KR20190048327A

KR20190048327A - 위암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190048327A
Application number: KR1020170143200A
Authority: KR
Inventors: 이지연; 김경미
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2019-05-09
Also published as: US20190127806A1; KR102074559B1; US10815533B2

Abstract

본 발명은 위암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 FGFR2-ACSL5 융합 유전자 또는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는 위암의 항암제 내성 진단용 마커 조성물, 상기 융합 유전자의 mRNA 또는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는 위암의 항암제 내성 진단용 조성물 및 키트, 및 상기 바이오마커를 이용하여 위암의 항암제 내성을 진단하는 방법에 관한 것이다. 위암 환자유래 조직에서 본 발명에 따른 FGFR2-ACSL5 융합 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 검출함으로써 FGFR 억제제 치료 시 상기 약물에 대한 내성을 나타낼지 미리 진단할 수 있어 보다 적절한 치료를 적용하여 치료 효율성을 높일 수 있다.

Description

위암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도{Biomarker for diagnosis of anticancer drug resistance of gastric cancer and use thereof}

본 발명은 위암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 FGFR2-ACSL5 융합 유전자 또는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는 위암의 항암제 내성 진단용 마커 조성물, 상기 융합 유전자의 mRNA 또는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는 위암의 항암제 내성 진단용 조성물 및 키트, 및 상기 바이오마커를 이용하여 위암의 항암제 내성을 진단하는 방법에 관한 것이다.

섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor; FGF) 수용체인 FGFR1-4는 수용체-티로신 인산화효소(receptor-tyrosine kinase) 패밀리에 속하며, 상기 수용체에 리간드인 FGF가 결합하면 FGF 이합체가 이루어지면서 FGFR 복합체를 형성되어 수용체의 세포질 도메인에서 다중 티로신 잔기의 인산화효소 활성화 및 자가-인산화(auto-phosphorylation)가 유도된다. 결과적으로 하위의 PI3K(phosphoinositide 3-kinase)-AKT 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase)-ERK(extracellular signal regulated kinase) 신호전달 경로의 활성화가 일어난다. 위암(gastric cancer; GC)에서 FGFR2 증폭이 관찰되는 빈도는 2~9%로 보고되어 있으며, FGFR2 증폭과 MET 및 HER2의 증폭은 상호 배타적인 것으로 알려져 있다. 예컨대, 764명의 위암환자 샘플(백인 환자 408명, 한국 환자 356명)을 대상으로 FGFR2 증폭 여부를 스크리닝한 연구 결과 한국인 환자(4.2%, 15/356) 보다 백인 환자(7.4%, 30/408)에서 FGFR2 증폭이 다소 더 많이 나타나는 것이 보고되어 있다(Lancet. 2014; 383:31-39). 특히, FGFR2 증폭은 미만형 조직학적 아형(a diffuse histological subtype)을 갖는 한국인 환자와 관련이 있는 것으로 나타났으며, 백인[Hazards ratio (HR)]=2.37; 95% 신뢰 구간 (CI) 1.6-3.5; P=0.0001)]과 한국인 (HR=2.33, 95% CI 1.28-4.25, P=0.0129) 모두에서 현저히 짧은 전체 생존율을 나타내는 것으로 확인되었다.

한편, 전임상 결과를 통해 FGFR2가 증폭된 위암 세포주에서 AZD4547, BGJ398 및 LY2874455와 같은 다양한 FGFR 선택적, 저분자 억제제의 강력한 항종양 효능이 입증되었으며, 결과적으로 FGFR 선택적, 저분자 억제제 및 항체를 이용한 여러 임상 2상 시험이 현재 FGFR 억제 효능 시험을 위해 FGFR2가 증폭된 위암 환자를 대상으로 진행 중이다. 또한, 최근 FGFR2b+ 위암 환자를 대상으로 한 FGFR2b 아형에 선택적 단클론 항체인 FPA144에 대한 임상 1상 시험에서는 33%(9명 중 3명)의 반응률을 보인 것으로 보고되었다.

FGFR2 억제에 대한 내성 획득에 영향을 미친다고 여겨지는 몇 가지 인자로는 세포주 실험을 통해 mTOR, EGFR, HER, MET 및 PTEN의 결실이 보고되어 있으나, 아직까지 환자에서 FGFR2 억제제에 대한 내성 획득의 메카니즘은 규명되어 있지 않다. 따라서 상기 항암약물들에 대한 내성을 미리 진단하여 적절한 치료법을 적용하여 최상의 효과를 얻기 위해서는 상기 FGFR2 억제제에 대한 내성 획득 메커니즘 및 진단을 위한 바이오마커 규명이 필요하다.

본 발명자들은 FGFR2가 증폭되어 있는 위암 환자에서 FGFR 억제제 치료 후 이에 대한 내성이 나타난 것을 확인하였고 이러한 내성이 유발된 조직에 대하여 RNA 서열분석을 실시한 결과 상기 FGFR 억제제에 대한 내성을 유발하는 FGFR2-ACSL5 융합 전사체를 발견하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 위암의 항암제 내성을 진단할 수 있는 FGFR2-ACSL5 바이오마커 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FGFR2-ACSL5 융합 유전자 또는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 위암의 항암제 내성 진단용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 FGFR2-ACSL5 융합 유전자의 mRNA 또는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 위암의 항암제 내성 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 위암의 항암제 내성 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항암제는 FGFR(Fibroblast growth factor receptor) 억제제로서, 보다 구체적으로 LY2874455, AZD4547, 또는 BGJ398일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유전자의 mRNA를 검출하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질을 검출하는 제제는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에서 FGFR2-ACSL5 융합 유전자의 mRNA 또는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 위암의 항암제 내성 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 mRNA 검출은 RNA 서열분석(RNA sequencing), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 검출은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 생물학적 시료는 위암 환자유래 종양조직일 수 있다.

본 발명자들은 FGFR2가 증폭된 위암 환자에서 FGFR 억제제 치료 후 이에 대한 내성이 나타난 조직을 분석한 결과 FGFR2-ACSL5 융합 전사체의 존재를 발견하였고, 상기 융합 전사체가 발현되는 경우 FGFR 억제제에 대하여 내성이 유발됨을 최종 확인함으로써 본 발명에 따른 위암의 항암제 내성 진단용 바이오마커를 발굴하였다. 따라서 위암 환자유래 조직에서 본 발명에 따른 FGFR2-ACSL5 융합 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 검출함으로써 FGFR 억제제 치료 시 상기 약물에 대한 내성을 나타낼지 미리 진단할 수 있어 보다 적절한 치료를 적용하여 치료 효율성을 높일 수 있다.

도 1a는 위암환자에서 LY2874455 치료 전과 후의 컴퓨터 단층촬영(CT) 이미지이고, 도 1b는 LY2874455 치료 14개월 후 상기 약물에 대한 내성이 유발되어 복막의 파종 및 폐쇄성 위 조직이 생긴 위의 이미지이다.
도 2는 위암환자에서 진단 시(Initial diagnosis)와 LY2874455에 내성이 유발된 후(At acquired resistance to LY2874455)의 각 1차 종양 조직에 대하여 H&E 염색, FGFR2에 대한 IHC 및 FISH를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 RNA 서열분석을 통해 확인된 FGFR2-ACSL5 융합 전사체의 구조를 그림으로 도시한 것이다.
도 4a는 FGFR2가 증폭되어 있고 FGFR2-ACSL5 융합 단백질이 발현되는 환자유래 종양세포(PDC#1) 및 FGFR2가 증폭되어 있으나 상기 융합 단백질은 발현되지 않는 환자유래 종양세포(PDC#2) 각각에 대해 LY274455 또는 AZD4547를 다양한 농도로 처리한 후 세포 생존능을 분석한 결과이고, 도 4b는 상기 PDC#2 세포에 FGFR2-ACSL5 융합단백질을 인위적으로 발현시킨 다음 AZD4547를 처리하고 세포 생존능을 측정한 결과이다.
도 5a는 대조군 Ba/F3 세포(pcDNA(vector)), FGFR2을 단독으로 발현시킨 세포(FGFR2 only), 및 FGFR2-ACSL5 융합 단백질(FGFR2-ACSL5 fusion)을 발현시킨 세포의 IL3 농도에 따른 세포 증식을 보여주는 결과이고, 도 5b는 상기 세포들에 각각 AZD4547을 처리한 후 세포 생존능을 측정한 결과이다.

본 발명자들은 위암의 항암제 내성을 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 FGFR2-ACSL5 융합 유전자 또는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 위암의 항암제 내성 진단용 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에서 대상으로 하는 질환인 “위암(gastric cancer)”은 위에 생기는 악성 종양으로, 위 점막상피에서 생기는 위선암과 점막하층에서 생기는 악성림프종, 근육육종, 간질성 종양 등이 있으나, 대게는 위선암을 일컫는다. 본 발명에 있어서, 위암은 보다 바람직하게는 FGFR2가 증폭되어 있는 위암을 의미한다.

본 발명에 따른 항암제 내성 진단 바이오마커인 FGFR2-ACSL5 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “진단(diagnosis)”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 항암제에 대한 위암의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 발병한 위암이 항암제 내성을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 또는 항암제 내성 위암의 예후(prognosis), 예컨대 항암치료에 대한 암의 반응성 결정을 판정하는 것을 모두 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 항암제는 FGFR(Fibroblast growth factor receptor) 억제제일 수 있고, 보다 바람직하게는 각각 하기 화학식 구조를 갖는 LY2874455, AZD4547, 또는 BGJ398일 수 있으나 FGFR 억제제에 포함되는 약물이라면 이에 제한되지 않는다.

[LY2874455]

[AZD4547]

[BGJ398]

상기 유전자의 mRNA를 검출하는 제제는 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소, 효소, 또는 형광체 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

상기 단백질을 검출하는 제제는 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.

본 발명의 항암제 내성 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 피검자 유래의 생물학적 시료에서 FGFR2-ACSL5 융합 유전자의 mRNA 또는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 위암의 항암제 내성 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “항암제 내성 진단을 위한 정보제공방법”은 진단을 위한 예비적 단계로써 위암의 항암제 내성 진단을 위해 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것을 의미하며, 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.

본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 위 종양 조직일 수 있으나, 본 발명에 따른 항암제 내성 진단용 바이오마커를 검출할 수 있는 위암 환자유래 시료라면 이에 제한되지 않는다.

상기 mRNA 검출은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 RNA 서열분석(RNA sequencing), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 이루어질 수 있으며, 보다 바람직하게는 RNA 서열분석을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단백질 검출은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 위암에서 항암제 내성을 진단할 수 있는 바이오마커로써 본 발명에 따른 FGFR2-ACSL5 융합 유전자 또는 이의 단백질을 규명하였다.

본 발명의 일실시예에서는, 위암으로 판정 받은 환자가 FGFR 억제제인 LY2874455에 대한 감수성을 보이며 치료 효과가 있었으나 치료 14개월 후 재발과 함께 상기 약물에 대한 내성이 유발되었음을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 약물에 내성이 유발된 상기 환자의 위암 생검 조직을 이용해 IHC 및 FISH를 수행하여 FGFR2가 증폭되어 있는 것을 확인하였고, 단 내성이 유발되기 전 종양 조직보다 FGFR2의 증폭 정도가 감소되어 있는 것을 확인하였으며, 상기 결과에 기반하여 환자유래 종양 조직을 이용해 RNA 서열분석을 실시한 결과 내성을 나타내는 조직에서 FGFR2-ACSL5 융합 전사체가 발현되는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 융합 전사체가 상기 약물에 대한 내성 획득과 연관이 있는지 검증하기 위해, 모두 FGFR2가 증폭되어 있으나 상기 융합 전사체를 발현하는 환자유래 종양세포주(PDC#1) 및 융합 전사체를 발현하지 않는 환자유래 종양세포주(PDC#2)에 FGFR 억제제인 LY274455 또는 AZD4547를 처리한 결과 상기 PDC#1 세포주만 내성을 보이는 것을 확인하였으며, 나아가 PDC#2에 상기 융합 전사체를 인위적으로 발현시킨 경우 역시 내성이 나타나는 것을 확인하였다.

이에 더하여, FGFR2-ACSL5 융합의 효과를 FGFR2 증폭과 분리하여 조사하기 위해 Ba/F3 세포에서 동일한 실험을 실시한 결과 FGFR2-ACSL5 융합 전사체의 발현에 의해 FRFR 억제제인 항암제에 내성이 유도되는 것을 알 수 있었다(실시예 4 참조).

상기 실시예 결과를 통해 FGFR2-ACSL5 융합 유전자 또는 이의 단백질의 항암제 내성 진단용 바이오마커로써의 유효성을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 피험자

본 실험에 참여한 환자는 SMC에서 시행된 예비 분자 프로파일링 연구(등록 번호: NCT02141152)인 분자 스크리닝 프로그램에 등록되었으며, 연구 시작 전에 모든 참여자로부터 서면 동의서를 받은 후 실험을 진행하였다. 간략하게, 본 실험은 임상 시험 등록 자격이 있는 전이성 고형 종양 환자들을 대상으로 하였다.

1-2. RNA 서열분석, 유전자 발현 및 신호전달 조절 분석

환자 샘플을 이용해 RNA 서열분석을 실시하였으며 이를 통해 얻은 Fastq 파일을 bowtie 방법에 따라 인간 게놈 레퍼런스(hg19)에 매핑하였다. 유전자 당 판독 수를 생성하기 위해 Tophat을 이용하였고, FusionMap는 융합 후보물질을 발견하는데 이용하였다. 융합 접합과 각 유전자의 야생형 서열을 지지하는 실제 판독 수를 추론하기 위한 자체 방법을 개발하였다. 간략하게, 공개적으로 이용 가능한 GC 데이터로 환자의 유전자 발현 데이터를 보정하였다. STAD TCGA 프로젝트(종양=238, 정상=33)의 유전자 발현 데이터는 정규화 목적으로 사용하였다. 통계 알고리즘인 COMBAT는 플랫폼 및 배치 효과가 데이터 분석에 미치는 영향을 줄이기 위해 이용하였다. 배치 효과를 감소시킨 후, 정상 위 조직 유전자 발현 값의 평균 및 표준 편차를 사용하여 환자의 유전자 발현 수준을 표준화하였고, 개별적인 경로 변경 점수는 IPAS 방법에 따라 얻었다.

1-3. 실시간 qRT-PCR에 의한 FGFR2 융합 확인

FGF2 융합 전사체의 발현 유무를 검증하기 위해 qRT-PCR 분석을 실시하였다. 보다 구체적으로, 내성이 생긴 종양의 생검 조직(종양 함량> 70%) 및 1차 종양 생검을 통해 제조한 4개의 포르말린 고정 파라핀-포매 조직절편(4-μm 두께)으로부터 총 RNA를 추출한 다음, DNase를 처리하고 NanoDrop 8000 (Thermo-Scientific, Wilmington, DE)을 이용해 추출된 RNA의 농도 및 순도를 측정하였다. 이후 상기 RNA를 주형으로 하여 Superscript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용해 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR은 TaqMan Gene Expression Master Mix(Part No. 4369016, Applied Biosystems, Foster, City, CA), a Custom TaqMan Gene Expression FGFR2-ACSL5 fusion assay (Assay ID AI39SUU; Applied Biosystems), 및 융합 특이적 프라이머(5'-CCA GGT AAT GTA AAT GTA CAG CCA CCT GTG CAT TCT GTT TGA CCA TAA GCT TCA TAC ACC TCA TTG GTT GTG AGA GTG AGA ATT CGA TCC AAG TCT TCT ACC AAC TGC-3'; bold, primers; red, probe)를 이용해 실시하였다. 또한, GAPDH (Assay ID Hs99999905_m1; Applied Biosystems) 유전자의 발현수준을 함께 측정하여 보정에 이용하였다.

1-4. FISH 및 IHC를 통한 FGFR2 발현 확인

FISH는 ZytoLight SPEC FGFR2/CEN 10 Dual Color Probe(Z-2122-200, Zytovision, Bremerhaven, Germany)를 사용하여 수행하였다. 1 μm 두께의 종양 절편에 각각의 DNA 프로브 세트를 처리하고 37℃에서 밤새 배양한 다음, 형광현미경 하에서 샘플 당 20개 핵에서 하이브리드 신호를 측정하였다. 겹쳐있는 핵은 모두 배제하였고 명확한 경계를 가진 핵을 대상으로 평가하였으며, FGFR2:CEP17 FISH 신호 비율이 2.0 이상일 때 FGFR2 유전자가 증폭된 것으로 간주하였다.

한편, 위암 조직에서 FGFR2 단백질의 발현유무를 검증하기 위해 IHC를 실시하였다. 보다 구체적으로 포르말린으로 고정한 후 파라핀에 포매시킨 조직을 4 μm 두께로 절단한 다음, 상기 조직 절편을 탈 파라핀 화하고 재수화시켰다. 다음으로 항원 검색 및 내인성 퍼옥시다제를 차단한 후, 샘플에 1차 항체를 처리하고 15분 동안 배양하였다. 이후 Bond^TM Polymer Refine Detection, DS9800(Vision Biosystems, Melbourne, Australia)이 장착된 BOND-MAX 자동 면역 스테이너(Leica Biosystems, Melbourne, Australia)를 제조사의 프로토콜에 따라 이용하였다.

1-5. 환자유래 종양세포 배양

환자들로부터 악성 복수(Malignant ascites)를 수집하였고, 수집된 복수(1-5 L)를 50 mL 튜브에 나누어 담고 1500 rpm에서 10 분간 원심분리한 다음 인산염 완충액(PBS)으로 2회 세척하였다. 이후 세포 펠렛을 배양 배지로 재현탁하고 75 cm² 배양 플라스크에 분주한 다음, 10% 소태아 혈청(FBS), 0.5 g/mL 히드로코르티손(hydrocortisone)(Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 5 g/mL 인슐린 (PeproTech, Rocky Hill, NJ), 및 5 ng EGF(PeproTech)가 함유된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지에서 배양하였다. 병리학적 확인 후, 확인된 세포를 1 x 10⁶ 세포/10 mm 배양접시 또는 96-웰 플레이트에 5000 세포/웰로 분주하였고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 72시간 배양하였다. 이러한 조건은 면역 블롯팅(immunoblotting)과 세포 증식 억제(cell proliferation-inhibition) 결과를 분석할 때도 이용하였으며, 종양 유래 세포주의 증식 억제는 CellTiter-Glo® Reagent(Promega, Madison, WI)를 이용하여 확인하였다.

1-6. FGFR-ACSL5 구조체 제조

전장 FGFR2-ACSL5 cDNA는 MegaMan cDNA 라이브러리(Stratagene, La Jolla, CA)로부터 제조된 부분 단편을 스플라이싱하여 제조하였다. 이후 제조된 전장 FGFR2-ACSL5 cDNA를 EcoRI/PmeI 부위를 사용하여 pcDNA3.1(Invitrogen)에 삽입하였고, 구조체의 개방형 해독틀(the open reading frames; ORFs)을 확인하기 위해 ABI 3730x1 DNA 분석기(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)를 이용해 서열분석을 실시하였다.

1-7. 세포주 및 트랜스펙션

Ba/F3 세포는 RIKEN BRC CELL BANK(Ibaraki, Japan)에서 구입하여 10% 소 태아혈청(FBS) 및 1 ng/mL 재조합 IL3(R & D Systems)가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 상기 배양한 5 x 10⁵개의 세포에 Nucleofector system(Lonza, Basel, Switzerland)을 이용해 2.5 mg의 pcDNA3.1/FGFR2 구조체, pcDNA3.1/FGFR2-ACSL5 융합 구조체, 또는 모벡터인 pcDNA3.1을 전기천공법을 통해 도입하였다. 이후 G418을 함유하는 배지에서 상기 구조체들이 도입된 세포를 2주 동안 선별하고, 면역 블롯팅을 통해 전장 융합 전사물의 발현을 확인하였다. 한편, 세포 생존능을 검증하기 위해, 웰 당 5 x 10³ 개의 Ba/F3 세포를 다양한 농도의 IL3 또는 AZD4547이 처리된 96-웰 플레이트에서 4회 반복하여 분주하고 72 시간 후, CellTiter-Glo를 사용하여 분석하였다.

1-8. 면역블롯 분석

단백질 분해효소 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail, Roche) 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail, Roche)이 함유된 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich)을 사용하여 세포로부터 총 단백질을 추출하고, Quick Start Bradford Protein Assay(Bio-Rad, Hercules, CA)를 통해 단백질 농도를 측정하였다. 면역 블롯팅을 실시하기 위해, 30 μg의 단백질을 사용해 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 수행한 후 크기별로 분리된 단백질을 트랜스퍼 과정을 통해 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitocellulose membranes)으로 이동시켰다. 다음으로, 상기 멤브레인에 0.1% v/v Tween 20이 함유된 Tris-완충 식염수에 5% nonfat dry milk를 희석한 용액을 처리하여 블로킹 과정을 수행하고, anti-FGFR2(Abcam, Cambridge, UK) 또는 anti-beta actin(Sigma Aldrich) 항체를 처리한 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 홀스레디쉬 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase)가 접합된 항-토끼 또는 항-마우스 IgG 2차 항체(Vector, Burlingame, CA)를 멤브레인에 처리하여 반응시킨 다음, ECL Western Blotting Substrate(Thermo Scientific)를 이용하여 화학발광을 통해 단백질 시그널을 검출하였으며 LAS-4000(Fujifilm, Tokyo, Japan)을 이용해 상기 시그널을 시각화하였다.

실시예 2. Case presentation

한 37세 여성이 체중 감소 및 구토 증상을 보여 위내시경 검사 (Esophagogastroduodenoscopy, EGD)를 실시한 결과 위장 전체를 따라 홍반, 부스러기, 비대가 동반된 적색의 점막 변화, 확산이 관찰되었으며, Bormann type-4 위암이 진행되어 십이지장으로의 침범이 나타났다. 따라서 내시경적 조직검사를 수행하였으며 이와 함께 위장의 병리학적 검사를 통해 반지세포 암종임을 확인하였다. 이에 따라 치료를 위해 복강경 수술을 실시하였으나 산재성의 복막의 파종이 나타나 개폐 수술은 불가능하였으며, 종양은 HER2 음성으로 확인되었다.

상기 환자에 대해 8주기(cycle)의 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 카페시타빈(capecitabine) 요법을 실시하였고 부분적인 반응을 보였다. 진행 과정에서 환자에 2주마다 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)과 이리노테칸(irinotecan)(FOLFIRI)을 12주기로 실시하였으며, 가장 좋은 부분반응을 보였다. 2차 항암 화학요법 동안에는 바터팽대부의 암적 침윤 때문에 담관이 막혀 스텐트를 삽입하였다. 그러나 FOLFIRI의 마지막 주기 치료 직후에 암 진행으로 인한 종양 폐쇄가 발생하였고 폐쇄 증상을 완화하기 위한 스텐트 삽입이 이루어졌다. 또한 3차 완화 화학요법으로 1일과 8일에 주입한 8주 주기의 도세탁셀(docetaxel)을 매 3주마다 투여했다. 이후 상기 환자는 FGFR1-4의 자가인산화를 억제하는 pan-FGFR 억제제인 LY2874455의 임상 1상 시험에 등록하였으며, 복수가 완전히 사라진 상태에서 LY287445로 치료한 직후에 증상이 상당히 개선된 것을 확인하였다.

그러나 LY2874455 치료 14개월 후, 상기 환자에서 갑작스럽게 상부 위장관 폐쇄 증상이 발병하였다. 환자는 완전한 유전체 검사를 위해 전사체 프로파일링(transcriptomic profiling)에 동의하였으며, 이를 위해 LY2874455에 대한 내성을 획득 시 상부 위장관 스텐트 재삽입 및 내시경 생검을 수행한 후 total RNA 서열분석과 표적 증폭을 수행하였다.

도 1a에 LY2874455의 치료 전과 후 상기 환자의 컴퓨터 단층촬영 사진을 나타내었으며, 도 1b를 통해 LY2874455 치료 14개월 후 LY2874455에 대한 내성이 유발된 조직을 확인할 수 있다.

실시예 3. FGFR 억제제에 대한 내성 획득 종양조직에서 FGFR2-ACSL5 융합 전사체 발현 확인

상기 실시예 2의 환자는 pan-FGFR 억제제인 LY2874455에 대한 내성이 유발되었는바, 상기 환자의 종양 조직에서 FGFR2의 발현유무를 검증하고자 하였다. 이를 위해, 진단 시와 상기 약물에 대한 내성이 유발된 후의 1차 위암 조직에 대하여 IHC 및 FISH를 실시하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 상기 약물에 내성을 나타내는 종양 조직의 막 및 세포질 모두에서 FGFR2의 발현이 증폭되어 있는 것을 확인하였다. 그러나 FISH 결과 내성이 유발되기 전의 종양 조직은 FGFR2 유전자 카피 수가 52.5인 반면 내성이 유발된 조직에서는 2.5카피가 검출되어 FGFR2가 상기 두 경우의 종양 조직에서 모두 과발현되어 있으나 과발현 정도가 상이한 것을 확인하였다. 또한 상기 두 조직에 대하여 표적 서열분석을 실시한 결과 FGFR2 증폭 이외의 FGFR2 돌연변이 또는 수차는 검출되지 않았다.

상기 결과에 기반하여 본 발명자들은 RNA 전사체 서열분석을 실시하였다. 그 결과 상기 약물에 대한 내성을 나타내는 종양 조직에서 새로운 FGFR2-ACSL5 융합 단백질이 존재하는 것을 확인하였다. 보다 구체적으로 도 3의 그림으로 도시한 바와 같이 상기 융합 단백질은 FGFR2(NM_022970)가 시작부터 774번째 아미노산까지 존재하고, 775번째 아미노산 자리부터는 ACSL5(NM_016234)의 502번째 코돈으로 이어진 구조임을 확인하였다. 또한 상기 융합체가 Ig2, I-set, FGFR2의 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 도메인 및 ACSL5의 절단된 AMP-결합(AMP-binding) 도메인을 포함하는 것을 확인하였다. 또한, 자체 개발한 융합 판독 검증 방법을 통해 215개의 판독 값이 융합 접합점과 정확하게 일치하는 반면 26개 및 136개는 야생형 FGFR2 및 ACSL5 유전자의 발현을 보여주었다. 유전자 융합을 보여주는 많은 판독 수는 FGFR2의 융합된 형태가 내성이 유발된 종양에서 발현이 증가되었음을 의미하는 것이다. 이를 검증하기 위해 qRT-PCR 분석을 실시한 결과, 내성이 유발된 종양에서 FGFR2-ACSL5 융합 전사체의 수준이 현저하게 증가한 것을 확인하였으나, 치료 전과 기저 종양 조직에서는 상기 융합 전사체가 발현되지 않는 것을 확인하였다.

위암환자에서 FGFR2 유전자의 발현은 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 보고된 GC 코호트와 비교할 때 현저히 증가되어 있는 것을 확인하였다(이상 값 통계: 3.156). FGFR2는 수용체 티로신 키나아제 중에서 상향 조절되는 유전자로, 이는 FGFR2 융합 전사체의 과발현이 환자의 내성 획득에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다. 환자에서 상향조절된 20가지 경로 중 3가지 경로는 PI3K-AKT-mTOR 축(PID ARF6 경로, BioCarta AKT 경로 및 PID PI3KCI 경로)과 관련 있는 것을 확인하였으며, 주목할만한 것은 인산화된 FGFR2가 어댑터 단백질인 FSR2를 통해 PI3K와 AKT 통로를 활성화 할 수 있다는 것이다. GC의 ACRG 분자 분류에 따르면, 상기 환자의 종양은 간엽성 위암(mesenchymal subtype)으로 분류되었으나, 종양에서 이러한 경로의 상향 조절이 FGFR2-ASCL5 융합 생성물의 높은 발현에 의한 것인지는 명확하지 않다.

실시예 4. FGFR2-ACSL5 융합과 FGFR 억제제에 대한 내성의 연관성 확인

본 발명자들은 상기 융합 단백질이 내성 획득에 미치는 영향을 더욱 자세히 조사하기 위하여, FGFR2가 2.5카피로 증폭되어 있고 FGFR2-ACSL5 융합 단백질이 발현되는 환자유래 종양세포주(PDC#1)를 확립하였고, 또한 화학요법 치료를 받지 않았고 FGFR2가 증폭되어 있으나 상기 융합된 단백질은 존재하지 않는 위암 환자유래 종양세포주(PDC#2)를 확립하였다.

먼저 상기 두 세포주에 각각 FGFR 억제제인 LY274455 또는 AZD4547를 농도별로 처리한 후 세포 생존능을 측정하였다. 그 결과 도 4a에 나타낸 바와 같이, PDC#1은 LY274455과 AZD4547 모두에 내성을 나타낸 반면(각각 2.9 μM 및 > 10 μM IC₅₀), FGFR2 융합체가 존재하지 않고 증폭만 되어 있는 PDC#2는 내성을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 다음으로 본 발명자들은 PDC#2에 FGFR2-ACSL5 융합 구조체를 트랜스펙션한 후 1 μM의 AZD4547을 처리하고 세포 생존능을 측정하였다. 그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 FGFR 억제제에 민감한 FGFR2가 증폭된 환자유래 종양세포주(PDC)에 FGFR2-ACSL5 융합체를 도입시킨 결과 상대적으로 FGFR 억제제에 대하여 내성을 나타내었다(cell viability of 86.6% vs 59.2%; 1 μM AZD4547, P < 0.0001).

나아가 FGFR2-ACSL5 융합의 효과를 FGFR2 증폭과 분리하여 조사하기 위해, Ba/F3 세포에 FGFR2-ACSL5 융합 구조체를 트랜스펙션하였다. 그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 상기 쥐의 조혈모세포주는 IL3에 의존적이며 FGFR2-ACSL5 융합 단백질의 발현에 의해 IL3에 독립적으로 형질전환되었다. 또한 도 5b에 나타낸 바와 같이 동질유전자의 Ba/F3-FGFR2 세포는 AZD4547에 대해 민감성을 나타낸 반면 Ba/F3-FGFR2-ACSL5 세포는 상기 약물에 내성이 유도된 것을 확인하였다.

종합적으로, FGFR2-ACSL5 융합이 AZD4547에 대한 내성과 관련있으며, 현재 FGFR2 억제제는 FGFR2가 증폭된 종양 환자에서의 치료제로써 사용되고 있다는 것이다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Biomarker for diagnosis of anticancer drug resistance of gastric cancer and use thereof <130> PD17-064 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3042 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGFR2-ACSL5 fusion <400> 1 atggtcagct ggggtcgttt catctgcctg gtcgtggtca ccatggcaac cttgtccctg 60 gcccggccct ccttcagttt agttgaggat accacattag agccagaaga gccaccaacc 120 aaataccaaa tctctcaacc agaagtgtac gtggctgcgc caggggagtc gctagaggtg 180 cgctgcctgt tgaaagatgc cgccgtgatc agttggacta aggatggggt gcacttgggg 240 cccaacaata ggacagtgct tattggggag tacttgcaga taaagggcgc cacgcctaga 300 gactccggcc tctatgcttg tactgccagt aggactgtag acagtgaaac ttggtacttc 360 atggtgaatg tcacagatgc catctcatcc ggagatgatg aggatgacac cgatggtgcg 420 gaagattttg tcagtgagaa cagtaacaac aagagagcac catactggac caacacagaa 480 aagatggaaa agcggctcca tgctgtgcct gcggccaaca ctgtcaagtt tcgctgccca 540 gccgggggga acccaatgcc aaccatgcgg tggctgaaaa acgggaagga gtttaagcag 600 gagcatcgca ttggaggcta caaggtacga aaccagcact ggagcctcat tatggaaagt 660 gtggtcccat ctgacaaggg aaattatacc tgtgtagtgg agaatgaata cgggtccatc 720 aatcacacgt accacctgga tgttgtggag cgatcgcctc accggcccat cctccaagcc 780 ggactgccgg caaatgcctc cacagtggtc ggaggagacg tagagtttgt ctgcaaggtt 840 tacagtgatg cccagcccca catccagtgg atcaagcacg tggaaaagaa cggcagtaaa 900 tacgggcccg acgggctgcc ctacctcaag gttctcaagc actcggggat aaatagttcc 960 aatgcagaag tgctggctct gttcaatgtg accgaggcgg atgctgggga atatatatgt 1020 aaggtctcca attatatagg gcaggccaac cagtctgcct ggctcactgt cctgccaaaa 1080 cagcaagcgc ctggaagaga aaaggagatt acagcttccc cagactacct ggagatagcc 1140 atttactgca taggggtctt cttaatcgcc tgtatggtgg taacagtcat cctgtgccga 1200 atgaagaaca cgaccaagaa gccagacttc agcagccagc cggctgtgca caagctgacc 1260 aaacgtatcc ccctgcggag acaggtaaca gtttcggctg agtccagctc ctccatgaac 1320 tccaacaccc cgctggtgag gataacaaca cgcctctctt caacggcaga cacccccatg 1380 ctggcagggg tctccgagta tgaacttcca gaggacccaa aatgggagtt tccaagagat 1440 aagctgacac tgggcaagcc cctgggagaa ggttgctttg ggcaagtggt catggcggaa 1500 gcagtgggaa ttgacaaaga caagcccaag gaggcggtca ccgtggccgt gaagatgttg 1560 aaagatgatg ccacagagaa agacctttct gatctggtgt cagagatgga gatgatgaag 1620 atgattggga aacacaagaa tatcataaat cttcttggag cctgcacaca ggatgggcct 1680 ctctatgtca tagttgagta tgcctctaaa ggcaacctcc gagaatacct ccgagcccgg 1740 aggccacccg ggatggagta ctcctatgac attaaccgtg ttcctgagga gcagatgacc 1800 ttcaaggact tggtgtcatg cacctaccag ctggccagag gcatggagta cttggcttcc 1860 caaaaatgta ttcatcgaga tttagcagcc agaaatgttt tggtaacaga aaacaatgtg 1920 atgaaaatag cagactttgg actcgccaga gatatcaaca atatagacta ttacaaaaag 1980 accaccaatg ggcggcttcc agtcaagtgg atggctccag aagccctgtt tgatagagta 2040 tacactcatc agagtgatgt ctggtccttc ggggtgttaa tgtgggagat cttcacttta 2100 gggggctcgc cctacccagg gattcccgtg gaggaacttt ttaagctgct gaaggaagga 2160 cacagaatgg ataagccagc caactgcacc aacgaactgt acatgatgat gagggactgt 2220 tggcatgcag tgccctccca gagaccaacg ttcaagcagt tggtagaaga cttggatcga 2280 attctcactc tcacaaccaa tgaggaatac ttggacctca gccaaacaga atgcacaggt 2340 ggctgtacat ttacattacc tggggactgg acatcaggtc acgttggggt gcccctggct 2400 tgcaattacg tgaagctgga agatgtggct gacatgaact actttacagt gaataatgaa 2460 ggagaggtct gcatcaaggg tacaaacgtg ttcaaaggat acctgaagga ccctgagaag 2520 acacaggaag ccctggacag tgatggctgg cttcacacag gagacattgg tcgctggctc 2580 ccgaatggaa ctctgaagat catcgaccgt aaaaagaaca ttttcaagct ggcccaagga 2640 gaatacattg caccagagaa gatagaaaat atctacaaca ggagtcaacc agtgttacaa 2700 atttttgtac acggggagag cttacggtca tccttagtag gagtggtggt tcctgacaca 2760 gatgtacttc cctcatttgc agccaagctt ggggtgaagg gctcctttga ggaactgtgc 2820 caaaaccaag ttgtaaggga agccatttta gaagacttgc agaaaattgg gaaagaaagt 2880 ggccttaaaa cttttgaaca ggtcaaagcc atttttcttc atccagagcc attttccatt 2940 gaaaatgggc tcttgacacc aacattgaaa gcaaagcgag gagagctttc caaatacttt 3000 cggacccaaa ttgacagcct gtatgagcac atccaggatt ag 3042 <210> 2 <211> 1013 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGFR2-ACSL5 fusion <400> 2 Met Val Ser Trp Gly Arg Phe Ile Cys Leu Val Val Val Thr Met Ala 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Ala Arg Pro Ser Phe Ser Leu Val Glu Asp Thr Thr 20 25 30 Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Thr Lys Tyr Gln Ile Ser Gln Pro Glu 35 40 45 Val Tyr Val Ala Ala Pro Gly Glu Ser Leu Glu Val Arg Cys Leu Leu 50 55 60 Lys Asp Ala Ala Val Ile Ser Trp Thr Lys Asp Gly Val His Leu Gly 65 70 75 80 Pro Asn Asn Arg Thr Val Leu Ile Gly Glu Tyr Leu Gln Ile Lys Gly 85 90 95 Ala Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Ala Cys Thr Ala Ser Arg Thr 100 105 110 Val Asp Ser Glu Thr Trp Tyr Phe Met Val Asn Val Thr Asp Ala Ile 115 120 125 Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Ala Glu Asp Phe Val 130 135 140 Ser Glu Asn Ser Asn Asn Lys Arg Ala Pro Tyr Trp Thr Asn Thr Glu 145 150 155 160 Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Lys 165 170 175 Phe Arg Cys Pro Ala Gly Gly Asn Pro Met Pro Thr Met Arg Trp Leu 180 185 190 Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Gln Glu His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys 195 200 205 Val Arg Asn Gln His Trp Ser Leu Ile Met Glu Ser Val Val Pro Ser 210 215 220 Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile 225 230 235 240 Asn His Thr Tyr His Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro 245 250 255 Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Ala Ser Thr Val Val Gly Gly 260 265 270 Asp Val Glu Phe Val Cys Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile 275 280 285 Gln Trp Ile Lys His Val Glu Lys Asn Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Asp 290 295 300 Gly Leu Pro Tyr Leu Lys Val Leu Lys His Ser Gly Ile Asn Ser Ser 305 310 315 320 Asn Ala Glu Val Leu Ala Leu Phe Asn Val Thr Glu Ala Asp Ala Gly 325 330 335 Glu Tyr Ile Cys Lys Val Ser Asn Tyr Ile Gly Gln Ala Asn Gln Ser 340 345 350 Ala Trp Leu Thr Val Leu Pro Lys Gln Gln Ala Pro Gly Arg Glu Lys 355 360 365 Glu Ile Thr Ala Ser Pro Asp Tyr Leu Glu Ile Ala Ile Tyr Cys Ile 370 375 380 Gly Val Phe Leu Ile Ala Cys Met Val Val Thr Val Ile Leu Cys Arg 385 390 395 400 Met Lys Asn Thr Thr Lys Lys Pro Asp Phe Ser Ser Gln Pro Ala Val 405 410 415 His Lys Leu Thr Lys Arg Ile Pro Leu Arg Arg Gln Val Thr Val Ser 420 425 430 Ala Glu Ser Ser Ser Ser Met Asn Ser Asn Thr Pro Leu Val Arg Ile 435 440 445 Thr Thr Arg Leu Ser Ser Thr Ala Asp Thr Pro Met Leu Ala Gly Val 450 455 460 Ser Glu Tyr Glu Leu Pro Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp 465 470 475 480 Lys Leu Thr Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu Gly Cys Phe Gly Gln Val 485 490 495 Val Met Ala Glu Ala Val Gly Ile Asp Lys Asp Lys Pro Lys Glu Ala 500 505 510 Val Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp Asp Ala Thr Glu Lys Asp 515 520 525 Leu Ser Asp Leu Val Ser Glu Met Glu Met Met Lys Met Ile Gly Lys 530 535 540 His Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Gln Asp Gly Pro 545 550 555 560 Leu Tyr Val Ile Val Glu Tyr Ala Ser Lys Gly Asn Leu Arg Glu Tyr 565 570 575 Leu Arg Ala Arg Arg Pro Pro Gly Met Glu Tyr Ser Tyr Asp Ile Asn 580 585 590 Arg Val Pro Glu Glu Gln Met Thr Phe Lys Asp Leu Val Ser Cys Thr 595 600 605 Tyr Gln Leu Ala Arg Gly Met Glu Tyr Leu Ala Ser Gln Lys Cys Ile 610 615 620 His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Thr Glu Asn Asn Val 625 630 635 640 Met Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Asn Asn Ile Asp 645 650 655 Tyr Tyr Lys Lys Thr Thr Asn Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala 660 665 670 Pro Glu Ala Leu Phe Asp Arg Val Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp 675 680 685 Ser Phe Gly Val Leu Met Trp Glu Ile Phe Thr Leu Gly Gly Ser Pro 690 695 700 Tyr Pro Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly 705 710 715 720 His Arg Met Asp Lys Pro Ala Asn Cys Thr Asn Glu Leu Tyr Met Met 725 730 735 Met Arg Asp Cys Trp His Ala Val Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Lys 740 745 750 Gln Leu Val Glu Asp Leu Asp Arg Ile Leu Thr Leu Thr Thr Asn Glu 755 760 765 Glu Tyr Leu Asp Leu Ser Gln Thr Glu Cys Thr Gly Gly Cys Thr Phe 770 775 780 Thr Leu Pro Gly Asp Trp Thr Ser Gly His Val Gly Val Pro Leu Ala 785 790 795 800 Cys Asn Tyr Val Lys Leu Glu Asp Val Ala Asp Met Asn Tyr Phe Thr 805 810 815 Val Asn Asn Glu Gly Glu Val Cys Ile Lys Gly Thr Asn Val Phe Lys 820 825 830 Gly Tyr Leu Lys Asp Pro Glu Lys Thr Gln Glu Ala Leu Asp Ser Asp 835 840 845 Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Arg Trp Leu Pro Asn Gly Thr 850 855 860 Leu Lys Ile Ile Asp Arg Lys Lys Asn Ile Phe Lys Leu Ala Gln Gly 865 870 875 880 Glu Tyr Ile Ala Pro Glu Lys Ile Glu Asn Ile Tyr Asn Arg Ser Gln 885 890 895 Pro Val Leu Gln Ile Phe Val His Gly Glu Ser Leu Arg Ser Ser Leu 900 905 910 Val Gly Val Val Val Pro Asp Thr Asp Val Leu Pro Ser Phe Ala Ala 915 920 925 Lys Leu Gly Val Lys Gly Ser Phe Glu Glu Leu Cys Gln Asn Gln Val 930 935 940 Val Arg Glu Ala Ile Leu Glu Asp Leu Gln Lys Ile Gly Lys Glu Ser 945 950 955 960 Gly Leu Lys Thr Phe Glu Gln Val Lys Ala Ile Phe Leu His Pro Glu 965 970 975 Pro Phe Ser Ile Glu Asn Gly Leu Leu Thr Pro Thr Leu Lys Ala Lys 980 985 990 Arg Gly Glu Leu Ser Lys Tyr Phe Arg Thr Gln Ile Asp Ser Leu Tyr 995 1000 1005 Glu His Ile Gln Asp 1010

Claims

FGFR2-ACSL5 융합 유전자 또는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 위암의 항암제 내성 진단용 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 항암제는 FGFR(Fibroblast growth factor receptor) 억제제인 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
제4항에 있어서,
상기 억제제는 LY2874455, AZD4547, 또는 BGJ398인 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
FGFR2-ACSL5 융합 유전자의 mRNA 또는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 위암의 항암제 내성 진단용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
제6항에 있어서,
상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
제6항에 있어서,
상기 항암제는 FGFR(Fibroblast growth factor receptor) 억제제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제9항에 있어서,
상기 억제제는 LY2874455, AZD4547, 또는 BGJ398인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제6항에 있어서,
상기 유전자의 mRNA를 검출하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제6항에 있어서,
상기 단백질을 검출하는 제제는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제6항의 조성물을 포함하는, 위암의 항암제 내성 진단용 키트.
피검자 유래의 생물학적 시료에서 FGFR2-ACSL5 융합 유전자의 mRNA 또는 상기 융합 유전자가 암호화하는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 위암의 항암제 내성 진단을 위한 정보제공방법.
제14항에 있어서,
상기 mRNA 검출은 RNA 서열분석(RNA sequencing), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제14항에 있어서,
상기 단백질 검출은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제14항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 위암 환자유래 종양조직인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.