CN104450710B - 抑制myd88基因的寡聚核酸及其应用 - Google Patents
抑制myd88基因的寡聚核酸及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了抑制MYD88基因的寡聚核酸，所述寡聚核酸为双链RNA，所述寡聚核酸的碱基组成为：所述寡聚核酸的碱基组成为：包括有(1)含有SEQ.ID NO.12所示的70％以上同源的反义链；(2)含有与(1)所述反义链反向互补配对的寡聚核酸的50％以上序列同源的正义链；且(3)所述正义链和所述反义链经过退火后能形成双链结构。并公开了含有上述寡聚核酸的DNA、载体、组合物及其应用。本发明提供了一类对MYD88有显著抑制作用的寡聚核酸，该寡聚核酸能在动物实验中实现抑制炎症作用，显著降低多种炎症因子，是一种十分有前景的炎症治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及一类抑制MYD88基因的寡聚核酸及其应用。
背景技术
骨关节炎(OA)是世界上致残的重要原因之一，大约多于10％的老年人有骨关节炎的症状。风湿性关节炎(RA)是一个慢性炎症疾病，影响着世界上约0.5％到1％的成年人，通常导致关节损坏并危及生活质量。多种炎性细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6等参与了RA和OA的发病和进展，其通过激活免疫细胞及诱导金属蛋白酶产生而促进关节破坏、滑膜炎、血管增生等。
MYD88是一种胞质可溶性蛋白，其由TLRs(TLR3除外)激活，是TLRs信号转导通路中最主要的接头蛋白。现有研究显示TLRs在类风湿关节炎发病及进展中发挥重要作用，而髓样分化因子MYD88作为TLRs通路中的核心蛋白，其在类风湿关节炎发病中的作用也日渐突出。研究表明MYD88不但在促进炎性细胞因子过表达中发挥重要作用，也能促进T细胞增殖和启动先天性免疫应答和适应性免疫应答。
在过去的20多年里，大多数新型治疗方法的研发工作是关于疾病缓解的抗关节炎药物(DMARDs)和疾病缓解的抗风湿性关节炎的药物(DMOADs)。到目前为止，制药业在研制有效安全的疾病缓和性药物(DMOADs)上并不成功，致使成千上万的病人仍受到该严重致残性疾病所带来的痛苦。随着新途径和给药方法的应用，在该治疗领域预期将有更多的发展，开发出可阻断、逆转疾病过程并缓和疾病的药物。
1998年克雷格·梅洛和安德鲁·法尔发现了基因沉默现象，随后Tuschl和他的同事在哺乳动物细胞中发现化学合成的19－25个碱基的小干扰RNA(siRNA)，可特异高效的沉默靶mRNA。从此siRNA被广泛用于基因功能研究，疾病治疗。siRNA可特异的同序列互补的靶mRNA结合，并使其降解。长片段的双链RNA被Dicer酶切割成21－23个碱基长度短片段RNA。两条链中同靶mRNA结合的链称为反义链，另一条链称为正义链或信使链。体外化学合成的siRNA进入细胞后同样发挥RNA干扰作用，而且有效降低了长链RNA引起的免疫反应。但针对同一基因不同片段位置可设计出多种siRNA，沉默效果有明显差异。
在本发明中，我们提供一种全新的siRNA作为关节炎及相关炎症的治疗药物；一种通过骨关节腔局部注射siRNA及其制剂抑制炎症因子表达的方法，实现了对关节炎及相关炎症的治疗作用。
发明内容
本发明目的旨在提供一类抑制MYD88基因表达的寡聚核酸。
实现上述目的的技术方案如下。
一类抑制MYD88基因的寡聚核酸，所述寡聚核酸为双链RNA，所述寡聚核酸的碱基组成为：
包括有(1)含有SEQ.ID NO.12组成的70％以上同源的反义链；(2)含有与(1)所述反义链反向互补配对的寡聚核酸的50％以上序列同源的正义链；且
(3)所述正义链和所述反义链经过退火后能形成双链结构。
在其中一个实施例中，所述寡聚核酸包括有(1)由SEQ.ID NO.12碱基序列所示的反义链；(2)含有SEQ.ID NO.11所示至少50％序列同源构成的正义链；且(3)所述正义链和所述反义链经过退火后能形成双链结构。
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在其中一个实施例中，所述寡聚核酸包括有(1)含有SEQ.ID NO.12所示至少70％序列同源构成的反义链；(2)含有SEQ.ID NO.11所示至少70％序列同源构成的正义链；且(3)所述正义链和所述反义链经过退火后能形成双链结构。
在其中一个实施例中，所述寡聚核酸由碱基组成如SEQ.ID NO.12所示的反义链以及碱基组成如SEQ.ID NO.11所示的正义链组成。
在其中一个实施例中，所述寡聚核酸由碱基组成如siRNA-M8-42，siRNA-M8-40，siRNA-M8-41，siRNA-M8-39，siRNA-M8-36，siRNA-M8-28所示。
本发明提供寡聚核酸是双链RNA，其中所述双链RNA中的特征为：反义链含有核苷酸序列为“3'GCCUCCUCUACCUGAAACU 5'”如序列表中序列12，或与其具有至少70％以上同源性的同源序列；正义链含有与反义链反向互补链具有50％同源性以上的核苷酸序列。上述寡聚核酸可为经过(1)-(4)中任一项或多项修饰得到的寡聚核酸：
1)对所述寡聚核酸的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰，优选将所述磷酸二酯键的氧用硫取代；
2)对所述寡聚核酸的所含核糖进行修饰，优选将核糖2’-OH用甲氧基或氟取代或者对所述2’-OH进行脱氧修饰，或以开环核酸(UNA)进行修饰；
3)对所述寡聚核酸的核苷酸碱基的修饰，优选胞嘧啶5位甲基修饰、5-乙炔基尿嘧啶、吲哚修饰；
4)对所述寡聚核酸末端修饰，优选末端连接胆固醇、多肽、荧光、糖、抗体分子、磷酸化修饰；
5)本发明所述寡聚核酸在3’末端可以添加悬挂碱基，优选悬挂碱基为dT。
本发明的另一目的还在于提供一种有抑制MYD88基因表达功能的DNA。
具体技术方案如下。
可表达上述任一种寡聚核酸且具有抑制MYD88基因表达功能的DNA。
本发明的另一目的还在于提供一种具有抑制MYD88基因表达功能的载体。
具体技术方案如下。
含有上述任一种寡聚核酸或者上述DNA的载体，所述载体为脂质体、聚合物材料、多肽、纳米材料。其中脂质体载体材料为本领域常用的阳离子脂质体，优选转染试剂lipo2000；聚合物载体材料优选透明质酸或聚赖氨酸；多肽材料优选RGD，或含RGD序列的多肽；纳米材料优选为壳聚糖纳米粒。
本发明的另一目的还在于提供一种具有抑制MYD88基因表达功能的组合物。具体技术方案如下。
一种具有抑制MYD88基因表达功能的组合物，含有上述任一种寡聚核酸或者上述DNA，以及药学上可接受的载体。
本发明的另一目的还在于提供上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物的应用。
具体技术方案如下。
上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物在制备调节细胞中MYD88基因表达制品中的应用。
上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物在制备诊断MYD88相关疾病的试剂中的应用。
上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物制备治疗MYD88基因异常引发的疾病的药物中的应用。
在其中一个实施例中，所述MYD88基因异常引发的疾病可选自炎症、免疫性疾病、感染性疾病、癌症、心血管疾病。
在其中一个实施例中，所述MYD88基因异常引发的疾病为骨关节炎、风湿性关节炎、滑膜炎、炎性肠炎、哮喘、I型糖尿病或红斑狼疮。更优选为骨关节炎、风湿性关节炎或滑膜炎。
本发明针对MYD88基因CDs区域内的不同位置进行优化设计，经过初步的实验之后，再选择了9对针对人与鼠同源基因的siRNA进行筛选试验。最后发现反义链含有核苷酸序列为“3'GCCUCCUCUACCUGAAACU 5'”的siRNA-M8-04对MYD88基因mRNA表达抑制效果最强，对MYD88基因的mRNA沉默效率达84％(实施例二)。在免疫印迹(western blotting)实验中，与空白和阴性对照组相比加入siRNA-M8-04后，MYD88蛋白表达水平明显下降，差异有显著性(P<0.05)(实施例三)。经IL 1-α刺激后的细胞中加入siRNA-M8-04，与加入阴性对照寡聚核酸相比，细胞炎症因子TNF、COX-2、IL-1β含量明显下降，表明siRNA-M8-04具有消除炎症效果(实施例四)。在实施例五中，本发明对序列进行了优化，实验结果表明:反义链含“3'GCCUCCUCUACCUGAAACU 5'的同源序列的双链寡核酸对MYD88基因mRNA具有抑制效果；正义链与反义链反向完全互补或部分仅部分互补对MYD88基因mRNA也具有抑制效果，且含有与反义链70％同源序列的双链RNA也具有抑制效果。实施例六应用质粒载体表达3'GCCUCCUCUACCUGAAACU 5'”序列，在细胞中也具有良好的MYD88基因的mRNA抑制效果。实施例七研究了化学修饰对核酸沉默MYD88基因效果的影响，结果表明：经适当的修饰后的寡聚核酸对MYD88基因具有良好的抑制作用。
实施例八的研究表明，经化学修饰后，本发明的siRNA在血清中的稳定性显著提高。实施例九为siRNA的活体大鼠试验，在关节炎模型大鼠的关节腔内单独或混合注射含反义链“3'GCCUCCUCUACCUGAAACU 5'”或5’-UCGAAACCCAUCUCCUCCG-3’的化学修饰物，关节液炎症因子含量检测试验表明，寡聚核酸在大鼠体内有明显的炎症抑制作用。
本发明的有益效果主要体现在：1、本发明运用基因沉默技术，经过大量的设计、筛选、分析与验证发现了一类对MYD88有显著抑制作用的寡聚核酸，在一类hFLS细胞中，抑制效率达到84％以上，且与该序列具有70％以上同源性的核酸序列都能起到基因沉默的效果，表明本发明是一类对MYD88沉默效果极强的核酸序列；2、本发明还涉及一类核酸化学修饰物，其具有的高稳定性、高活性、高特异性与低细胞毒性使之能成为活体施用的有效药物；3、本发明涉及的核酸能在动物实验中实现抑制炎症作用，显著降低多种炎症因子，是一种十分有前景的炎症治疗药物。
附图说明
图1 siRNA-M8-04免疫印迹实验结果示意图。
图2 siRNA-M8-04下调炎症因子实验结果示意图。
图3 不同siRNA-M8结构的靶基因表达量实验结果示意图。
图4 化学修饰增强寡聚核酸血清稳定性实验结果示意图。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规公知方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。hFLS细胞购自Cell Applications，MCF-7细胞购自ATCC，Human IL-1βimmunoassay检测试剂盒购自Assay Pro，Lipofectamine2000试剂盒购自Invitrogen，胰酶、Trizol、PBS为sigma产品，雄性SD大鼠为广东医学实验动物中心产品，引物、siRNA等核酸序列均广州市锐博生物科技有限公司合成。
本发明中所描述的“TNF”为“TNF-α”。
抑制率＝NC(negative contral)对照表达量-目的基因表达量/NC(negativecontral)对照表达量。
本发明所述“药学上可接受的载体”是指本领域中常用的体内转染试剂，如聚乙烯亚胺(PEI)，jetPEI(线性聚乙烯亚胺)，羟基脂肪酸酯(PHA)，阳离子聚合物，氨基酸，脂质体等。
实施例一寡聚核酸的化学合成
(1)实施例中所应用的RNA和修饰寡核酸单体均按照以下方法获得：
寡核酸中的RNA核苷酸以2’-O-TBDMS亚磷酰胺单体制备；DNA核苷酸以脱氧核苷亚磷酰胺单体制备；核苷酸糖基修饰核苷以2’-OCH3、2’-F、锁核酸(LNA)、开环核酸(UNA)、5-甲基胞嘧啶、吲哚、5-乙炔基尿嘧啶亚磷酰胺单体制备；骨架磷酸硫代核酸以Beaucage试剂或PADS试剂代替碘水制备；胆固醇、荧光标记、糖修饰、磷酸化寡聚核酸由对应单体制备；多肽修饰寡核酸由巯基修饰寡核酸与多肽经过迈克尔加成反应得到，以上所述单体从SigmaAldrich，Chem Genes，Glen research公司购买。
(2)寡聚核酸、糖基、碱基、骨架硫代修饰、胆固醇、荧光标记修饰寡核酸制备方法:
理论产量1umol合成规格完成，称取通用固相支持物CPG 20mg(载量50umol/g)，各类亚磷酰胺的单体溶解于无水乙腈溶液中(0.15M)。5-乙硫基-1H-四唑乙腈溶液作为活化剂(0.25M)，氧化剂碘水(0.02M)，3％三氯乙酸二氯甲烷溶液。按照标准RNA合成程序设置程序循环合成，每步偶合时间2-10分钟，经20个循环后，完成寡核苷酸固相合成。吹干CPG，转移到5ml EP管中，加入氨水/乙醇溶液(3/1)1-20ml，55℃加热5～20小时。在10000rpm的转速下离心10min取上清液，抽干浓氨水/乙醇后得到白色胶状固体。固体溶于200μl 1M TBAFTHF溶液，室温震荡20小时。加入0.5ml 1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，室温震荡15分钟，置于离心抽干机抽至体积为原体积1/2，除去THF。溶液用0.5ml氯仿萃取2次，加入1ml 0.1MTEAA上样液，将混合溶液倒入固相萃取柱，按照标准RNA除盐流程，除去溶液中过量盐，所得核酸浓度由微量紫外分光光度计测定，由质谱确认核酸结构。
(3)多肽、抗体连接寡核酸制备方法：
以上方法制备100nmol HS修饰寡聚核酸后，溶解于950μl 100mM HEPES-KOH缓冲液(pH1－14)。与500nmol含烯键修饰的多肽或抗体溶于50μl的水溶液混合。在氮气保护下0－100℃，进行反应，反应效率由HPLC监控，定量转化后，将溶液超滤浓缩后用于实验。
退火：以上制备的寡核酸等量混合于1ml水或缓冲液中，95℃加热2－20分钟，室温静置冷却至室温备用。
实施例二抑制MYD88基因mRNA表达的有效寡聚核酸筛选
进行siRNA设计以确定靶向于MYD88的siRNA，进行生物信息筛选，确保序列对于MYD88序列是特异性的且对于来自任何其他基因的序列不是特异性的。靶序列使用NCBI提供的BLAST搜索引擎相对于GenBank中的序列进行核对，经过大量的初步实验筛选出9对有效siRNA，进行进一步优化。
细胞转染实验。hFLS细胞用0.25％的胰酶进行消化，制成细胞悬液接种于12孔培养板中，当hFLS细胞生长至对数生长期(即生长达80％融合成片时)，siRNA与转染试剂Lip2000混合后，进行分组转染，实验共分为11组：Notarget(NTC)为阴性对照组、NC为空白对照组、siRNA-M8-01至siRNA-M8-09为针对MYD88基因序列不同位置设计的siRNA序列。
Si-h-MYD88_001：CGGCAACTGGAACAGACAA SEQ ID NO.1
靶序列：CGGCAACTGGAACAGACAA
正义链(5'-3')：5'CGGCAACUGGAACAGACAA dTdT 3' SEQ ID NO.2
反义链(3'-5')：3'dTdT GCCGUUGACCUUGUCUGUU 5' SEQ ID NO.3
Si-h-MYD88_002：CTGGAACAGACAAACTATC SEQ ID NO.4
靶序列：CTGGAACAGACAAACTATC
正义链(5'-3')：5'CUGGAACAGACAAACUAUC dTdT 3' SEQ ID NO.5
反义链(3'-5')：3'dTdT GACCUUGUCUGUUUGAUAG 5' SEQ ID NO.6
Si-h-MYD88_003：GGCACCTGTGTCTGGTCTA SEQ ID NO.7
靶序列：GGCACCTGTGTCTGGTCTA
正义链(5'-3')：5'GGCACCUGUGUCUGGUCUA dTdT 3' SEQ ID NO.8
反义链(3'-5')：3'dTdT CCGUGGACACAGACCAGAU 5' SEQ ID NO.9
Si-h-MYD88_004：CGGAGGAGATGGACTTTGA SEQ ID NO.10
靶序列：CGGAGGAGATGGACTTTGA
正义链(5'-3')：5'CGGAGGAGAUGGACUUUGA dTdT 3' SEQ ID NO.11
反义链(3'-5')：3'dTdT GCCUCCUCUACCUGAAACU 5' SEQ ID NO.12
Si-h-MYD88_005：CCATCAAGTACAAGGCAAT SEQ ID NO.13
靶序列：CCATCAAGTACAAGGCAAT
正义链(5'-3')：5'CCAUCAAGUACAAGGCAAU dTdT 3' SEQ ID NO.14
反义链(3'-5')：3'dTdT GGUAGUUCAUGUUCCGUUA 5' SEQ ID NO.15
Si-h-MYD88_006：GATGATTACCTGCAGAGCA SEQ ID NO.16
靶序列：GATGATTACCTGCAGAGCA
正义链(5'-3')：5'GAUGAUUACCUGCAGAGCA dTdT 3' SEQ ID NO.17
反义链(3'-5')：3'dTdT CUACUAAUGGACGUCUCGU 5' SEQ ID NO.18
Si-h-MYD88_007：CATCAGAAGCGACTGATCC SEQ ID NO.19
靶序列：CATCAGAAGCGACTGATCC
正义链(5'-3')：5'CAUCAGAAGCGACUGAUCC dTdT 3' SEQ ID NO.20
反义链(3'-5')：3'dTdT GUAGUCUUCGCUGACUAGG 5' SEQ ID NO.21
Si-h-MYD88_008：GGCATATGCCTGAGCGTTT SEQ ID NO.22
靶序列：GGCATATGCCTGAGCGTTT
正义链(5'-3')：5'GGCAUAUGCCUGAGCGUUU dTdT 3' SEQ ID NO.23
反义链(3'-5')：3'dTdT CCGUAUACGGACUCGCAAA 5' SEQ ID NO.24
Si-h-MYD88_009：TATGCCTGAGCGTTTCGAT SEQ ID NO.25
靶序列：TATGCCTGAGCGTTTCGAT
正义链(5'-3')：5'UAUGCCUGAGCGUUUCGAU dTdT 3' SEQ ID NO.26
反义链(3'-5')：3'dTdT AUACGGACUCGCAAAGCUA 5' SEQ ID NO.27
转染24h后收集hFLS细胞，于1000rpm离心5分钟，去除上清，在细胞沉淀物中加入1ml Trizol裂解液，反复吹打或剧烈震荡使细胞充分裂解，然后转移至新的EP管(1.5ml)中，在室温15-30℃下静置5分钟。加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，振荡15s使其充分混匀，在室温下静置10分钟左右于4℃低温离心机离心，12000rpm，15分钟，离心后液体分为3层：上层无色液体为总RNA，约0.5ml；中层白色蛋白质层；下层红色物为DNA，用吸管吸取上层水相0.5ml上清转移至另一备用的1.5ml EP管中，同时加入0.5ml预冷的异丙醇，充分混匀后于4℃放置10分钟于4℃，12000rpm离心10分钟后，小心弃去上清液，可见在管壁底部附着有少量白色片状物。加入1ml 75％用DEPC处理过的新鲜配制的乙醇，洗涤沉淀，垂直震荡后于4℃，10000rpm离心5min，倒掉大部分上清于4℃，10000rpm再次离心5min，吸去上清加入20μlDEPC处理过的水，至沉淀物完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
将1μl Oligo dT(0.5μg/μl)和2.0μg总RNA加入到PCR管中，再加入DEPC水至9ul；充分混匀后在离心机上进行离心，于70℃温浴10分钟；随后将其放入0℃冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火将EP管取出后置于冰上与试剂混合，配制反应体系，混匀后短暂离心。将上述反应体系置于42℃中反应1小时，随后再于70℃水浴锅中水浴10分钟使逆转录酶失活将所得到的逆转录产物—cDNA。将cDNA、荧光染料与上、下游引物混合，进行定量PCR检测，检测结果见表1。
荧光定量PCR引物：(FP)5’-TACAAGGCAATGAAGAAAGAGT-3’ (SEQ ID NO.44)；
(RP):5’-CAAGGCGAGTCCAGAACC-3’ (SEQ ID NO.45)。
表1hFLS细胞水平MYD88-siRNA靶基因的相对表达量
结果表明，同阴性对照组相比我们经过前期筛选获得的9对有效siRNA序列中，siRNA-M8--04对MYD88的沉默效果最好，抑制了84％以上的基因表达。其中siRNA-M8--04的正义链为序列11，反义链为序列12。
实施例三Western blot法检测hFLS中MYD88蛋白的表达
经siRNA-M8--04转染的细胞，取出培养瓶，弃去细胞培养液，用PBS洗涤2遍，倒掉PBS，加入适量预冷的2×Lysis Buffer，用细胞刮将细胞刮下，置于冰上充分裂解细胞30min，于低温离心机4℃，12000g，离心15min，取上清液，用Bradford法测定蛋白浓度，最后将样品蛋白的终浓度均调整为2μg/μl，于-80℃冰箱保存备用。分别取12g总蛋白量的样品，加入等体积的2X loading buffer上样缓冲液。将二者充分混匀后，在沸水中煮浴10分钟，4℃存放备用。根据目的蛋白分子量大小配制相应浓度的胶(10％的SDS-PAGE分离胶和5％的浓缩胶)，等胶制备好后，将梳子拔去后用电泳缓冲液清洗上样孔，将之前准备好的样品上样，每孔加入蛋白样品，进行电泳。电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，400mA恒流条件下电转2小时，将蛋白转移到PVDF膜上。随后进行显色和曝光分析，分析结果见图1。
结果表明，siRNA-M8—04(SEQIDNO.11和SEQIDNO.12)显著抑制了MYD88的蛋白表达，后续选用siRNA-M8--04做进一步的试验。
实施例四寡聚核酸对炎症因子的抑制
细胞转染实验。原代培养hFLS与MCF7细胞至6孔板，细胞密度约50％利用转染试剂lipo 2000转染siRNA-M8-04和对照，浓度50nM。转染24小时后,换无血清饥饿培养24小时。IL 1-α(10ng/ml)刺激24小时，随后提取RNA利用荧光定量PCR检测靶基因表达，与实施例二操作步骤相同。利用real time PCR检测hFLS与MCF7细胞中TNF、COX2和IL-1β基因的表达水平。收取上清液。Human IL-1βimmunoassay检测试剂盒检测hFLS与MCF7细胞IL-1β的分泌水平。结果请见图2。
结果表明，与阴性对照组相比siRNA-M8--04在MCF7与hFLS细胞中均能有效抑制cox-2、TNF多种炎症因子的基因表达与分泌，其中在hFLS细胞中对IL-1β的基因抑制率达到85％。在hFLS细胞中，转染siRNA-M8-04后TNF的基因表达量高于对照，可能是由TNF的细胞功能比较复杂引起的。
实施例五同源寡核酸对MYD88基因抑制效果的验证
为验证同源比率对siRNA-M8-04效果的影响，分三组开展设计制备了其同源siRNA，将这些序列按照实施例二方法，转染，荧光定量PCR检测对MYD88基因mRNA表达抑制效率。第一组反义链为“3'-GCCUCCUCUACCUGAAACU-5'”及其同源序列，正义链为“5’CGGAGGAGAUGGACUUUGA3’”同源序列，如下表2,:S＝正义链，AS＝反义链。正义链分别选择11nt、15nt、23nt、27nt、dT悬垂、错配(加粗、斜体)。
表2反义链组
第二组：正义链均为“5’-CGGAGGAGAUGGACUUUGA-3’”，反义链为“3'-GCCUCCUCUACCUGAAACU-5'”同源序列，如下表3
表3正义链组
第三组：正义链和反义链为两组组合，如下表4。
表4组合组
实验结果参见图3，结果表明三组设计的siRNA均起到了沉默靶基因的作用，表明与序列2有70％以上同源性的siRNA均能干扰MYD88基因的表达。其中添加了悬挂碱基的21nt的siRNA-M8-14干扰效果最好，为87％；仅11nt互补的siRNA-M8-21干扰效果最差，为20％，但也起到了干扰靶基因表达的作用。
实施例六质粒靶基因沉默效果影响
根据MYD88全长序列，利用siRNA在线设计软件设计含siRNA-M8-04序列的双链寡核苷酸序列，如表5。采用不对人类任何基因产生干扰的siRNA双链作为阴性对照(NC)。注：划线部分为碱基互补区域(从5’→3’)，粗体部分为干扰靶序列，方框部分为限制性内切酶位点。
表5含siRNA-M8-04序列的双链
对表5的寡核苷酸退火后形成双链，插入到siRNA表达载体中，构建含siRNA-M8-04序列的干扰载体，并转化感受态细胞DH5α。在转化平板挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定，随后对干扰效果进行检测。在感染前一天，将生长状态良好的MCF7细胞接种于六孔板中进行感染:无血清培养基洗细胞一次后加入1.5mL细胞培养基；分别用250uL培养基稀释质粒载体，轻轻混匀；将10uLLipofectamine2000试剂以250uL细胞培养基稀释后，轻轻混匀，室温孵育5min，感染后48h收集细胞，实时定量PCR方法检测目的基因mRNA表达情况(见表6)。
表6质粒载体干扰后的基因表达量
实施例七化学修饰对MYD88抑制效果的影响
对siRNA-M8-04进行不同的化学修饰及其组合修饰，以提高siRNA稳定性，提升干扰效果。化学修饰包括核糖的卤素修饰(2’-F修饰)、甲氧基修饰(2’-OMe)、硫代修饰、胆固醇修饰等。实验方法如实施例二，其中胆固醇、多肽、半乳糖、修饰siRNA组未加入转染试剂，其他组均与lip2000或PEI或PHA转染材料混合。
表7修饰种类
表8化学修饰对siRNA沉默效果的影响
从表8可知，经各类适当的化学修饰后，本发明的siRNA均起到了沉默目的基因表达的效果。其中siRNA-M8-28、siRNA-M8-36、siRNA-M8-39、siRNA-M8-40、siRNA-M8-41干扰效果较好，表明2’-氧甲基、硫代、胆固醇或磷酸化修饰能够保持较好的干扰效果。
实施例八化学修饰对寡聚核酸血清稳定性的影响
对实施例七的若干化学修饰核酸分子进行血清稳定性检测。将siRNA分子经无RNA酶水稀释至5μM后加入等体积的新鲜血清,然后在37℃孵育30分钟，取样进行电泳观察不同siRNA完整性。结果表明未修饰siRNA-M8-14在30分钟后已明显降解，而修饰核酸siRNA-M8-42，siRNA-M8-40，siRNA-M8-41，siRNA-M8-39，siRNA-M8-36，siRNA-M8-28在30分钟内无明显分解。
实施例九大鼠关节液炎症因子含量试验
为进一步验证siRNA药物对关节炎的治疗作用，进行RT-PCR检测大鼠模型中相关基因的表达水平。建模方案：雄性大鼠(240±20g,广东省医学实验动物中心提供)共21只，用II型胶原酶作为诱导剂促进关节炎的形成。将II型胶原酶(Sigma产品)注射到后肢关节腔，一次性给予200μL(500U)的II型胶原酶，剂量为100μL/腿。健康组给予PBS作为空白对照，用量与注射时间与炎症模型组相同。给药方案：在注射II型胶原酶6d后，将SD大鼠随机分为7组，每组3只。一组为PBS组，其他六组为siRNA给药实验组，其中siRNA实验组每次每只大鼠注射20nmol的siRNA溶液(10nmol/腿)，注射体积100μL，PBS组每次每只大鼠注射等体积的PBS，每组均每周给药2次。其中给药组siRNA-M8-39的siRNA由壳聚糖纳米粒包裹。
取建模3周后的大鼠进行real-time PCR检测：最后一次给药后隔天处死大鼠，然后剪开皮肤，用镊子分离皮下组织和肌肉逐步暴露出关节，将膝关节浸泡于组织保存液中，防止RNA降解。将关节置入倒入液氮的研钵中，充分研磨至骨组织成粉末，按照Qiagen公司Rneasy Mini kit说明书，抽提RNA，Aglient2200确定RNA抽提质量，紫外分光光度计测定浓度后可用于下一步的逆转录反应。定量PCR分别检测给药组、对照组、模型组中MYD88基因与炎症因子的基因表达量，统计分析后结果见表9。
表9大鼠中炎症因子的表达量
从表9可知，关节炎模型中炎症相关基因MYD88、TNF、COX-2、IL-1β表达升高，siRNA-M8-28，siRNA-M8-36，siRNA-M8-39，siRNA-M8-40，siRNA-M8-41，siRNA-M8-42可显著下调大鼠炎症疾病中的MYD88、TNF、COX-2、IL-1β的表达，起到了保护软骨与滑膜，改善炎症的效果，表明本发明的siRNA分子是潜在的可预防或治疗炎症的药物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.抑制MYD88基因的寡聚核酸，所述寡聚核酸为双链RNA，其特征是所述寡聚核酸由碱基组成如SEQ.ID NO.12所示的反义链以及碱基组成如SEQ.ID NO.11所示的正义链组成，并经过特定碱基修饰，所述寡聚核酸由碱基组成如下：
5’CmGmGmAGGAGAUGGACUUUmGmAm3’
3’GmCmCmUCCUCUACCUGAAAmCmUm-p5’；或
5’CmsGmsGmsAGGAGAUGGACUUUmsGmsAms3’、
5’UmsCmsAmsAAGUCCAUCUCCUCmsCmsGms 3’；或
5’-Chol-CmGmGmAGGAGAUGGACUUUmGmAm-3’、
5’p-UmCmAmAAGUCCAUCUCCUCmCmGm 3’；或
5’Chol-CmsGmsGmsAGGAGAUGGACUUUmsGmsAms3’
5’UmsCmsAmsAAGUCCAUCUCCUCmsCmsGms 3’；或
5’CmGmGmAGGAGAUGGACUUUmGmAm3’
5’p-UmCmAmAAGUCCAUCUCCUCmCmGm 3’
其中s表示S修饰，m表示2’-甲氧基修饰，Chol表示胆固醇修饰，p表示磷酸化修饰。
2.根据权利要求1所述的寡聚核酸，其特征是，对所述寡聚核酸的3’末端添加悬挂碱基，所述悬挂碱基为dTdT。
3.可表达权利要求1-2任一种所述寡聚核酸且具有抑制MYD88基因表达功能的DNA。
4.含有权利要求1-2任一种所述寡聚核酸或者权利要求3所述DNA的载体，所述载体为脂质体、聚合物材料、多肽、纳米材料。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征是，所述脂质体为阳离子脂质体；所述聚合物材料为透明质酸或聚赖氨酸；纳米材料为壳聚糖纳米粒。
6.一种具有抑制MYD88基因表达功能的组合物，含有权利要求1-2任一种所述寡聚核酸或者权利要求3所述DNA，以及药学上可接受的载体。
7.权利要求1-2任一种所述寡聚核酸或者权利要求3所述DNA或权利要求4或5所述载体或者权利要求6所述的组合物在制备抑制细胞中MYD88基因表达制品中的应用。
8.权利要求1-2任一种所述寡聚核酸或者权利要求3所述DNA或者权利要求4或5所述载体或者权利要求6 所述的组合物在制备诊断MYD88基因异常引发的疾病的试剂的应用。
9.权利要求1-2任一种所述寡聚核酸或者权利要求3所述DNA或者权利要求4或5所述载体或者权利要求6所述的组合物在制备治疗MYD88基因异常引发的疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征是，所述MYD88基因异常引发的疾病为炎症、免疫性疾病、感染性疾病、癌症、心血管疾病中的任一种。
11.根据权利要求8或9所述的应用，其特征是，所述MYD88基因异常引发的疾病为骨关节炎、风湿性关节炎、滑膜炎、炎性肠炎、哮喘、I型糖尿病或红斑狼疮。
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Patent Citations (2)
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