CN117144005A - Lbx2-as1在结直肠癌分期、分级、预后以及制备、作为结直肠癌药物、试剂方面的应用 - Google Patents

Lbx2-as1在结直肠癌分期、分级、预后以及制备、作为结直肠癌药物、试剂方面的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117144005A
CN117144005A CN202311018835.5A CN202311018835A CN117144005A CN 117144005 A CN117144005 A CN 117144005A CN 202311018835 A CN202311018835 A CN 202311018835A CN 117144005 A CN117144005 A CN 117144005A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lbx2
colorectal cancer
mir
prognosis
mdk
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311018835.5A
Other languages
English (en)
Inventor
李梦婷
赵正孝
张志杰
陈峭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liuzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Liuzhou Zhuang Medical Hospital
Original Assignee
Liuzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Liuzhou Zhuang Medical Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liuzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Liuzhou Zhuang Medical Hospital filed Critical Liuzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Liuzhou Zhuang Medical Hospital
Priority to CN202311018835.5A priority Critical patent/CN117144005A/zh
Publication of CN117144005A publication Critical patent/CN117144005A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体是LBX2‑AS1在结直肠癌分期、分级、预后以及制备、作为结直肠癌药物、试剂方面的应用。本申请中证实了LBX2‑AS1可促进结肠癌细胞体外增殖、侵袭及转移，在结肠癌中起着促癌的生物学作用，LBX2‑AS1作为ceRNA与miR‑219a‑2‑3p竞争性调控MDK表达，上调LBX2‑AS1/miR‑219a‑2‑3p/MDK可能通过激活TGFβ信号通路，促进Vimentin、snail的表达，从而促进结肠癌细胞侵袭及转移。LBX2‑AS1与结肠癌的分期、分级和预后不良呈显着正相关，可以应用于结直肠癌分期、分级、预后方面。

Description

LBX2-AS1在结直肠癌分期、分级、预后以及制备、作为结直肠 癌药物、试剂方面的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是LBX2-AS1在结直肠癌分期、分级、预后以及制备、作为结直肠癌药物、试剂方面的应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是全球第三大常见的恶性肿瘤。全球年发病人数超过100万，在发达国家的死亡率更是高达33％。且该病的患者人群逐渐趋向年轻化。CRC的转移是影响生存率的最大因素。大约四分之一的患者在诊断时就已经伴随有转移的发生，这直接导致了CRC患者整体的不良预后和较高死亡率。因此，了解CRC转移进展的潜在分子机制，寻找CRC患者预后情况判断的关键标志物以及预后情况判断的试剂至关重要。
目前国内外暂无LBX2-AS1在CRC发生发展中的侵袭转移作用及其可能的作用机制，尤其是LBX2-AS1对CRC的侵袭转移和EMT过程的影响及其中可能参与的信号通路的报道，因此，确定LBX2-AS1在CRC组织中的表达水平及LBX2-AS1对CRC具体作用，特别是LBX2-AS1与CRC侵袭、转移的关系及分子机制，以及着重研究LBX2-AS1对CRC细胞侵袭、转移的影响，对于将LBX2-AS1充分应用到CRC的治疗、CRC模型的制备、CRC细胞的培养等方面，具有十分重要的现实意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供LBX2-AS1在结直肠癌分期、分级、预后以及制备、作为结直肠癌药物、试剂方面的应用。具体是通过以下技术方案得以实现的：
LBX2-AS1在结直肠癌分期、分级、预后方面的应用。
进一步的，所述结直肠癌预后方面，是以LBX2-AS1作为结直肠癌预后标志物方面。
进一步的，是以LBX2-AS1作为结直肠癌预后情况判断的试剂或试剂盒方面。
进一步的，所述结直肠癌预后，是结直肠癌转移方面的预后。所述结直肠癌转移方面的预后，具体是当LBX2-AS1表达量高于正常值时，结直肠癌转移的可能性升高，当LBX2-AS1表达量正常或偏低时，结直肠癌转移的可能性降低
本申请发明人在研究中发现，LBX2-AS1可促进结肠癌细胞体外增殖、侵袭及转移，在结肠癌中起着促癌的生物学作用，LBX2-AS1作为ceRNA与miR-219a-2-3p竞争性调控MDK表达，上调LBX2-AS1/miR-219a-2-3p/MDK可能通过激活TGFβ信号通路，促进Vimentin、snail的表达，从而促进结肠癌细胞侵袭及转移。LBX2-AS1与结肠癌的分期、分级和预后不良呈显着正相关，可以应用于结直肠癌分期、分级、预后方面。LBX2-AS1还可以作为CRC的一个重要治疗靶点。
LBX2-AS1在制备/作为结直肠癌促进试剂方面的应用。
进一步的，所述结直肠癌促进试剂，是促进结直肠癌转移的试剂。
进一步的，所述结直肠癌促进试剂，是促进结直肠癌侵袭的试剂。
本申请发明人在研究中发现，LBX2-AS1可促进结肠癌细胞体外增殖、侵袭及转移，在结肠癌中起着促癌的生物学作用。说明可以将LBX2-AS1应用在制备/作为结直肠癌促进试剂方面，可以进一步用于结直肠癌细胞扩增、制备CRC肿瘤转移模型、筛选结直肠癌治疗药物等方面。
LBX2-AS1抑制药物在制备/作为抗结直肠癌药物方面的应用。
本申请中证实了降低LBX2-AS1含量能够抑制CRC细胞的增殖、迁移及侵袭能力，说明了LBX2-AS1抑制药物可以制备或直接作为抗结直肠癌药物。
LBX2-AS1在制备/作为miR-219a-2-3p抑制药物方面的应用。
过表达LBX2-AS1后miR-219a-2-3p明显下降，提示LBX2-AS1与miR-219a-2-3p呈负相关，LBX2-AS1可以作为miR-219a-2-3p抑制药物。
LBX2-AS1在制备/作为MDK促进药物方面的应用。
MDK(中期因子)是一种肝素结合生长因子，在人类各种恶性肿瘤中异常高水平表达，并作为恶性肿瘤重要介质参与细胞生长、生存、转移、迁移和血管生成。LBX2-AS1与MDK呈正相关，LBX2-AS1可以作为MDK促进药物，用于结直肠癌细胞扩增、制备CRC肿瘤转移模型、筛选结直肠癌治疗药物等方面。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
(1)本申请发明人在研究中发现，LBX2-AS1可促进结肠癌细胞体外增殖、侵袭及转移，在结肠癌中起着促癌的生物学作用，LBX2-AS1作为ceRNA与miR-219a-2-3p竞争性调控MDK表达，上调LBX2-AS1/miR-219a-2-3p/MDK可能通过激活TGFβ信号通路，促进Vimentin、snail的表达，从而促进结肠癌细胞侵袭及转移。LBX2-AS1与结肠癌的分期、分级和预后不良呈显着正相关，可以应用于结直肠癌分期、分级、预后方面。LBX2-AS1还可以作为CRC的一个重要治疗靶点。
(2)本申请中说明了降低LBX2-AS1含量能够抑制CRC细胞的增殖、迁移及侵袭能力，说明了LBX2-AS1抑制药物可以制备或直接作为抗结直肠癌药物。
(2)本申请中说明了过表达LBX2-AS1后miR-219a-2-3p明显下降，提示LBX2-AS1与miR-219a-2-3p呈负相关，LBX2-AS1可以作为miR-219a-2-3p抑制药物。
(3)本申请中说明了LBX2-AS1与MDK呈正相关，LBX2-AS1可以作为MDK促进药物，用于结直肠癌细胞扩增、制备CRC肿瘤转移模型、筛选结直肠癌治疗药物等方面。
附图说明
图1是lncRNALBX2-AS1在结肠癌组织和配对癌旁正常组织的表达，其中A：80例结肠组织及配对癌旁正常组织中LBX2-AS1的表达情况；B：在TCGA结肠数据集275例结肠癌组织及349例癌旁正常组织中LBX2-AS1的表达情况。
图2是lncRNALBX2-AS1在结直肠癌细胞中的表达差异，其中A.正常结直肠上皮细胞NCM460与结直肠癌细胞株中lncRNA LBX2-AS1的表达差异；B.转染过表达LBX2-AS1慢病毒HT-29中LBX2-AS1 mRNA表达量；C.过表达LBX2-AS1慢病毒转染HT-29细胞荧光图。Note:*P<0.05。
图3是Starbase预测LBX2-AS1以ceRNA形式调控MDK表达。A：LBX2-AS1与MDK呈负相关；B：LBX2-AS1与MDK相互关联的miRNAs。
图4是lncRNALBX2-AS1作为ceRNA靶基因预测，其中A.过表达LBX2-AS1后结肠癌细胞表达miRNAs的情况；B.双荧光素酶实验检测lncRNA LBX2-AS1与miRNA 219a-2-3p的结合；C.双荧光霉素实验检测miRNA219a-2-3p与MDK的结合。Note:*P<0.05，****P<0.0001。
图5是过表达lncRNALBX2-AS1对HT-29细胞活力和侵袭转移的影响，其中A.过表达LBX2-AS1后HT-29细胞增殖能力增强，miR-219a-2-3p mimic干扰后细胞增殖能力回复；B.过表达LBX2-AS1后HT-29细胞转移能力增强，miR-219a-2-3p mimic干扰后细胞转移能力回复；C.过表达LBX2-AS1后HT-29细胞侵袭能力增强，miR-219a-2-3p mimic干扰后细胞侵袭能力回复。Note:*P<0.05。
图6是过表达lncRNALBX2-AS1对HT-29细胞侵袭、转移相关基因及蛋白表达的影响。过表达LBX2-AS1后MDK1、TGF-β1、Vimentin、Snail基因表达增加，miR-219a-2-3p mimic干扰后上述基因表达回复；B.C过表达LBX2-AS1后TGF-β1、Vimentin、Snail蛋白表达增加，miR-219a-2-3p mimic干扰后上述蛋白表达回复。Note:*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；****P<0.0001。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
1材料与方法
1.1细胞与试剂
人结肠癌细胞株RKO、HT-29、HCT116、SW480和LOVO及正常肠粘膜上皮细胞NCM460均由中国科学院干细胞库提供，DMEM培养基购自美国BD公司，过表达慢病毒购自上海吉凯基因公司，miR-219a-2-3p mimic及引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。鼠抗人TGFβ1、Vimentin抗体购自美国abcam公司和Snail1及MDK抗体均购自美国GeneTex公司，
1.2一般资料
选取柳州市中医医院普外科在2021年1月至2022年1月间行CRC根治术治疗的80例CRC患者的癌组织和配对癌旁组织(癌周3cm以上)。入选标准：(1)术前签署知情同意书；(2)病理确诊为结肠癌。排除标准：(1)手术前曾进行放化疗；(2)存在其它影响本结果评价的疾病，如严重的心脏病、脑血管疾病、肝病、肾病或其他恶性肿瘤者。实验方案已通过柳州市中医医院医学伦理委员会的批准，并且取得了患者的知情同意书。所有结直肠癌标本至少经过1名高级病理学家诊断确认。
1.3研究方法
1.3.1lncRNALBX2-AS1在结直肠癌组织及细胞中的表达
通过qPCR检测80例患者的肿瘤组织和癌旁组织中lncRNA LBX2-AS1的表达差异并计算LBX2-AS1的相对表达量，另外对80例结肠癌病人的生存资料进行分析。在线生物信息学平台GEPIA分析TCGA数据库COAD中279例结直肠癌标本和349例癌旁标本中lncRNALBX2-AS1的表达差异。检测人结肠癌细胞系RKO、HT-29、HCT116、SW480和LOVO及正常肠粘膜上皮细胞NCM460中lncRNA LBX2-AS1的表达量。对HT-29细胞系进行转染，OE-LBX2-AS1和相应的阴性对照(NC)均来自吉凯(上海，中国)。按照说明书的步骤对细胞慢病毒转染后通过qPCR对转染效果进行验证。将细胞分为CON组(未干预组)、NC组(阴性对照OE-NC)、OE-LBX2-AS1组(转染慢病毒过表达LBX2-AS1组)。
1.3.2检测miRNA-219a-2-3p、miR-3150a-3p、miR-3174和miR3612在过表达LBX2-AS1前后结肠癌细胞HT-29中的表达量。
通过在线数据库Starbase查询LBX2-AS1作为ceRNA调控MDK时，参与其中的miRNA有：miR-219a-2-3p、miR-3150a-3p、miR-3174和miR-3612。将miR-219a-2-3p、miR-3150a-3p、miR-3174和miR-3612的逆转录引物由上海生工生物有限公司设计成特殊的茎环结构，以U6作为内参(具体引物序列详见表1)。逆转录反应体系(15μL)如下：将5μL RNA模板及3μL逆转录引物加入逆转录混合液体系中。反应条件：16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟。
表1:引物序列表
1.3.3RNA逆转录合成cDNA
按照20ul的体系进行逆转录，逆转录的RNA量根据浓度调节；逆转录程序为：42℃30min→85℃10min；逆转录结束后体系用DEPC水稀释3倍后保存于-20℃。体系如下：
表2逆转录反应体系
1.3.4荧光素酶报告实验检测lncRNALBX2-AS1对miR-219a-2-3p的靶向性
将lncRNA LBX2-AS1/MDK的可能结合位点通过PCR扩增，然后将pmir-GLO质粒插入到结合位点。将mimic NC、lncRNA LBX2-AS1/MDK WT或lncRNA LBX2-AS1/MDK MUT和miR-219a-2-3p mimics使用Lipofectamine 2000共转染48小时后使用双荧光素酶检测报告基因系统来检测荧光素酶活性。
1.3.5miRNAmimic转染HT-29
MiR-219a-2-3p mimic来自生工(生工，中国)序列为：miR-219a-2-3p mimics：5′-AGAAUUGUGGCUGGACAUCUGU-3′，按照Lipofectamine RNAi Max转染试剂说明书使用进行细胞转染48小时后，收集样品进行检测。
1.3.6CCK-8法检测HT细胞-29活力
根据HT-29细胞转染不同将细胞分为CON组(未干预组)、NC组(阴性对照OE-NC)、OE-LBX2-AS1组(转染慢病毒过表达LBX2-AS1组)、OE-LBX2-AS1+miR-219a-2-3p mimics组(转染miR-219a-2-3p mimics)，采用CCK8实验来检测细胞增殖功能，在细胞培养0、12、24、48h时向每孔加入10μL CCK8溶液，将培养板置入培养箱内孵育1h后通过酶标仪测定在450nm处的吸光度(A)值，所有实验均为3个重复。
1.3.7细胞划痕实验
将6孔板中的细胞密度调整为2×105个/孔并培养24小时后按照实验所需分组进行处理。使用无血清的培养基培养细胞4小时从而减缓细胞增殖。用10ul移液枪枪头在直尺的辅助下用在6孔板的单层细胞中呈直线划痕，每孔间隔划3-5根直线，PBS去除刮下的细胞，加入无血清培养基，37℃、5％CO2培养孵箱12、24、48小时后，PBS清洗数遍后，更换新的无血清培养基，在与第一次相同的位置拍照，通过Image J软件对不同处理组划痕宽度进行数据采集统计分析。
1.3.8通过Transwell法检测各组HT-29细胞侵袭能力的变化
用不含血清的细胞培养液将各组细胞配制成浓度为5×105/ml的单细胞悬浮液，上室加入100μl转染后培养48小时的细胞悬液，下室加入600μl 10％胎牛血清DEME培养基，然后将小室放入培养板中；继续分别培养12小时、24小时、48小时后取出Transwell小室，吸去培养基，用无钙PBS洗涤2次，用棉签擦拭Matrigel和上室的细胞，依次用甲醇固定30分钟，将小室适当风干。用0.1％结晶紫染色20分钟，用棉签轻轻擦拭顶层未迁移细胞，用PBS洗涤3次。在100倍显微镜下随机在三个视野中观察细胞并进行计数。
1.3.9qPCR分析
采用SYBR PCR Master Mix试剂盒对lncRNA LBX2-AS1、MDK1、TGFβ1、Vimentin、Snail的基因表达量进行检测(引物序列详见表1，反应体系见表3)，以GAPDH基因作为内参基因进行对照。RT-qPCR反应条件：95℃预变性10min；95℃变性50s，60℃退火25s，72℃延伸15s，40次循环。采用2-ΔΔCt方法计算。每个样本重复3次，取平均值。
表3cDNA合成反应体系
1.3.10Westernblot法检测TGF-β1、Vimentin、Snail、MDK蛋白表达
分别收集各组细胞样本，提取蛋白并测定蛋白浓度。将蛋白样品充分与上样缓冲液混合，并在沸水浴加热5min后上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后转至PVDF膜，将PVDF膜浸泡在5％脱脂牛奶中室温下封闭2h。加入适宜浓度一抗，4℃封闭孵育过夜。次日用TBST清洗PVDF膜3次，次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1000)常温孵育，将A和B两种试剂等体积混合；然后放入成像仪中拍照。使用Gel-ProAnalyzer软件分析各组目标条带的光密度值，以GAPDH做为内参,根据相应蛋白条带与GAPDH的比值计算目标蛋白的相对表达量。
1.4统计学处理
实验数据采用GraphPad Prism 8进行统计学分析，其中计量资料以均数±标准差表示，符合正态分布的计量资料比较采用独立样本t检验，不符合正态分布的计量资料比较采用秩和检验。两组计数资料的比较使用卡方检验，P<0.05表示组间差异具有统计学意义。
2结果
2.1在结直肠癌组织及细胞中lncRNALBX2-AS1的表达
80例结直肠癌患者(图1A)的癌组织样本中lncRNA LBX2-AS1的表达量较癌旁组织样本明显升高(P＜0.05)，这与TCGA数据库(图1B)相一致。对80例结肠癌病人的生存资料进行分析，结果显示LBX2-AS1表达水平与结肠癌病人临床特征的相关性。表2可以看出，LBX2-AS1的表达水平和病人的年龄、性别等临床参数无关，和结肠癌的病理T分期以及淋巴结转移呈现正相关(*P<0.05)。与正常肠粘膜细胞(2.263±0.04)相比，lncRNA LBX2-AS1在RKO、HT-29、HCT116、SW480、LOVO细胞系中的表达分别为3.17±0.11、2.72±0.02、3.27±0.06、3.91±0.03、3.34±0.04。HT-29细胞系中lncRNA LBX2-AS1的表达较其他细胞系低，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2A)，作为后续细胞实验研究对象。在转染过表达慢病毒后，HT-29中LBX2-AS1水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)(图2B、C)。
表4LBX2-AS1表达水平与结肠癌临床特征的相关性
2.2lncRNA作为ceRNA海绵吸附miRNA靶向调控MDK
为探讨LBX2-AS1和MDK的潜在关系，通过Starbase软件预测LBX2-AS1作为ceRNA作用于MDK时可能作用的miRNA有miR-219a-2-3p、miR-3150a-3p、miR-3174、miR-3612。与未干预细胞相比，过表达LBX2-AS1的HT-29细胞表达miR-219a-2-3p下降，呈负相关，而miR-3174表达升高，成正相关，差异具有统计学意义(P值<0.05)(图3A)。
2.3lncRNALBX2-AS1对miR-219a-2-3p相关作用关系及miR-219a-2-3p对MDK的靶向性
为明确LBX2-AS1和miR-219a-2-3p的互作关系，本研究首先通过Starbase软件预测LBX2-AS1和miR-219a-2-3p、miR-219a-2-3p和MDK的假定结合位点，进一步利用荧光素酶实验相互验证它们之间的作用关系。在HT-29细胞中，荧光素酶实验显示，转染miR-219a-2-3p mimics后，与miminc NC(1.00±0.02)相比，在转染lncRNA LBX2-AS1 WT的HT-29细胞中荧光素酶活性明显下降，降低程度达50％(0.45±0.01)，而miR-219a-2-3p在lncRNALBX2-AS1MUT中作用消失(1.00±0.02vs 1.00±0.03)(图3B)。此外转染miR-219a-2-3p mimics后，与miminc NC(0.72±0.02)相比，在转染MDK WT的HT-29细胞中荧光素酶活性明显降低，降低幅度接近50％(0.28±0.01)，而miR-219a-2-3p在MDK MUT中作用消失(0.72±0.01vs0.72±0.02)(图4C)。数据表明，miR-219a-2-3p可以分别与lncRNALBX2-AS1、MDK直接结合。
2.4lncRNALBX2-AS1和miR-219a-2-3p对HT-29细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响
在培养48小时后，CON组与NC组相比差异无明显统计学差异，OE-LBX2-AS1组细胞活力值明显高于CON组和OE-NC组，差异有统计学意义(P＝0.008<0.01、P＝0.04<0.05)。与OE-LBX2-AS1组相比，OE-LBX2-AS1+miR-219a-2-3p mimics组细胞活性明显下降，差异有统计学意义(P＝0.013<0.05)(图4A)。OE-LBX2-AS1组细胞迁移距离、侵袭相对细胞数均显著高于CON组和OE-NC组(P＝0.0027<0.01、P＝0.036<0.05；P＝0.0009<0.001、P＝0.042<0.05)，而增加miR-219a-2-3p mimics缩短LBX2-AS1所增宽的迁移距离，减少侵袭相对细胞(P＝0.0003<0.001、P＝0.03<0.05)(图5B、C)，结果提示过表达lncRNALBX2-AS1后的HT-29细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显增强，miR-219a-2-3p可抑制其增殖、侵袭及迁移作用。
2.5lncRNALBX2-AS1和miR-219a-2-3p对HT-29细胞侵袭、转移相关基因表达的影响
CON组、OE-NC组、OE-LBX2-AS1组、OE-LBX2-AS组+miR-219a-2-3p mimics组中，MDK基因表达水平分别为1.00±0.07、1.174±0.24、5.748±1.23、3.177±0.68，TGF-β1基因表达水平分别为1.00±0.17、1.014±0.06、5.94±0.70、1.16±0.09，Vimentin基因表达水平分别为1.00±0.08、1.008±0.07、4.34±1.08、1.417±0.24，Snail基因表达水平分别为1.00±0.12、1.205±0.19、4.36±1.28、2.30±0.47。与NC组相比，OE-LBX2-AS1组的MDK(t＝6.343，P＝0.0032)、TGF-β1(t＝12.07，P＝0.0003)、Vimentin(t＝5.34，P＝0.0059)和Snail(t＝4.203，P＝0.0137)表达明显升高。
2.6lncRNALBX2-AS1和miR-219a-2-3p对HT-29细胞侵袭、转移相关蛋白表达的影响
CON组、OE-NC组、OE-LBX2-AS1组、OE-LBX2-AS组+miR-219a-2-3p mimics组中，MDK1蛋白表达水平分别为1.0±0.03、0.96±0.05、2.03±0.13、1.49±0.06，TGF-β1蛋白表达水平分别为1.03±0.11、1.072±0.06、2.80±0.23、1.50±0.02，Vimentin蛋白表达水平分别为1.00±0.22、1.023±0.24、2.08±0.28、1.33±0.17，Snail蛋白表达水平分别为1.00±0.21、0.99±0.17、2.08±0.30、1.39±0.42。与NC组相比，OE-LBX2-AS1组的MDK1(t＝13.24，P＝0.0002)、TGF-β1(t＝12.7，P＝0.0002)、Vimentin(t＝4.96，P＝0.008)和Snail(t＝5.508，P＝0.0053)表达明显升高；与OE-LBX2-AS1组相比，OE-LBX2-AS组+miR-219a-2-3p mimics组的MDK(t＝6.639，P＝0.0027)、TGF-β1(t＝9.848，P＝0.0006)、Vimentin(t＝3.978，P＝0.016)和Snail(t＝2.327，P＝0.035蛋白表达明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)(图6B、C)。
3讨论
LBX2-AS1在CRC中的侵袭转移作用及其可能的作用机制尚不明确，我们的研究重点是LBX2-AS1对CRC的侵袭转移和EMT过程的影响及其中可能参与的信号通路。
本研究收集80对结直肠癌及邻近正常结直肠上皮组织，并通过qPCR检测了LBX2-AS1的相对表达量，结果表明，CRC肿瘤组织中lncRNALBX2-AS1的表达明显较癌旁组织增加，这与TCGA数据库结果相一致，此外本研究发现LBX2-AS1与结肠癌的分期、分级和预后不良呈显着正相关，提示LBX2-AS1在CRC中可能起着促癌作用。由于恶性肿瘤的进展首先可观察到肿瘤细胞增殖和生长方式的改变，为进一步明确LBX2-AS1在CRC进展过程中的生物学行为，本研究通过检测CRC细胞株(RKO、HT-29、HCT116、SW480和LOVO)及正常肠粘膜上皮细胞NCM460的LBX2-AS1表达量，结果显示CRC细胞株的LBX2-AS1表达量较正常肠粘膜上皮细胞明显升高，其中HT-29细胞株中LBX2-AS1表达量相对较低。后续在HT-29细胞系中过表达lncRNA LBX2-AS1，分别采用CCK8实验检测细胞的增殖能力、划痕实验观察细胞迁移能力，Transwell侵袭实验了解细胞侵袭转移能力，结果发现lncRNA LBX2-AS1过表达可促进HT-29细胞增殖、侵袭及转移，证实lncRNALBX2-AS1可促进HT-29细胞增殖、侵袭及转移，加速CRC进展。综上，lncRNALBX2-AS1可能是CRC的一个重要治疗靶点。
MDK(中期因子)是一种肝素结合生长因子，在人类各种恶性肿瘤中异常高水平表达，并作为恶性肿瘤重要介质参与细胞生长、生存、转移、迁移和血管生成，值得我们注意的是MDK可诱导EMT，其过程与TGF-β通路相关。在CRC中MDK可促进肿瘤细胞抗失巢凋亡，MDK表达量升高可诱导结直肠癌细胞形态转变成梭形(EMT)，并导致细胞之间联系变弱并向远处移动。本研究通过GEPIA在线数据库了解LBX2-AS1与MDK呈负相关，其调控形式可能是竞争性内源性RNA(ceRNA)假说。本研究通过Starbase数据库预测，LBX2-AS1可与miR-219a-2-3p、miR-3150a-3p、miR-3174、miR-3612竞争性结合调控MDK表达，在体外HT-29细胞检测预选miRNA的表达，结果提示过表达LBX2-AS1后miR-219a-2-3p明显下降，提示LBX2-AS1与miR-219a-2-3p呈负相关，通过双荧光素酶实验结果，研究再次证实miR-219a-2-3p可以分别结合LBX2-AS1、MDK。此外在细胞恶性行为方面，上调LBX2-AS1可促进HT-29增殖、侵袭转移等恶性行为发生，加入miR-219a-2-3p mimic后上述促癌效应减弱。
上皮细胞-间充质转化(epithelial–mesenchymal transition，EMT)是具有极性的上皮细胞在一些因素的作用下失去基底膜的附着极性与细胞间紧密连接和黏附连接能力转换为具有浸润性和游走迁徙能力的间充质细胞的可逆过程，以细胞-细胞粘附的丧失和细胞活力的增加为特征，是肿瘤进展和转移的关键过程，可由多种生长因子引发，如TGF-β、EGF、HGF等。MDK与EMT过程相关且被证实在体外与TGF-β通路的各种蛋白成员相互作用，进而引起EMT并导致癌细胞在体内外迁移的增加。我们目前的研究表明LBX2-AS1与MDK呈正相关，其调控受miR-219a-2-3p mimic所抑制，此外LBX2-AS1诱导的HT-29细胞发生EMT特可能与TGF-β1信号相关，其特征是TGF-β1升高的同时伴随着Vimentin及snail的表达上调。
综上所述，LBX2-AS1在结肠癌中表达上调，且表达水平和结肠癌患者年龄、性别无相关性，与结肠癌肿瘤TNM分期呈正相关。LBX2-AS1可促进结肠癌细胞体外增殖、侵袭及转移，在结肠癌中起着促癌的生物学作用，LBX2-AS1作为ceRNA与miR-219a-2-3p竞争性调控MDK表达，上调LBX2-AS1/miR-219a-2-3p/MDK可能通过激活TGFβ信号通路，促进Vimentin、snail的表达，从而促进结肠癌细胞侵袭及转移。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.LBX2-AS1在结直肠癌分期、分级、预后方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌预后方面，是以LBX2-AS1作为结直肠癌预后标志物方面。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌预后，是结直肠癌转移方面的预后。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌转移方面的预后，具体是当LBX2-AS1表达量高于正常值时，结直肠癌转移的可能性升高，当LBX2-AS1表达量正常或偏低时，结直肠癌转移的可能性降低。
5.LBX2-AS1在制备/作为结直肠癌促进试剂方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌促进试剂，是促进结直肠癌转移的试剂。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌促进试剂，是促进结直肠癌侵袭的试剂。
8.LBX2-AS1抑制药物在制备/作为抗结直肠癌药物方面的应用。
9.LBX2-AS1在制备/作为miR-219a-2-3p抑制药物方面的应用。
10.LBX2-AS1在制备/作为MDK促进药物方面的应用。
CN202311018835.5A 2023-08-14 2023-08-14 Lbx2-as1在结直肠癌分期、分级、预后以及制备、作为结直肠癌药物、试剂方面的应用 Pending CN117144005A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311018835.5A CN117144005A (zh) 2023-08-14 2023-08-14 Lbx2-as1在结直肠癌分期、分级、预后以及制备、作为结直肠癌药物、试剂方面的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311018835.5A CN117144005A (zh) 2023-08-14 2023-08-14 Lbx2-as1在结直肠癌分期、分级、预后以及制备、作为结直肠癌药物、试剂方面的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117144005A true CN117144005A (zh) 2023-12-01

Family

ID=88907101

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311018835.5A Pending CN117144005A (zh) 2023-08-14 2023-08-14 Lbx2-as1在结直肠癌分期、分级、预后以及制备、作为结直肠癌药物、试剂方面的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117144005A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. The long non-coding RNA HOTTIP promotes progression and gemcitabine resistance by regulating HOXA13 in pancreatic cancer
Wang et al. miR-29b regulates migration of human breast cancer cells
Su et al. Aberrant expression of microRNAs in gastric cancer and biological significance of miR-574-3p
Yin et al. Cancer-associated fibroblasts-derived exosomes upregulate microRNA-135b-5p to promote colorectal cancer cell growth and angiogenesis by inhibiting thioredoxin-interacting protein
Lu et al. MiR‐205 suppresses tumor growth, invasion, and epithelial‐mesenchymal transition by targeting SEMA4C in hepatocellular carcinoma
CN109423517B (zh) 外泌体在肿瘤诊断、治疗和预后评估中的用途
WO2012154567A2 (en) Human invasion signature for prognosis of metastatic risk
Li et al. Investigation of the potential theranostic role of KDM5B/miR-29c signaling axis in paclitaxel resistant endometrial carcinoma
CN112501299A (zh) 一种用于预测肝癌复发和转移的方法及应用
Xu et al. Mechanism of lncRNA FEZF1-AS1 in promoting the occurrence and development of oral squamous cell carcinoma through targeting miR-196a.
WO2017217807A2 (ko) Nckap1을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물
Cai et al. ETV4 promotes the progression of gastric cancer through regulating KDM5D.
Li et al. miR-597-5p inhibits cell growth and promotes cell apoptosis by targeting ELK1 in pancreatic cancer
Gunyuz et al. SEMA6D differentially regulates proliferation, migration, and invasion of breast cell lines
CN108165631B (zh) 一种骨肉瘤的生物标志物syt12及其应用
CN112641797B (zh) 抑制结直肠癌生长、转移的靶标与诊断标志物及其应用
CN112410429B (zh) Fxyd3作为胃癌诊断标志物和治疗靶标的应用
CN117144005A (zh) Lbx2-as1在结直肠癌分期、分级、预后以及制备、作为结直肠癌药物、试剂方面的应用
CN114480647A (zh) 膀胱癌检测试剂盒、核酸检测芯片、信号通道抑制剂及其应用
CN111471683A (zh) miR-93-5p作为诊断和治疗胃癌标志物的应用
CN110819718A (zh) miR-154-5p在前列腺癌骨转移的新应用
CN115287359B (zh) Mcoln2在结直肠癌中的应用
Ma et al. MicroRNA-300 inhibits the metastasis of prostate cancer through the regulation of TRIM63
TWI546075B (zh) 以微小去氧核醣核酸為基礎用於抗大腸直腸癌及大腸直腸癌預後的方法
CN113186290B (zh) Dkk4在肝母细胞瘤诊断和治疗中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination