CN110123828A

CN110123828A - Pralr的抑制剂在制备治疗耐紫杉醇卵巢癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN110123828A
Application number: CN201810133144.2A
Authority: CN
Inventors: 许国雄; 管文彩; 林群博
Original assignee: Jinshan Hospital of Fudan University
Current assignee: Jinshan Hospital of Fudan University
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: CN110123828B

Abstract

本发明涉及PRALR的抑制剂在制备治疗耐紫杉醇卵巢癌的药物中的应用。本发明从TCONS_00013523序列开始，利用5’‑RACE和3’‑RACE技术发现了完整的基因序列，并命名为PRALR(Paclitaxel resistance‑associated lncRNA，紫杉醇耐药相关长链非编码RNA)。进一步证实其为一个新型的卵巢癌耐药相关lncRNA，且敲低后卵巢癌紫杉醇耐药细胞的增殖、迁移和侵袭能力都有显著的下降。提示PRALR可作为逆转卵巢癌紫杉醇耐药的分子靶点，PRALR的抑制剂可作为治疗耐紫杉醇卵巢癌的有效药物。本发明还提供了对PRALR抑制效果显著的siRNA。

Description

PRALR的抑制剂在制备治疗耐紫杉醇卵巢癌的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及PRALR的抑制剂在制备治疗耐紫杉醇卵巢癌的药物中的应用。

背景技术

lncRNA，即长链非编码RNA，是一类长度超过200核苷酸(nt)的RNA分子的总称，它们基本没有编码蛋白的功能，但可以和DNA、RNA及蛋白质结合，广泛参与机体的生理和病理过程，在疾病发生发展和调控方面有重要的作用。

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位居各妇科恶性肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。早期症状不明显，诊断时已处于晚期，缺乏高效的化疗药物及耐药的产生是主要原因。

近年研究发现lncRNA在卵巢癌的发生、发展中具有重要作用，有望成为新型肿瘤标记物和肿瘤治疗的靶点。借助基因芯片和高通量测序方法等技术，发现与卵巢癌相关的lncRNA有：LSINCT5、XIST、ZNF300P1、AB073614、HOXA11-AS、H19、HOTAIR、PVT1、ANRIL、HOST2、FAL1、MEG3，并且研究表明LSINCT5、XIST、HOTAIR、ANRIL等有望成为卵巢癌预后判断的分子标记物。

《第四军医大学》2015年硕士论文“lncRNA在卵巢癌耐药细胞株中的筛选及作用机制的初探”进行了以下研究：1)以顺铂敏感细胞株A2780、耐药细胞株CP70为研究对象，应用lncRNA基因芯片差异分析、实时荧光定量PCR等观察lncRNA在卵巢癌耐药和非耐药细胞中的表达变化，分析lncRNA基因表达水平变化导致顺铂耐药的分子机制。2)以A2780/CP70细胞为研究对象，应用mRNA基因芯片差异分析、实时荧光定量PCR等观察mRNA在卵巢癌耐药和非耐药细胞中的表达变化，分析mRNA基因表达水平变化与顺铂耐药的相关性。3)生物信息学分析比对lncRNA基因芯片与mRNA基因芯片差异表达基因，遴选特异的lncRNA。4)应用实时荧光定量PCR验证特异的lncRNA与mRNA表达水平相关性，分析lncRNA在参与顺铂耐药过程中可能的耐药机制。5)以顺铂耐药细胞株CP70为研究对象，应用siRNA技术沉默相关lncRNA基因，实时荧光定量PCR观察转染后特异基因的表达，MTT法观察特异lncRNA的siRNA对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响，并分析其内在的分子机制。最后得出以下结论：lncRNA参与顺铂耐药的发生，而通过基因芯片筛选和RT-PCR验证后确定lncRNA-U2在顺铂耐药转变中发挥重要作用；lncRNA-U2促进顺铂耐药的作用可能是通过调控Bax/Bcl-2等细胞凋亡蛋白实现的。

专利文献CN105907858A，公开日2016.08.31，采用lncRNA芯片技术对卵巢癌组织中化疗耐药lncRNA筛选；对样本上的靶基因进行GO和Pathway分析，得出靶基因的功能与肿瘤增殖、凋亡、存活相关，以及涉及肿瘤耐药相关的信号通路；对编码蛋白的lncRNA进行筛选，选择差异倍数较大的3条lncRNA，对lncRNA表达情况进行观察，得出RP11-697E22.2在所有卵巢癌细胞细胞株中表达均显著升高，进而得出lncRNA RP11-697E22.2参与了不同类型卵巢癌耐药的调控，能够作为卵巢癌防治的干预靶标。

专利文献CN107354159A，公开日2017.11.17，公开了一种lncRNASMAD5-AS1的siRNA在卵巢癌治疗中的应用，该发明通过设计并合成特异靶向抑制SMAD5-AS1的siRNA序列，将其转染到卵巢癌细胞株中，证实抑制SMAD5-AS1表达可显著抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力。

然而，发现新的lncRNA及其在卵巢癌(尤其是耐药卵巢癌，如耐紫杉醇卵巢癌)发生发展中的作用，仍然是十分必要的，这对于卵巢癌的分子机制研究、临床治疗和诊断都具有重要意义。

发明内容

本申请发明人从TCONS_00013523序列(只包含部分lncRNA序列)开始，利用5’-RACE和3’-RACE技术发现了完整的基因序列，并命名为PRALR(Paclitaxel resistance-associated lncRNA，紫杉醇耐药相关长链非编码RNA)。进一步证实其为一个新型的卵巢癌耐药相关lncRNA，且敲低后卵巢癌紫杉醇耐药细胞的增殖、迁移和侵袭能力都有显著的下降。基于此完成了本发明。

一方面，本发明提供了PRALR或其基因的抑制剂在制备治疗耐紫杉醇卵巢癌的药物中的应用，所述的PRALR是卵巢癌耐药相关lncRNA，序列如SEQ ID NO:1所示。

作为另一优选例，PRALR的基因能够转录得到所述的PRALR。

作为另一优选例，所述的PRALR的基因序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

作为另一优选例，所述的PRALR或其基因的抑制剂为反义核酸、siRNA、miRNA或shRNA。

作为另一优选例，所述的PRALR或其基因的抑制剂为siRNA，所述的siRNA序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。

作为另一优选例，所述的siRNA序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示，且在SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示序列的3’末端增加碱基TT。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：

a)PRALR或其基因的抑制剂，和

b)药学上可接受的载体；

所述的PRALR是卵巢癌耐药相关lncRNA，序列如SEQ ID NO:1所示。

作为另一优选例，PRALR的基因能够转录得到所述的PRALR。

作为另一优选例，所述的PRALR或其基因的抑制剂为siRNA，所述的siRNA序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示，或在SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示序列的3’末端再增加碱基TT。

需要说明的是，所述“抑制剂”是指能够降低PRALR或其基因的表达量或活性的物质，达到阻碍PRALR或其基因的功能的目的。通常地，所述抑制剂包括针对PRALR或其基因的反义核酸、siRNA、miRNA或shRNA，但不仅限于此，还包括包含以上具有抑制作用的序列的表达载体，以及其他一些分子化合物。

所述的“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂、稀释剂和佐剂。该术语具体指这样一些药剂：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington′s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

本发明优点在于：

1、本发明从TCONS_00013523序列(只包含部分lncRNA序列)开始，利用5’-RACE和3’-RACE技术发现了完整的序列，并命名为PRALR。进一步证实其为一个新型的卵巢癌耐药相关lncRNA，且敲低后卵巢癌紫杉醇耐药细胞的增殖、迁移和侵袭能力都有显著的下降。因此PRALR可作为逆转卵巢癌紫杉醇耐药的分子靶点，PRALR的抑制剂可作为治疗耐紫杉醇卵巢癌的有效药物。

2、本发明设计的针对PRALR的siRNA2敲低效果明显，显著优于研究过程中设计的其他siRNA，开发为耐紫杉醇卵巢癌临床药物的潜力巨大。

附图说明

图1.5’-RACE和3’-RACE扩增拼接出PRALR的全长序列。

图2.plncPRALR-zeo质粒图谱。

图3.真核细胞过表达plncPRALR-zeo后qPCR检测lncRNA PRALR结果。其中A为OVCAR-3细胞系中过表达plncPRALR-zeo结果，B为OV3R-PTX细胞系中过表达plncPRALR-zeo结果。**代表P<0.01。

图4.siRNA敲减效果验证结果。*代表P<0.05。

图5.PRALR对耐紫杉醇卵巢癌细胞增殖能力的影响。**代表P<0.01。

图6.PRALR对耐紫杉醇卵巢癌细胞迁移能力的影响。*代表P<0.05。

图7.PRALR对耐紫杉醇卵巢癌细胞侵袭能力的影响。*代表P<0.05。

图8.过表达或者敲低PRALR对细胞耐受PTX的影响。*代表P<0.05；**代表P<0.01。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本文的实施例中，所述的“PRALR”、“lncPRALR”、“lncRNA PRALR”均指该lncRNA或其基因。所述的“卵巢癌紫杉醇耐药细胞系OV3R-PTX”、“OV3R-PTX”、“耐紫杉醇卵巢癌细胞”均指同一细胞系。

实施例1 PRALR全长序列的获得及表达载体构建

1材料

卵巢癌细胞系OVCAR-3(ATCC号：HTB-161)；

本课题组自建的卵巢癌紫杉醇耐药细胞系OV3R-PTX(于专利ZL201410708515.7中公开)；

基因组DNA提取试剂(Takara 9770A)；

总RNA提取试剂盒(Axygen AP-MN-MS-RNA-50)；

反转录试剂盒(Roche 04897030001)；

高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara R045A)；

限制性内切酶HindⅢ(Takara 1060A)、XbaⅠ(Takara 1093A)；

PCR产物回收试剂盒(Takara 9761)；

DNA凝胶回收试剂盒(Takara 9762)；

EasyGeno快速重组克隆试剂盒(Tiangen VI201)；

感受态细胞DH5α(Tiangen CB101)；

小量质粒提取试剂盒(Tiangen DP103-02)；

无内毒素质粒大提试剂盒(Tiangen DP117)；

pcDNA3.1(+)/zeo(Invitrogen V86020)；

Opti-MEM I培养基(Gibco，31985-070)；

X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(Roche 04476093001)；

FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche 04913850001)；

RACE 5’/3’Kit(TAKARA 634858)。

2方法

2.1鉴定PRALR全长序列

2.1.1 5’RACE和3’RACE扩增引物设计

从UCSC数据库中下载人的TCONS_00013523序列，分别设计套式PCR的引物用于5’-RACE和3’-RACE扩增。扩增引物由苏州金唯智生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

2.1.2 5’RACE和3’RACE扩增和测序

参见RACE 5’/3’Kit(TAKARA 634858)说明书进行扩增，简单说明如下：首先，采用outer和inner primers以及UPM引物扩增出5’RACE和3’RACE全长序列。其次，采用试剂盒中In-Fusion Cloning方法将RACE扩增片段插入试剂盒自带的LineareizedpRACE vector中，然后选取8-10个克隆进行测序鉴定，最终确定5’-RACE和3’-RACE的序列，拼接出PRALR全长序列。

2.2 plncPRALR-zeo质粒构建

2.2.1引物设计

从UCSC数据库中下载人的TCONS_00013523序列，再结合真核表达质粒pcDNA3.1(+)/zeo的多克隆酶切位点HindⅢ和XbaⅠ两侧的序列，使用Primer Express 3.0设计合成了4对引物，用于扩增转录TCONS_00013523两个外显子和内含子序列。扩增引物由苏州金唯智生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

2.2.2细胞培养和基因组DNA提取

将人的卵巢癌PTX耐药细胞系OV3R-PTX按照10^6个细胞接种于T25细胞培养瓶。待细胞生长融合至80％-90％时，弃掉培养基上清，使用无菌的PBS清洗两次，然后尽量去除PBS，采用Takara基因组DNA提取试剂盒(Takara 9770A)裂解细胞提取获得细胞基因组DNA。具体步骤如下：

1)将800μl的裂解液DNAiso加入细胞表面并用枪头吹打8～10次，转移裂解的细胞于无RNA酶的离心管中；

2)4℃，10000g离心10min；

3)吸取上清液于新的无RNA酶的离心管，加入300μl无水乙醇颠倒混匀3分钟，直到形成絮状沉淀；

4)小心用枪头将絮状DNA沉淀绕出，放入1ml的75％乙醇内洗涤一次；

5)12000g离心5min，弃上清，空气中晾干1-2min；

6)用200μl ddH₂O(预热至65℃)溶解基因组DNA。

2.2.3 PCR扩增和产物纯化

对TCONS_00013523两个外显子和内含子扩增，采用高保真酶PrimeSTAR Max DNAPolymerase(Takara R045A)进行扩增。反应体系中包含2×PrimeSTAR Max Premix 12.5μl，上下游引物各10pmol以及模板50ng/μl的DNA 0.5μl，其余使用去离子水补足至25μl。PCR反应条件：94℃预变性2min；95℃20s，60℃5s，72℃1min运行35个循环，最后在72℃继续延伸10min获得目的扩增产物。

PCR产物纯化采用Takara MiniBEST DNA Fragment Purification Kit(Takara9761)进行回收。根据试剂盒的实验手册进行操作，具体实验步骤如下：

1)在PCR反应液中，加3倍体积的Buffer DC，混匀后，转移到制备管中，12000rpm离心1min，弃收集管滤液；

2)加650μl Buffer WB洗涤第一次，12000rpm离心1min，弃收集管滤液；

3)加650μl Buffer W2洗涤第二次，12000rpm离心1min，弃收集管滤液；

4)12000rpm离心2min，去除残留的洗涤液；

5)制备管置于洁净的1.5ml离心管，在制备管膜中央加30μl去离子水(预热至65℃)，室温静置1min；

6)12000rpm离心1min洗脱获得纯化产物；

7)使用narodrop2000测定纯化产物的浓度。

2.2.4质粒载体双酶切，割胶纯化

采用HindⅢ(Takara 1060A)和XbaⅠ(Takara 1093A)对载体进行双酶切。反应体系为10×Buffer 6μl，HindⅢ和XbaⅠ各8μl，质粒8μg，再用去离子水补足至60μl。然后置37℃酶切过夜。

酶切后的产物采用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit(Takara9762)进行割胶纯化。具体步骤如下：

1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，并称取凝胶重量，将该重量换算作为一个凝胶体积(如1mg＝1μl体积)；

2)加入5个凝胶体积的Buffer GM，混合均匀后于37℃加热10min，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化；

3)将步骤2)中的混合液加入到DNA制备管中，12000g离心1min，弃滤液；

4)加700μl Buffer WB，12000g离心30s，弃滤液；

5)以同样的方法再用700μl Buffer WB洗涤一次，12000g离心1min，弃废液；

6)12000g离心2min，去除残留的乙醇；

7)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加30μl去离子水(预热至65℃)，室温静置1min；

8)12000g离心1min洗脱获得纯化的DNA；

9)使用Narodrop2000测定纯化产物的浓度。

2.2.5 PCR和质粒纯化产物连接

PCR产物与载体大片段采用EasyGeno快速重组克隆试剂盒(Tiangen VI201)连接。连接总体积10μl，具体操作步骤如下：

1)按照插入片段与载体大片段的摩尔比3:1，计算插入片段质量：

插入片段(ng)＝插入片段的碱基数×载体大片段的质量(0.1μg)×3/载体大片段的碱基。其中插入片段1碱基数为1033bp，插入片段2碱基数为1179bp，插入片段3碱基数为1810bp；pcDNA3.1(+)/zeo酶切大片段为4934bp。

2)连接体系的配置(共10μl)

3)混匀离心，50℃放置1h。

2.2.6连接产物的转化

采用感受态细胞DH5α(Tiangen CB101)进行转化实验，具体步骤如下：

1)将感受态细胞DH5α从-80度取出至冰上解冻10min；

2)吸取2.2.5中连接产物10μl加入100μl感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min；

3)将冰浴后的感受态细胞离心管置42℃水浴加热90s，期间不要摇动管；

4)快速将离心管转移到冰上，使细胞冷却2min；

5)每管加入800μl LB液体培养基(培养基事先加温至37℃)，混匀后37℃，220rpm振荡培养45min；

6)将适当体积(200μl/90mm平皿)已转化的感受态细胞平铺到含有氨苄青霉素的LB的琼脂平板上，平板放置室温下直至表面液体被吸收；

7)倒置平皿，于37℃培养箱中培养12-16h。

2.2.7质粒的鉴定

质粒进行一代Sanger测序验证插入序列碱基的准确性。具体步骤如下：

1)随机挑取5个克隆，根据质粒抗性基因接种于5ml LB-氨苄青霉素液体培养基中，37℃，220rpm振荡过夜培养；

2)采用小量质粒提取试剂盒(Tiangen DP103-02)提取重组质粒，步骤简述如下：

a)将5ml菌液收集至离心管底部，尽量去除上清；

b)依次加入溶液P1、P2和P3，离心取上清；

c)将上清液加入收集管中央，吸附后离心；

d)用去蛋白液PD洗涤收集管1次，漂洗液PW洗涤2次；

e)高速离心2～3min，去除残留的漂洗液；

f)使用50μl去离子水(预热至65℃)洗脱质粒DNA。

3)质粒送苏州金唯智生物技术有限公司进行一代Sanger测序，测序引物详见表1；

4)测序序列拼接使用Vector NTI Advance软件，版本号11.5；

5)从UCSC下载基因组DNA序列，和拼接序列进行比对分析，观察是否存在碱基突变。

2.2.8质粒的大量提取

对于测序正确的克隆利用无内毒素质粒大提试剂盒(Tiangen DP117)进行质粒的大量制备，具体步骤说明如下：

1)将一个单菌落自平板挑出，培养在5ml的含氨苄青霉素的LB培养液，37℃，220rpm振荡培养8小时；

2)将起始培养液用150ml的含氨苄青霉素的LB培养液1000倍稀释，37℃，220rpm振荡培养12～16小时；

3)8000g，4℃离心3min，将菌液收集于50ml离心管底并完全弃去上清液；

4)加入8ml含RNase A的溶液P1，在涡旋器上充分重悬菌液；

5)向重悬液中加入8ml裂解液P2，轻轻颠倒混匀6～8次，室温孵育5min；

6)将3ml平衡缓冲液BL加入纯化柱的中央，8000g离心2min，弃废液；

7)向重悬液中加入8ml中和液P4，立即轻轻来回颠倒混匀6～8次；

8)将中和后液体通过内毒素过滤器CS1中，收集滤液于50ml管底；

9)在过滤的收集管中加入0.3倍体积的异丙醇，混合均匀；

10)分2～3次将以上液体加入步骤6)中平衡的CP6柱子上，8000g离心1min；

11)在吸附柱CP6中央加入10ml的漂洗液PW，洗涤2次，弃废液；

12)在吸附柱CP6中央加入3ml的无水乙醇，洗涤1次，弃废液；

13)8000g离心3min，去除残留的乙醇；

14)使用1ml去离子水(预热至65℃)洗脱质粒DNA；

15)利用Narodrop2000分光光度法测定质粒的浓度和纯度。分装保存于-20℃备用。

2.2.9细胞转染

质粒转染采用X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(Roche 04476093001)进行转染，具体步骤如下：

1)转染前一天将人的卵巢癌细胞系OVCAR-3和OV3R-PTX按照3*10^5个细胞接种于6孔板中进行培养。

2)转染开始前，使用Opti-MEM I培养基(Gibco，31985-070)稀释对照质粒pcDNA3.1(+)-zeo和过表达质粒plncPRALR-zeo以及X-tremeGENE siRNA TransfectionReagent：

a)准备3个无酶的离心管，首先在管中加入无血清培养基，1号管和2号管分别加入150μl无血清培养基，3号管加入300μl无血清培养基；

b)将2μg对照和过表达质粒分别加入1号管和2号管无血清培养基中；

c)将16μl X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent加入3号管无血清培养基中；

d)室温孵育5分钟。

3)转染复合物的混合和孵育：

a)将3号管吸出150μl转染试剂稀释液加入1号或者2号管中，轻轻混匀；

b)室温孵育15分钟。

4)将复合物加至细胞，轻柔振荡或旋转培养板或培养瓶，确保培养物均匀分布于培养板表面。

5)37度，5％CO₂继续培养48h后提取RNA。

2.2.10总RNA提取

采用Axygen总RNA提取试剂盒(Axygen AP-MN-MS-RNA-50)裂解细胞提取获得细胞总RNA。具体步骤如下：

1)将600μl的裂解液buffer R-Ⅰ加入细胞表面并用枪头吹打8～10次，转移裂解的细胞于无RNA酶的离心管中；

2)使用21-25号针头的注射器抽吸8～10次，充分裂解细胞，加入220μlbuffer R-Ⅱ，震荡混匀30s；4℃离心12000g离心10min；

3)吸取上清液于新的无RNA酶的离心管，加入400μl异丙醇充分混匀；

4)用柱子吸附RNA，6000g离心1min；

5)加入buffer W1A溶液500μl，12000g离心1min，清洗一次；

6)加入AW2溶液700μl，12000g离心1min，清洗2次；

7)弃收集管废液后，12000g离心2min去除残留乙醇；

8)用100μl buffer TE(预热至65℃)洗脱获得总RNA。

2.2.11反转录获得cDNA和qPCR检测lncRNA的表达

采用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit(Roche 04897030001)进行反转录。首先，在500ng的总RNA中加入50mM olig(dT)18 0.5μl和600mM Random Primer1μl，并用DEPC水补足体积至6.5μl。将该混合液置65℃加热10min，然后立刻至于冰上2min。再在反应体系中加入5×Transcriptor Reaction buffer 2μl，1mM dNTP 1μl以及Rnaseinhibitor 10U，Reverse Transcriptase 5U进行反转录。反转录条件为25℃10min，55℃40min，85℃5min。最后获得cDNA于-20℃冻存备用。

采用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche 04913850001)进行qPCR。反应体系包括2×FastStart Universal SYBR Green M buffer 7.5μl，10μM的引物LncPRALR-F/R各0.5μL，cDNA1.5μL，DEPC treat水补足至15μl，进行qPCR。PCR反应条件为95℃10min，1个循环，95℃10s，60℃30s(收集荧光)40个循环，最后添加一个melt curve分析。

3结果

3.1引物设计

扩增PRALR外显子和内含子全长以及5’-RACE和3’-RACE扩增的引物对序列见表1，使用无缝克隆连接技术，小写字母是载体上的序列，大写字母是和PRALR的基因组对应的扩增序列。

表1扩增PRALR外显子和内含子全长以及5’-RACE和3’-RACE扩增的引物对序列

3.2 PRALR全长序列

采用5’-RACE和3’-RACE扩增并进一步拼接出PRALR的全长序列(SEQ ID NO:1)，PRALR的基因序列(不包含内含子)如图1和SEQ ID NO:2所示。

3.3 plncPRALR-zeo质粒图谱

采用Vector NTI软件(11.5版本)构建了重组质粒图谱，具体信息见图2。其中，插入到质粒中的PRALR基因序列(包含内含子)如SEQ ID NO:3所示。

3.4测序结果

选择1个重组质粒的插入序列，在genbank数据库中进行序列比对，结果显示，和基因组序列NC_018918.2完全一致(表2)。

表2重组质粒的插入序列和genbank数据库中基因组DNA比对结果

3.5 plncPRALR-zeo在OVCAR-3和OV3R-PTX中过表达结果

通过OVCAR-3和OV3R-PTX细胞系中转染plncPRALR-zeo质粒，qPCR检测显示，转染plncPRALR-zeo组和blank以及pcDNA3.1(+)-zeo空载体转染组相比较，OVCAR-3中lncPRALR表达显著上调130648倍(图3中A)，OV3R-PTX中lncPRALR表达显著上调170倍(图3中B)。可见本发明所构建的PRALR表达质粒能显著提升OV3R-PTX细胞中PRALR表达量，非常有利于研究与PRALR相互作用的蛋白或核酸分子的功能，以及紫杉醇耐药和其他化疗药耐药的机制。

实施例2 PRALR对耐紫杉醇卵巢癌细胞生物学行为的影响

1方法

1.1 lncRNA-siRNA的合成

我们设计了3条针对PRALR的siRNA，如表3所示。

表3 PRALR-siRNA

1.2验证siRNA敲减效果

卵巢癌OVCAR-3紫杉醇耐药细胞(OV3R-PTX)铺板24小时，给予处理组lncRNA-siRNA及对照组si-NC转染(5μL siRNA+8μL X-treme GENE Transfection Reagent)，转染48小时后提取RNA，逆转录成cDNA后通过qRT-PCR实验检测结果。

1.3 PRALR对卵巢癌紫杉醇耐药细胞增殖能力的影响

WST-1试剂盒检测法：将OVCAR-3紫杉醇耐药细胞按照5000个/孔的密度值接种于96孔板上，恒温培养箱(37℃，5％CO₂)孵育24h。转染实验：先将对照组si-NC和PRALR-siRNA2以及转染试剂分别溶解于opti-MEM培养基，室温静置5分钟，接着将含有转染试剂的opti-MEM培养基分别加入到si-NC组和siRNA2组，室温静置15分钟，最后分别将混合试剂等量加入到相应的96孔板中。培养6h后更换成新鲜的含有FBS的培养基，放入恒温培养箱孵育。在0h、24h、48h三个时间点，每个小孔中加入100μL新鲜完全培养基和10μL的CCK-8试剂，混合均匀，将96孔培养板在培养箱内孵育2小时，遮盖96孔培养板避光操作，使用酶标仪在450nm处测量吸光度，结果统计分析。实验重复三次。

1.4 PRALR对卵巢癌紫杉醇耐药细胞迁移能力的影响

Transwell迁移实验：将OVCAR-3紫杉醇耐药细胞接种于6孔板中，转染24h后，胰酶消化，用无血清培养基重悬混匀，细胞计数8万个/100μL。在Transwell上室加入约8万个细胞/孔，细胞悬液体积100μL，Transwell下室加入含10％血清的培养基700μL/孔。置于5％CO₂培养箱在37℃孵育48h。等到培养时间结束，弃掉上室培养基后用PBS溶液清洗两遍，取出上室棉签轻轻地拭去上室内未穿透膜的细胞。4％多聚甲醛固定15分钟，结晶紫染液染色20分钟，PBS溶液清洗1遍后干燥5分钟，显微镜下观察穿透膜的细胞(200×)，随机选取三个视野拍照并且计数，结果统计分析。实验重复三次。

1.5 PRALR对卵巢癌紫杉醇耐药细胞侵袭能力的影响

Transwell迁移实验：无菌条件下将已稀释好的Matrigel基质胶平铺于Transwell小室的上室中，约100μL/孔，置于5％CO₂培养箱在37℃放置4小时，将OVCAR-3紫杉醇耐药细胞接种于6孔板中，转染24h后，胰酶消化，用无血清培养基重悬混匀，细胞计数8万个/100μL。在已加了Matrigel基质胶的Transwell上室加入约8万个细胞/孔，细胞悬液体积100μL，Transwell下室加入含10％血清的培养基700μL/孔。置于5％CO₂培养箱在37℃孵育48h。等到培养时间结束，弃掉上室培养基后用PBS溶液清洗两遍，取出上室棉签轻轻地拭去上室内未穿透膜的细胞。4％多聚甲醛固定15分钟，结晶紫染液染色20分钟，PBS溶液清洗1遍后干燥5分钟，显微镜下观察穿透膜的细胞(200×)，随机选取三个视野拍照并且计数，结果统计分析。实验重复三次。

2结果

2.1 siRNA敲减效果验证

qRT-PCR检测结果显示，PRALR-siRNA2敲减效果最佳(图4)，在OVCAR-3紫杉醇耐药细胞中的敲减效率高达60％以上，而且显著高于PRALR-siRNA1和PRALR-siRNA3。

2.2 PRALR对卵巢癌紫杉醇耐药细胞增殖能力的影响

WST-1实验结果显示用siRNA-2敲低lncRNAPRALR后，卵巢癌紫杉醇耐药细胞的增殖能力受到抑制(图5)。

2.3 PRALR对卵巢癌紫杉醇耐药细胞迁移能力的影响

Transwell迁移实验结果显示，用siRNA-2敲低lncRNAPRALR后，卵巢癌紫杉醇耐药细胞的迁移能力受到抑制(图6)。

2.4 PRALR对卵巢癌紫杉醇耐药细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示，用siRNA-2敲低lncRNA PRALR后，卵巢癌紫杉醇耐药细胞的侵袭能力受到抑制(图7)。

实施例3验证PRALR是一个PTX耐药基因

1方法

1.1细胞转染

6孔板中接种OVCAR-3或者OV3R-PTX细胞。OVCAR-3细胞转染空载体pcDNA3.1(+)-ZEO和过表达质粒plncPRALR-zeo(即实施例1所述plncPRALR-zeo)；OV3R-PTX细胞转染NC-siRNA和PRALR-siRNA2(即实施例2所述PRALR-siRNA2)。转染步骤同实施例1中2.2.9 1)～4)。

1.2 PTX耐药IC50测定

PTX耐药IC50测定的具体步骤如下：

1)步骤1.1细胞转染24h后，进行胰酶消化，计数，按照10^4个细胞数/孔接种在96孔板细胞中；

2)37度，5％CO₂继续培养24h后，用含10％FBS的1640培养基配置PTX药物，浓度梯度分别为0μM，0.001μM，0.005μM，0.01μM，0.05μM，0.1μM，0.5μM，1μM，2μM，4μM，5μM，每种浓度分别加入3孔96孔板不同转染组细胞中；

3)37度，5％CO₂继续培养48h后，每孔细胞更换新鲜的10％FBS的1640培养基100μL，再加入10μL CCK8试剂，37度，5％CO₂孵育2h后在450nm波长下检测每孔的吸光度值；

4)使用Graphpad Prism 5软件统计分析每一个转染组对PTX耐药的IC50值。

2结果

不同转染组PTX耐药IC50测定结果见图8。在OVCAR-3细胞系中过表达lncPRALR组(转染plncPRALR-zeo)比对照组(转染空载体组)PTX耐药系数IC50升高了4.6倍，P<0.01(见图8中A)；在OV3R-PTX细胞系中敲低lncPRALR(转染lncPRALR-siRNA2组)比对照组(转染NC-siRNA组)PTX耐药系数IC50下降了2.1倍，P<0.05(见图8中B)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属金山医院

<120> PRALR的抑制剂在制备治疗耐紫杉醇卵巢癌的药物中的应用

<130> /

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 579

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagguugcag agaaaaggga acacuuauac acuguuggug ggaguguaaa uuaguucaac 60

uauuguguaa agcaauaugu caauuccuca aagagcuaaa aaagaacuac cauuggacuc 120

agcaauccca uuacugggua uauacucaga ggaauauaag ucacucuacu auaaacacac 180

acgcaugcaa auuuucauug uagcacuauu uacaauagca aagacaugga aucaaccuaa 240

augcucauca augacagauc ggauaaagaa aauaugcauc uucaaccuuu cuggacuaca 300

gcaccugcca acugaccccc acaucauggc uccaacgcug gcuucaucac auaucuucuc 360

ucucaguccc uuuggcucuc agggugcaau agcuuaacaa aauugcugau cuaggugccu 420

cagcauuguu ucuuugucau agucucugua uuaucuuauu uugagccauu cuuuuccugc 480

aaagauccua acugaaugag auaacuacuu cauaagcuau uuguaagguu uaaauaaauu 540

aaugcauauu uaauacauga aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 579

<210> 2

<211> 561

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaggttgcag agaaaaggga acacttatac actgttggtg ggagtgtaaa ttagttcaac 60

tattgtgtaa agcaatatgt caattcctca aagagctaaa aaagaactac cattggactc 120

agcaatccca ttactgggta tatactcaga ggaatataag tcactctact ataaacacac 180

acgcatgcaa attttcattg tagcactatt tacaatagca aagacatgga atcaacctaa 240

atgctcatca atgacagatc ggataaagaa aatatgcatc ttcaaccttt ctggactaca 300

gcacctgcca actgaccccc acatcatggc tccaacgctg gcttcatcac atatcttctc 360

tctcagtccc tttggctctc agggtgcaat agcttaacaa aattgctgat ctaggtgcct 420

cagcattgtt tctttgtcat agtctctgta ttatcttatt ttgagccatt cttttcctgc 480

aaagatccta actgaatgag ataactactt cataagctat ttgtaaggtt taaataaatt 540

aatgcatatt taatacatga a 561

<210> 3

<211> 3951

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cttcaagcat aattgcctgg gaataatagt agatttaaat tcaaatttta ttttgtgaag 60

gataacattt aaattaaatt tttttttgtg aaagcaacta tcttaactat ctgtgctaac 120

gacagctcta tgatagaagg aactttgttt attatgctta ctatgcagat gcagaaacac 180

agaaaggaag aggattagca actttcccag atctgagttg agctgagatt tgagtcaagg 240

caatattgct tctggggctg taacaactac attttattgt ctcctgaaca gatacttcct 300

tttcttactt aataagaata gaccttggag gtctggacct ggacatgaac gtacactttt 360

ctaaagaaga tatacacatg gccaacaagc atgtgaaaaa aagctcaata tcactgatca 420

ttagagaaat gcaaatgaaa atcacaatga gagaccatct cacaccagtc agaatggcta 480

ttattaaaaa ctcaaaaaat aacagatgct ggcgaggttg cagagaaaag ggaacactta 540

tacactgttg gtgggagtgt aaattagttc aactattgtg taaagcaata tgtcaattcc 600

tcaaagagct aaaaaagaac taccattgga ctcagcaatc ccattactgg gtatatactc 660

agaggaatat aagtcactct actataaaca cacacgcatg caaattttca ttgtagcact 720

atttacaata gcaaagacat ggaatcaacc taaatgctca tcaatgacag atcggataaa 780

gaaaatatgg tacgtataca ccatgcaata ctgtgcagcc ataaaaaaga atgagatatt 840

ttgtgggaac atggatggag ctggagacca tcatcctttg caaactaaca aaggaacaga 900

aaagcaaata gtgcatgttt tcacttataa gtgggaacta aatgatgaga atttatgaac 960

acaaagtaac aacagacact gtggcctact tgagggtgga aggtaggagg agggaaagga 1020

tcagaaaaaa taactgttgg gtaattggct tatgtattag tcccttctca tactgctata 1080

aagacatgcc tgagactggg taatttacag agaaaagagg tttaattgac tcacacttct 1140

gcaggctgta catgtacagg aggcatggct ggggagacct caggaatctt aaaatcatgg 1200

cagaagggct aggggaagca agcaagtctt cacgtggcag caggagaaag agagagcaaa 1260

acaaagggga aagtgctaca cactttcaaa caaccagatc tcatgagaac tcactatcac 1320

aaaaacaaca aggggaaact gtccgcatga tccaatcacg tcccaccaga tccttccccc 1380

aacactgagg attacaattc aacatgaaat ttaccggggg gacaaagagt caaacggtat 1440

cagcttagta cctgggtgag gaaataatct gtacaacaaa acctcatgac aaacatttac 1500

ctatataaca aacctgcaca tgtacctaaa atctaaagta agagttaaaa aaaattatac 1560

aggagtatac ttagaaggca tagtttctga attctaaatc attattcata aaaattttac 1620

ccaatatttt tcattgcata tttcctataa aaaataatag atcaaagact actaattgta 1680

aaaagaaaaa aaaagcaagc tgctaatatt tattgtgcct ttactctttg ccaggcctta 1740

ttaaacgctt tacctttgtt acactgttta actctccaaa taactctaaa atgtagttac 1800

agttattgtt tctgagaaag gatggaactg aggctctata agttcaagtc actatagact 1860

actggtctag gccagtagtt ctatttttaa cacgtttatg aaacaccttg aaaagttatt 1920

aaaagagttc cctggtttca acaccagaag atctaattca gcccaaaaat ttgctgatgc 1980

ttctggtcag aggaccacac tttgaaaact actgctctcc taatggtgtt agcaattgtc 2040

tgaatcctga gactttaacc aacatatgaa cacacaaaac gtgatgttca ttccgtagat 2100

attgattgat gctgaatcca aacctcatca aactaaatta ttcatgtacc atgacagaca 2160

ggaatcctaa aggcattttt ataaaagaca tttgcctcta atccttaagg acagacactt 2220

aagtagcaca ttttggtaca tagaaattag atttcagtac taaactctac tcacttttct 2280

caaagctatt aaatcagcaa atagttggta tcaagcatca ttgtaaatga atgaaaattg 2340

ttgttttaaa taataaactt taaaagtgag agattaatag attcccaaat tgataaagcc 2400

agttagtgcc agattctacc acaccctatt ttcagtttcc ttgaatgagt agtatgtcaa 2460

cagctcccct tggtcctcca gtataatttc tccccagatt tcatttaggt acatgactac 2520

tgataattag caatggaatt taaattcctc aggagctctt gcatctaggc atgggaccaa 2580

ggctaagttc tagtcaatgg gatgtaagca gaaatgatgt gcgtaacatc aagaatcagt 2640

ttttcagaga gataatttgc ttttcttttc tccttcttgt ctttgatagc atcttcaacc 2700

tttctggact acagcacctg ccaactgacc cccacatcat ggctccaacg ctggcttcat 2760

cacatatctt ctctctcagt ccctttggct ctcagggtgc aatagcttaa caaaattgct 2820

gatctaggtg cctcagcatt gtttctttgt catagtctct gtattatctt attttgagcc 2880

attcttttcc tgcaaagatc ctaactgaat gagataacta cttcataagc tatttgtaag 2940

gtttaaataa attaatgcat atttaataca tgaagctgtg cctagtttat agtaattact 3000

caaaaatgtt acttatttct ccatccaaaa catacaaaca atagtatatc cttcatgagg 3060

acttcttgtg gactaaaaag gcagtatctt taaagtgttt tgcagtctct gacaaaacca 3120

cactattacc cttactcaag gttttaattg attgtatgta cacaaggtta gtctatatga 3180

gctttggaaa gatgggaaat tcaaagtaga acagttaagg aaggaaagtg tatgttccac 3240

taataaaata tatattagtt cctgtaatca gattgtgagt gacaatggaa tccagtggac 3300

ccattttgcc ctcagacaga tggctgagaa attgctggtg tggcaagcaa gcaactctga 3360

ctgcaaaatg gcagactcat ttgcttgggg gacaggaatg agggatggtt cacatgggaa 3420

gcacaaagtc acccttgatg aaagttcaga gaagaaagag atcatcaaac ttactctaat 3480

taccaaaagg tgatgacatt agcagaagaa ttagagtttg aaatagtact tttggtagag 3540

aggactgatt tctaagaaag cccatactca tgatacaaag gcagttggtg ggccccaaag 3600

cagaatagct gcctcaggtg ggcaagtagc taaagttcac caagcactgt gtcccaaaac 3660

tcacatacac gctataccta cctgcatccc atgatgccag gagagccaca tttctgtggc 3720

aagggacagt gaacagagag gagccaacat gggaatgaga aacagagtta taaacaaaaa 3780

gcaagagagg aaccctcagg gtaacagaat cagtcactct tgaatatgtg acagagtaga 3840

aggtaattac ctcttatatc cggatattga aattccaatt ctagtctctg gaccatactt 3900

ctttgaaggt tagaaatatc agtagctcag ttggatctca gattggagct g 3951

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctagcgttta aacttaagct tcttcaagca taattgcctg ggaa 44

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctcctcctac cttccaccct caag 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttgagggtg gaaggtagga ggag 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggattcctgt ctgtcatggt acatg 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

catgtaccat gacagacagg aatcc 25

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggtttaaacg ggccctctag acagctccaa tctgagatcc aac 43

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gattacgcca agcttgaact accattggac tcagcaatcc 40

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gattacgcca agcttgtcac tctactataa acacacacgc a 41

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gattacgcca agcttccgat ctgtcattga tgagcattta gg 42

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gattacgcca agcttggttg attccatgtc tttgctattg 40

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 15

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 15

cuacaggugu gaagcaaga 19

<210> 16

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 16

ucuugcuuca caccuguag 19

<210> 17

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 17

gggugcaaua gcuuaacaa 19

<210> 18

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 18

uuguuaagcu auugcaccc 19

<210> 19

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 19

gauccuaacu gaaugagau 19

<210> 20

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 20

aucucauuca guuaggauc 19

Claims

1.PRALR或其基因的抑制剂在制备治疗耐紫杉醇卵巢癌的药物中的应用，所述的PRALR是卵巢癌耐药相关lncRNA，序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，PRALR的基因能够转录得到所述的PRALR。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的PRALR的基因序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PRALR或其基因的抑制剂为反义核酸、siRNA、miRNA或shRNA。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的PRALR或其基因的抑制剂为siRNA，所述的siRNA序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的siRNA序列如SEQ ID NO:17和SEQID NO:18所示，且在SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示序列的3’末端增加碱基TT。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：

a)PRALR或其基因的抑制剂，和

b)药学上可接受的载体；

所述的PRALR是卵巢癌耐药相关lncRNA，序列如SEQ ID NO:1所示。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，PRALR的基因能够转录得到所述的PRALR。

9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的PRALR或其基因的抑制剂为反义核酸、siRNA、miRNA或shRNA。

10.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的PRALR或其基因的抑制剂为siRNA，所述的siRNA序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示，或在SEQ ID NO:17和SEQID NO:18所示序列的3’末端再增加碱基TT。