CN110283912A

CN110283912A - has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用

Info

Publication number: CN110283912A
Application number: CN201910650792.XA
Authority: CN
Inventors: 陈小佳; 洪岸; 金媛; 郭淑军; 张逸波
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2019-09-27

Abstract

本发明公开了has‑miR‑3656作为食管鳞癌分子标志物的应用。本发明通过临床数据分析及构建慢病毒侵染肿瘤细胞模型的实验，证明has‑miR‑3656在食管鳞癌中异常高表达并具有显著促进肿瘤发生发展的作用，即has‑miR‑3656可作为促癌基因，参与是食管鳞癌的发生发展。因此，has‑miR‑3656可在预防与治疗食管鳞癌疾病中作为新的肿瘤标志物，用于临床诊断及预防检测，同时has‑miR‑3656可作为肿瘤治疗的分子靶标，为研制抗肿瘤新药开辟新的途径，具有很好的实际应用价值。

Description

has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用

技术领域

本发明属于生物分子标志物检测领域，特别涉及has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用。

背景技术

食管癌是一种常见恶性肿瘤，食管癌典型的症状为进行性咽下困难，先是难咽干的食物，继而是半流质食物，最后水和唾液也难以咽下。而食管鳞癌(esophagealsquamouscell carcinoma，ESCC)是发生于食管，向鳞状上皮分化的恶性肿瘤，是食管癌的主要病理类型。虽然目前治疗食管癌的手段有多种，但不论手术、放疗还是化疗，其疗效差、生存率低且早期食管癌不易发现。因此，寻找食管鳞癌疾病中的肿瘤标志物具有重要意义。

MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一类内源性非编码单链RNA，其长约为18～25个核苷酸。miRNA在生物体内普遍存在，它们通过与mRNA不完全互补结合，使mRNA降解或抑制其翻译，从而参与转录后基因表达调控。一个miRNAs来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达，是复杂的调节网络。在人类基因中占比约2％～3％的miRNAs参与多达30％的基因调控，超过50％的miRNAs位于恶性肿瘤基因的调控区域，人体内miRNAs失衡是恶性肿瘤发病的重要机制。越来越多的证据表明，

microRNA可作为一种癌基因或抑癌基因，参与调控多种癌症的发生和发展过程。

因此，探索一种能够用于临床诊断及预防检测食管鳞癌的MicroRNA具有重要现实意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用。

本发明的另一目的在于提供has-miR-3656在制备用于诊断食管鳞癌的试剂盒、试纸、芯片或高通量测序平台中的应用。

本发明的另一目的在于提供has-miR-3656在制备预防和/或治疗食管鳞癌的药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用。

所述的has-miR-3656为血清外泌体(Exosome)内的has-miR-3656，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1)所示：ggcgggugcgggggugg。

所述的has-miR-3656可以是天然或人工合成的has-miR-3656，或者使用可以表达has-miR-3656的DNA片段的载体转染细胞获得。

所述的载体包括病毒载体。

所述的病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于慢病毒载体。

has-miR-3656在制备用于诊断食管鳞癌的试剂盒、试纸、芯片或高通量测序平台中的应用。

一种食管鳞癌生物分子标志物，为has-miR-3656。

用于检测血清外泌体内has-miR-3656表达水平(表达量)的试剂在制备诊断食管鳞癌的试剂盒或试纸中的应用。

一种快速诊断食管鳞癌的试剂盒，该试剂盒中含有对血清外泌体内has-RNA-3656表达量进行定量检测的试剂。

has-miR-3656在制备预防和/或治疗食管鳞癌的药物中的应用。

所述的药物还包括药物学上可以接受的载体，包括稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、或吸附载体。

has-miR-3656的抑制剂在制备预防和/或治疗食管鳞癌的药物中的应用。

has-miR-3656作为食管鳞癌的生物分子标志物在筛选治疗食管鳞癌的药物中的应用。

has-miR-3656作为药物靶点在制备治疗食管鳞癌的药物中的应用。

本发明的研究基础：

1、本发明通过临床数据分析发现食管鳞癌样本中hsa-miR-3656异常高表达。

2、本发明通过检测血清外泌体分析发现hsa-miR-3656异常高表达。

3、本发明成功构建了慢病毒侵染肿瘤细胞并建立了裸鼠移植瘤模型发现hsa-miR-3656和具有显著促进食管鳞癌发生发展的作用。

4、本发明表明microRNA在临床实践中有非常重要的意义，将成为新一代的肿瘤生物诊断标志物和用于肿瘤治疗的分子靶标。尤其是开辟了以hsa-miR-3656为主的肿瘤疾病全新靶标的研究，也为研制抗肿瘤新药开辟新的途径。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明通过临床数据分析及构建慢病毒侵染肿瘤细胞模型的实验证明has-miR-3656在食管鳞癌中异常高表达并具有显著促进肿瘤发生发展的作用，即has-miR-3656可作为促癌基因，参与是食管鳞癌的发生发展。因此，hsa-miR-3656很可能在预防与治疗食管鳞癌疾病中作为新的肿瘤标志物，可用于临床诊断及预防检测，具有很好的实际应用价值。

附图说明

图1是Kaplan–Meier分析hsa-miR-3656在食管癌中的表达与预后关系图。

图2是qPCR实验检测食管鳞癌患者与健康人血清外泌体中hsa-miR-3656的表达。

图3是电镜观察及qPCR实验检测过表达hsa-miR-3656细胞的绿色荧光表达量图；其中，A是ESCC细胞过表达hsa-miR-3656后细胞的绿色荧光表达情况；B是qPCR实验检测ESCC细胞过表达hsa-miR-3656后的hsa-miR-3656的表达情况。

图4是过表达hsa-miR-3656细胞接种于裸鼠形成ESCC移植瘤后肿瘤的生长情况及qPCR实验检测肿瘤中hsa-miR-3656的表达图；其中，A是过表达hsa-miR-3656ESCC细胞形成的移植瘤形态；B是移植瘤体积变化情况；C是移植瘤重量；D移植瘤内miR-3656表达情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1：

1、为探讨肿瘤微环境分泌的外泌体对肿瘤细胞生物学功能发挥所依赖的分子基础，我们抽提食管鳞癌肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)来源的外泌体(CDEs)及正常成纤维细胞(外泌体是培养肿瘤相关成纤维细胞及正常成纤维细胞后提取的，肿瘤相关成纤维细胞及正常成纤维细胞来自广州肿瘤医院提供的临床组织标本)(NFs)来源的外泌体(NDES)并对其sRNA进行测序(CAFs和NFs本实验室进行分离和鉴定获得)，获得具显著差异表达的miR-3656。外泌体抽提采用试剂盒并参考说明书进行(外泌体提取试剂盒购买于SBI公司)，具体方式如下：

(1)收集培养细胞后的上清液：上述两种细胞分别用含10％(v/v)FBS(胎牛血清)的DMEM培养基培养至融合度为50％，后更换无血清培养基培养24小时后收集上清。之后用无血清培养基与含10％(v/v)FBS的DMEM培养基每24小时交替培养，收集无血清培养基培养后的上清；

(2)纯化上清液：将收集得到的上清液在4℃、200g条件下离心10min以除漂浮细胞，然后再4℃、2000g条件下离心15min以除细胞碎片，再用孔径为0.22um的小滤器过滤除大颗粒；

(3)浓缩上清液：将步骤(2)中纯化后的上清液移入100KD离心柱(即100KD超滤浓缩柱)，3000g离心15min；

(4)孵育：将浓缩的上清液移入新EP管加入适量的ExoQuick-TC(CATALOG#:EXOTC50A-1)，震荡混匀，4℃过夜。孵育过程中勿动，EP管勿倾倒；外泌体沉降，过夜的混合物在4℃或室温条件下离心(1500g，30min)，后除去上清，保留EP管底部白色沉淀；

(5)重悬及保存：将白色沉淀用100～500μl的1×PBS缓冲液重悬并封装于-80℃冰箱保存。

(6)因已有测序实验安排故直接送新鲜抽提的外泌体于广州锐博生物公司进行sRNA测序及分析(各种细胞培养所用的培养皿、培养瓶购买于Corning公司；100KD超滤浓缩柱和0.22um的小滤器，分别购买于Millipore公司和Thermo Fisher公司)。

(7)结果：根据hsa-miR-3656(MIMAT0018076序列：ggcgggugcg ggggugg)在食管癌中表达的情况对184例临床病人的总生存情况的进行分析。采用Kaplan–Meier plotter数据库进行网上分析，Kaplan–Meier分析结果表明高表达hsa-miR-3656与184例临床病人不良预后显著相关，如图1所示。

2、取上述组织来源的临床患者血清及体检中心健康人的血清，提取血清外泌体，qPCR实验检测miR-3656表达情况。具体方式如下：

(1)血清收集：采集静脉血至采血管，4℃静置，12h使其自然凝固后，3000g离心10min，上清液即为血清；

(2)孵育：将上清液移入新EP管加入适量的ExoQuick-TC(CATALOG#:EXOTC50A-1)，震荡混匀，4℃过夜。孵育过程中勿动，EP管勿倾倒；外泌体沉降，过夜的混合物在4℃或室温条件下离心(1500g，30min)，后除去上清，保留EP管底部白色沉淀；

(3)重悬及保存：将白色沉淀用100～500μl的1×PBS缓冲液重悬并封装于-80℃冰箱保存。

(4)外泌体RNA抽提。参照RNAiso Plus说明书，步骤简要描述如下：

①在沉淀中加入适量体积的RNAiso，移液枪吹打，吹匀，吹散，使外泌体完全裂解，吸入RNAase-Free的EP管中；

②向上述外泌体混合液中加入200μl体积的三氯甲烷，盖上盖子，涡旋震荡仪剧烈震荡15s或更久，使外泌体充分匀浆且乳化后，冰上静置5min，待分层；

③12000g，4℃，离心15min；

④取出EP管，保持液面平稳，EP管中呈现明显的三层：无色含RNA的水相上层、白色蛋白层和粉红色的有机相下层，移液枪小心吸取无色上层水相400μl放入另一个装有400μl异丙醇的EP管中，颠倒混匀，室温静置15min；

⑤12000g，4℃，离心15min，然后小心吸掉液体，若外泌体量足够且抽提步骤标准，管底应有白色沉淀；

⑥沿EP管壁，缓缓地加入含75％(v/v)乙醇的DEPC水，轻轻震荡，弹起沉淀，以充分清洗含RNA的白色沉淀；

⑦12000g，4℃，离心5min；重复1～2次步骤⑥和⑦，尽最大可能移除管中液体，12000g，4℃离心2min，移除干净EP管中液体；

⑧开盖，室温干燥沉淀2～5min，不可干燥过度，以避免沉淀较难溶解；

⑨根据沉淀的体积加入15～50μl体积的DEPC水，吹打溶解沉淀，分光光度计测得RNA浓度，将RNA保存于-80℃冰箱。

(5)反转录体系及过程(638316Mir-X^TMmiRNA qRT-PCR TB Green^TMKit)参照Takara说明书：

①配制逆转录体系如下：RNA样品(3.5～10ug)≤44μl、DNaseI Buffer(10×)5μl、DNaseI(5U/μl)0.5μl、RNase-free ddH₂O 44.5μl至终体积50μl；37℃条件下反应30min后加入1μl 0.5M的EDTA(乙二胺四乙酸)，再在80℃条件下反应2min。

②miRNA加尾反应：mRQ Buffer(2×)5μl，RNA样品(0.25～8ug)3.75μl，mRQEnzyme 1.25μl终体积10μl。先37℃反应1h，再85℃反应5min，反应完成后加入90μl ddH₂O。

③RT-qPCR反应体系：ddH₂O 9μl，SYBR Advantage Premix(2×)12.5μl，ROX Dye(50×)0.5μl，miRNA-specific Primer(引物序列由锐博公司根据上述hsa-miR-3656的序列合成；10μM)0.5μl，mRQ 3’Primer(来自上述试剂盒)0.5μl，cDNA 2.0μl，终体积25μl。反应程序95℃10s(预变性)—95℃5s(变性)—60℃20s(退火)—72℃15s(延伸)，40个循环(内参使用U6)。

U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；

U6下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

qPCR实验检测血清外泌体hsa-miR-3656表达结果如图2所示。

3、包装慢病毒建立肿瘤细胞模型，采用Lipofectamine^TM3000试剂进行转染具体方式如下：

(1)在6孔细胞培养板中接种约1×10⁶个HEK-293T细胞(上海吉泰依科赛生物)，每孔加入2mL含10％(v/v)FBS的DMEM完全培养基(DMEM等各种培养基购于GE公司；胎牛血清购于PAN公司)，37℃，5％CO₂培养至细胞密度达到60％～70％时准备转染；

(2)将3.75～7.5μl的Lipofectamine^TM3000Transfection Reagent加入到含125μlOpti-MEMTM Medium的EP管(A)，静置5min；将5ug DNA加入到含125μl Opti-MEMTM Medium的EP管(B)，然后再加10μl P3000TM Reagent(DNA complex:质粒(lentiviral pasmid：NC质粒、miR3656重组质粒):包装质粒(lentiviral packaging plasmid：psPAX2):信封质粒(lentiviral envelope plasmid：pMD2.G)＝4:3:1，w/w)(以上质粒均来源于复能基因公司)；将EP管(B)中混合液加入到EP管(A)中，室温静置15～20min；

(3)将步骤(1)中获得的待转染的HEK-293T细胞移除培养基并用PBS洗一遍，加入1～2ml无血清培养基，将步骤(2)中制备的混合物沿孔壁逐滴加入细胞中培养6～10h，然后除去培养基并加入2.5ml含30％(v/v)血清的培养基，每24h收集上清液，收集2～3次；然后将上清液4℃、3000g离心10min除细胞碎片并用0.22μm PVDF滤膜过滤，所收集滤液即为病毒液。

(4)侵染肿瘤细胞系EC18和KYSE30(上海吉泰依科赛生物)，建立稳定高表达hsa-miR-3656的细胞系及对照组细胞系(转染对照质粒(NC质粒)后的对应的细胞为对照组)，具体侵染方式为：将待感染细胞移除培养基并用PBS缓冲液洗一遍，加1200～800μl新鲜RPMI-1640培养基，然后沿孔壁逐滴加入上述获得的200～800μl病毒液，加入终浓度为2～10ug/ml聚凝胺(polybrene)，24h后除去上清换新鲜培养基，48h后显微镜下观察荧光情况(细胞表达GFP)，加入嘌呤霉素(puromycin，5mg/ml)筛选稳定细胞株，终浓度3ug/ml(用正常细胞做致死曲线1～10ug/ml，选择加入puromycin的最佳浓度)。从加入嘌呤霉素(puromycin)后每天换液并加新鲜嘌呤霉素，两天后，频率更为两天换一次，得到稳定高表达hsa-miR-3656细胞系EC18-3656和KYSE30-3656，以及对照组细胞系EC18-NC和KYSE30-NC。一周后，电镜观察过表达及对照组细胞系绿色荧光表达及Q-PCR检测hsa-miR-3656表达情况。其中，Q-PCR检测具体方式为：

(5)总RNA抽提参照RNAiso Plus说明书，步骤简要描述如下：

①移除上述细胞培养皿中的上清，室温条件下用PBS缓冲液洗两遍，然后移除PBS缓冲液，再加入1ml体积的RNAiso，移液枪吹打细胞，吹匀，吹散，使细胞完全裂解，吸入RNAase-Free的EP管中；

②向上述细胞匀浆中加入200μl体积的三氯甲烷，盖上盖子，涡旋震荡仪剧烈震荡15s或更久，细胞充分匀浆且乳化后，冰上静置5min，待分层；

③12000g，4℃，离心15min；

⑤12000g，4℃，离心15min，然后小心吸掉液体，若细胞量足够且抽提步骤标准，管底应有白色沉淀；

(6)反转录体系及过程同步骤2(5)。

电镜观察及qPCR检测过表达hsa-miR-3656细胞的绿色荧光表达量如图3所示。

4、裸鼠移植瘤模型建立

将上述稳定高表达hsa-miR-3656细胞系EC18-3656、KYSE30-3656，以及对照组细胞系EC18-NC、KYSE30-NC大量培养，并分别进行动物实验。将实验裸鼠分为4组(命名为实验组1EC18-3656、对照组1EC18-NC，实验组2KYSE30-3656、对照组2KYSE30-NC)，每组5只，裸鼠腋下分别注射1×10⁷个细胞，成瘤后每两天测量肿瘤体积，处死裸鼠后取瘤拍照，称重，取部分瘤组织进行qPCR检测。

过表达hsa-miR-3656细胞接种于裸鼠形成ESCC移植瘤后肿瘤的生长情况及QPCR检测肿瘤中hsa-miR-3656的表达情况如图4所示，从结果可以看出hsa-miR-3656和具有显著促进食管鳞癌发生发展的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> has-miR-3656

<400> 1

ggcggggcgg ggggg 15

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U6上游引物

<400> 2

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U6下游引物

<400> 3

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims

1.has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用。

2.根据权利要求1所述的has-miR-3656作为食管鳞癌分子标志物的应用，其特征在于：所述的has-miR-3656为血清外泌体内的has-miR-3656，其核苷酸序列如下SEQ ID NO.1所示。

3.has-miR-3656在制备用于诊断食管鳞癌的试剂盒、试纸、芯片或高通量测序平台中的应用。

4.一种食管鳞癌生物分子标志物，其特征在于：为has-miR-3656。

5.用于检测血清外泌体内has-miR-3656表达水平的试剂在制备诊断食管鳞癌的试剂盒或试纸中的应用。

6.一种快速诊断食管鳞癌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有对血清外泌体内has-RNA-3656表达量进行定量检测的试剂。

7.has-miR-3656在制备预防和/或治疗食管鳞癌的药物中的应用。

8.has-miR-3656的抑制剂在制备预防和/或治疗食管鳞癌的药物中的应用。

9.has-miR-3656作为食管鳞癌的生物分子标志物在筛选治疗食管鳞癌的药物中的应用。

10.has-miR-3656作为药物靶点在制备治疗食管鳞癌的药物中的应用。