CN111471683A - miR-93-5p作为诊断和治疗胃癌标志物的应用 - Google Patents

Abstract

miR‑93‑5p作为诊断和治疗胃癌标志物的应用。本发明公开了一种用于诊断和治疗胃癌的miRNA标志物，具体所述miRNA为miR‑93‑5p。本发明公开了miR‑93‑5p在制备诊断胃癌的产品以及治疗胃癌的药物组合物中的应用。本发明同时公开了一种诊断胃癌的试剂盒以及治疗胃癌的药物组合物。本发明的试剂盒能够作为胃癌诊断的手段之一。本发明的药物组合物对胃癌有较好的抑制作用，在胃癌治疗中具有重要的参考和现实意义。

Description

miR-93-5p作为诊断和治疗胃癌标志物的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及非编码RNA在制备胃癌诊断产品，以及治疗药物领域中的用途，特别是涉及miR-93-5p在制备胃癌诊断产品，以及治疗药物领域中的用途。

背景技术

胃癌(gastric carcinoma,GC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居世界第三位，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位(Siegel,et al.,2017；Torre,et al.,2015)。胃癌早期无明显症状，易被诊断为胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症从而易被忽略，一旦发现，胃癌一般都已经发展至中晚期，导致其病死率高达75％。80％患者就诊时处于晚期，预后较差(Wang,et al.,2019)。胃癌是一种常见的恶性肿瘤，尽管近年来在医疗、药理学和遗传学方面取得了进步，但胃癌仍然是世界范围内常见和致命的癌症(Siegel,et al.,2015；Siegel,et al.,2017；Siegel,et al.,2018；Siegel,et al.,2019)。胃癌治疗和预后的一个重要问题是诊断较晚，缺乏合适的无创预后技术和检测手段。迄今为止，胃癌检测的金标准仍然是内镜引导下的活检，它不仅具有侵袭性，而且本身可能会对粘膜组织造成损伤。与胃癌发生发展或预后相关的分子可作为肿瘤诊断标志物，具有早期检测、方便、快速、无痛等优点。

到目前为止，已经证实胃癌是由不同的致癌基因激活或抑癌基因失活引起的(Boreiri,et al.,2013)。FAM46(family-with-sequence-similarity-46)蛋白属于一类具有序列相似性的核苷酸转移酶(Ntase)折叠超家族。研究表明，FAM46基因同某些肿瘤存在相关性，参与恶性肿瘤的发生和发展过程，其表达水平可能作为肿瘤重要的诊断和预后因子，并且该基因可能是一个潜在的肿瘤治疗靶点(陈晨,2015)。本文将FAM46在胃癌中浸润与转移、突变、诊疗与预后等方面进行综述，为胃癌的早期诊断、临床诊疗和预后提供新的思路。

迄今为止，已有多项研究表明，FAM46家族蛋白可能在细胞中发挥重要作用；然而，它们的确切功能仍然未知。Kuchta等在2016年对核苷酸转移酶(Ntase)折叠蛋白进行了全面的分类，并将FAM46蛋白分配到这个超家族作为潜在的活性成员(Kuchta,et al.,2009)。所有已知的动物基因组均能编码FAM46蛋白，人类FAM46基因家族包括FAM46A、FAM46B、FAM46C和FAM46D共4个成员(Kuchta,et al.,2016)。FAM46A基因首先在人类视网膜组织中发现，最初被命名为C6orf 37，该基因位于6号染色体6q14区域，全场长约7kp，编码区域包含3个外显子和2个内含子，编码约450个氨基酸。生物信息学分析表明，FAM46A基因通过转录、剪切等步骤改变第一个外显子长度和ATG位置，产生5种单体，翻译产生的蛋白氨基酸数量从86到523不等(Barragan,et al.,2008)。蛋白质组学研究表明，FAM46A可能存在许多互作蛋白分子，例如ZFYVE9分子，参与非磷酸化的SMAD2/SMAD3二聚体向转化生长因子受体募集过程(Schoggins,et al.,2011)。由于FAM46A在神经视网膜内表现出优先表达，因此被报道可作为为人类视网膜疾病的良好候选基因。生物信息学分析表明，FAM46A蛋白含有核定位信号、锌指结构结合域和ZFYVE9蛋白结合位点，提示其可能参与细胞增殖等生物过程(Barragan,et al.,2008)。通过基因关联分析，研究者们发现某些肿瘤的发生与FAM46A呈现相关性，如肺癌(Etokebe,et al.,2014)，结肠癌(Cui,et al.,2006)、乳腺癌(Siddiq,etal.,2012)等，暗示该基因可能作为某些肿瘤重要的诊断和预后因子。根据美国专利(US7615349B2)显示，FAM46B在转移性黑色素瘤细胞中表达水平较低。最新研究表明，FAM46B和FAM46C可分别作为狼疮性肾炎(Benjachat,et al.,2015)和多发性骨髓瘤的潜在检测标志物(Barbieri,et al.,2016；Chapman,et al.,2011)。另外，有报道称FAM46D在肺和胶质母细胞瘤肿瘤中过表达(Bettoni,et al.,2009)，同时与FAM46C一同在自闭症样行为的转基因小鼠的大脑中过表达(Hamilton,et al.,2011)。FAM46C的功能具有两面性。FAM46C被认为是I型干扰素刺激基因，可以增强某些病毒的复制(Schoggins,et al.,2011)，然而在安第斯病毒感染长尾侏儒大鼠的急性期去发挥抗病毒因子作用(Campbell,et al.,2015)，也有研究认为FAM46C的功能与调控基因转录有关(Chapman,et al.,2011)。

研究表明，FAM46基因在癌症患者体内会产生基因突变(Kuchta,et al.,2016)。最近的研究已经在不同的癌症患者中发现了FAM46蛋白的单点突变现象，例如，FAM46C点突变(Y247N)影响晚期精子形成和红细胞分化的终末期(Tian,2010)。对FAM46蛋白所有高度保守残基的突变进行分析发现，FAM46活性位点残基在许多恶性肿瘤中发生突变，这些突变对该蛋白质本身活性影响较大，并可能与确诊的癌症有关。除了多发性骨髓瘤，FAM46基因可能还参与其他癌症亚型的发病机制，如肝细胞癌、膀胱移行细胞癌、头颈部鳞状细胞癌等(Kuchta,et al.,2016)，提示FAM46基因可作为诊断某些癌症的分子标志物或治疗靶标。

已有的研究表明，血管生成是肿瘤发生发展的重要机制之一。研究发现，血管紧张素受体存在于大多数常见肿瘤细胞上，且其表达数量影响肿瘤的变化，如恶化程度和是否转移。这种现象与肿瘤新生血管生成增加受到血管紧张素Ⅱ介导有关(郭琳,2016)，另外，血管紧张素Ⅱ可通过激活信号通路增强某些癌细胞的增殖能力(钟小红,2014)。文献报道，血管紧张素II能诱导FAM46A基因表达上调(Barragan,et al.,2008)，表明FAM46A可能参与肿瘤的发生和侵袭等生理过程。由于FAM46蛋白具有非典型poly(A)聚合酶功能，能阻止mRNA的早期降解(Tian,2010)，暗示FAM46具有促进细胞生长的功能。Kanda等的研究表明，FAM46基因在胃癌组织中异常表达，这些证据表明，FAM46蛋白可能参与胃癌的发生和侵袭过程(Kanda,et al.,2018)。另外，胃癌患者术后血清中FAM46C基因水平较术前明显降低(Kanda,et al.,2018)，因此术前血清中FAM46C水平是胃癌患者预后的独立影响因素，可作为评估胃癌患者预后的生物标志物。由于单个分子标记难以精确地代表各种肿瘤特征，因此需要更可靠、更方便的预后模型来提高胃癌患者的长期生存。最新研究表明，FAM46C联合另外三个基因MAGED2、BTG1和SYT8，能比较客观的预后胃癌治疗(Kanda,et al.,2018)。

已有的肿瘤治疗药物多以促肿瘤生长的细胞因子及其受体为靶点来设计，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，在大多数原发性肿瘤的发生和转移过程中起关键作用(Ychou,et al.,2011)，目前开发了VEGF抗体及其受体拮抗剂(Wu and Swartz,2014)。单克隆抗体和分子抑制剂都属于常见的肿瘤治疗药物。

近年来单克隆抗体和分子抑制剂已成为多种恶性肿瘤的治疗药物。常见的单克隆抗体以VEGF-A为靶点设计。贝伐单抗在包括胃癌在内的多种实体肿瘤中均有活性，能阻断VEGF与相应受体的相互作用，以干扰肿瘤血管生成，从而阻止肿瘤的生长(De Vita,etal.,2012)。雷莫芦单抗能特异性阻断VEGFR-2的胞外结构域，并干扰肿瘤的血液供应，从而阻止肿瘤的生长(Krupitskaya and Wakelee,2009)。

分子抑制剂存在两类：受体拮抗剂和信号通路抑制剂。受体拮抗剂阻断细胞因子受体与受体结合，从而阻断下游信号通路转导，抑制肿瘤细胞生长活动。表皮生长因子受体(EGFR)的胞内胞质结构域具有酪氨酸激酶活性(Ciardiello and Tortora,2008)，与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。常见EGFR拮抗剂有西妥昔单抗、帕尼单抗、马妥珠单抗、尼妥珠单抗(Ciardiello and Tortora,2008；De Vita,et al.,2011；Rojo,et al.,2010)。酪氨酸激酶抑制剂(拉帕替尼、阿帕替尼、舒尼替尼和索拉非尼等)通过阻断酪氨酸蛋白激酶途径抑制肿瘤细胞增殖(Chow and Eckhardt,2007；De Vita,et al.,2014；Tian,et al.,2011；Wilhelm,et al.,2008)。吉非替尼是一种EGFR喹唑啉酪氨酸激酶抑制剂，埃罗替尼是EGFR酪氨酸激酶抑制剂，能可逆地阻断受体的ATP结合位点(Bareschino,et al.,2007；DeVita,et al.,2014)。PI3K/AKT/mTOR信号通路在包括胃癌在内的大部分癌症中被激活(Markman,et al.,2010)，针对该通路设计的靶药依维莫司，在I/II期研究和胃癌临床患者中显示出较好的疗效(Cidon,et al.,2013)。

目前还未见开发出以FAM46蛋白作为靶点的治疗药物制剂。由于FAM46蛋白参与胃癌的发生和侵袭过程(Kanda,et al.,2018)，因此，拮抗FAM46的药物制剂可能是未来的研究热点。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种与胃癌发生发展相关的miRNA标志物，所述标志物可以作为胃癌的特异性诊断标志物，应用于胃癌的发现；本发明的目的之二在于提供miRNA标志物在筛选治疗胃癌的候选药物中的应用。

为了研究与胃癌相关的miRNA在胃癌中的作用，从而筛选合适的miRNA。我们通过生物信息学技术及现代分子生物学技术从胃癌组织中找到了可以作为胃癌标志物的miR-93-5p。

因此，本发明一方面提供了一种miRNA，所述miRNA为miR-93-5p，所述检测miR-93-5p表达水平的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用。

优先地，本发明所述试剂为特异性扩增miR-93-5p的引物。

另一方面，本发明还提供了一种诊断胃癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测miR-93-5p表达水平的试剂。

优先地，本发明所述试剂为特异性扩增miR-93-5p的引物。

优先地，本发明所述特异性扩增miR-93-5p的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

再一方面，本发明还提供了一种miR-93-5p基因的用途，所述用途为用于制备治疗胃癌的药物组合物。

优先地，本发明所述药物组合物包括miR-93-5p基因的抑制剂。

优先地，本发明所述的药物组合物还包括FAM46C基因。

再一方面，本发明还提供了一种治疗胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括miR-93-5p基因的抑制剂，所述miR-93-5p基因的抑制剂为si-miR-93-5p，所述si-miR-93-5p的序列如SEQ ID NO.4所示。

优先地，本发明所述药物组合物还包括FAM46C基因，所述FAM46C基因如SEQ IDNO.5所示。

本发明通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，从胃癌组织中筛选到用于胃癌断和治疗的标志物miR-93-5p(miR-93-5p在胃癌组织中高表达)。在此基础上，本发明提供了检测miR-93-5p的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用。该应用包括诊断胃癌的试剂盒以及制备治疗胃癌的药物组合物。本发明的试剂盒能够作为胃癌诊断的手段之一。本发明的药物组合物对胃癌有较好的抑制作用，在胃癌治疗中具有重要的参考和现实意义。

附图说明

图1胃癌相关miRNA筛选及靶基因预测。A：胃癌miRNA表达芯片中差异表达miRNA交集情况，左侧圆形表是GSE93415表达芯片中的差异miRNA，右侧表示GSE78091芯片中的差异miRNA，中间部分表示两个芯片数据的交集。B：GSE93415中差异miRNA表达热图，横坐标表示样本编号，纵坐标表示miRNA名称，左侧树状图表示差异miRNA表达情况聚类，图中每一个小方块表示一个基因在一个样本中的表达水平，右上方直方图为色阶。C：GSE78091芯片中miR-93-5p的表达情况，横坐标表示样本类型，纵坐标表示miR-93-5p在该芯片中的表达情况，差异性p值位于左上角，左侧箱图表示正常样本中miR-93-5p表达情况，右侧箱图表示肿瘤组中miR-93-5p表达情况。

图2胃癌组织及胃癌细胞系miR-93-5p上调。A：miR-93-5p在胃癌患者癌组织和癌旁中的表达情况。B、C：miR-93-5p不同病理分期的胃癌组织中的表达情况。D、E：胃癌患者的OS和DFS Kaplan meier生存分析,绿色为高表达miR-93-5p的患者，蓝色为低表达miR-93-5p的患者。F:胃粘膜上皮永生化细胞和胃癌细胞系中的miR-93-5p的表达情况。

图3下调miR-93-5p抑制HepG2细胞迁移、侵袭。A：迁移和侵袭实验检测胃癌细胞的迁移侵袭能力(×200)，Blank组为未转染任何序列的空白对照，inhibitor NC组为转染inhibitor NC的对照组，miR-93-5p inhibitor组为转染miR-93-5p inhibitor的实验组。B、C：迁移和侵袭实验的量化分析结果图。D：转染inhibitor NC或miR-93-5p inhibitor后细胞株形态对比(×100)。E：免疫荧光检测EMT相关分子E-cadherin、vimentin和Snail的表达情况(×400)。F：WB检测FAM46C、E-cadherin、vimentin和Snail的表达情况及其量化结果图。

图4 FAM46C是miR-93-5p的靶基因。A：胃癌mRNA表达芯片GSE2685差异分析热图，横坐标表示差异p值，纵坐标表示logFC倍数，图中每一个小点表示一个基因，红色表示在胃癌中表达水平显著上调的基因，绿色表示在胃癌中表达水平显著下调的基因。黑色点没有显出差异表达的基因。B：miR-93-5p靶基因预测结果与GSE2685中表达下调基因交集结果，左侧圆形表示TargetScan数据库靶基因预测结果，右侧表示GSE2685芯片中表达下调的基因，中交表示两个数据的交集。C：miR-93-5p与FAM46C3’UTR、FOXA13’UTR的结合位点，MUT为相应的突变位点。D：荧光素酶双报告系统验证miR-93-5p与FAM46C3’UTR、FOXA1 3’UTR的结合情况。E：Western Blot检测胃粘膜上皮永生化细胞和胃癌细胞系中的FAM46CG的表达情况。F：miR-93-5p对FAM46C的影响(Western Blot检测)。

图5过表达FAM46C抑制HepG2细胞迁移、侵袭。A：迁移和侵袭实验检测过表达AHANK对胃癌细胞的迁移侵袭能力的影响(×200)，Blank组为未转染任何序列的空白对照，emptyvector组为转染empty vector组的对照组，FAM46C组为转染FAM46C过表达质粒，B：过表达AHANK对胃癌细胞的影响的迁移和侵袭实验的量化分析结果图。C:迁移和侵袭实验检测同时过表达AHANK和miR-93-5p mimic时，胃癌细胞的迁移侵袭能力的变化(×200),mimicsNC+empty vector组为mimics NC+empty vector共转染组，miR-93-5p mimic+emptyvector组为miR-93-5p mimic+empty vector共转染组，miR-93-5p mimic+FAM46C组为miR-93-5p mimic+FAM46C共转染。D：过表达AHANK对胃癌细胞的影响的迁移和侵袭实验的量化分析结果图。

图6miR-93-5p靶向抑制FAM46C调控wnt信号通路。A：WB检测wnt通路相关分子wnt-1、β-catenin及p-β-catenin的表达情况。B：TOP/FOPflash检测各组的β-catenin-TCF/LEF转录活性。TOPflash或FOPflash和Renilla质粒转染细胞，48小时后测定。荧光素酶活性与为海肾荧光活性的比值。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明经过广泛而深入的研究，通过生物信息学技术和分子生物学技术，检测胃癌组织中miRNA的表达水平，发现其中具有明显表达差异的miRNA片段，探讨其与胃癌的发生之间的关系，从而为胃癌的检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明发现胃癌组织中miR-93-5p显著性上调，并且通过大量实验证明，采用该miRNA具有较高的阳性检出率；进一步的细胞实验证明，改变胃癌组织的表达水平可以影响胃癌细胞的迁移和侵袭，提示miR-93-5p可以作为药物靶标用于胃癌的精准治疗。

“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与胃癌相关联的基因、基因的片段或变体。

在本发明的实施例中，一种代表性的人miR-93-5p基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。本发明的miR-93-5p核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明的miRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测miR-93-5p的表达。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。举例说明，本发明提供的试剂盒是基于qRT-PCR实验来源的，本发明不仅提供了一种检测miR-93-5p的引物，还提供了具体的检测方法，在此基础上，本发明可以提炼出一种用于检测miR-93-5p表达水平的qRT-PCR检测试剂盒。

这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。所述生物样品可以是例如细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物液体、血液样品、尿液样品或皮肤抑制剂和药物(组合物)。

基于发明人的发现，本发明提供了一种miR-93-5p的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制miR-93-5p基因的功能性表达即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以miR-93-5p基因为靶序列、且能够抑制miR-93-5p基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调miR-93-5p有用的物质，可用于治疗胃癌。

作为本发明的一种优选方式，所述miR-93-5p的抑制剂是一种miR-93-5p特异性的siRNA。在本发明的实施例中，该si-miR-93-5p在胃癌细胞中能够特异性的抑制miR-93-5p的表达，从而获得低表达或不表达miR-93-5p的胃癌组织，从而达到抑制胃癌的发生和发展。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

本发明的药物组合物包括miR-93-5p的抑制剂以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。在本发明的实施例中，本发明的药物组合物靶向抑制胃癌细胞的生长，从而达到抑制胃癌的发生和发展。另外，在本发明的另一实施例中，在裸鼠成瘤模型中，本发明的药物组合物具有良好的抑制胃癌发生和发展的作用。

当然，本发明的药物组合物还可与其他治疗胃癌的药物联用(如本发明中提及的FAM46C基因)，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、方法

1.胃癌相关miRNA及mRNA预测

利用GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，检索获取胃癌相关miRNA及mRNA表达芯片。利用R语言“limma”包，进行差异分析，以|logFC|>2，p value<0.05为差异基因筛选标准，并构建差异基因表达热图及火山图。利用TargetScan数据库(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测miR-93-5p的调控靶基因，利用Venn图构建网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，构建miRNA及靶基因交集Venn图。利用UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)，对TCGA胃癌数据库中FAM46C的表达水平进行检索。

2.研究对象及样本收集

共95例胃癌组织和癌旁组织来自从2012年1月到2015年12月在我院接受了根治性手术的胃癌患者。在手术之前患者没有接受过放疗或化疗手术。所有病例均由两位经验丰富的病理学家在组织学上独立诊断。于病案室收集临床资料(患名、性别、年龄、手术记录、病理号码、病理报告等)。整理分析临床病理资料，包括肿瘤大小(≤5cm和>5cm)、浸润深度(T1+T2+T3和T4)、淋巴结转移(N0/N1/N2/N3、TNM分期Ⅰ/Ⅱ/)、组织学分(G1/2/3/4)和脉管瘤(阴性/阳性)，其中TNM分期依照第七版《AJCC癌症分期手册》进行。组织标本的收取均已获得医院伦理委员会批准，并签署知情同意书。

3.分组及转染

4种人胃癌细胞系SUN-216(CBP60503，培养条件：RPMI-1640+10％FBS)，BGC-823(CBP60477，培养条件：RPMI 1640(w/o Hepes)with10％FBS)，MKN74(CBP60490，培养条件：RPMI-1640+10％FBS)和HGC-27(CBP60480，培养条件：MEM+1％NEAAwith 10％FBS)和人胃上皮细胞GES-1(CBP60512)购自南京科佰生物科技有限公司。细胞分组：inhibitorNC(订购于广州锐博)、miR-93-5p inhibitor组(转染miR-93-5p inhibitor，其为含有si-miR-93-5p的质粒，si-miR-93-5p的序列如SEQ ID NO.4所示)、Empty vector组(转染pCDH vector)、FAM46C组、(转染pCDH-FAM46C-vector)、miR-93-5p mimic+Empty vector组(转染miR-93-5p mimic+pCDH vector)、miR-93-5p mimic+FAM46C组(转染miR-93-5p mimic+pCDH-FAM46C--vector)、miR-93-5p mimic+DMSO组(转染miR-93-5p mimic+DMSO)、miR-93-5pmimic+DDK1组(转染miR-93-5p mimic+wnt通路抑制剂DDK1)。

4.qRT-PCR

运用Trizol(15596026，Invitrogen，Car，Cal，USA)法提取血清总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，用Nano-Drop ND-1000分光光度计测RNA浓度和纯度。按照反转录试剂盒说明书(购自北京全式金公司)在PCR扩增仪进行逆转录反应合成cDNA模版，设计miR-93-5p、FAM46C、U6和GADPH的引物，交由上海生工设计并合成(表1)。逆转录实验体系20μL，mRNA逆转录参照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(目录号AE301-02，北京全式金)说明书进行。取反应液进行实时荧光定量PCR，参照

Premix ExTaqTM II试剂盒(TaKaRa，大连，中国)说明书进行荧光定量PCR操作，反应体系为20μL：10μLSYBR Premix、cDNA模板2μL，上下游引物各0.6μL及DEPC水6.8μL。miRNA逆转录体系25μl，参照All-in-One^TM miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(AMRT-0020，GeneCopoeia，中国广州)说明书进行。取反应液进行实时荧光定量PCR，参照All-in-One^TM miRNA qPCR Kit(AMPR-0200，GeneCopoeia，中国广州)说明书进行荧光定量PCR操作，反应体系为20μL：应用美国ABI公司的7500型荧光定量PCR进行Real-time quantitative RT-PCR实验，检测miR-93-5p以U6作为内参基因，FAM46Cl基因以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，检测miR-93-5p、FAM46CU6表达水平。2-ΔΔCt表示实验组与对照组目的基因表达的倍比关系，公式如下:ΔCt＝CT(目的基因)-CT(内参)、ΔΔCT＝ΔCt实验组-ΔCt对照组。Ct为反应的实时荧光强度达到设定的阈值时所经过的扩增循环数，此时扩增是呈对数期增长。(此处实验重复3次)计算细胞中miR-93-5p和FAM46Cl表达量。实验至少重复三次。

表1 qRT-PCR目的基因及内参基因上下游引物

5.Western blot

提取组织和细胞蛋白，采用BCA试剂盒(20201ES76，翊圣生物科技有限公司，上海)测定蛋白浓度。根据不同浓度进行定量，每孔上样30μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后采用湿转方法将蛋白转至PVDF膜上，5％BSA室温下封闭1h。加入兔多克隆抗体Wnt1(1:25,ab15251，Abcam，Cambridge，UK)、兔多克隆抗体p-β-catenin(1/500,ab27798，Abcam，Cambridge，UK)、鼠单克隆抗体E-Cadherin(1:1000,ab76055，Abcam，Cambridge，UK)、兔多克隆抗体SNAIL(1：2000，ab180714，Abcam，Cambridge，UK)、鼠单克隆抗体vimentin(1:1000，ab20346，Abcam，Cambridge，UK)、兔单克隆抗体β-catenin(1：5000，ab32572，Abcam，Cambridge，UK)、鼠单克隆抗体FAM46C(1:500,ab68556，Abcam，Cambridge)。4℃过夜。使用TBST缓冲液处理对象3次，每次5min，再使用对应的的二抗在室温下孵育1h，反复清洗PDFV膜3次，每次5min。使用化学发光试剂是其显影，GAPDH作为内参。Bio-rad Gel Dol EZ成像仪(GEL DOC EZ IMAGER，Bio-rad，California，USA)显影。通过Image J系统分析目的条带灰度值。实验至少重复三次。

6.荧光素酶报告

使用生物学预测网站http://www.targetscan.org/vert_71进行miR-93-5p的靶基因分析，并验证FAM46C是否为miR-93-5p的直接靶基因。设计引物并扩增FAM46C基因3’UTR序列，与psiCHECK2载体连接获得双荧光素酶报告载体，命名为Wild Type(WT)；设计miR-93-5p种子序列和FAM46C基因3’UTR结合区的突变引物，使用引物重叠聚合酶链式反应(PCR)，以FAM46C基因3’UTR片段为模板，扩增得到FAM46C基因3’UTR的上下游片段，以上下游同源臂的混合物作为模板，PCR扩增得到含有突变结合位点的FAM46C基因3’UTR目的片段，利用酶切位点与psiCHECK2载体连接，获得FAM46C靶位点突变报告载体，命名为MutantType(MUT)。将测序正确的WT、MUT分别与miR-93-5p共转染至细胞HEK-293T(上海北诺生物科技有限公司)。转染48h后收集并裂解细胞，按照Genecopoeia公司的双荧光素酶检测试剂盒提供的操作方法检测在细胞中miR-93-5p对FAM46C 3’UTR的荧光素酶活性的改变。用Promega公司的Glomax20/20 luminometer荧光检测仪检测荧光强度。每组实验重复三次。

7.Transwell检测细胞迁移、侵袭

Matrigel(356234，BD，美国，新泽西州)在4℃过夜融化，需使用用4℃预冷的无血清RPMI-1640培养基是其稀释至终浓度为1mg/mL(要在冰上操作)；在Transwell小室(8μm孔径)上室底部中央垂直加入稀释后的Matrigel(80μl/孔)，使基质胶分布均匀，37℃温育4h；经过转染48h的细胞消化后，PBS和无血清DMEM培养基先后洗涤一次，用无血清DMEM培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为1×10⁶/mL；在下室(即24孔板底部)加入700μL含10％胎牛血清的DMEM培养基，上室加入细胞悬液，培养箱培养24小时；用镊子小心取出小室，吸干上室液体，4％多聚甲醛室温固定30分钟；0.05％结晶紫室温染色30min；轻轻用清水冲洗浸泡数次，用湿棉签仔细擦除去上室细胞；晾干，倒置显微镜(XSP-8CA，上海光学仪器厂，上海，中国)200X下取10个随机视野计数，统计结果。实验至少重复3次。

将Transwell小室放入24孔细胞培养板中，在每个小室上室聚碳酸酯膜上铺以Matrigel(2μg/μL)，下室加入含600μL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，分别取各组调整好细胞密度后的细胞悬液加入上室，细胞数为5×10⁴个/室，每组设置4个平行样本，37℃培养36h。吸弃小室内的培养液，取出小室，用棉签拭去膜基质和上室内表皮上的细胞，下室面用4％多聚甲醛固定30min，0.1％结晶紫室温染色20min后洗去染液，空气干燥，在光学显微镜下(×200)观察、照相，每张膜随机选取5个视野进行观察计数，并计算平均值。实验重复3次。

8.细胞形态观察

于前一天将合适密度(2×10⁴/孔)的细胞种植到六孔板中，5％血清的DMEM培养基中培养，次日，于倒置显微镜下观察各组细胞的形态特征。实验至少重复3次。

9.免疫荧光检测E-cadherin、vimentin、Snail的表达

常规消化转染后细胞，计数后铺于细胞爬片上生长24h。在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤)；PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；吸水纸吸掉封闭液，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；滴加DAPI复染核避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下察采集图像。实验至少重复3次。

10.TOPflash/FOP flash双荧光素酶报告基因分析

转染前1天，接种细胞于24孔板中(5×104/孔)，培养24小时；使用转染试剂FuGENE6或Lipofect2000共转染1000ng TOP flash(或FOP flash)质粒和100ng内对照内参质粒Renilla，继续培养24小时。然后细胞分为两组处理，不加蛋白处理组control)，加CTHRC1重组蛋白处理组(加含有10n M、20n M CTHRC1蛋白的1％FBS培液)蛋白处理24小时。将细胞种到不透光的白板96孔板中，按Dual-Glo Luciferase Assay Systerm检测试剂盒(E2920，Promega，美国)说明书操作，检测双荧光素酶Firefly Luciferase/Renlilla Luciferase活性。荧火虫荧光与海肾荧光比值做为统计量。

二、具体实施例

1.胃癌相关miRNA筛选

利用GEO数据库，检索获得胃癌miRNA表达芯片数据。对胃癌miRNA表达芯片GSE93415进行差异分析，最终获得76个差异表达miRNA。对GSE78091芯片进行差异分析，共获得113个差异表达miRNA。为了进一步筛选到胃癌相关的miRNA，对两个芯片中前20个显著差异表达的miRNA进行Venn分析，结果发现，在两个芯片的前20个显著差异表达的miRNA交集中，仅有一个miRNA，为miR-93-5p(图1A)。进一步在GSE93415和GSE78091中检索miR-93-5p的表达水平，结果发现，在这两个芯片中，miR-93-5p均是在胃癌样本中表现出高表达(图1B，C)。因此，将miR-93-5p确定为研究对象。

2.胃癌组织及胃癌细胞系miR-93-5p上调

miR-93-5p在胃癌与癌旁组织中的相对表达量，结果见(图2)：与癌旁组织比较，胃癌组织中miR-93-5p高表达(P<0.0001)(图2A)；且miR-93-5p的表达水平与患者肿瘤的病理分期相关，TNM分期越高，miR-93-5p在胃癌组织中的表达水平越高(图2B、C)；通过ROC曲线得出miR-93-5p的临界值为2.874，将miR-93-5p分成高表达(≥2.874)和低表达(<2.874)。miR-93-5表达水平与患者的OS和DFS相关，高表达miR-93-5p的患者具有较差的预后(图2D、E)。另外，相对人胃上皮细胞GES-1，在胃癌细胞系中(图2F)miR-93-5p高表达，其中HGC-27细胞中miR-93-5p表达最高(P<0.0001)。

3.下调miR-93-5p抑制HepG2细胞迁移、侵袭

与inhibitorNC组对比，miR-93-5p inhibitor组的迁移能力下降约两倍(显著降低)(P＝0.0006)；与inhibitorNC组对比，miR-93-5p inhibitor组的侵袭能力显著降低(P＝0.0001)(图3A-C)。通过迁移侵袭实验发现，在HepG2细胞中，竞争性抑制miR-93-5p后，细胞的迁移及侵袭能力均被抑制。通过倒置相差显微镜(OLYMPUS 100×)观察分别转染NCinhibitor、miR-93-5p inhibitor组的HepG2胞株发现NC inhibitor组细胞株具体表现为间质样形态特征，各个细胞大小差异较大，细胞多形性明显，细胞隙变大且较为分散，较为明显的伪足出现；miR-93-5p inhibitor组细胞株具体表现为具体表现为由间质样形态特征向上皮样形态特征转变，各个细胞大小类似，细胞聚集成团，形状呈类圆形，细胞之间接触紧密(图3D)免疫荧光实验显示，相比inhibitorNC组，miR-93-5p inhibitor组的间质标志物E-cadherin的表达量高；上皮标志物vimentin和Snail的荧光强度减弱(图3E)。另外，Western blot检测结果表明，相比inhibitor NC组，miR-93-5p inhibitor组的FAM46C表达升高，上皮标志物E-cadherin表达升高，间质标志物vimentin和Snail降低(图3F)。上述结果表明miR-93-5p促进胃癌细胞的上皮间质转化。

4.FAM46C是miR-93-5p的靶基因

为了进一步了解miR-93-5p的作用机制，在GEO数据库中，筛选获得胃癌mRNA表达芯片数据GSE13861。对该芯片中的差异表达基因进行差异分析，最终获得614个差异表达mRNA(图4A)。其中202个mRNA在胃癌中表达水平显著提高，412个mRNA在胃癌中表达水平显著降低。通过TargetScan数据库，对miR-93-5p在胃癌中的调控靶基因进行预测，并对预测结果中的535个基因与芯片GSE13861中显著下调的基因取交集(图4B)，在交集中获得2个基因，分别为FOXA1和FAM46C基因。

使用生物学预测网站microRNA.org进行miR-93-5p的靶向结合位点预测，结果表明miR-93-5p与FOXA1和FAM46C具有特异性结合位点(图4C)。荧光素酶双报告基因系统显示，当野生型FAM46C-WT存在时，与inhibitorNC相比，转染miR-93-5p inhibitor组的荧光酶活性被增加；但当FAM46C-MUT(突变了与miR-93-5p结合位点，图4D)存在时，miR-93-5pinhibitor组和inhibitor NC组的荧光素酶活性没有明显的变化；然而，无论是野生型FOXA1-WT还是FOXA1-MUT存在时，与inhibitorNC相比，转染miR-93-5p inhibitor组的荧光酶活性没有明显的变化(图4D)。因此，认为FOXA1不是miR-93-5p靶基因，而FAM46C基因极有可能是miR-93-5p的直接靶标基因。

另外，相对于永生化的胃粘膜上皮细胞RGM-1，在胃癌细胞系中AHANK表达降低，其中miR-93-5p表达最高的的HepG2细胞中AHANK表达最低(P＝0.0018)(图4E)，因此我们将miR-93-5p inhibitor转染到HepG2中并检测AHANK的变化，Western Blot实验发现，相比inhibitorNC组，miR-93-5p inhibitor组的FAM46C表达被明显的上调(P＝0.0001)(图F)。这表明，miR-93-5p可以直接靶向结合到FAM46C的3’UTR，并抑制FAM46C的表达。

5.miR-93-5p通过调控FAM46C促进HepG2细胞的上皮间质转化

与Empty vector组对比，FAM46C组HepG2细胞的迁移能力(P＝0.0003)和侵袭能力也受到抑制(p＝0.0029)(图5A、B)。表明FAM46C能够抑制细胞的迁移及侵袭能力。

与miR-93-5p mimic+Empty vector组对比，miR-93-5p mimic+FAM46C组HepG2细胞的迁移侵袭能力被抑制(图5C、D)。表明FAM46C能够抑制细胞的迁移及侵袭能力，并且miR-93-5p mimic可以减弱FAM46C引起的迁移侵袭能力的改变。

6.miR-93-5p靶向抑制FAM46C调控wnt信号通路

进一步对FAM46C基因在胃癌中的研究情况进行文献检索发现，目前FAM46C基因在胃癌中没有任何相关文献研究。但是，有研究指出，FAM46C基因与Wnt信号通路密切相关(PMID：28494797，25413884)，而Wnt信号通路被认为很大程度上影响了胃癌的发展程度(PMID：29805736，29689047)。这些分析结果及已有的报道暗示，在胃癌中，FAM46C基因极有可能是miR-93-5p的直接靶标基因，通过FAM46C基因，miR-93-5p能调控Wnt信号通路，从而影响胃癌的发展。

与inhibitor NC组对比，miR-93-5p inhibitor组的FAM46C被上调，wnt-1、β-catenin及p-β-catenin均被下调，wnt通路被抑制；与Empty vector组对比，FAM46C组的FAM46C被上调，wnt-1、β-catenin及p-β-catenin均被下调，wnt通路被抑制；与miR-93-5pmimic+Empty vector组对比，miR-93-5p mimic+FAM46C组的FAM46C被上调，wnt-1、β-catenin及p-β-catenin均被下调，wnt通路被抑制；与miR-93-5p mimic+DMSO组对比，miR-93-5p mimic+DDK1组的FAM46C无明显变化，wnt-1、β-catenin及p-β-catenin均被下调，wnt通路被抑制(图6A)。

在TOP/FOP flash luciferase assay检测中，与inhibitorNC组对比，miR-93-5pinhibitor组的β-catenin-TCF/LEF转录活性被抑制；与Empty vector组对比，FAM46C组的β-catenin-TCF/LEF转录活性被抑制；与miR-93-5p mimic+Empty vector组对比，miR-93-5p mimic+FAM46C组的β-catenin-TCF/LEF转录活性被抑制，恢复到Blank的水平；与miR-93-5p mimic+DMSO组对比，miR-93-5p mimic+DDK1组的β-catenin-TCF/LEF转录活性被明显抑制(图6B)；

综上，miR-93-5p mimic可以激活Wnt/β-catenin通路，过表达FAM46C可以抑制Wnt/β-catenin通路；同时FAM46C可以消除miR-93-5p mimic对Wnt/β-catenin通路的激活作用；另外的，加入DDK1也可以消除miR-93-5p mimic对Wnt/β-catenin通路的激活作用。因此我们认为，miR-93-5p靶向抑制FAM46C调控wnt信号通路。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

<110> 湖南省科域生物医药科技有限公司

<120> miR-93-5p作为诊断和治疗胃癌标志物的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> miR-93-5p核苷酸序列

<400> 1

ctgggggctc caaagtgctg ttcgtgcagg tagtgtgatt acccaaccta ctgctgagct 60

agcacttccc gagcccccgg 80

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccgccaaag tgctgttc 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagagcaggg tccgaggta 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> si-miR-93-5p序列

<400> 4

ctccaaagtg ctgttcgt 18

<210> 5

<211> 1305

<212> DNA

<213> FAM46C基因序列

<400> 5

gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacaagaaag 60

ttggcatggc agaggagagc agctgtacca gggattgcat gtccttcagc gtgctcaact 120

gggatcaggt tagccggctg catgaggtcc tcactgaagt tgtacctatc cacggacgag 180

gcaactttcc aaccttggag ataactctga aggacatcgt ccagaccgtc cgcagtcggc 240

tggaggaggc aggcatcaaa gtgcatgacg tccggctgaa tggctccgca gctggccacg 300

ttttggtcaa agacaatggc ttgggctgca aagacctgga cctaatcttc catgtggctc 360

ttccaacaga ggcagaattt cagctggtta gagatgtggt tctgtgttcc cttctgaact 420

tcctgccaga gggtgtgaac aagctcaaaa tcagtccagt cactctgaag gaggcatatg 480

tgcagaagct agtgaaggtt tgcacggaca ctgaccgctg gagcctgatc tccctctcca 540

acaagaacgg gaagaacgtg gagctgaagt ttgtcgactc cattcggcgt cagtttgagt 600

tcagtgtgga ctctttccaa atcatcctgg attctttgct tttcttctat gactgttcca 660

ataatcccat ctctgagcac ttccacccca ccgtgattgg ggagagcatg tacggggact 720

ttgaggaagc ttttgaccat ctgcagaaca gactgatcgc caccaagaac ccagaagaaa 780

tcagaggcgg gggacttctc aagtacagca accttcttgt gcgggacttc aggcccacag 840

accaggaaga aatcaaaact ctagagcgct acatgtgctc caggttcttc atcgacttcc 900

cggacatcct tgaacagcag aggaagttgg agacttacct tcaaaaccac ttcgctgaag 960

aagagagaag caagtacgac tacctcatga tccttcgcag ggtggtgaac gagagcaccg 1020

tgtgtctcat ggggcatgaa cgcaggcaga ctctgaacct catctccctc ctggccttgc 1080

gtgtgctggc ggaacaaaac atcatcccca gtgccaccaa cgtcacctgt tactaccagc 1140

cggcccctta cgtcagtgat ggcaacttca gcaactacta cgttgcccat cctccagtca 1200

cctacagcca gccttaccct acctggctgc cctgtaacta cccaactttc ttgtacaaag 1260

ttggcattat aagaaagcat tgcttatcaa tttgttgcaa cgaac 1305

Claims (10)

1.一种miRNA，所述miRNA为miR-93-5p，其特征在于，检测miR-93-5p表达水平的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为特异性扩增miR-93-5p的引物。

3.一种诊断胃癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测miR-93-5p表达水平的试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为特异性扩增miR-93-5p的引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增miR-93-5p的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

6.一种miR-93-5p基因的用途，其特征在于，用于制备治疗胃癌的药物组合物。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包括miR-93-5p基因的抑制剂。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物还包括FAM46C基因。

9.一种治疗胃癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括miR-93-5p基因的抑制剂，所述miR-93-5p基因的抑制剂为si-miR-93-5p，所述si-miR-93-5p的序列如SEQ IDNO.4所示。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括FAM46C基因，所述FAM46C基因如SEQ ID NO.5所示。

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