단백질 수준 평가
(1) OLX301A-110-3, OLX301A-110-5, OLX301A-110-7, OLX301A-110-13, OLX301A-110-14 처리에 따른 분석
실시예 1에서 합성된 siRNA의 MyD88 단백질에 대한 발현 억제 효과를 확인하기 위하여, 각각 1 nM의 siRNA를 ARPE-19 세포(ATCC)에 형질감염시킨 뒤, western blot을 통해 MyD88 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, ARPE-19 세포를 12-웰 플레이트에 5 x 104 cells/well로 씨딩하였고, 이로부터 24시간 후, 여기에 2 μM의 siRNA를 첨가한 후, Opti-MEM media 조건에서 세포를 인큐베이션하였다. 이로부터 24시간 후, 배지를 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco)을 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium/F-12 Nutrient Mixture Ham (DMEM/F-12) 1:1 Mixtures (Gibco)로 교체하였고, 48시간 후, MyD88 단백질의 발현 수준을 측정하였다.
그 결과, 상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 상기 siRNA의 처리에 따른 MyD88 단백질의 발현 억제 효과를 확인하였다. 특히, 상대적으로 우수한 MyD88 단백질 발현 억제 효율을 나타냈다.
(2) OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23의 처리에 따른
in vivo
에서의 MyD88 단백질의 녹다운 분석
1) 정상 마우스에서의 MyD88 단백질 발현의 억제 효능
본 실시예에서는 in vivo에서의 실시예 1에서 합성된 siRNA인 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23가 MyD88 단백질의 발현을 억제하는지 알아보기 위해, 아래와 같은 실험을 수행했다. 정상 마우스에서의 MyD88 단백질 발현의 억제 효능을 확인하기 위해, 9주령의 수컷 C57BL/6 마우스 (그룹당 3 마리, 안구 6개)에 8 μg의 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23을 포함하는 10 mM PBS 혼합액 0.8 μl를 제조하여 유리체 내 주사 (intravitreal injection, IVT) (Day 0) 하였다. 투여 7일째 마우스로부터 RPE를 분리하여 RIPA buffer (SIGMA, R0278)를 넣고, tissue grinder pestle (Scienceware, 199230001)와 sonicator (Sonics, VC505)를 이용하여 균질화하였다. 이후, 원심분리하여 얻은 상층액으로부터 BCA Protein Assay Kit (Thermo, 23225)를 이용하여 단백질을 정량하고, 각 샘플마다 20 μg의 단백질을 8-16% Precast Gel (Bio-rad, 456-1106)를 사용하여 전기영동하고, PVDF membrane (Bio-rad, 1620177)으로 transfer 하였다. SuperBlockTM (TBS) blocking buffer (Thermo, 37535)에 blocking하고, MyD88 antibody (1:500; Cell signaling, 4283)와 Vinculin antibody (1:2,000; Santa Cruz, sc-73614)및, HRP-conjugated anti-rabbit과 anti-mouse IgG (1:5,000; Santa Cruz, sc-2357와 Bethyl laboratories, A90-116P)를 사용하여 각 제조사의 프로토콜에 따라 반응시켰다. ECL (Thermo, 34580, or 34095)을 처리하여 ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad, 1708265)으로 MyD88과 Vinculin 단백질 발현 정도를 확인하였다. 해당 시험의 음성 대조군으로는 scrambled cp-asiRNA (SCR) 투여군이 사용되었다. 그 결과, MyD88 단백질의 레벨이 약 35~45% 가량 낮아진 것을 확인하였다. (표 9, 도 2a 및 도 2b 참조)
2) Laser-injury 마우스 모델에서의 MyD88 단백질 발현의 억제 효능
OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23의 Laser-injury 마우스 모델에서의 MyD88 단백질 발현 억제 효과를 확인하기 위해, 9주령의 수컷 C57BL/6 마우스 (그룹당 6마리의 마우스, 안구 12개)에 Laser injury (Power: 130 mW, Duration: 80 ms, Size: 75 μm, 6 lasers/안구)를 준 직후, 4 μg의 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23을 포함하는 10 mM PBS 혼합액 0.8 μl를 제조하여 유리체 내 주사 (intravitreal injection, IVT) (Day 0) 하였다. 투여 7일째에 상기와 동일한 방법으로 마우스 RPE를 분리하여 각 샘플마다 20 μg의 단백질에 대한 Western blot analysis를 통해 MyD88 단백질 발현 수준을 측정하였다. 해당 시험의 음성 대조군으로는 scrambled cp-asiRNA (SCR) 투여군이 사용되었다. 그 결과, MyD88 단백질의 레벨이 약 30~35% 가량 낮아진 것을 확인하였다. (표 10, 도 3a 및 도 3b 참조)
3) CNV 모델에서의 CNV 부피 감소 확인
본 실시예에서는 레이저 광응고에 의한 맥락막 신생 혈관 (Choroidal neovascularization: CNV)이 유도된 마우스에서의 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23의 투여에 따른 치료 효능을 평가하였다. 구체적으로, 9주령의 수컷 C57BL/6 마우스 (그룹 당 8마리, 8안구)에 레이저 광응고 (Power: 130 mW, Duration: 80 ms, Size: 75 μm, 4 lasers/안구)를 유도한 직 후, 1 및 2 μg의 OLX301A-110-21, OLX301A-110-22 및 OLX301A-110-23을 포함하는 10 mM PBS 혼합액 0.8 μl를 제조하여 유리체 내 주사 (intravitreal injection, IVT) (Day 0) 하였다. 이로부터 6일째에 마우스의 안구로부터 분리한 RPE flat은 혈관 내피세포에 특이적인 Isolectin B4 (Vector laboratories, FL-1201) 형광 염색을 하였다. 이후 공초점 현미경(Leica, TCS SP8)을 이용하여 형광이 관찰되는 시작부터 끝 지점까지 촬영하였다. Image J software를 통해 촬영된 이미지로부터 IB4 염색이 된 영역을 수치화 하여 CNV 부피를 측정하고, 음성 대조군과의 상대적인 % 비교를 통해 치료 효능을 평가하였다. 해당 시험의 음성 대조군으로는 10 mM PBS 투여군이 사용되었고, 양성 대조군으로는 1 및 2 μg의 OLX10020 투여군이 사용되었다. 그 결과, CNV 부피가 약 30~40% 정도 감소함을 확인하였고, 양성 대조군에 비해서도 그 효능이 우수함을 확인하였다. (표 11, 도 4 참조)
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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ggttggtgta gtcgcagaca 20
Claims (8)
- 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥의 RNAi 유도용 핵산 분자로서,
상기 안티센스 가닥은 19 내지 21nt의 길이를 가지고, 상기 안티센스 가닥 내 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드는 센스 가닥과 상보적이며, 상기 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형을 포함하고; 및
상기 센스 가닥은 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이며(5'->3'):
(a) mUmGUGACUUCCAGAC*mC*mA*Lp,
(b) mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*Lp, 및
(c) mUGmUGAmCmUmUmCmCAGAmC*mC*A*Lp,
상기에서, *는 포스포로티오에이트 결합으로의 변형, m은 2'-O-메틸로의 치환, 및 Lp은 친유성 모이어티인, RNAi 유도용 핵산 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는 siRNA인, RNAi 유도용 핵산 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 화학적 변형은:
하나 이상의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로의 변형; 또는
하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -O-메틸(Methyl)로 치환인 것인, RNAi 유도용 핵산 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는 비대칭 이중가닥 구조를 형성하며, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것인, RNAi 유도용 핵산 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는 골수 분화 일차 반응 유전자 88(Myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88)의 발현을 억제하는 것인, RNAi 유도용 핵산 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 하기 (A) 내지 (D)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이며(5'->3'):
(A) P-mUGGUCUGGAAGmUmCAmC*A*mU*mU*mC,
(B) P-mUfGmGfUmCfUmGfGmAfAmGfUmCfAmC*fA*mU*fU*mC,
(C) P-mUGmGUCUmGmGmAmAmGUCAC*mA*U*U*C, 및
(D) P-mUGGfUfCfUGGAAGfUfCAfC*A*fU*fU*fC,
상기에서, *는 포스포로티오에이트 결합으로의 변형, m은 2'-O-메틸로의 치환, f는 2'-플루오르로의 치환, 및 P는 5'-인산기의 결합을 의미하는 것인, RNAi 유도용 핵산 분자.
- 청구항 1에 따른 RNAi 유도용 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 노인성 황반변성의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 삭제
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