CN115058420A

CN115058420A - 一种环状非编码RNA-circSP3及其干扰RNA和应用

Info

Publication number: CN115058420A
Application number: CN202210651197.XA
Authority: CN
Inventors: 田进伟; 于波; 袭祥文; 李水洁; 田江天; 房绍红; 刘惠彬; 于丽; 陈彧; 倪文君
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Medical University
Priority date: 2022-06-09
Filing date: 2022-06-09
Publication date: 2022-09-16

Abstract

本发明公开了一种环状非编码RNA‑circSP3及其干扰RNA和应用。本发明通过动脉粥样硬化小鼠模型中对主动脉组织的高通量测序，筛选出在小鼠早期动脉粥样模型相较于正常小鼠主动脉组织高表达中一个关键的circRNA分子—circSP3，其序列在人和小鼠中高度保守。本发明通过PCR、sanger测序、Rnase R处理证实了circSP3的环状特征；接着设计其特异性干扰序列siRNA，通过体外转染人类主动脉平滑肌细胞后发现，沉默circSP3后可显著抑制平滑肌细胞的增殖和迁移能力；体内敲降circSP3后抑制早期小鼠AS进展，表明其在动脉粥样硬化发病机制中的重要作用，可以作为治疗早期动脉粥样硬化新的分子标记和药物靶点。本发明的提出为早期动脉粥样硬化的治疗提供了一种新的技术手段。

Description

一种环状非编码RNA-circSP3及其干扰RNA和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种环状非编码RNA-circSP3在治疗早期动脉粥样硬化中的影响及其应用。

背景技术

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种由多种因素多种细胞参与的慢性复杂性疾病。其是以血管内皮损伤为始点，伴随着炎症、免疫反应，血管壁中的脂质沉积，涉及到主要功能细胞，包括平滑肌细胞、内皮细胞和免疫细胞的炎性和增殖性级联反应。现有的研究方法和手段已经对AS的发生发展有了一定的认知与了解，对心血管疾病的诊断和治疗有了实质性的改善，但早期动脉粥样硬化发生发展由于未完全暴露其临床特征，早期有效的临床干预容易被忽视。尽管

等人发现他汀、白介素-1可以通过降脂、抗炎等来抑制早期斑块发展，但其带来的残存风险依旧很高，因此探求早期动脉粥样硬化病变形成的机制仍然是重要的。

平滑肌细胞(smooth muscle cells，SMC)在AS斑块形成、进展中发挥着重要的功能，研究表明，在AS斑块内含有的各种细胞中，70％左右来源于SMC。 AS早期，SMC通过异常增殖迁移并合成细胞外基质是损伤的关键；此外，SMC 分泌多种促炎、促增殖因子并募集巨噬细胞；SMC还通过吞噬摄取脂质，形成泡沫细胞。因此VSMC与早期AS的发生发展密不可分。

环状RNA(circular RNA，circRNA)，是一类新兴的非编码RNA，在真核生物中普遍存在，表达稳定且在物种间高度保守。研究表明，circRNA在动脉粥样硬化、冠脉斑块形成、斑块破裂等病理生理过程中出现不同水平的变化，AS 作为一种基因遗传易感性疾病，转录水平的研究可以更深入的阐述其发生发展，有助于我们更好的理解其发病机制，进而从RNA水平为AS提供新的诊疗靶点。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种在早期动脉粥样硬化动脉组织相较于正常动脉组织中高表达且在物种间高度保守的环状非编码RNA-circSP3及其应用，上述circRNA可作为干预动脉粥样硬化的新靶点。

本发明的目的之二在于提供上述环状非编码RNA-circSP3的抑制剂及其在制备治疗早期动脉粥样硬化药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过对小鼠AS模型中的动脉组织进行全转录组高通量测序，筛选到在早期AS组相较于正常组高表达，且保守性高的一种环状非编码RNA-circSP3，其序列在人和小鼠中高度同源保守，序列如SEQ ID NO.1所示。然后本发明通过聚合酶链反应(PCR)、Sanger测序和RNase R处理对环状RNA进行验证。为进一步研究circSP3对SMC的功能的影响，构建siRNA沉默人类主动脉平滑肌细胞(HASMC)的circSP3，研究circSP3对SMC的增殖、迁移等功能中的作用。结果证实，体外转染siRNA沉默circSP3可显著抑制SMC的增殖和迁移，通过AAV病毒干扰早期AS模型APOE^-/-血管circSP3表达，可以抑制早期斑块形成与进展，表明circSP3在早期动脉粥样硬化阶段发挥着重要的作用，可作为诊疗早期动脉粥样硬化新的分子标记和干预靶点。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种环状非编码RNA，所述的环状非编码RNA为circSP3，其序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提出了一种所述的环状非编码RNA的抑制剂。

其中，优选的，所述的抑制剂为所述的环状非编码RNA的干扰RNA。

其中，优选的，所述的抑制剂为所述的环状非编码RNA的干扰RNA，由正义链以及反义链组成，其中正义链的序列为：GCAGACAGGUGAUUUGGCUTT，反义链的序列为:AGCCAAAUCACCUGUCUGCTT。

其中，优选的，所述的抑制剂为所述的环状非编码RNA的干扰RNA，由正义链以及反义链组成，其中正义链的序列为：GACAGUCCUCCACACACGUTT，反义链的序列为：ACCUCUCUGCAGCACUGUCTT。

其中，优选的，所述的抑制剂为所述的环状非编码RNA的干扰RNA为腺相关病毒包被的RNA干扰序列，由上游链以及下游链组成，其中上游链的序列为： GATCCCAGTCCTGCAGACAGGTGATTTTCAAGAGAAATCACCTGTCTGCAG GACTGTTTTTTG，下游链的序列为：AATTCAAAAAACAGTCCTGCAGACAGGTGATTTCTCTTGAAAATCACCTGT CTGCAGGACTGG。

更进一步，本发明还提出了所述的环状非编码RNA作为分子标记和靶点在制备治疗早期动脉粥样硬化药物中的应用。

更进一步，本发明还提出了所述的环状非编码RNA的抑制剂在制备治疗早期动脉粥样硬化药物中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明通过对小鼠AS模型中的动脉组织进行全转录组高通量测序，筛选到在早期AS组相较于正常组高表达，且保守性高的circSP3。为进一步研究circSP3 对SMC功能的影响，构建siRNA沉默人类主动脉平滑肌细胞(HASMC)的circSP3，研究circSP3对SMC的增殖、迁移等功能中的作用。结果证实，体外转染siRNA 沉默circSP3可显著抑制SMC的增殖和迁移，通过AAV病毒干扰早期AS模型 APOE^-/-血管circSP3表达，可以抑制早期斑块形成与进展，表明circSP3在早期动脉粥样硬化阶段发挥着重要的作用，可作为诊疗早期动脉粥样硬化新的分子标记和干预靶点。同时，本发明也为早期动脉粥样硬化的预防和治疗提供了新的技术手段。

附图说明

图1为通过正反向引物PCR、Rnase R处理和sanger测序等实验证明circSP 3的环状结构；

其中，A：环状RNA circSP3形成示意图以及测序结果；B：circSP3 PCR 产物电泳成像证明其成环特性；C：RNA表达水平；

图2为circaSp3特异siRNA干扰序列沉默效果；

图3为siRNA沉默平滑肌细胞中circSP3抑制平滑肌细胞的增殖活性；

图4为siRNA沉默circSP3抑制平滑肌细胞的迁移能力。

其中，A：Transwell实验；B：细胞划痕实验；

图5为AAV干预早期AS模型鼠，主动脉中circSP3的表达效果；

其中，A：体内实验示意图；B：盐水组、AAV-NC、AAV-sh-circSP3，三组治疗中，主动脉circSP3的表达量；

图6为体内敲减circSP3可显著抑制早期小鼠动脉粥样硬化的发生与进展。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：circSP3的结构鉴定

1.材料

1.1细胞

本发明所用的人类主动脉平滑肌细胞(HASMC)购买自美国ATCC细胞库，细胞培养应用Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit。培养条件为37℃，5％CO2。

1.2试剂

TRIzol Reagent购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒(04897030001)购自德国Roche公司。荧光实时(Real-time)定量PCR(polymerase chain reaction) 所用的SYBRGreen Master(ROX)试剂盒购自德国Roche公司。琼脂糖购买自美国sigma公司，Gelred染购买自美国biotium公司，DNA Marker和Loading Buffer 购买于北京天根公司。PCR特异性引物由睿博兴科生物技术有限公司设计合成。引物如下表1：

表1

2.方法

2.1高通量测序

本发明通过对小鼠AS模型中的动脉组织进行全转录组高通量测序，筛选到在早期AS组相较于正常组高表达，且保守性高的一种环状非编码RNA-circSP3，其序列在人和小鼠中高度同源保守，序列如SEQ ID NO.1所示。

2.2 RNA提取

根据试剂说明书使用Trizol reagent提取细胞RNA，将细胞置于1mL Trizolreagent中。室温放置5分钟，充分裂解细胞核。加入0.2mL氯仿，同时剧烈涡旋震荡15秒，室温放置5-10分钟，4℃，12000转/分钟，离心15分钟，之后可观察液体分为三层，将无色水相移至另一干净1.5mL离心管(注意不可触碰中间层)，并加等量异丙醇(约0.4ml)，轻柔颠倒混匀，室温孵育5-10分钟以沉淀RNA。 4℃，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清，加入1mL75％乙醇(用DEPF水稀释，现用现配)洗涤沉淀，期间反复吹打。4℃，12000转/分钟离心5-6分钟，弃上清，加入无水乙醇1mL洗涤沉淀，4℃离心5-6分钟，弃上清。待白色RNA沉淀自行干燥5-10分钟。加入20-50uL DEPC水溶解沉淀，用紫外分光光度计测总 RNA浓度和纯度。

2.3逆转录

应用罗氏cDNA逆转录试剂盒(cDNA Reverse Transcription Kit)按以下体系进行逆转录反应：Transcriptor Reverse Transcriptase(20U/μl)0.5μl，Transcriptor RTReaction Buffer(5×)4μl，Protector RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，Deoxynuc-leo-tide Mix 2μl，Random Hexamer Primer(600μM)2μl，总RNA 1ug(根据紫外分光光度计测得的RNA浓度计算所需RNA体积)，最后以无RNA酶的DEPC水将反应体积补足为20μl。于普通PCR机器按如下逆转录反应条件：25℃10分钟；55℃ 30分钟；85℃5分钟；4℃5分钟。

2.4 PCR

按照Roche公司SYBR Green Master(ROX)试剂盒的说明书按如下体系(10ul 体系)进行PCR反应：

体系配制完成后以95℃10min预变性，按95℃15s变性、60℃30s退火过程循环40次得到PCR结果。

2.5琼脂糖凝胶电泳

制胶：1.5％琼脂糖凝胶，称取1.05g琼脂糖，溶于70ml 0.5ⅹTBE液，加入 2μlGelred染料，摇晃混匀，加热2分钟，使琼脂粉充分溶解。倒胶。静置约30 分钟后，待胶完全凝固，轻轻拔掉梳子；电泳：DNA markerⅠ6μl、DNA产物5μl +loading buffer 1μl充分混匀,120v恒压电泳。成像：凝胶成像仪成像，拍照。

3.结果

通过正反向引物PCR、Rnase R处理和sanger测序实验确定了circSP3的环状结构特性，为进一步探究circSP3的功能奠定基础。图1A为环状RNA circSP3 形成示意图以及测序结果；图1B为circSP3 PCR产物电泳成像证明其成环特性；图1C为RNA表达水平，与线性RNA相比，circSP3更为稳定。

实施例2：构建平滑肌细胞circSP3的沉默模型

1.材料

1.1细胞与siRNA

本例所用的细胞及培养条件如实施例1。

设计有关沉默circSP3(siRNA)序列，RNAi-1正义链 (Sence):GCAGACAGGUGAUUUGGCUTT,反义链(Antisense): AGCCAAAUCACCUGUCUGCTT，RNAi-2正义链(Sence):GACAGUCCUCCACACACGUTT,反义链 (Antisense):ACCUCUCUGCAGCACUGUCTT。

小干扰RNA(siRNA)的合成由苏州吉玛基因股份有限公司完成。

1.2试剂

小干扰RNA(siRNA)转染所用Neon Transfection System和细胞转染仪购自美国Invitrogen公司；DMEM培养基购自Hyclone公司，青霉素、链霉素购自上海碧云天生物技术有限公司。

2.方法

2.1 circSP3在平滑肌细胞中的表达

待细胞培养密度达到80％～90％时，吸弃培养基，用PBS冲洗后，加入2ml 胰蛋白酶消化约2分钟后，再加入2ml完全培养基终止消化，将4ml细胞悬液加入离心管，25℃，1000rpm离心5分钟。弃掉上清，加入1ml PBS重悬细胞并计数。25℃，1000rpm再次离心5分钟，弃掉上清，加入缓冲液R重悬细胞。将siRNA加入1.5ml离心管中，再加入细胞悬液抽吸混匀。将装有3ml电解缓冲液E的NeonTM管插入电转仪中，吸取细胞混合液(枪头中必须无气泡)，将带有样品的NeonTM移液器垂直插入NeonTM管中，设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数及脉冲时间。电脉冲释放后，电转完成，将转染完毕的细胞接种到6 孔板，加入新鲜的完全培养基。48小时后，通过Real-time PCR检测circSP3在细胞中的表达情况。

3.结果

提取的平滑肌细胞总RNA，通过Real-time PCR分析circSP3的表达情况。 si-RNA转染组相对于si-NC转染组，circSP3的表达量显著降低，说明circSP3的细胞沉默模型造模成功(图2)，从而为进一步研究circSP3在平滑肌细胞的功能中发挥的作用奠定了基础。

实施例3：circSP3对平滑肌细胞增殖的调控作用

1材料

1.1细胞

实验所用的细胞及培养方法同实施例1。

1.2试剂

实验所用si-circSP3-1(RNAi-1)以及si-circSP3-2(RNAi-2)同实施例2。 CCK-8购自日本同仁化学科技公司。

2.方法

2.1 CCK8增殖实验

按实施例1转染siRNA，将转染完毕的细胞接种到48孔板，以每孔1x10⁴个/ml的细胞密度接种细胞，每孔200uL完全培养基，将培养板放入37℃恒温培养箱中预培养(贴壁6-8小时)；细胞经过一段时间的处理后，吸弃原培养基更换为预配制好的含有10％CCK-8的培养基(180ml培养基+20mlCCK8)，培养2 小时，用酶标仪测定48孔板在450nm处的吸光度(OD值)。连续测数日，绘制增长曲线。

3结果

本发明通过CCK8实验检测了体外转染si-RNA沉默circSP3后，平滑肌细胞的增殖情况，发现circSP3沉默组的细胞增殖明显抑制(图3)，提示沉默circSP3 抑制平滑肌增殖。

实施例4：circSP3对平滑肌细胞迁移的调控作用

1.细胞

实验所用的细胞及培养方法同实施例1。

1.2试剂

实验所用si-circSP3-1(RNAi-1)以及si-circSP3-2(RNAi-2)同实施例2。结晶紫染色液购买自中国碧云天生物技术公司。4％多聚甲醛、0.5％Triton X-100 渗透剂、2mg/mL甘氨酸溶液等试剂为本实验室自行配置。

2.方法

2.1 Transwell实验

70％～80％融合的对数生长期细胞用无血清培养液饥饿12～24小时。常规消化细胞，离心后PBS重悬细胞1～2次，用含BSA的无血清培养液(或含1％FBS 的培养液)制备细胞悬液，调整细胞密度至(2～5)×105/ml。取100ul细胞悬液接种于Transwell小室。24孔板下室加入600ul含10％FBS的培养液，常规培养细胞12～48小时。24孔板中每孔加入800ul甲醇。用镊子取出小室，吸干上室液体，移入甲醇，室温，固定1min。另外一板24孔培养板中每孔加入800ul0.1％结晶紫染色液。取出小室，吸干上室固定液，放入染色液，室温，染色20min。小室用清水轻轻冲洗浸泡3次进行脱色。用镊子取出小室，吸干上室液体，用棉签轻轻擦掉上室底部膜表面未迁移细胞。移至载玻片，显微镜下随机观察5个视野细胞，并进行照相、计数和统计分析。

2.2细胞划痕实验

细胞常规消化，制备密度为每毫升5×10⁵个细胞的悬液，细胞接种于24孔培养板中，常规培养16～24小时，直到形成单层细胞。无血清培养液培养4h。沿培养板底部呈“一”字进行划痕，镜下记录划痕区相对距离。PBS液清洗细胞3次，加入无血清培养基。37℃，5％CO2，培养箱中培养。0h、24h取样，拍照。

2.3结果

为了验证circSP3是否影响平滑肌细胞迁移能力，本发明通过transwell和细胞划痕实验检测了si-RNA转染细胞24小时后的细胞迁移能力的变化，发现 circSP3沉默组细胞的迁移水平明显受到抑制(图4)，提示沉默circSP3抑制平滑肌细胞迁移，图4A为transwell实验以及统计结果；图4B为细胞划痕实验以及统计结果。

实施例5：circSP3对小鼠动脉粥样硬化进展的影响

1.材料

1.1动物

本发明的ApoE-/-小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，在小鼠8 周时，给予高脂饲料喂养。

设计有关腺相关病毒(AAV)包被的小鼠干扰序列，AAV-sh-circSP3：Top strand:GATCCCAGTCCTGCAGACAGGTGATTTTCAAGAGAAATCACCTGTCTGCAG GACTGTTTTTTG，Bottomstrand: AATTCAAAAAACAGTCCTGCAGACAGGTGATTTCTCTTGAAAATCACCTGT CTGCAGGACTGG。

通过尾静脉将携带sh-circSP3/sh-NC的腺相关病毒(AAV)以及生理盐水注射到小鼠体内，高脂6周后，小鼠14周龄时取材主动脉以及心脏分析circSP3对早期动脉粥样硬化进展的影响。实验动物的使用得到了哈尔滨医科大学伦理委员会的批准。

1.2试剂

高脂饲料(12108C)购自于南京森堡生物制品公司，HE、改良油红O、Masson 染色液盒购自北京索莱宝有限公司。腺相关病毒由汉恒生物有限公司合成并载体包装。

2.方法

2.1小鼠分组注射腺相关病毒

8周龄雄性ApoE-/-小鼠被随机分为三组并给予高脂饮食，分别为：生理盐水组(Saline组)、腺相关病毒空载体(AAV-NC)组以及circSP3沉默组(AAV- sh-circSP3)，通过尾静脉注射到小鼠体内。在小鼠高脂开始时同时尾静脉注射，每次注射200ul体量，滴度为10¹²。小鼠高脂6周后给予麻醉，在体式显微镜下，分别取材小鼠心脏及小鼠主动脉。

2.2小鼠主动脉根部病理HE染色

切片后固定，固定时间为30s-1min，清水稍冲洗1-2s；玻片浸没于含苏木素的染缸中，时间大概为3-5min；然后清水洗去苏木素，大概5-10s；返蓝5-10s,清水稍冲洗1-2s，显微镜下观察，细胞核蓝色；再把玻片浸没于含伊红的染色缸中 30-60s，然后清水冲洗干净表面；利用不同浓度的酒精(从低浓度—高浓度)和二甲苯进行该项操作。显微镜下观察，细胞核蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈现出深浅不一的红色。

2.3小鼠主动脉根部病理油红O染色

选择10um冰冻切片，室温平衡5分钟，蒸馏水反复冲洗5次；擦干片子，滴加60％异丙醇30-40秒，弃除液体；滴加油红O置于孵膜中35分钟，观察，着色明显后置于水中；滴加苏木染色3分钟，流水终止染色，镜下观察，并反蓝。

2.4小鼠主动脉根部病理Masson染色

冷丙酮固定切片，PBS冲洗，苏木素染细胞核；masson染色试剂盒内丽春红酸性品红液染5-10min，蒸馏水快速漂洗；磷钼酸水溶液处理约3-5min；苯胺蓝液复染5min；脱水透明。

3.结果

AAV干预早期AS模型鼠主动脉中circSP3的表达效果如图5所示。体内敲减circSP3与对照组相比可显著抑制早期小鼠动脉粥样硬化斑块的进展(图6)。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> 一种环状非编码RNA-circSP3及其干扰RNA和应用

<141> 2022-06-09

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1360

<212> DNA

<213> circSP3

<400> 1

acaggtgatt tggcttctgc acagttagga ggagcaccaa accgatggga ggttttgtca 60

gccacaccta caactataaa agatgaagct ggtaatctag tccagattcc aagtgctgct 120

acttcaagtg ggcagtatgt tcttcccctt cagaatttgc agaatcaaca aatattttcc 180

gttgcaccag gatcagattc atcaaatggt acagtgtcca gtgttcaata tcaagtgata 240

ccacagatcc agtcagcaga tggtcagcag gttcaaattg gtttcacagg ctcttcagat 300

aatgggggta taaatcaaga aagcagtcaa attcagatca ttcctggctc taatcaaacc 360

ttacttgcct ctggaacacc ttctgctaac atccagaatc tcataccaca gactggtcaa 420

gtccaggttc agggagttgc aattggtggt tcatcttttc ctggtcaaac ccaagtagtt 480

gctaatgtgc ctcttggtct gccaggaaat attacgtttg taccaatcaa tagtgtcgat 540

ctagattctt tgggactctc gggcagttct cagacaatga ctgcaggcat taatgccgac 600

ggacatttga taaacacagg acaagctatg gatagttcag acaattcaga aaggactggt 660

gagcgggttt ctcctgatat taatgaaact aatactgata cagatttatt tgtgccaaca 720

tcctcttcat cacagttgcc tgttacgata gatagtacag gtatattaca acaaaacaca 780

aatagcttga ctacatctag tgggcaggtt cattcttcag atcttcaggg aaattatatc 840

cagtcgcctg tttctgaaga gacacaggca cagaatattc aggtttctac agcacagcct 900

gttgtacagc atctacaact tcaagagtct cagcagccaa ccagtcaagc ccaaattgtg 960

caaggtatta caccacagac aatccatggt gtgcaagcca gtggtcaaaa tatatcacaa 1020

caggctttgc aaaatcttca gttgcagctg aatcctggaa cctttttaat tcaggcacag 1080

acagtgaccc cttctggaca ggtaacttgg caaacgtttc aagtacaagg ggtccagaac 1140

ttgcagaatt tgcaaataca gaatactgct gcccaacaaa taactttgac gcctgttcaa 1200

accctcacac ttggtcaagt tgcggcaggt ggagccttca cttcaactcc agttagtcta 1260

agcactggtc agttgccaaa tctacaaaca gttacagtga actctataga ttctgctggt 1320

atacagctac atccaggaga gaatgctgac agtcctgcag 1360

Claims

1.一种环状非编码RNA，其特征在于，所述的环状非编码RNA为circSP3，其序列如SEQID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的环状非编码RNA的抑制剂。

3.如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述的抑制剂为权利要求1所述的环状非编码RNA的干扰RNA。

4.如权利要求3所述的抑制剂，其特征在于，所述的抑制剂为权利要求1所述的环状非编码RNA的干扰RNA由正义链以及反义链组成，其中正义链的序列为：GCAGACAGGUGAUUUGGCUTT，反义链的序列为:AGCCAAAUCACCUGUCUGCTT。

5.如权利要求3所述的抑制剂，其特征在于，所述的抑制剂为权利要求1所述的环状非编码RNA的干扰RNA由正义链以及反义链组成，其中正义链的序列为：GACAGUCCUCCACACACGUTT，反义链的序列为：ACCUCUCUGCAGCACUGUCTT。

6.如权利要求3所述的抑制剂，其特征在于，所述的抑制剂为权利要求1所述的环状非编码RNA的干扰RNA为腺相关病毒包被的RNA干扰序列，由上游链以及下游链组成，其中上游链的序列为：GATCCCAGTCCTGCAGACAGGTGATTTTCAAGAGAAATCACCTGTCTGCAGGACTGTTTTTTG，下游链的序列为：AATTCAAAAAACAGTCCTGCAGACAGGTGATTTCTCTTGAAAATCACCTGTCTGCAGGACTGG。

7.权利要求1所述的环状非编码RNA作为分子标记和靶点在制备治疗早期动脉粥样硬化药物中的应用。

8.权利要求2-6任一项所述的环状非编码RNA的抑制剂在制备治疗早期动脉粥样硬化药物中的应用。