CN115287359B - Mcoln2在结直肠癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了MCOLN2在结直肠癌中的应用。利用肿瘤公共数据库进行生物信息学分析和临床组织样本表达检测发现，相较于正常组织，MCOLN2的表达在结直肠肿瘤组织中显著降低。并且在结直肠癌细胞中过表达MCOLN2可以显著抑制结直肠癌细胞的增殖能力。以上结果提示MCOLN2低表达与结直肠癌的进展密切相关，并可能在其中扮演关键角色。

Description

MCOLN2在结直肠癌中的应用
技术领域
本发明涉及MCOLN2在结直肠癌中的应用。
背景技术
结直肠癌(colorectalcancer,CRC)是最常见的人类恶性肿瘤之一，随着我国逐步进入人口老龄化，CRC的发病率逐年增加，其致死率也高居肿瘤致死率的前五位。虽然CRC疾病研究取得了不少成果，但是多数患者就诊时已为晚期，丧失了治愈的最佳时机。因此深入研究发病机制、探寻新的治疗靶点并实施个体化治疗是CRC研究中的新挑战，也是制定CRC精准治疗策略的关键。
MCOLN家族与肿瘤发生发展密切相关。与MCOLN1和MCOLN3不同，目前的研究发现MCOLN2大部分表达在淋巴细胞和骨髓细胞中，主要参与病毒或者细菌侵入体内所引起的先天免疫反应。有文献报道，敲低MCOLN2的表达，可以抑制AKT-ERK1/2磷酸化所诱导的神经胶质瘤细胞凋亡，进而抑制神经胶质瘤的生长。然而，MCOLN家族在结直肠癌中的研究，至今未见报道。
发明内容
我们前期研究发现溶酶体离子通道蛋白MCOLN2在结直肠癌中表达降低，且过表达MCOLN2可以显著抑制结直肠癌细胞的细胞活力和克隆形成能力；同时转录组测序发现ERstress信号通路与MCOLN2密切相关，上调MCOLN2可以有效抑制ER stress信号通路相关分子ATF4的蛋白表达。此外，在MCOLN2过表达的细胞系中过表达ATF4可以挽救MCOLN2所引起的细胞活力降低。据此，我们提出假说MCOLN2通过抑制ATF4的表达，调控ER stress信号通路，进而抑制结直肠癌细胞的增殖。我们将综合应用质谱分析、免疫共沉淀等实验方法，在细胞、实验动物以及临床标本等层面，多维度探讨MCOLN2抑制结直肠癌进展的分子机制，为结直肠癌诊疗提供新的靶标和思路。
在本项目中，我们利用结直肠癌公共数据库分析MCOLN2表达与患者预后、以及临床病理参数的相关性。进一步在细胞水平探索敲低或者过表达MCOLN2对结直肠癌细胞的活力、细胞周期、凋亡以及对下游信号通路的调控，及介导结直肠癌进展的具体机制。最后拟利用裸鼠皮下成瘤模型，探索和确证MCOLN2抑制结直肠癌增殖的分子机制。本项目的顺利实施，为探索结直肠癌临床治疗策略提供新的思路和靶点。
结直肠癌公共数据库生物信息学分析发现，相较于正常组织，MCOLN2的表达在结直肠肿瘤组织中显著降低，此结果在12对结直肠癌和正常结直肠组织中得到验证。且在结直肠癌细胞中过表达MCOLN2可以显著抑制结直肠癌细胞株的增殖能力。以上结果提示MCOLN2低表达与结直肠癌的进展密切相关，并可能在其中可能扮演关键角色。
附图说明
图1为qPCR检测MCOLN2在12对配对结直肠肿瘤和正常组织中mRNA的表达水平图；
图2为qPCR检测MCOLN2在结直肠癌细胞系中mRNA的表达水平图；
图3：A.westernblot检测SW480过表达MCOLN2质粒后MCOLN2蛋白表达水平；B.SW480过表达MCOLN2后克隆形成能力；C.CCK8检测SW480过表达MCOLN2后细胞活力；D.westernblot检测在RKO细胞中siRNA敲低MCOLN2后MCOLN2蛋白表达水平；E.CCK8检测RKO敲低MCOLN2后细胞活力；F.RKO敲低MCOLN2后克隆形成能力；
图4：A.KEGG通路分析；B.MCOLN2和ATF4在结直肠癌细胞和结直肠正常细胞中的内源蛋白表达水平；C.westernblot检测SW480过表达MCOLN2后ATF4的表达水平；D.CCK8检测过表达MCOLN2的SW480上调ATF4的表达可以有效恢复细胞活力。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
研究方案
1.1研究目标
1)阐明MCOLN2在结直肠癌组织中的表达水平及其临床意义。
2)明确MCOLN2抑制结直肠癌发生发展的分子机制。
1.2研究内容
1.2.1检测MCOLN2在结直肠癌组织中的表达水平
A.从已发表的13个有关结直肠癌临床组织样本转录组表达的高通量芯片结果中分析发现，离子通道MCOLN家族成员MCOLN2在所有研究中都提示在肿瘤组织中低表达。此外，对含有配对结直肠癌组织样本的已发表的高通量测序结果(Genes ChromosomesCancer,2010/11/01)的二次分析发现，在65对结直肠癌和对应的正常结直肠组织中，结直肠癌组织中MCOLN2的表达显著低于结直肠正常组织。由此，我们筛选出MCOLN家族中的MCOLN2进行功能性研究。
13个有关结直肠癌芯片如下：
1.Rectal Adenocarcinoma vs.Normal Gaedcke Colorectal,GenesChromosomes Cancer,2010；
2.Colorectal Carcinoma vs.Normal Hong Colorectal,Clin Exp Metastasis,2010；
3.Calan Adenoma vs.Normal Sabates-Bellver Colon,Mol Cancer Res,2007；
4.Rectal Adenoma vs.Normal Sabates-Bellver Colon,Mol Cancer Res,2007；
5.Colorectal Adenocarcinoma vs.Normal Skrzypczak Colorectal,PLoS One,2010；
6.Colorectal Carcinoma vs.Normal Skrzypczak Colorectal,PLoS One,2010；
7.Colon Adenoma vs.Normal Skrzypczak Colorectal 2,PLoS One,2010；
8.Colorectal Carcinoma vs.Normal Skrzypczak Colorectal 2,PLoS One,2010；
9.Cecum Adenocarcinoma vs.Normal TCGA Colorectal,No Associated Paper,2011；
10.Colon Adenocarcinoma vs.Normal TCGA Colorectal,No AssociatedPaper,2011；
11.Colon Mucinous Adenocarcinoma vs.Normal TCGA Colorectal,NoAssociated Paper,2011；
12.Rectal Adenocarcinoma vs.Normal TCGA Colorectal,No AssociatedPaper,2011；
13.Rectal mucinous Adenocarcinoma vs.Normal TCGA Colorectal,NoAssociated Paper,2011；
B.运用荧光实时定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印迹(WB)等试验方法检测MCOLN2在收集的临床组织样本和结直肠癌细胞株中的mRNA和蛋白表达水平情况。
1.2.2检测MCOLN2在结直肠癌进展过程中发挥的生物学功能以及下游通路
A.在低表达的结肠癌细胞中上调MCOLN2的表达，运用CCK8、克隆形成、细胞凋亡等实验方法检测细胞增殖和凋亡的改变情况。
B.在高表达的结肠癌细胞中敲低MCOLN2的表达，运用CCK8、克隆形成、细胞凋亡等实验方法检测细胞增殖和凋亡的改变情况。
C.在裸鼠体内使用稳定细胞系构建原位成瘤模型，观察肿瘤成瘤数目、重量和体积等指标。
D.在低表达的结肠癌细胞中上调MCOLN2的表达，运用高通量转录组测序方法检测MCOLN2过表达组和对照组中基因表达差异，筛选可能的靶基因及下游信号通路。
1.2.3研究MCOLN2调控结直肠癌增殖的分子机制
A.根据前述高通量测序结果，筛选出可能的信号通路，运用qPCR验证测序结果。
B.运用WB检测目的信号通路的关键分子变化水平。
C.运用质谱分析检测上述信号通路中与MCOLN2直接结合的靶点。
1.3拟解决的关键科学问题
1)在体内体外水平明确MCOLN2在结直肠癌中参与调控的生物学功能。
2)阐明MCOLN2通过调控ERstress信号通路抑制结直肠的增殖的具体分子机制。
2.1研究方法
A、蛋白免疫印迹(WB)
用商品化的蛋白裂解液(RIPA)加入蛋白酶抑制剂(PMSF)裂解细胞或动物组织，BCA蛋白定量后，根据蛋白浓度，上样20ug蛋白样品。SDS-PAGE电泳(80V110mins)，PVDF膜转膜2小时，WB封闭液(碧云天P0252)封闭半小时，一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10mins，孵育一抗同种属的二抗室温1小时，TBST洗膜3次，每次10mins，ECL化学发光法检测膜上信号强弱。本发明中，一抗包括：MCOLN2一抗(ACC-082,Alomone labs)GAPDH一抗(60004，proteintech)、ATF4一抗(10835,proteintech)；二抗包括：羊抗兔二抗(7074，cellsignal technology)，羊抗鼠二抗(7076，cell signal technology)。
B、克隆形成
将细胞重悬至单个细胞悬液，种植在6孔细胞培养板中(500个细胞每孔)。2-3天给细胞换一次细胞培养基(10％FBS+90％DEME)(体积比)。两周后，用甲醇固定细胞，0.5％结晶紫染色10min，显微镜下计数超过50个细胞的克隆。
C、细胞周期
用胰酶消化细胞，离心，用PBS清洗细胞两次，离心，去上清。接着向沉淀细胞中逐滴加入适量预冷的70％乙醇，轻轻混匀细胞，4℃避光过夜。1000rpm离心细胞10min，弃上清。用PBS清洗细胞两次。采用PI/RNase染色，将细胞重悬于0.5mlPI/RNase染色液。室温避光孵育15分钟，上流式细胞仪测定结果。
D、细胞凋亡
用EDTA胰酶消化细胞，4℃离心3分钟，去除上清。细胞沉淀用预冷的PBS缓冲液润洗两次，再用稀释到1倍浓度的Annexin V-FITC结合缓冲液(C1062S-2，碧云天)配制1×106个/ml的细胞悬液，用300目的尼龙网过滤至流式管。按体积加入染料AnnexinV，轻轻混匀，室温避光孵育15min；加入碘化丙啶(propidine iodide,PI)，室温避光孵育5min，上流式细胞仪测定结果。样本分别设置阴性对照、AnnexinV单阳性对照、PI单阳性对照和试验管。
E、CCK8检测细胞活力
将2000个细胞接种于96孔细胞培养板中，分别以不同的时间点为实验终点，加入10％CCK8检测试剂(每孔100ul总体积：90ul细胞培养液+10ul CCK8检测试剂)，继续培养2小时，用分光光度仪460nm波长检测吸光度，根据结果计算细胞活力曲线。
F、免疫荧光染色技术
细胞种植在玻璃片上，放到24孔细胞培养板中培养48小时，经过不同处理后，吸走培养基，用PBS清洗两次。用体积百分比为4％的多聚甲醛室温固定10min，PBS清洗三次/5min，用含有TritonX-100(体积百分比0.1％)，BSA(质量百分比5％)的封闭液室温孵育1小时。吸走封闭液，一抗(1％BSA配制)4℃孵育过夜。PBST清洗细胞3次/5min，荧光二抗(1％BSA配制)室温孵育1小时，PBST避光清洗3次/5min。1ug/mLDAPI染核1min，抗淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜拍照。
G、免疫共沉淀(Co-IP)
预冷的PBS清洗细胞两次，加入预冷的细胞温和RIPA裂解液，用预冷的细胞刮片将细胞轻轻刮下，用1ml枪头轻柔吹打5次，冰上裂解30min。4℃，12000g离心15min，将上清转移至新的预冷的1.5mlEP管，取50-100ul上清作为Input，剩下的上清液均分为两组(IgG和目标一抗)。同时，用细胞裂解液活化A/G bead。在两组上清中分别加入目标一抗和同种属IgG，4℃，旋转摇床过夜。接着加入活化的A/Gbead，4℃，旋转摇床4小时，4℃，12000g，离心2min，弃上清。加入1ml RIPA裂解液，清洗bead三次，4℃，12000g，离心30s，弃上清。加入浓度为1倍的上样缓冲液(碧云天P0015)50ul，重悬bead，100℃10min。4℃，12000g，离心30s，收集上清，用于WB。
H、MCOLN2体内实验研究
1)动物接种肿瘤细胞：利用已构建的四环素诱导表达的MCOLN2过表达稳定细胞株，取对数生长期细胞，离心，弃上清，用无菌PBS洗涤3遍，并用无菌PBS将细胞重悬至5×106个/ml，然后取100ul细胞悬液与等体积基质胶混匀，并接种到无胸腺裸鼠右侧背骨上区。分组及处理：①DMSO处理；②四环素处理。
四环素诱导表达的MCOLN2过表达稳定细胞株的构建方法：
(1)从HEK293细胞中克隆得到MCOLN2基因的全长序列(cDNA)；
(2)设计引物，在MCOLN2全长序列两端加上AgeI和EcoRI酶切位点序列；
正向序列：taaccggtatggcccggcagccttatcg
反向序列：cggaattcttagctaataggtatcaagt
(3)酶切载体：使用限制性内切酶AgeI和EcoRI，对pLKO-Tet-On载体进行酶切；
(4)连接反应：把步骤(2)和步骤(3)的产物通过T4连接酶连接起来，具体条件如下(表2-23)；
表2-23连接反应
Figure BDA0003800515960000061
室温反应1-3个小时，连接产物可放置-20℃保存。
(5)转化(Transformation)
①取出连接产物及感受态细胞放置于冰上。按照产品说明书将10μL的连接产物加入到包含有100μL感受态细胞的EP管中充分混合(注意动作轻柔、避免产生气泡)，然后把EP管放置冰上孵育30分钟，接着把EP管放置42℃金属浴热激45秒，迅速将热激后的EP管放置冰上孵育3分钟。
②往管里加入900μL不含抗生素的细菌培养液，轻柔混匀后把EP管放置于细菌培养箱(37℃，200转/分钟)孵育1小时，使细菌充分复苏。
③涂板：将EP管从细菌培养箱中取出，室温3000rpm离心3分钟，去掉900μL细菌培养液，用移液枪用剩下的细菌培养液把菌重悬，吸取细菌悬液10～20μL到含氨苄或卡那抗性的细菌培养板上，然后把细菌培养板放置于生化培养箱(37℃)孵育16～18小时，待单克隆菌落形成。挑取单克隆进行扩增。
2)肿瘤生长监测：待到肿瘤接种7天后，每三天按照上述分组进行处理，并且测量肿瘤长径(L)和短径(S)，参照文献报道的推算公式(V＝LS2/2)计算肿瘤体积，绘制生长曲线。观察4周后牺牲动物。解剖动物取出肿瘤，称重，取1/2肿瘤组织迅速冻存于液氮中，剩余1/2经体积百分比为4％的中性多聚甲醛固定后冰冻和石蜡包埋备用。
3)qPCR和WB检测：提取冻存肿瘤组织总RNA及蛋白，分别检测MCOLN2、ATF4等蛋白表达。
4)免疫荧光共聚焦和IHC检测：用冰冻组织和石蜡组织切片，检测MCOLN2、ATF4等蛋白表达。
实验结果
1)MCOLN2在结直肠癌组织中低表达
为了研究MCOLN2在结直肠癌组织中的表达水平，我们首先利用结直肠癌公共数据库中的数据进行生信分析，结果显示，MCOLN2在结直肠癌组织中的表达显著低于正常结直肠组织。接着我们收集了中山大学附属第六医院12例结直肠癌和配对正常结直肠组织新鲜临床样本，如图1和图2所示的qPCR结果显示，MCOLN2在9例结直肠癌组织中呈低表达。
2)MCOLN2抑制结直肠癌细胞体外增殖能力
通过对临床样本的研究，我们发现结直肠癌中MCOLN2表达下调，且有可能发挥重要作用，在此基础上，如图3所示，为了明确MCOLN2在结直肠癌中的功能，我们在内源MCOLN2表达低的SW480细胞株中过表达MCOLN2，在内源MCOLN2高表达的RKO细胞株中敲低MCOLN2的表达，并进行下一步的功能试验。运用CCK8、克隆形成等实验检测MCOLN2在体外水平参与调控的功能，结果发现MCOLN2过表达显著抑制SW480的细胞活力和克隆形成能力，而敲低MCOLN2则可以有效促进RKO的细胞活力和克隆形成能力。
3)MCOLN2下游调控机制的研究基础
如图4所示，为了寻找MCOLN2发挥调节肿瘤生物学功能潜在的下游机制，我们将SW480 MCOLN2过表达细胞株和对照细胞株进行了转录组测序分析，通过GO及KEGG通路分析寻找MCOLN2参与调控的潜在通路和靶基因。KEGG通路分析发现ERstress通路与MCOLN2关系密切，进一步运用westernblot发现，内源性MCOLN2和ATF4在结直肠癌细胞株和正常结直肠细胞株中的表达呈负相关，且在SW480过表达MCOLN2显著抑制ATF4的蛋白表达水平。此外，ATF4可以有效恢复MCOLN2过表达所引起的细胞活力抑制，提示ERstress通路和ATF4可能是MCOLN2的下游信号通路和靶基因。
上述对实施的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.MCOLN2在制备结直肠癌检测或诊断或预后的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过检测MCOLN2的表达量对结直肠癌进行检测或诊断或预后评估。
4.MCOLN2作为调控靶点在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
5.促进MCOLN2表达的试剂在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
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