CN114032237A

CN114032237A - 一种环状非编码RNA circSTK39及其在预防和治疗动脉粥样硬化中的应用

Info

Publication number: CN114032237A
Application number: CN202111183227.0A
Authority: CN
Inventors: 田进伟; 于波; 郭守利; 田江天; 符亚红; 袭祥文; 于丽; 杨奕
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Medical University
Priority date: 2021-10-11
Filing date: 2021-10-11
Publication date: 2022-02-11

Abstract

本发明公开了一种环状非编码RNA circSTK39及其在预防和治疗动脉粥样硬化中的应用。本发明通过对小鼠AS模型中的动脉组织进行全转录组高通量测序，筛选到在晚期AS组有表达，且保守性高的环状非编码RNA——circSTK39。其中，人类中的circSTK39是由SEQ ID NO.1所示的DNA序列经转录后得到。本发明通过探究circSTK39对血管平滑肌细胞增殖迁移的调控功能，发现了circSTK39在动脉粥样硬化整个发生发展过程中发挥着重要的作用。本发明的提出使得可以在临床中通过对该靶点的筛查，对早期动脉粥样硬化及时进行药物干预，延缓甚至逆转疾病。在晚期的动脉粥样硬化筛查中，可了解患者病变发展情况，及时干预避免临床事件发生。因此，本发明的提出为预防和治疗动脉粥样硬化提供了新的分子标记和干预靶点。

Description

一种环状非编码RNA circSTK39及其在预防和治疗动脉粥样硬化中的应用

技术领域

本发明涉及一种环状非编码RNA-circSTK39及其在预防和治疗动脉粥样硬化中的应用。本发明属于分子生物学领域，

背景技术

随着社会经济的发展，心血管疾病的发病率和死亡率在全球范围内不断上升，中国心血管健康与疾病报告指出，2018年心血管病死亡占我国城乡居民总死亡原因的首位，农村为46.66％，城市为43.81％，心血管疾病已成为威胁公众健康的重要疾病之一。动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)被认为是由多种因素相互作用导致的一种慢性炎症反应，是多种心脑血管疾病的主要病理基础。AS早期常表现为缓慢隐匿型增长，而晚期阶段容易出现跳跃式快速进展，导致急性临床事件的发生。

血管平滑肌细胞(VSMC)是AS斑块的重要组成部分，在AS进展过程中起到关键的作用，内皮功能受损，炎症反应刺激，VSMC发生表型转换，迁移到损伤血管内膜，发生异常增殖并分泌大量细胞外基质，参与AS早期阶段纤维帽的形成和发展，而AS晚期阶段，VSMC凋亡占主要地位，是不稳定性斑块破裂，继而发生出血和形成血栓的主要原因之一。因此VSMC的异常增殖和迁移与AS的发生发展密不可分。

环状RNA(circular RNA，circRNA)，是一类新兴的非编码RNA，在真核生物中普遍存在，表达稳定且在物种间高度保守。近年来的研究表明circRNA与包括心脏病在内的多种疾病密切相关，对人类健康有很大影响，但是绝大部分的circRNA的功能仍不清楚。本发明借助高通量测序筛选出在晚期AS动脉组织中表达且在物种间高度保守的circSTK39，通过设计干扰RNA检测其对平滑肌细胞功能的影响，并进一步通过体内转染干扰RNA的腺相关病毒载体，发现了circSTK39与动脉粥样硬化疾病的关系，有助于我们更好的理解其发病机制，从RNA水平为AS提供新的诊疗靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在晚期动脉粥样硬化动脉组织中表达且在物种间高度保守的环状非编码RNA及其在预防和治疗动脉粥样硬化中的应用。

circSTK39

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过对小鼠AS模型中的动脉组织进行全转录组高通量测序，筛选到在晚期AS组有表达，且保守性高的circSTK39。其中，人类中的circSTK39是由核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的DNA序列经转录后得到。小鼠中的circSTK39是由核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA序列经转录后得到。通过荧光定量PCR实验发现circSTK39在人AS斑块组织中显著高表达。构建siRNA沉默小鼠主动脉平滑肌细胞(MASMC)以及人类主动脉平滑肌细胞(HASMC)的circSTK39，研究circSTK39在平滑肌细胞的增殖、迁移等功能中的作用，从而探究circSTK39在动脉粥样硬化中的作用机制。通过探究circSTK39对血管平滑肌细胞增殖迁移的调控功能，我们发现circSTK39在动脉粥样硬化整个发生发展过程中发挥着重要的作用，circSTK39具有抑制动脉粥样硬化进展的作用，可成为治疗AS的新靶点。

在上述研究的基础上，本发明首先提出了一种环状非编码RNA，命名为circSTK39，所述的环状非编码RNA circSTK39是由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA序列经转录后得到。

进一步的，本发明还提出了一种腺相关病毒载体，所述的腺相关病毒载体中含有编码所述的环状非编码RNA的DNA序列。以及所述的腺相关病毒载体在制备预防和治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

再进一步的，本发明还提出了环状非编码RNAcircSTK39在制备预防和治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

其中，优选的，所述的环状非编码RNAcircSTK39是由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA序列经转录后得到。

其中，优选的，所述的环状非编码RNAcircSTK39以及腺相关病毒载体通过促进主动脉平滑肌细胞增殖及迁移的作用来达到预防和治疗动脉粥样硬化的目的。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明通过探究circSTK39对血管平滑肌细胞增殖迁移的调控功能，发现了circSTK39在动脉粥样硬化整个发生发展过程中发挥着重要的作用。本发明的提出使得可以在临床中通过对该靶点的筛查，对早期动脉粥样硬化及时进行药物干预，延缓甚至逆转疾病。在晚期的动脉粥样硬化筛查中，可了解患者病变发展情况，及时干预避免临床事件发生。因此，可作为诊疗动脉粥样硬化新的分子标记和干预靶点。

附图说明

图1为人和小鼠中状非编码RNA-circSTK39的序列比对结果；

图2为siRNA沉默效果；

A：小鼠circSTK39特异siRNA干扰序列沉默效果；B：人类circSTK39特异siRNA干扰序列沉默效果；

图3为原代小鼠主动脉平滑肌中沉默circSTK39，抑制平滑肌的增殖活性；

A：CCK8增殖实验；B：EDU实验

图4为原代小鼠主动脉平滑肌细胞中沉默circSTK39，抑制平滑肌的迁移能力；

A：Transwell实验；B：细胞划痕实验

图5为人主动脉平滑肌细胞沉默circSTK39，抑制平滑肌的增殖活性；

A：CCK8增殖实验；B：EDU实验

图6为人主动脉平滑肌细胞中沉默circSTK39，抑制平滑肌的迁移能力；

A、B：Transwell实验；C、D：细胞划痕实验

图7为体内转染过表达/敲减circSTK39对小鼠动脉粥样硬化的进展的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：构建平滑肌细胞circSTK39的沉默模型

1.材料

1.1细胞与siRNA

本发明所用的小鼠主动脉平滑肌细胞(MVSMC)来源于C57BL/6小鼠主动脉，通过组织贴壁法进行提取及培养，细胞培养应用含有10％灭活胎牛血清(美国Science Cell公司)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO2。人主动脉平滑肌细胞(HASMC)购买自美国ATCC细胞库，细胞培养应用Vascular Smooth MuscleCell Growth Kit。

设计小鼠circSTK39沉默(siRNA)序列：

RNAi-1正义链(Sence):UCCGCUGCCUUCUUGGCUCTT，

RNAi-1反义链(Antisense):GAGCCAAGAAGGCAGCGGATT，

RNAi-2正义链(Sence):UGCUCCGCUGCCUUCUUGGTT，

RNAi-2反义链(Antisense):CCAAGAAGGCAGCGGAGCATT。

小干扰RNA的设计和合成由苏州吉玛基因股份有限公司完成。

1.2试剂

小干扰RNA(siRNA)转染所用Neon Transfection System和细胞转染仪购自美国Invitrogen公司；DMEM培养基购自Hyclone公司，青霉素、链霉素购自上海碧云天生物技术有限公司。

2.方法

2.1circSTK39在小鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

待细胞培养密度达到80％～90％时，吸弃培养基，用PBS冲洗后，加入2ml胰蛋白酶消化约2分钟后，再加入2ml完全培养基终止消化，将4ml细胞悬液加入离心管，25℃，1000rpm离心5分钟。弃掉上清，加入1ml PBS重悬细胞并计数。25℃，1000rpm再次离心5分钟，弃掉上清，加入缓冲液R重悬细胞。将siRNA加入1.5ml离心管中，再加入细胞悬液抽吸混匀。将装有3ml电解缓冲液E的NeonTM管插入电转仪中，吸取细胞混合液(枪头中必须无气泡)，将带有样品的NeonTM移液器垂直插入NeonTM管中，设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数及脉冲时间。电脉冲释放后，电转完成，将转染完毕的细胞接种到6孔板，加入新鲜的完全培养基。48小时后，通过Real-time PCR检测circRNA在细胞中的表达情况。

3.结果

提取的平滑肌细胞总RNA，通过Real-time PCR分析circSTK39的表达情况。si-RNA转染组相对于si-NC转染组，circSTK39的表达量显著降低，说明circSTK39的细胞沉默模型造模成功(图2)，从而为进一步研究circSTK39在平滑肌细胞的功能中发挥的作用奠定了基础。

实施例2：circRNA对小鼠主动脉平滑肌细胞增殖及迁移的调控作用

1.材料

1.1细胞

实验所用的细胞及培养方法同实施例1。

1.2试剂

设计小鼠circSTK39沉默(siRNA)序列：

si-circSTK39-1正义链(Sence):UCCGCUGCCUUCUUGGCUCTT，

si-circSTK39-1反义链(Antisense):GAGCCAAGAAGGCAGCGGATT，

si-circSTK39-2正义链(Sence):UGCUCCGCUGCCUUCUUGGTT，

si-circSTK39-2反义链(Antisense):CCAAGAAGGCAGCGGAGCATT。

CCK-8购自日本同仁化学科技公司，EDU染色试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。结晶紫染色液购买自中国碧云天生物技术公司。4％多聚甲醛、0.5％Triton X-100渗透剂、2mg/mL甘氨酸溶液等试剂为本实验室自行配置。

2.方法

2.1 CCK8增殖实验

按实施例1转染siRNA，将转染完毕的细胞接种到48孔板，以每孔1x10⁴个/ml的细胞密度接种细胞，每孔200uL完全培养基，将培养板放入37℃恒温培养箱中预培养(贴壁6-8小时)；细胞经过一段时间的处理后，吸弃原培养基更换为预配制好的含有10％CCK-8的培养基(180ml培养基+20mlCCK8)，培养2小时，用酶标仪测定48孔板在450nm处的吸光度(OD值)。连续测数日，绘制增长曲线。

2.2 EDU实验

在48孔板中加入细胞悬液进行培养(每孔约2000个细胞)根据实验设计处理各孔细胞；每孔加入5050μM的EdU培养基200uL，恒温细胞培养箱内孵育2小时；吸弃旧培养基，PBS洗涤细胞(3次，每次5分钟)；每孔加入提前配置好的细胞固定液100uL，室温固定20分钟；弃去细胞固定液，每孔加入2.5mg/mL的甘氨酸溶液200uL，摇床孵育5分钟；PBS洗涤细胞，摇床5分钟；每孔加入提前配制好的200uL 1x Apollo染液，室温避光摇床孵育25分钟；每孔加入200uL0.5％TritonX-100的PBS液(渗透剂)，摇床洗涤(3次，每次10分钟)；每孔加入200uL 1xHoechst33342染液，室温避光静置20分钟后弃去染色液；PBS摇床洗涤3次，每次5分钟；荧光显微镜拍摄保存(避光条件)。

2.3 Transwell实验

70％～80％融合的对数生长期细胞用无血清培养液饥饿12～24小时。常规消化细胞，离心后PBS重悬细胞1～2次，用含BSA的无血清培养液(或含1％FBS的培养液)制备细胞悬液，调整细胞密度至(2～5)×10⁵/ml。取100ul细胞悬液接种于Transwell小室。24孔板下室加入600ul含10％FBS的培养液，常规培养细胞12～48小时。24孔板中每孔加入800ul甲醇。用镊子取出小室，吸干上室液体，移入甲醇，室温，固定1min。另外一板24孔培养板中每孔加入800ul 0.1％结晶紫染色液。取出小室，吸干上室固定液，放入染色液，室温，染色20min。小室用清水轻轻冲洗浸泡3次进行脱色。用镊子取出小室，吸干上室液体，用棉签轻轻擦掉上室底部膜表面未迁移细胞。移至载玻片，显微镜下随机观察5个视野细胞，并进行照相、计数和统计分析。

2.4细胞划痕实验

细胞常规消化，制备密度为每毫升5×10⁵个细胞的悬液，细胞接种于24孔培养板中，常规培养16～24小时，直到形成单层细胞。无血清培养液培养4h。沿培养板底部呈“一”字进行划痕，镜下记录划痕区相对距离。PBS液清洗细胞3次，加入无血清培养基。37℃，5％CO2，培养箱中培养。0h、24h、48h取样，拍照。

3.结果

3.1 circSTK39对小鼠主动脉平滑肌细胞增殖能力的影响

为了验证circSTK39是否影响小鼠原代平滑肌细胞增殖能力，本发明通过CCK8增殖实验和EDU实验检测了si-RNA转染细胞后的增殖情况，发现circSTK39沉默组细胞增殖受到明显抑制(图3)，提示circSTK39具有促进小鼠主动脉平滑肌细胞增殖的能力。

3.2 circSTK39对小鼠主动脉平滑肌细胞迁移能力的影响

为了验证circSTK39是否影响小鼠主动脉平滑肌细胞迁移能力，本发明通过transwell和细胞划痕实验检测了si-RNA转染细胞48小时后的细胞迁移能力的变化，发现circSTK39沉默组细胞的迁移水平明显受到抑制(图4)，提示circST K39具有促进小鼠主动脉平滑肌细胞迁移的能力。

实施例3：circRNA对人主动脉平滑肌细胞增殖及迁移的调控作用

1.材料

1.1细胞

实验所用的细胞及培养方法同实施例1。

1.2试剂

设计人类circSTK39沉默序列：

si-circSTK39正义链(Sence):CAAAAAGGCAGUGGAGCUATT，

si-circSTK39反义链(Antisense):UAGCUCCACUGCCUUUUUGTT。

其余试剂同实施例2。

2.方法

2.1CCK8增殖实验

同实施例2。

2.2EDU实验

同实施例2。

2.3Transwell实验

同实施例2。

2.4细胞划痕实验

同实施例2。

3.结果

3.1circSTK39对人主动脉平滑肌细胞增殖能力的影响

为了验证circSTK39是否影响人主动脉平滑肌细胞增殖能力，本发明通过CCK8增值实验和EDU实验检测了si-RNA转染细胞后的增殖情况，发现circSTK39沉默组细胞增殖受到明显抑制(图5)，提示circSTK39具有促进人主动脉平滑肌细胞增殖的能力。

3.2 circSTK39对人主动脉平滑肌细胞迁移能力的影响

为了验证circSTK39是否影响人主动脉平滑肌细胞迁移能力，本发明通过transwell和细胞划痕实验检测了si-RNA转染细胞48小时后的细胞迁移能力的变化，发现circSTK39沉默组细胞的迁移水平明显受到抑制(图6)，提示circST K39具有促进人主动脉平滑肌细胞迁移的能力。

实施例4：circSTK39对小鼠动脉粥样硬化进展的影响

1.材料

1.1动物

本发明的ApoE^-/-小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在小鼠高脂12周时，小鼠分组：生理盐水组、空载体(AAV-NC)或携带sh-circSTK39的腺相关病毒2/9(AAV-sh-circSTK39)、过表达载体NC(AAV9-oe-nc)及过表达circSTK39(AAV9-oe-circSTK39)组。通过尾静脉注射到小鼠体内，小鼠22周龄时取材主动脉分析circSTK39对动脉粥样硬化进展的影响。实验动物的使用得到了哈尔滨医科大学伦理委员会的批准。

AAV-sh-circSTK39中所含有的sh-circSTK39序列为：

上游序列:

gatccGCCAAGAAGGCAGCGGAGCATTCAAGAGATGCTCCGCTGCCTTCTTGGTTTTTTA

下游序列:

cgcgtAAAAAACCAAGAAGGCAGCGGAGCATCTCTTGAATGCTCCGCTGCCTTCTTGGCG

AAV9-oe-circSTK39中所含有的circSTK39基因序列为SEQ ID NO.1所示。

1.2试剂

高脂饲料(猪油10％、奶粉4％、胆固醇2％、胆酸钠0.5％)购自于南京森堡生物制品公司，改良油红O染色液购自北京索莱宝有限公司。腺相关病毒由汉恒生物有限公司合成。

2.方法

2.1小鼠分组注射腺相关病毒

8周龄雄性ApoE^-/-小鼠被随机分为五组并给予高脂饮食，分别为：腺病毒空载体(AAV-NC)组、circSTK39沉默组(AAV-sh-circSTK39)、过表达载体NC(AAV9-oe-nc)组及过表达circSTK39(AAV9-oe-circSTK39)组、生理盐水组(Saline组)，通过尾静脉注射到小鼠体内。从小鼠高脂12周开始尾静脉注射，每次注射100ul体量，为维持病毒浓度，4周后再次追加注射一次。小鼠高脂22周时给予麻醉，在体式显微镜下，分别取材小鼠心脏及小鼠主动脉。

2.2小鼠主动脉油红O染色

从甲醛溶液中取出标本，流水冲洗，剥去外膜，尽可能剔除多余脂肪组织。将处理好的血管置于预先配置好的油红O工作液中，室温染色10-20分钟(根据血管染色情况决定，着色明显后取出)，于75％酒精中脱去浮色，待透明血管部分无浮色时取出，体视显微镜下平铺整根血管，观察拍照。

3.结果

体内敲减circSTK39与对照组相比可显著促进小鼠动脉粥样硬化的进展，而过表达circSTK39可显著抑制AS的进展，说明circSTK39具有抑制动脉粥样硬化进展的作用，可成为治疗AS的新靶点(图7)。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> 一种环状非编码RNA circSTK39及其在预防和治疗动脉粥样硬化中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 881

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gcagtggagc tactgctgtg gttcaggcag ccctatgcaa acccaggcaa gaacgtgtag 60

caataaaacg gatcaacttg gaaaaatgcc agaccagtat ggatgaacta ttaaaagaaa 120

ttcaagccat gagtcagtgc agccatccca acgtagtgac ctattacacc tcttttgtgg 180

tcaaagatga actttggctg gtcatgaaat tactaagtgg aggttcaatg ttggatatca 240

taaaatacat tgtcaaccga ggagaacaca agaatggagt tctggaagag gcaataatag 300

caacaattct taaagaggtt ttggaaggct tagactatct acacagaaac ggtcagattc 360

acagggattt gaaagctggt aatattcttc tgggtgagga tggttcagta caaatagcag 420

attttggggt aagtgcgttc ctagcaacag ggggtgatgt tacccgaaat aaagtaagaa 480

aaacattcgt tggcacccca tgttggatgg ctcctgaagt catggaacag gtgagaggct 540

atgacttcaa ggctgacatg tggagttttg gaataactgc cattgaatta gcaacaggag 600

cagcgcctta tcacaaatat cctcccatga aagtgttaat gttgactttg caaaatgatc 660

cacccacttt ggaaacaggg gtagaggata aagaaatgat gaaaaagtac ggcaagtcct 720

ttagaaaatt actttcactg tgtcttcaga aagatccttc caaaaggccc acagcagcag 780

aacttttaaa atgcaaattc ttccagaaag ccaagaacag agagtacctg attgagaagc 840

tgcttacaag aacaccagac atagcccaaa gagccaaaaa g 881

<210> 2

<211> 881

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

gcagcggagc aactgcggtg gttcaggcag ccctatgcaa acccaggcaa gaacgcgtag 60

ccataaagcg gatcaacttg gaaaaatgcc agacgagtat ggatgaactc ctgaaagaaa 120

ttcaagccat gagccaatgc agccatccca acgtagtgac ttattacacc tcctttgtgg 180

tcaaagatga gctgtggctg gtcatgaaat tactaagtgg aggttccatg ttggatatca 240

tcaaatacat cgttaatcga ggagaacata aaaatggtgt cctagaagag gcgataattg 300

caacaattct taaggaggtt ttggaaggtt tagactatct gcacagaaac ggtcagatcc 360

atagggattt gaaagctgga aatattcttc tgggtgagga tggctcagta caaatagcag 420

attttggagt aagcgcattc ttagccacag ggggtgatgt tacacggaat aaagtcagaa 480

aaacatttgt tggtacccca tgttggatgg cccctgaagt catggaacag gtgagaggct 540

atgacttcaa ggctgatatg tggagttttg gaataactgc cattgaatta gcaaccggag 600

cagcgcctta ccacaaatac cctccaatga aagtgctaat gctgactttg caaaatgacc 660

cgcccacttt agaaactggt gtagaggata aagaaatgat gaaaaaatac ggcaagtcct 720

tcagaaagtt actgtcactg tgtcttcaga aagatccttc caaaaggccc acagcagcag 780

aacttttaaa atgcaagttc ttccagaaag ccaagaacag agagtacctg atcgagaagc 840

tgctgacaag aaccccagac atagcccaaa gagccaagaa g 881

Claims

1.一种环状非编码RNA，命名为circSTK39，其特征在于，所述的环状非编码RNAcircSTK39是由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA序列经转录后得到。

2.一种腺相关病毒载体，其特征在于，所述的腺相关病毒载体中含有编码权利要求1所述的环状非编码RNA的DNA序列。

3.环状非编码RNA circSTK39在制备预防和治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的环状非编码RNA circSTK39是由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA序列经转录后得到。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的环状非编码RNA circSTK39具有促进主动脉平滑肌细胞增殖及迁移的作用。

6.权利要求2所述的腺相关病毒载体在制备预防和治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的腺相关病毒载体具有促进主动脉平滑肌细胞增殖及迁移的作用。