CN109097358A

CN109097358A - 一种lncRNA在预防或治疗高血压中的应用

Info

Publication number: CN109097358A
Application number: CN201710999118.3A
Authority: CN
Inventors: 蔡军; 耿彬; 崔庆华; 金翎; 林宪娟
Original assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2017-10-24
Filing date: 2017-10-24
Publication date: 2018-12-28
Anticipated expiration: 2037-10-24
Also published as: CN109097358B

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA，所述其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，将其命名为AK098656。本发明还公开了所述lncRNA在制备预防、诊断或治疗高血压产品中的应用。进一步的，本发明还提供了一种AK098656抑制剂，所述抑制剂在制备预防或治疗高血压的药物组合物中的应用。本发明首次发现一种人类特有的在血管平滑肌细胞中优势表达的AK098656参与高血压的发生；本发明发现AK098656可以作为预防或治疗高血压提供新的分子靶点，指导相关药物的筛选和研发。

Description

一种lncRNA在预防或治疗高血压中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种lncRNA在预防或治疗高血压中的应用。

背景技术

高血压是已有10亿人受影响的全球性的疾病。高血压是心血管疾病最重要的危险因素，从115/75mmHg开始，随着血压的升高，心血管疾病发病风险也相应增加。高血压是多种心脑血管疾病的重要病因、危险因素和主要的死亡原因之一，其发病机制十分复杂。

lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，于2002年被 Okazaki Y等人在对小鼠全长cDNA文库的大规模测序过程中首次发现并命名。它的序列并没有特定的特征，有些具有poly(A)尾巴，有些没有poly(A) 尾巴，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式，与编码基因相比，lncRNA 表达量更低。目前并不能仅根据lncRNA的序列或者结构来推测它们的功能。

lncRNA具有低序列保守性、低表达水平、高种属及组织特异性的特点。研究发现，lncRNA的表达水平明显低于编码蛋白质的基因，但并不影响 lncRNA功能的发挥。相对于mRNA的广泛表达，lncRNA的表达具有比较高的组织或细胞特异性，而且它们的表达可以是高度的环境和时间依赖性。 lncRNA可广泛分布于各个亚细胞结构中，在细胞质与细胞核中均有表达，其中分布于细胞核中的lncRNA最多。位于细胞核内的某些lncRNA可以与 PcGs相互作用启动和维持染色质表观遗传学修饰(当然具体机制会各不相同)。有的lncRNA是亚细胞结构的重要组成部分，如NEAT1RNA。此外，需要说明的是，lncRNA能以稳定的形式存在于循环血浆、血液以及尿液中。

lncRNA已被发现和多种生物途径和疾病相关，是近年来的研究热点，但在高血压领域的报道是较为缺乏的。lncRNA可以作为各种细胞增殖、分化的新的调节剂，参与到心血管疾病的发病机制中。高血压发病机制涉及多种因素，包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统，血管平滑肌和血管内皮功能障碍，以及受损的血小板功能和肾相关因素。lncRNA在高血压机制的研究中占有重要地位，从而为高血压提供新型治疗策略。并且关于lncRNAs如何调控高血压的发生与进展的具体机制很少有报道，尚不清楚。

发明内容

因此，本发明的目的是在于提供一种新的HASMC优势表达的lncRNA，AK098656，以及AK098656在制备预防、诊断或治疗高血压产品中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了一种lncRNA，所述lncRNA核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，将其命名为AK098656。

优选的，所述AK098656在人的HASMCs的细胞质中优势表达。

优选的，所述AK098656在高血压患者血液样本中呈高表达。

优选的，所述lncRNA在制备预防、诊断或治疗高血压产品中的应用；优选的，所述lncRNA为AK098656。

优选的，所述产品包括试剂、试剂盒或药物。

进一步地，本发明提供一种AK098656抑制剂，所述的抑制剂包括： AK098656核酸的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA以及AK098656的活性抑制剂。

优选的，所述抑制剂能抑制AK098656表达或活性。

优选的，所述活性抑制剂能与靶lncRNA相互作用，更具体地，与靶 lncRNA结合，通过形成结合体，lncRNA功能减少或被阻断。

优选的，所述抑制剂优选为siRNA，所述siRNA包括如SEQ ID NO:2 和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

进一步地，本发明还提供了所述的抑制剂在制备预防或治疗高血压的药物组合物中的应用。

优选的，所述抑制剂能抑制HASMCs合成表型增加；所述抑制剂通过促进HASMCs由合成表型向收缩表型转化治疗高血压。

优选的，所述HASMCs表型转换蛋白包括MYH11和FN1；所述MYH11 是介导调节HASMCs收缩信号的SMC特异性基因，FN1是ECM调节 HASMCs粘附、机械传导、收缩信号和僵硬度的必不可少的蛋白。

优选的，所述MYH11的抗体和FN1的抗体能与AK098656有效结合，从而pull-downAK098656的RNA。

本发明所述的AK098656与细胞分化、细胞运动、高血压相关疾病等信号通路相关，所述信号通路都涉及MYH11/FN1功能性紊乱。

优选的，所述抑制剂通过抑制由溶酶体路径介导的部分MYH11/FN1降解治疗高血压。

本发明AK098656可能作为脚手架拉动PSMD11(26S蛋白酶体非ATP 酶调节亚基11)靠近MYH11，因此加速MYH11的降解，并且可能通过增加收缩蛋白MYH11的降解促进HASMCs的表型转换。

进一步地，本发明提供一种转基因大鼠模型在高血压发病机制的研究模型或治疗高血压药物的筛选或研发模型中应用，所述转基因大鼠模型是通过pCDNA3.1-AK098656表达载体构建的。

进一步地，本发明还提供一种用于辅助诊断高血压的试剂盒，所述试剂盒包含检测AK098656的表达水平的工具，以及如何使用所述试剂盒的说明。

优选的，所述试剂盒能够通过检测血液样本中的AK098656的表达水平来诊断患者是否患有高血压；所述AK098656在高血压患者血液样本中呈高表达。

关于如何使用试剂盒的说明书优选告知高表达水平的AK098656预示患有高血压。

检测AK098656表达水平的工具包括基因芯片、测序、实时定量PCR，优选的为实时定量PCR。

优选的，所述工具包括用于特异性检测AK098656表达水平的引物对，所述引物对序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；以及包括与所述引物配合使用的探针，所述探针为SEQ ID NO:6。

本发明有益效果如下：

(1)本发明首次发现一种人类特有在血管平滑肌细胞中优势表达的 lncRNA，AK098656。

(2)本发明发现AK098656可以作为核酸支架介导细胞骨架蛋白 MYH11和FN1的稳定性，诱导HASMCs分化，进而导致阻力血管重构和血压升高。

(3)本发明首次发现可以直接促使高血压升高的人源lncRNA。 AK098656转基因大鼠模型与原发性高血压患者早期病理过程相似，这为高血压的发病机制及药物治疗提供了一个新的研究工具。

(4)本发明发现AK098656可以作为预防或治疗高血压提供新的分子靶点，指导相关药物的筛选和研发。

附图说明

图1 AK098656在高血压病人与血压正常者中的表达；

图2 AK098656在不同人的细胞系中的表达；

图3 RNAscope显示AK098656在细胞中的定位；

图4 AK098656在HASMCs中的亚细胞定位；

图5 EdU增殖检测实验；

图6与细胞增殖相关的蛋白表达水平变化；

图7 Transwell迁移实验；

图8 HASMCs细胞划痕实验；

图9与增值、迁移相关的蛋白表达水平；

图10 ChIRP pull-down与AK098656相互作用的蛋白的SDS-PAGE银染；

图11(A)ChIRP方法pull-down与AK098656相互结合蛋白Western Blot 检测结果；(B)RIP检测MYH11-AK098656和FN1-AK098656的相互作用；

图12 MYH11/FN1的蛋白表达水平；

图13给以H₂O₂刺激不同时间，MYH11/FN1不同程度的降解；

图14溶酶体活性抑制剂氯喹能够阻断MYH11/FN1的降解；

图15 AK098656对MYH11/FN1的泛素化的影响；

图16 Co-IP检测AK098656过表达后HASMCs中PSMD11-MYH11相互作用；

图17 ChIRP方法检测AK098656与PSMD11的结合；

图18 AK098656在TgAK098656大鼠和WT大鼠中的表达；

图19 TgAK098656出现自发性发展的高血压；

图20遥测监测12周TgAK098656大鼠和WT大鼠24小时血压；

图21 TgAK098656大鼠和WT大鼠中相关蛋白表达水平；

图22左肾动脉超声图像；

图23 LRA和SMA血管平滑肌增厚程度；

图24 TgAK098656大鼠和WT大鼠心脏功能相关数据。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社， 2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

本发明所用的试剂主要包括以下：

1、实验细胞

HASMCs(人主动脉平滑肌细胞)，HUVECs(人脐静脉内皮细胞)和 HAVECs(人动脉血管内皮细胞)均购买于SciencCell实验室。Hela(人宫颈癌细胞)、BCG823(人胃癌细胞)、A549(人肺腺癌细胞)、PANC-1 (人胰腺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、BPH(人前列腺增生细胞)、 H1299(人肺腺癌细胞)、HCT-116(人结肠癌细胞)、293T(人肾上皮细胞系)、SW-480(人结肠癌细胞)和CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞购买自中国医学科学院北京协和医学院细胞资源中心。HASMCs细胞所用培养基为SMC培养基。HUVECs细胞和HAVECs细胞培养于ECM培养基。其他细胞培养于高糖培养基DMEM，补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素。

2、细胞培养及细胞实验相关试剂

SMC培养基购买于北京裕恒丰科技有限公司，补充有2％胎牛血清(FBS， cat#0010)，1％平滑肌细胞生长添加物(cat#1152)和1％青霉素/链霉素(P/S) 溶液(cat#0503)。

ECM培养基购买于北京裕恒丰科技有限公司，补充有5％FBS(cat #0010)，1％内皮细胞生长添加物(cat#1152)和1％P/S溶液(cat#0503)。 DMEM高糖培养基、Hepes、胰蛋白酶均购自美国Sigma公司。胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)购自美国Hyclone公司。青霉素、链霉素购自华北制药股份有限公司。Neofect^TM DNA转染试剂购自零客创智(北京)生物科技有限公司。放线菌酮(cat#C8030)购自LIFEN SCIENCE公司。血小板源生长因子(PDGF)货号为100-14B。血管紧张素II(AngII)(cat#4474913)购自西亚试剂。

3、抗体

鼠抗Actin、PCNA(sc7907)、T-ERK(sc93)、ubiquitination(sc8017)、 β肌动蛋白(sc47778)均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。P-ERK (4376)购自美国CellSignaling Technology公司；collagen I(ZA0616)购自北京中杉金桥生物技术公司；α-SMA(BM0002)、OPN(BS1264)购自武汉博士德生物公司；MYH11(ab53219)、FN1(ab2413)、PSMD11(Ab99413) 购自美国Abcam公司。辣根过氧化酶标记的驴抗兔二抗、驴抗鼠二抗和驴抗兔FITC-偶联荧光二抗购自美国Jackson Immuno Research Laboratories。

4、其它材料和化学试剂

PCR引物及探针设计合成均由北京奥科生物技术公司提供；SiRNA由广州锐博公司合成；腺病毒由山东维真公司包装；大鼠饲料购自北京科澳协力饲料有限公司；96孔酶标板、96孔costar荧光酶标板、各种培养皿、离心管均购自美国Corning公司；Transwell迁移实验用24孔板购自美国Coatar公司；硝酸纤维素膜(nitrocellulose filtermembrane,NC膜)购自美国Millipore公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；CO₂、液氮购自北京大学医学部试剂采购处；Dynabeads，磁珠分离器(bead separations)购自美国Invitrogen byLife Technologies公司；EZ-Link HPDP-Biotin购自美国Thermo scientific公司；Protein A Resin购自北京全式金公司；X光胶片、显影粉、定影粉、Tris-base、甘氨酸、脱脂奶粉、RIPA裂解液均购自北京普利莱基因技术有限公司；超敏化学发光检测试剂盒(ECL)、BCA蛋白定量试剂盒、均购自北京普利莱基因技术有限公司。

本发明所述HASMCs细胞有两种表型即收缩表型和合成表型。且不同于其它高分化细胞，HASMCs具有高度可塑性。正常的血管中膜中HASMCs 是一种高分化的细胞，主要起维持血管形态以及收缩血管的作用，具有低增殖、低迁移、低蛋白分泌的特征；当血管病变时，HASMCs可以去分化成为未分化的细胞，细胞收缩性能下降，表现出高增值、高迁移、高蛋白分泌等特征。

实施例1 AK098656在高血压病人中表达上调

1、样品收集

选择来自中国北方的15例高血压病人和与其匹配的15例健康对照，以及来自南方地区的15例高血压病人和与其相匹配的15例健康对照。北方研究对象从2013年6月至2014年8月由首都医科大学朝阳医院心内科招募，南方研究对象由温州医科大学第一附属医院招募。所有对照在性别和年龄方面匹配，是非吸烟者，并且没有其他临床可检测的心血管疾病因素。收集所有参与者的外周血样品，同时，记录、整理参与者的基本信息如表1所示。其中高血压的诊断标准及控制标准参照2010年《中国高血压防治指南》，所有程序均按照当地医院伦理审查委员会批准的方案进行，并从所有参与者获得知情同意书。

表1 30例高血压病人与30例正常血压人群的基本信息

注：SBP:收缩压，DBP:舒张压，BMI:身体质量指数，FBG:空腹血糖，TG:甘油三酯，LDL: 低密度脂蛋白，HDL:高密度脂蛋白，CHO:胆固醇。

2、lncRNA芯片和验证

使用Qiagen RNeasy Lipid Tissue Kit(Qiagen，Hilden，Germany)提取人血浆的总RNA；通过使用NanoDrop ND-1000对来自每个样品的总RNA 进行定量，并通过标准变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性；利用人lncRNA Array v2.0(8×60K，Arraystar)分析人血浆lncRNA基因芯片；应用GeneSpring GX v12.0(Agilent Technologies)软件进行分子标准化和数据处理。在原始数据的分位数归一化之后，将至少1个样品中的lncRNA标记为存在或边缘的(“All Targets Value”)并选择用于进一步的数据分析。对于中国北方数据集，北方3个人血混合成为一个样本，计有10个样本(5个高血压病人样本与5个血压正常对照样本)，因此进行t检验以及倍数变化的分析，以进行更严格的筛选和缩小候选的lncRNAs范围。lncRNAs p≤0.05(t检验)和表达倍数变化≥1.5被认为是显著基因。对于南方地区的数据集，南方15个人血混合成为一个样本，计仅有2个样本(1个高血压病人样本与1个血压正常对照样本)，不能使用统计检验(例如t检验)进行比较。因此，表达倍数变化≥1.5的lncRNA被认为是显著基因。此外，在两个数据集中的重叠的有显著变化的lncRNA被认为是最终失调的lncRNA。

从上述lncRNA芯片中找到了存在表达差异的lncRNA，AK098656，如 SEQ ID NO：1所示，本发明通过以下实施例采用实时定量PCR(qRT-PCR) 作进一步验证。使用QiagenRNeasy Lipid Tissue Kit(Qiagen，Hilden， Germany)提取人血浆的总RNA；用RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit (美国Thermo scientific公司)进行逆转录；采用RR390A Premix Ex Taq (Probe qPCR)TAKARA进行实时定量PCR，具体步骤参照说明书；其中，所述引物和探针由北京奥科生物技术公司设计合成。所述特异性扩增 AK098656引物及探针为：

正向引物:5‘-CCTCATTTGCTGGCACCTG-3’(SEQ ID NO:4)；

反向引物:5‘-GGGAGGCAAGGTAGAAGGGA-3’(SEQ ID NO:5)；

探针:5’fam+CCATTGTCACTGTTGCAATGTTGCAATGATATCAACA+3’BHQ 1(SEQ ID NO:6)；

所述内参18S-human：

正向引物:5‘-AAACGGCTACCACATCCA-3’(SEQ ID NO:7)；

反向引物:5‘-CACCAGACTTGCCCCTCCA-3’(SEQ ID NO:8)；

探针:5’fam+AGCAGGCGCGCAAATTACC+3’BHQ1(SEQ ID NO:9)；

最后使用MxPro Mx3000软件进行分析，结果以均值±标准误表示。两组数据间采用student's t test分析，多组结果比较采用One-way ANOVA Tukey's test进行分析，线性回归分析采用Spearman correlation calculation分析。p< 0.05为差异有显著性。

结果发现AK098656的高血压组与正常对照组差异表达明显，组内标准差小，所以，将AK098656在第二批参与者中进行验证。

本发明再次招募来自中国北方的188例(包括100例高血压病人与88 例血压正常的健康对照者)参与者和中国南方的91例(68例高血压病人与 23例血压正常的健康对照者)参与者，记录其基本信息如表2所示，收集所有参与者的外周血样品。通过qRT-PCR检测，结果如图1所示(Hypertension 表示高血压组；Normotension表示正常对照)，进一步确认AK098656在高血压病人中表达上调。

表2中国北方地区和南方地区高血压病人与正常血压人群基本信息

实施例2 AK098656在HASMCs细胞中定位

为了测定不同细胞中AK098656丰度和细胞表达特异性，本发明通过 RT-PCR分析AK098656在13种不同的细胞系中的表达，其包括HASMCs、 HUVECs、HAVECs、Hela、BCG823、A549、PANC-1、HepG2、BPH、H1299、 HCT-116、293T和SW-480细胞系。

所述的RT-PCR分析过程同实施例1，结果如图2所示，AK098656在 HASMC中优势表达。

进一步地，本发明还通过Northern Blot分析证实AK098656确实在 HASMCs中表达；进而通过体外转录翻译实验确认AK098656是lncRNA。所述Northern Blot根据DIGNorthern Starter Kit(Roche)操作；体外转录翻译实验按照T7 Quick CoupledTranscription/Translation System (Promega,WI,USA)试剂盒操作。

本发明通过RNAscope实验表明AK098656在HASMCs的细胞质中的表达明显高于细胞核，如图3B；在CHO染色未见AK098656的表达，如图3C 所示；而CHO细胞转染AK098656质粒后，胞质中可见AK098656表达，如图3D所示。所述RNAscope实验方法参照RNAScope预处理试剂盒及检测试剂盒(美国Advanced Cell Diagnostics公司)说明书。

通过荧光原位杂交技术(FISH)验证AK098656在三种人血管相关细胞 HASMC、HUVEC、HAVEC中的表达，结果显示，AK098656在HASMCs 细胞质与细胞核中都有表达，而在HAVECs和HUVECs中表达少或不表达，同时也证实了AK098656在HASMCs中优势表达。所述FISH实验步骤如下：

1)准备探针(所述探针为生物素标记探针，如表3所示)

a.0.1μg probe加10μg鱼精蛋白DNA混合后，通过DNA提取的方法提取，空气干燥。b.加5μl去离子甲酰胺重悬后，75℃变性7分钟。c.加5μl2× 变性反应液d.冰上30分钟。

2)新鲜PBS轻柔的冲洗细胞。

3)过滤除菌的3％多聚甲醛室温固定10分钟，PBS清洗2次，每次5 分钟。

4)渗透液(0.5％Triton-100in PBS)冰上透膜5～7分钟，70％乙醇清洗2 次每次5分钟。

5)依次经过80％、98％、100％乙醇，每次3分钟，进行脱水过程，空气干燥。

6)于载玻片上滴加10μl已经处理好的探针，将玻片细胞面朝下放于探针上，在避光、湿润(50％甲酰胺、2×SSC)环境中37℃水浴过夜。

7)用镊子小心移除玻片，50％甲酰胺、2×SSC在42℃清洗3次，每次 5分钟。

8)2×SSC在42℃清洗3次，每次5分钟。

9)Biotin-probe

a.4×SSC、0.1％Tween20、5％BSA组成封闭液，室温封闭30分钟。b. 荧光标记的streptavidin，1：400稀释于封闭液中，避光、湿润环境下，室温孵育40～60分钟。或4℃过夜孵育。

10)2×SSC清洗3次

11)DAPI或Hoechst复染核，2×SSC清洗2次，每次5分钟。

12)抗荧光淬灭封片剂封片，镜下观察并照相

同时，采用胞核胞浆分离的方法，分别提取RNA(Trizol RNA抽提试剂)，使用qRT-PCR的方法进行分析，进一步确认AK098656在HASMCs中的亚细胞定位，如图4所示。由此发现AK098656主要定位于HASMCs的细胞质中。

实施例3 AK098656促进平滑肌细胞合成表型增加

1.AK098656对HASMCs增殖能力的影响

本发明通过腺病毒介导AK098656过表达(方法参照《李燕.过表达 ANT1基因诱导血管平滑肌细胞凋亡与Bax/Bcl-2表达的关系研究[D].第三军医大学,2011.》)和siRNA敲低或沉默AK098656的方法(方法参照《宋剑.应用siRNA敲低MMP-9基因表达后对人U251胶质瘤细胞增殖和侵袭作用的体内外研究[D].河北医科大学,2008.》)进行实验，并进一步探讨 AK098656是否对平滑肌细胞的表型调节起作用。所述siRNA包括如SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示的核苷酸序列。

1.1 EdU细胞增殖实验：

采用EdU掺入实验检测AK098656对HASMCs增殖能力的影响。所述方法参照EdU细胞增殖检测试剂盒(广州锐博生物科技有限公司)说明书。

结果如图5所示，腺病毒过表达AK098656后，分别给予胎牛血清(FBS)、血管紧张素II(AngII)、血小板源生长因子(PDGF)的刺激，发现过表达 AK098656促进HASMCs增殖。相反地，siRNA敲低AK098656能抑制由FBS、 AngII和PDGF刺激的增殖。

1.2 Western Blot检测

Western Blot检测细胞增殖分子marker，包括增殖细胞核抗原(proliferatingcell nuclear antigen，PCNA)和磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylatedextracellular signal-regulated kinase1/2，p-ERK1/2)。所述 WesternBlot检测方法参考文献《马骋,高岩,苟三怀,等.大鼠胫骨骨折愈合过程中Ⅰ,Ⅱ型胶原蛋白的表达:失神经状态下Western blot方法测定[J].中国组织工程研究,2008,12(50):9978-9981.》。

结果如图6所示，转染AK098656的siRNA后，发现PCNA和p-ERK1/2 的蛋白表达下降，而腺病毒过表达AK098656则出现相反的变化。

上述实验结果均表明AK098656促进HASMCs的增殖。

2.AK098656对HASMCs迁移功能的影响

采用Boyden chambertranswell assays和细胞划痕实验检测AK098656对 HASMCs迁移功能的影响。

2.1 Transwell迁移实验：

1)准备细胞

a.准备一个六孔板细胞，进行预处理后，换无血清培养基培养过夜(至少10小时)；b.用0.025％的胰酶打断细胞间的链接，并用无血清培养基终止消化过程，进行细胞计数，调整细胞悬液总体积使每mL培养基细胞数目大致相同。

2)Transwell24孔板种细胞

a.Transwell板下方小孔每孔加入800μL液体，其中添加不同的趋化因子；

b.Transwell板上方小室内加入等体积等细胞数的细胞悬液；c.二氧化碳孵育箱培养12～24小时。

3)染色

a.4％多聚甲醛溶液室温固定15～20分钟，PBS清洗2～3次；b.1％龙胆紫染液(溶于PBS)染色约30分钟，PBS清洗；c.用棉签轻轻擦拭小室内面，注意勿将小室底部弄变形，PBS清洗。

4)在载玻片上滴加PBS，将小室置于PBS上，镜下观察并拍照。

结果如图7所示，在HASMCs中分别过表达或敲低AK098656，给以 AngII和PDGF诱导细胞迁移，可观察到过表达AK098656的HASMCs迁移细胞增多，而敲低AK098656的细胞迁移数目较少。

2.2细胞划痕实验：

1)准备12孔板，在孔板底部用黑色笔画直线，以备划痕后拍照定位。

2)进行预处理后的细胞，待细胞长满后，做与已画好的直线相垂直的划痕。PBS清洗，加适量培养基。

3)镜下观察并拍照，时间点为0、6、12、24小时。

结果如图8所示，细胞划痕实验中出现相似结果，过表达AK098656的 HASMCs在FBS、AngII或PDGF刺激下，孔板中间划痕相比对照组明显变窄。

上述实验结果均表明AK098656对FBS、AngII或PDGF诱导的HASMCs 迁移起积极作用。

3.AK098656对细胞的合成表型相关蛋白的影响

肌动蛋白α(αsmooth muscle actin，α-SMA)是一种与细胞收缩有关的蛋白，而骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和I型胶原蛋白(collagen I)属于细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)蛋白，这些蛋白都与细胞的合成表型以及HASMCs的增值和迁移相关。

Western Blot检测发现过表达AK098656降低了收缩蛋白α-SMA表达，但增加了细胞外基质蛋白(OPN和collagen I)的表达；敲低AK098656则出现相反的蛋白表达水平变化，如图9所示。而且合成表型的本质特征是 HASMCs增殖和迁移。所述Western Blot检测方法同1.2所示。

上述实验结果显示AK098656能促进HASMCs由收缩表型向合成表型转化。反之，敲低AK098656使HASMCs向收缩表型转换。

实施例4 AK098656通过直接结合降低收缩蛋白MYH11和FN1

AK098656位于人第16号染色体(负链，GRCh38/hg38)上，并且与编码蛋白质的基因都没有重叠。qRT-PCR检测AK098656上游基因CDYL (20kb)和下游基因DYNLBR2(30kb)的表达，发现过表达或敲低AK098656，其邻近基因的表达未见统计学改变。结果表明AK098656对相邻基因没有调控功能。

本发明用全基因组芯片测定方法研究AK098656过表达或敲低后， HASMCs全基因的表达谱。首先，将过表达或敲低AK098656的HASMCs 的总RNA逆转录为cDNA，并与全人基因组芯片4X44K(AMADID 014850， Aglient Technologies，CA，USA)杂交。将p<0.01和表达倍数变化>2.0的基因认定为明显失调；然后，与对照组相比，过表达AK098656的HASMCs 中检测到1490个转录子表达升高和946个转录子表达下调(倍数变化≥2)；敲低AK098656的HASMCs中检测到1418上调和1610个下调的转录子。并通过IPA软件(http://www.ingenuity.com/products/ipa/)分析表明AK098656 与细胞分化、细胞运动、高血压相关疾病和肾素-血管紧张素信号路径相关。所述路径都涉及高血压和MYH11/FN1功能紊乱。

本发明通过微阵列分析表明AK098656的功能与HASMCs分化和高血压发生有关。

实施例4中发现AK098656定位于细胞质中，其是否能够通过与胞质中的蛋白相互作用发挥功能。为此，本发明采用ChIRP(Chromatin isolation by RNA purification)的方法pull-down HASMCs中的蛋白，如图10所示(其中 FP:非生物素标记的探针，BP生物素标记的探针)。所述ChIRP方法步骤如下：

1)取20μL磁珠于一EP管中，用PBS清洗2次，备用。2)将生物素标记的探针和非生物素标记的探针与磁珠结合，37℃1小时。或4℃过夜。3)准备 15cm皿的细胞，PBS清洗2次；4％多聚甲醛固定20分钟，PBS清洗2次。 4)在15cm皿中加入约2ml PBS(以覆盖细胞为宜)，紫外交联2分钟，400mJ/cm ²，PBS清洗2次。5)用细胞刮刮除细胞，并移至新的EP管中，超声裂解。6) 将裂解物离心取上清，加入第2)步已准备好的磁珠中，37℃1～2小时。或 4℃过夜7)用生理盐水清洗磁珠，动作轻柔。8)加入适量1×上样缓冲液，95℃ 水浴煮样品3次，每次5分钟。9)样品用于Western Blot。所用探针如表3 所示。

表3探针序列

并随后进行质谱分析，结果发现176种蛋白与AK098656相互作用，其中包括肌球蛋白、肌动蛋白以及与肌动蛋白相结合的蛋白。

根据对与AK098656相互作用蛋白的蛋白组学分析，选择更靠近基因连接功能中心的肌球重链11(myosin heavy chain-11，MYH11)和纤连蛋白 (fibronectin-1，FN1)作为靶蛋白。

为了验证AK098656直接与MYH11和FN1相结合，采用ChIRP方法 pull-down蛋白，Western Blot证实AK098656可以拉下MYH11和FN1，如图11A所示(FOP非生物素标记的探针，BOP生物素标记的探针)。相应地，通过蛋白pull-down RNA实验，以SNRNP70作为阴性对照，RNA免疫共沉淀(RIP)结果也表明MYH11抗体和FN1抗体能与AK098656有效结合，从而pull-down AK098656的RNA，如图11B所示。所述RNA免疫共沉淀实验参照文献《KhalilaAM,Guttman M,Huarte M,Garbera M,Rajd A,Morales DR,Thomas K,Pressera A,Bernstein BE,Oudenaarden AV,Regeva A,Lander ES,and Rinn JL(2009).Many humanlarge intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexesand affect gene expression.PNAS 106, 11667–72.》。在同一切片中AK098656的FISH实验与MYH11/FN1的免疫荧光实验证实AK098656与MYH11/FN1在细胞质中共定位。

所述FISH实验同实施例2所示，所述免疫荧光实验如下所示：

1)冰冻切片在室温复温，PBS洗3次，每次5分钟。石蜡切片由二甲苯至无水乙醇再至不同浓度的乙醇溶液，进行入水过程。2)滴加透膜液，室温孵育10分钟。3)移去透膜液，PBS洗3次，滴加封闭液，室温封闭10分钟。 4)移去封闭液，在载玻片上滴加一抗稀释液，4℃湿盒中孵育过夜(12小时)。 5)移去一抗，PBS洗3次，滴加二抗稀释液，室温避光孵育1小时。6)移去二抗，PBS轻柔冲洗3次，用抗荧光淬灭封片剂及盖玻片封片，镜下观察并照相。

上述实验结果表明AK098656直接和与细胞运动相关的蛋白结合。

通过Western Blot发现敲低AK098656后，MYH11/FN1的表达水平升高；过表达AK098656后，MYH11/FN1表达水平降低(图12)。

蛋白合成减少、蛋白降解增多或转录减少都能促进蛋白表达下调。真核细胞内蛋白质降解的途径主要有溶酶体(lysosome)途径、泛素化(ubiquitin) 途径和胱天蛋白酶(caspase)途径，其中胱天蛋白酶途径是细胞凋亡的蛋白降解途径。放线菌素D抑制蛋白质生物合成后，过表达AK098656明显增加 H₂O₂诱导的HASMCs的MYH11/FN1蛋白降解，如图13所示。

溶酶体活性抑制剂氯喹处理HASMCs后，发现过表达AK098656促进 H₂O₂诱导的MYH11/FN1降解被有效阻断，如图14所示，而过表达AK098656 对MYH11/FN1的泛素化没有影响，如图15所示。这表明AK098656能够调节由溶酶体路径介导的部分MYH11/FN1降解。

质谱数据表明AK098656与26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11 (PSMD11)有直接的相互作用。据报道，PMSD11的升高能够增加蛋白酶体活性并且促进错误折叠的蛋白降解。

免疫共沉淀(Co-IP)实验表明HASMCs中PSMD11-MYH11存在相互作用，并且过表达AK098656后能够增加MYH11与PSMD11的相互作用，如图16所示，增加蛋白酶体活性而加速MYH11/FN1的降解速率。

ChIRP实验也验证了AK098656与PSMD11的相互作用如图17所示。

本实施例所述ChIRP和Western Blot方法步骤同上述实施例所示。所述 Co-IP方法如下：

1)准备好一个六孔板细胞。2)用PBS将处理好的细胞洗3次。3)六孔板没空加入200μl预冷的RIPA裂解液，用细胞刮将细胞从培养板上刮下来，将细胞裂解液放入EP管中，反复冻融3次，使细胞充分裂解。4)4℃12000g 离心10分钟，取上清至新的EP管中，加入20μlprotein A珠子，4℃轻摇30 分钟。此步骤可以去除细胞裂解液中与protein A结合的蛋白。5)4℃5000g 离心10分钟，取上清至新的EP管中，BCA法蛋白定量。6)将蛋白浓度调整为1mg/ml，取500μg蛋白至一个新的1.5mlEP管中，加入2μg抗体。同时设置阴性对照:取等量蛋白，加入2μg与抗体同种属的IgG。7)4℃轻摇2小时，使目的蛋白与抗体结合。8)2小时后加入20μlprotein A珠子，4℃轻摇过夜。 9)第二天，4℃5000g离心10分钟，弃上清，加入1mlRIPA裂解液漂洗珠子，4℃离心10分钟，弃上清，重复3次。10)留珠子体积约20μl，加入20μl2×上样缓冲液，95℃水浴煮样品3次，每次5分钟。11)样品用于Western Blot。

上述实验结果表明AK098656可能作为脚手架拉动PSMD11靠近 MYH11，因此加速MYH11的降解，并且可能通过增加收缩蛋白的降解促进 VSMCs的表型转换。

进一步地，本发明通过SYBRPremix Ex Taq(RR420A，TaKaRa)检测了AK098656过表达和敲低对MHY11/FN1转录水平的调节。所用引物如下：

FN1(Fibronectin)：

正向引物5‘-CCCAATTGAGTGCTTCATGCC-3’(SEQ ID NO:10)；

反向引物5‘-AACTCCCAGGGTGATGCTTG-3’(SEQ ID NO:11)；

MYH11(Myosinheavy chain 11)：

正向引物5‘-CTGGTGGACAAACTGCAAGC-3’(SEQ IDNO:12)；

反向引物5‘-TCTTTGGTCACCTTTCAGCAGT-3’(SEQ IDNO:13)。

与MYH11/FN1蛋白表达减少相一致，AK098656过表达也减少 MYH11/FN1的mRNA转录水平，但是敲低AK098656却能增加MYH11/FN1 的mRNA转录水平。沉默MYH11或FN1能明显增加AK098656的表达水平。

上述实验结果表明，过表达AK098656后MYH11/FN1蛋白表达减少，也可能是由于其转录减少；表明AK098656与MYH11/FN1mRAN之间存在负反馈调节。

实施例5 AK098656转基因大鼠发生自发性高血压并伴有血管重构

为了证实AK098656对HASMCs表型调节和体内高血压发病机制的影响，本发明通过将含有全长人类AK098656基因(AK098656)的 pCDNA3.1-AK098656载体显微注射到受精的Sprague-Dawley(SD)大鼠胚胎中来构建AK098656转基因(即Tg^AK098656)大鼠模型。在所述动物模型中的血浆和主动脉(尤其是主动脉的平滑肌细胞)中可以检测到AK098656的表达；同时取其它组织做qRT-PCR，分析数据发现在WT大鼠未检测到 AK098656表达，而Tg^AK098656大鼠中除主动脉的其它组织AK098656表达量低或没有表达，如图18所示。

大鼠性成熟后监测血压，我们发现与WT型大鼠相比，在Tg^AK098656在 10周龄出现自发性高血压，如图19所示。在9-12周龄的大鼠腹主动脉中植入植入子，遥测检测并记录清醒大鼠血压，在对Tg^AK098656大鼠进行24小时的观测周期中发现其血压升高，如图20所示。

Western Blot结果显示，相比WT型大鼠，Tg^AK098656大鼠胸主动脉、左肾动脉(LRA)和肠系膜上动脉(SMA)中MYH11、FN1和α-SMA表达水平降低，如图21所示，与细胞实验的结果相一致。

同样，免疫荧光(参考实施例4所示的免疫荧光实验方法)显示Tg^AK098656大鼠动脉壁中MYH11、FN1和α-SMA表达减少，而collagen I沉积增多。这与AngII诱导的高血压大鼠实验结果一致。

通过外周血管超声检查，发现Tg^AK098656大鼠LRA和SMA狭窄更加明显，如图22所示，这一结果与表型改变相一致。同时血管弹力蛋白1(elastin-1) 免疫荧光染色及H&E图像分析显示LRA和SMA管腔狭窄，中膜增厚，且中膜/管腔直径比值增大，如图23所示，提示存在血管重构。但是，主动脉和肠系膜上动脉的Myograph结果提示肠系膜上动脉和胸主动脉收缩舒张功能并未改变，其血管活性不受AK098656过表达的影响。在体内实验中，收缩蛋白表达下调，动脉狭窄，中膜增厚和中膜/管腔直径比值增大这些实验结果均表明AK098656在体内可调控VSMCs表型转换。

结合血压升高的表现，超声心动图以及心肌细胞的WGA染色，如图24 所示，提示Tg^AK098656大鼠出现轻微的心脏肥大，如左心室收缩期后壁增厚和左心室心肌细胞变大，但心脏泵功能未见改变如表4所示。这些在体数据表明AK098656对VSMC表型转换的影响诱导阻力血管狭窄，促进高血压的发生。

表4 13周龄WT大鼠和AK098656转基因大鼠的心功能相关数据

注：LVIDd:左心室舒张期内径；LVIDs:左心室收缩期内径；LVPWd:左心室后壁舒张末期厚度，LVPWs:左心室后壁收缩末期厚度；EF:心脏射血分数；FS:缩短分数， LVMASS:左心室心肌重量；LVVol-d:舒张末期左室容量，LV Vol-s:收缩末期左室重量

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院阜外医院

<120> 一种lncRNA在预防或治疗高血压中的应用

<130> p17133

<160> 72

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> AK098656

<400> 1

agtctagtct gtgacctgag ccatcatggt agggtgtcca gggtgagggg agggtggtgt 60

gaatccccag taatgcaggt cctttccagg ccaggcccct ggtccccagg agtgcgggga 120

tgcctgaggt ctactgctgc cttatccaga gctgccaccc ccggcgatga ctcagagttc 180

ctgtggcccc agcatcatcc ctccatccct ggctgtgagg caggagcaga gttgcagacc 240

tgagaggcct tgaatttgtt tgatatagga ctttgccacc agacaaagtg ctttgcctgt 300

gaggtctggc ttggcctggc ctctgagaaa gaacaaacac agacctcact ggaaggaacc 360

tggagaacgg gagaggagag gctgctgctg tctgccctcc cagcagcaga tataaagaca 420

atgggcttct aagtccccta gagtcccagc tgtgtaattt aaggcgagtt catctctcac 480

agcctcagtt tcctcatttg ctggcacctg tctttctcct tcatagccat tgtcactgtt 540

gcaatgatat caacaatgct tacatttcag atagatcccc agctgggttg aaaggaacgt 600

caagaccctt cctttcttat gacctatgta tcaactccct tctaccttgc ctccctccac 660

ttggagcgag ttctagttgg tgaaatgtag ccagaggttc ctggaaaggc tttccttctc 720

aagtaaagcc tggctcagag aaaaccactg gtctctttcc ttttcttcct cctgacatga 780

acatgggaca ggaaggagca tggagaagac aagaacaagg ctctcagaag gaaatggtgt 840

ggctggagcc atgagaactg gttgtggagg gggcaaatat aatttctgac ctacgtaatg 900

atgtatgcac aagaagcctc tcttgaatgt attaattcag taaacagtta tggagtcctt 960

acaatgtgct agtgggactt tgaagatgaa tccaaatttg gatcctggcc tggaaaggct 1020

caaagcccaa tatgggagtg attctgagca gaaacaacgg ggaacggatg tcttcattgt 1080

gactcagcga gcaaagagat ggagtctttt ccaagaagaa agtgggagat ttgggaccac 1140

tgacatattt ggcccactga ttccattccc ctagaccaac acgtgttcat caaattgcat 1200

cactcttatg gggaacttaa tgcaactccg gtgcccattg cattagtttt tgatgatgga 1260

attctctttg tgaacttgaa cttgaggggt ctggctaccc ctctgagact tcttttttga 1320

gataaaatca tataacat 1338

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

uccccaguaa ugcaggucct t 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaccugcau uacuggggat t 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctcatttgc tggcacctg 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggaggcaag gtagaaggga 20

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccattgtcac tgttgcaatg ttgcaatgat atcaaca 37

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaacggctac cacatcca 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caccagactt gcccctcca 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agcaggcgcg caaattacc 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cccaattgag tgcttcatgc c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aactcccagg gtgatgcttg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctggtggaca aactgcaagc 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tctttggtca cctttcagca gt 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctgagccatc atggtagggt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgtgaatccc cagtaatgca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggatgcctga ggtctactgc 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catcatccct ccatccctg 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gagttgcaga cctgagaggc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

accagacaaa gtgctttgcc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cctggcctct gagaaagaac 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cactggaagg aacctggaga 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccctcccagc agcagatata 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aagtccccta gagtcccagc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gcctcagttt cctcatttgc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

agccattgtc actgttgcaa 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

agatagatcc ccagctgggt 20

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gacccttcct ttcttatgac ct 22

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ctccacttgg agcgagttct 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tggaaaggct ttccttctca 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggctcagaga aaaccactgg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

caggaaggag catggagaag 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

agaaggaaat ggtgtggctg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgtggagggg gcaaatataa 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tgcacaagaa gcctctcttg 20

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tgtgctagtg ggactttgaa ga 22

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gaaaggctca aagcccaata 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tgggagtgat tctgagcaga 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tgactcagcg agcaaagaga 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tgacatattt ggcccactga 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cccctagacc aacacgtgtt 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

acttaatgca actccggtgc 20

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tgtgaacttg aacttgaggg g 21

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

acctgagcca tcatggtagg 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ggtggtgtga atccccagta 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ctgctgcctt atccagagct 20

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

cagcatcatc cctccatcc 19

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cctgagaggc cttgaatttg 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gccaccagac aaagtgcttt 20

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tggcctctga gaaagaacaa a 21

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tcactggaag gaacctggag 20

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ccctcccagc agcagatat 19

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

ccctagagtc ccagctgtgt 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

atttgctggc acctgtcttt 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gccattgtca ctgttgcaat 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

tcagatagat ccccagctgg 20

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

agacccttcc tttcttatga cc 22

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

tccacttgga gcgagttcta g 21

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

cctggaaagg ctttccttct 20

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

ggctcagaga aaaccactgg t 21

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

acaggaagga gcatggagaa 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

cagaaggaaa tggtgtggct 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

ttgtggaggg ggcaaatata 20

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

gcacaagaag cctctcttga a 21

<210> 64

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

caatgtgcta gtgggacttt ga 22

<210> 65

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

aaatttggat cctggcctg 19

<210> 66

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

tctgagcaga aacaacggg 19

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

gcgagcaaag agatggagtc 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

aaagtgggag atttgggacc 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

tccattcccc tagaccaaca 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

ggaacttaat gcaactccgg 20

<210> 71

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

tttgtgaact tgaacttgag gg 22

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

tggctacccc tctgagactt 20

Claims

1.一种lncRNA，其特征在于，所述lncRNA核苷酸序列为SEQ ID NO1所示，将其命名为AK098656。

2.如权利要求1所述lncRNA，其特征在于，所述AK098656在高血压患者血液样本中呈高表达。

3.权利要求1或2所述lncRNA在制备预防、诊断或治疗高血压产品中的应用。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述lncRNA与细胞分化、细胞运动、高血压相关疾病信号通路相关；所述信号通路都涉及MYH11/FN1功能性紊乱。

5.一种AK098656抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括：AK098656核酸的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA以及AK098656的活性抑制剂。

6.权利要求5所述抑制剂在制备预防或治疗高血压的药物组合物中的应用。

7.权利要求6所述应用，其特征在于，所述抑制剂通过促进HASMCs由合成表型向收缩表型转化治疗高血压。

8.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述HASMCs表型转换相关蛋白包括MYH11和FN1。

9.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述抑制剂通过抑制由溶酶体路径介导的部分MYH11/FN1降解治疗高血压。

10.一种转基因大鼠模型在高血压发病机制的研究模型或治疗高血压药物的筛选或研发模型中应用，所述转基因大鼠模型是通过pCDNA3.1-AK098656表达载体构建的。

11.一种用于辅助诊断高血压的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测AK098656的表达水平的工具，以及如何使用所述试剂盒的说明。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述工具包括用于特异性检测AK098656表达水平的引物对，所述引物对序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；以及包括与所述引物组配合使用的探针，所述探针为SEQ ID NO:6。