JP6493681B2 - 肺がんで見出された新規融合遺伝子 - Google Patents
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Description
[1]がんの責任変異(ドライバー変異)である遺伝子融合の検出方法であって、がんを有する被験者由来の単離された試料における下記(a)〜(e)のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法:
(a)EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドであって、EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドであって、KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドであって、BRAFのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(d)CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、CD74の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;ならびに
(e)SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、SLC3A2の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[2]融合ポリヌクレオチドが下記(a)〜(e)のいずれかである、[1]に記載の方法:
(a)下記のポリペプチドをコードするEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド:
(i)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド;
(b)下記のポリペプチドをコードするKIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド:
(i)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号4で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド;
(c)下記のポリペプチドをコードするTRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド:
(i)配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号6で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド;
(d)下記のポリペプチドをコードするCD74-NRG1融合ポリヌクレオチド:
(i)配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号8または10で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド;および
(e)下記のポリペプチドをコードする、SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチド:
(i)配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号36で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド。
[3]融合ポリヌクレオチドが下記(a)〜(e)のいずれかである、[1]または[2]に記載の方法:
(a)(i)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)(i)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)(i)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(d)(i)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
(e)(i)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[4]がんが肺がんである、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]がんの責任変異(ドライバー変異)である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および/または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法であって、下記の工程を含む、方法:
(1)被験者由来の単離された試料における下記(a)〜(e)のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程:
(a)EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドであって、EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドであって、KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(c)TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドであって、BRAFのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d)CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、CD74の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
(e)SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、SLC3A2の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;ならびに
(2)前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および/または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
[6]がんの責任変異(ドライバー変異)である遺伝子融合の検出用キットであって、下記(A)〜(C)のいずれかまたはそれらの組合せを含む、キット:
(A)EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド;
(B)EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド;あるいは
(C)EZR-ERBB4融合ポリペプチド、KIAA1468-RET融合ポリペプチド、TRIM24-BRAF融合ポリペプチド、CD74-NRG1融合ポリペプチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
[7]EZRタンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4タンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたEZR-ERBB4融合ポリペプチドまたはその断片。
[8]KIAA1468タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたKIAA1468-RET融合ポリペプチドまたはその断片。
[9]BRAFタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたTRIM24-BRAF融合ポリペプチドまたはその断片。
[10]CD74タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたCD74-NRG1融合ポリペプチドまたはその断片。
[11]SLC3A2タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドまたはその断片。
[12][7]〜[11]のいずれかに記載の融合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
[13]がんの治療方法であって、[5]に記載の方法によりがんの責任変異(ドライバー変異)である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および/または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすと判定された被験者に、前記融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および/または活性を抑制する物質を投与する工程を含む、方法。
[14]がん治療剤のスクリーニング方法であって、下記の工程を含む、方法:
(1)[7]〜[11]のいずれかに記載の融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程;
(2)前記融合ポリペプチドの発現および/または活性が抑制されるか否かを決定する工程;ならびに
(3)前記融合ポリペプチドの発現および/または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
以下、各遺伝子融合について説明する。なお本明細書中、融合ポリヌクレオチドにおける「融合点」とは、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とが接続される境界を意味し、これは2つのヌクレオチド残基の間の境界である。また融合ポリペプチドにおける「融合点」とは、N末端側のポリペプチドとC末端側のポリペプチドとが接続される境界を意味し、これは2つのアミノ酸残基の間の境界であるか、または遺伝子融合が1つのコドン内で生じた場合には当該コドンによりコードされる1つのアミノ酸残基自体である。
本遺伝子融合は、EZRタンパク質とERBB4タンパク質の融合タンパク質(以下、EZR-ERBB4融合ポリペプチドとも称する)の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては6q25および2q34の領域内に切断点を有する転座(t(2;6))により生じる変異である。
(i)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
(i)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本遺伝子融合は、KIAA1468タンパク質とRETタンパク質の融合タンパク質(以下、KIAA1468-RET融合ポリペプチドとも称する)の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては18q21および10q11の領域内に切断点を有する転座(t(10;18))により生じる変異である。
(i)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号4で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
(i)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本遺伝子融合は、TRIM24タンパク質とBRAFタンパク質の融合タンパク質(以下、TRIM24-BRAF融合ポリペプチドとも称する)の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては7q33および7q34の領域内に切断点を有する逆位(inv7)により生じる変異である。
(i)配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号6で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
(i)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本遺伝子融合は、CD74タンパク質とNRG1タンパク質の融合タンパク質(以下、CD74-NRG1融合ポリペプチドとも称する)の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては5q32および8p12の領域内に切断点を有する転座(t(5;8))により生じる変異である。
(i)配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達殖を亢進する活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号8または10で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド。
(i)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本遺伝子融合は、SLC3A2タンパク質とNRG1タンパク質の融合タンパク質(以下、SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドとも称する)の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては11q12.3および8p12の領域内に切断点を有する転座(t(8;11))により生じる変異である。
(i)配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号36で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド。
(i)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本発明は、前記4種の遺伝子融合の検出方法(以下、本発明の検出方法とも称する)を提供する。本発明の検出方法は、がんを有する被験者由来の単離された試料における前記いずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む。
(a)各融合遺伝子について、5’側融合パートナー遺伝子(EZR、KIAA1468、TRIM24、CD74またはSLC3A2遺伝子)の塩基配列にハイブリダイズするプローブ及び3’側融合パートナー遺伝子(ERBB4、RET、BRAFまたはNRG1遺伝子)の塩基配列にハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
(b)各融合遺伝子について、5’側融合パートナー遺伝子と3’側融合パートナー遺伝子との融合点を含む塩基配列にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
(a1) 5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド(以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ1」とも称する)と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド(以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ1」とも称する)との組み合わせ;
(a2) 5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド(以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ1」とも称する)と、5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド(以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ2」とも称する)との組み合わせ;
(a3) 3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド(以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ2」とも称する)と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド(以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ1」とも称する)との組み合わせ。
(a1-1)EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、ERBB4のキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ、
(a1-2)KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、RETのキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ、
(a1-3)TRIM24のRINGフィンガードメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、BRAFのキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ、
(a1-4)CD74の膜貫通ドメインのコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、NRG1のEGFドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ、および
(a1-5)SLC3A2の膜貫通ドメインのコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、NRG1のEGFドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ。
以上のように、がんの責任変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを、前記プライマー、プローブ、または抗体、あるいはそれらの組み合わせを用いて検出することができ、それにより当該遺伝子融合を検出することができる。したがって、本発明は、下記のいずれかまたはそれらの組み合わせを含む、がんの責任変異である遺伝子融合の検出用キット(以下、本発明のキットとも称する)を提供する:
(A)EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド;
(B)EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド;あるいは
(C)EZR-ERBB4融合ポリペプチド、KIAA1468-RET融合ポリペプチド、TRIM24-BRAF融合ポリペプチド、CD74-NRG1融合ポリペプチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
前記5種の遺伝子融合は、がんの責任変異であり、それぞれERBB4キナーゼ活性の恒常活性化、RETキナーゼ活性の恒常活性化、BRAFキナーゼ活性の恒常活性化、およびNRG1の細胞増殖因子としての機能の亢進により、がんの悪性化等に寄与していると考えられる。そのため、このような遺伝子融合が検出されるがん患者においては、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および/または活性を抑制する物質による治療が有効である蓋然性が高い。
(1)被験者由来の単離された試料における下記(a)〜(e)のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程:
(a)EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドであって、EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドであって、KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(c)TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドであって、BRAFのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d)CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、CD74の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
(e)SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、SLC3A2の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;ならびに
(2)前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および/または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
上記の通り、本発明の同定方法により、前記5種の遺伝子融合のいずれかにより生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および/または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがん患者が同定される。そのため、がん患者のうち、当該融合遺伝子を保持する患者に選択的に当該物質を投与することにより、効率的にがんの治療を行うことが可能である。従って、本発明は、がんの治療方法であって、上記本発明の同定方法により当該物質が治療効果をもたらすと判定された被験者に、当該物質を投与する工程を含む方法(以下、本発明の治療方法とも称する)を提供する。
本発明は、前記4種の遺伝子融合のいずれかを有するがん患者に対して治療効果をもたらすがん治療剤のスクリーニング方法(以下、本発明のスクリーニング方法とも称する)を提供する。本発明のスクリーニング方法により、前記5種の融合ポリペプチド(すなわち、EZR-ERBB4融合ポリペプチド、KIAA1468-RET融合ポリペプチド、TRIM24-BRAF融合ポリペプチド、CD74-NRG1融合ポリペプチド、およびSLC3A2-NRG1融合ポリペプチド)のうちいずれかの発現および/または活性を抑制する物質を、がん治療剤として得ることができる。
(1)EZR-ERBB4融合ポリペプチド、KIAA1468-RET融合ポリペプチド、TRIM24-BRAF融合ポリペプチド、CD74-NRG1融合ポリペプチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程;
(2)前記融合ポリペプチドの発現および/または活性が抑制されるか否かを決定する工程;ならびに
(3)前記融合ポリペプチドの発現および/または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
本発明は、以下の単離された融合ポリペプチド(以下、本発明の融合ポリペプチドとも称する)またはその断片を提供する:
(1)EZRタンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4タンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたEZR-ERBB4融合ポリペプチド、
(2)KIAA1468タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたKIAA1468-RET融合ポリペプチド、
(3)BRAFタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたTRIM24-BRAF融合ポリペプチド、
(4)CD74タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたCD74-NRG1融合ポリペプチド、ならびに
(5)SLC3A2タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたSLC3A2-NRG1融合ポリペプチド。
(1)EZR-ERBB4融合ポリペプチドに関して、
(i)配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは
(iii)配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド;
(2)KIAA1468-RET融合ポリペプチドに関して、
(i)配列番号4で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは
(iii)配列番号4で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド;
(3)TRIM24-BRAF融合ポリペプチドに関して、
(i)配列番号6で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは
(iii)配列番号6で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド;
(4)CD74-NRG1融合ポリペプチドに関して、
(i)配列番号8または10で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、あるいは
(iii)配列番号8または10で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド;ならびに
(5)SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドに関して、
(i)配列番号36で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、あるいは
(iii)配列番号36で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド。
がん患者から採取した肺組織からトータルRNAを調製した。
RNAシークエンシングのためのcDNAライブラリーは製造者の標準プロトコールに従い、mRNA-Seqサンプル調製キット(イルミナ社製)を用いて調製した。簡潔に説明すると、2μgのトータルRNAからpoly-A(+)RNAを精製し、フラグメンテーション緩衝液で94℃、5分加熱することで断片化した後、2本鎖cDNA合成に用いた。得られた2本鎖cDNAをPEアダプターDNAにライゲ―ションした後、PCRで増幅した。このように作成したライブラリーをゲノムアナライザーIIxシークエンサー(GAIIx、イルミナ社製)、又はハイセックシークエンサー(HiSeq2000、イルミナ社製)を用いた50-bp又は75-bpのペアエンドシークエンスに供した。
融合転写産物の検出は、McPherson, A. et al PLoS Comput Biol. 2011 May;7(5):e1001138に記載されるdeFuseプログラムを用いて行った。具体的には、スプライスされた遺伝子配列とスプライスされていない遺伝子配列からなる参照配列にペアエンドリードをアライン(Align)した。次に、参照配列に一致しないアラインメント(ambiguous discordant alignments)について、可能な2遺伝子の遺伝子融合を仮定し、アラインメントを行った。そして、遺伝子融合をヌクレオチドレベルで支持するような2つの遺伝子に亘るスプリットリードを検出し、スプリットリードとそれぞれが2つの遺伝子にマップされるペアエンドリード(スパニングリード)による確証性、スパニングリード間のヌクレオチド長の整合性を考慮し、遺伝子融合の候補とした。次に、当該候補より、コードされるであろうアミノ酸構造が、タンパク質キナーゼやキナーゼが司る細胞内情報伝達経路の活性化をもたらすような遺伝子融合を抽出した。
トータルRNA(500 ng)をスーパースクリプトIII逆転写酵素(登録商標、インビトロジェン社製)を用いて逆転写した。得られたcDNA(10 ngのトータルRNAに相当)もしくは10 ngのゲノムDNAをKAPA Taq DNAポリメラーゼ(KAPAバイオシステムス社製)を用いたPCR増幅に供した。反応は次の条件のもとサーマルサイクラー内で行った:95℃30秒、60℃30秒、72℃2分を40サイクル、その後72℃10分最終伸長反応。また、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)をコードする遺伝子をcDNA合成の効率の評価のため増幅した。さらに、PCR産物はBigDyeターミネーターキットとABI 3130xl DNAシークエンサー(アプライドバイオシステムス社製)とを用いて、両方向に塩基配列を直接決定した。なお、本研究で用いたプライマーを表1に示す。
本実施例は、肺がん組織における新規融合転写産物の同定について記載する。
本実施例は、実施例1で見出された遺伝子融合のRT-PCRによる検出について記載する。
本実施例は、実施例1で見出された遺伝子融合が肺がんの責任変異である可能性が高いことを示す。
本実施例および実施例5には、実施例1において解析した114例に含まれる90例についてさらに解析を行った結果を示す。
<サンプル>
90例のIMAは、1998年から2013年までに国立がん研究センター中央病院(東京、日本)で外科的処置を受けた原発性肺腺がんを有する連続する患者から同定した。組織学的診断は、LADCについての最新の世界保健機関の分類およびthe International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society(IASLC/ATS/ERS)の基準に基づいた(Travis WD, et al. J Thorac Oncol. 2011, 6, 244-85; Travis WD, Brambilla, E., Muller-Hermelink, H.K. and Harris, C.C. , editor. World Health Organization Classification of Tumors; Pathology and Genetics, Tumours of Lung, Pleura, Thymus and Heart. Lyon: IARC Press; 2004)。トータルRNAは、大まかに切り、急速凍結した(snap-frozen)組織サンプルから、TRIzol(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を使用して抽出した。研究は、参加機関の治験審査委員会によって承認された。
RNAシークエンシングライブラリーは、1または2μgのトータルRNAから、mRNA-Seq Sample Prep KitまたはTruSeq RNA Sample Prep Kit(Illumina、San Diego、CA、USA)を使用して調製した。得られたライブラリーを、Genome Analyzer IIx(GAIIx)またはHiSeq 2000(Illumina)による50または75 bpリードのペアエンドシークエンシングに供した。TopHat-Fusionアルゴリズム(Kim D, Salzberg SL. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 2011, 12, R72)を使用して、融合転写産物を検出した。
CD74-NRG1、EZR-ERBB4およびTRIM24-BRAF融合タンパク質の発現用のレンチウイルスベクターを構築するために、全長cDNAをPCRにより腫瘍のcDNAから増幅し、pLenti-6/V5-DESTプラスミド(Invitrogen)に挿入した。各インサートcDNAの完全性を、サンガーシークエンシングにより確認した。予測されたサイズの融合産物の発現を、一過性にトランスフェクトした細胞およびウイルス感染させた細胞のウェスタンブロット解析により確認した(図3)。
IMA患者は、1998年から2013年までに国立がん研究センター中央病院(東京、日本)で外科的処置を受けた全てのLADC症例のおよそ2%を構成した。切除された組織は、10%ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋されていた。4μmの連続切片をアルシアンブルー−過ヨウ素酸シッフ法を使用してヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、細胞質のムチン産生を可視化した。トータルRNAは、大まかに切り、急速凍結した(snap-frozen)組織サンプルから、TRIzol(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を使用して抽出し、その品質を2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies、Santa Clara、CA、USA)を使用して調べた。全てのサンプルは、>6.0のRNAインテグリティーナンバー(RNA Integrity Numbers(RINs))を有していた。ゲノムDNAも、組織サンプルから、QIAamp DNA Mini kit(Qiagen、Valencia、CA、USA)を使用して抽出した。EGFR、KRAS、BRAF、およびHER2遺伝子におけるホットスポット変異を高解像度融解(HRM)法によって調べ、EML4-またはKIF5B-ALK、KIF5B-またはCCDC6-RET、およびCD74-、EZR-、またはSLC34A2-ROS1融合をRT-PCRによって調べた。詳細な方法は、以前に記載されている(Kohno T, et al. Nat Med. 2012, 18, 375-7; Yoshida A, et al. Am J Surg Pathol. 2013, 37, 554-62; Kinno T, et al. Ann Oncol. 2014, 25, 138-42)。
トータルRNA(500 ng)を、Superscript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)を使用してcDNAに逆転写した。cDNA(10 ngのトータルRNAに相当する)または10 ngのゲノムDNAを、KAPA Taq DNA Polymerase(KAPA Biosystems、Woburn、MA、USA)を使用するPCR増幅に供した。以下の条件下で、サーマルサイクラー内で反応を行った:95℃30秒間、60℃30秒間、および72℃2秒間を40サイクル、72℃10分間の最終伸長。グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)をコードする遺伝子を増幅し、cDNA合成の効率を推定した。PCR産物を、BigDye Terminator kitを使用して、ABI 3130xl DNA Sequencer(Applied Biosystems、Foster City、CA、USA)上で、両方向で直接配列決定した。ここで使用したプライマーを表1に示す。
NIH3T3細胞は、沖縄科学技術大学院大学(沖縄、日本)の山本雅博士から提供された。NCI-H1299細胞は、UT Southwestern Medical CenterのDr. J. D. Minnaから提供された。EFM19および293FT細胞は、それぞれDSMZ(Braunschweig、Germany)およびInvitrogenから入手した。H1299およびEFM-19は、10% FBSを含むRPMI培地中で培養し、NIH3T3および293FTは、10% FBSを含むDMEM培地中で培養した。
免疫組織化学を、組織マイクロアレイ切片について実施した。4μmの厚さの切片を脱パラフィンし、BRAFおよびNRGについては標的賦活化溶液9(Dako、Carpinteria、CA、USA)を使用して、ERBB4についてはクエン酸バッファーを使用して、熱誘導エピトープ賦活化(heat-induced epitope retrieval)を実施した。スライドを3%過酸化水素で20分間処理して、内因性のペルオキシダーゼ活性を阻害し、その後、脱イオン水で2〜3分間洗浄した。次いでスライドを、BRAFに対する一次抗体(1:800、ポリクローナル、Sigma、St. Louis、Mo、USA)、NRG1に対する一次抗体(1:500、ポリクローナル、Thermo Scientific)、またはERBB4に対する一次抗体(1:100、clone E200;Abcam、Cambridge、UK)と、室温にて1時間インキュベートした。EnVision-FLEXおよびLINKER(Dako)システムを使用して免疫反応を検出した。反応を3,3'-ジアミノベンジジンで可視化し、その後、ヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍細胞の>10%での細胞質の染色を、BRAFおよびNRG1について陽性であるとし、膜染色をERBB4について陽性であるとした。
NRG1再構成を同定するために、NRG1用のbreak-apartプローブ(Chromosome Science Labo、札幌、日本;3'セントロメア側プローブとして、Spectrum Orangeで標識した、RP11-1002K11 + RP11-35D16、および5'テロメア側プローブとして、Spectrum Greenで標識した、RP11-23A12 + RP11-715M18)を使用して、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した腫瘍について、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を実施した。
KOD-PLUS Taqポリメラーゼ(Toyobo、大阪、日本)を使用して、各インデックス腫瘍サンプルからのcDNAをPCR増幅することにより、全長のCD74-NRG1、EZR-ERBB4、およびTRIM24-BRAF cDNAを得た。PCR産物を制限酵素で消化し、pLenti-6/V5-DESTプラスミド(Invitrogen)にライゲーションした。各インサートcDNAの完全性を、サンガーシークエンシングにより確認した。各発現プラスミドを、ViraPower packaging mix(Invitrogen)と共に、Lipofectamine 2000試薬(Invitrogen)を使用して293FT細胞にトランスフェクトすることにより、CD74-NRG1、EZR-ERBB4、またはTRIM24-BRAFを発現するレンチウイルスを作製した。
CD74-NRG1 cDNAを発現する細胞がHER2:HER3細胞内シグナル伝達を活性化するNRG1リガンドを分泌するか否かを決定するために、以前に記載されているように(Wilson TR, et al. Cancer Cell. 2011, 20, 158-72)、ERRB2/HER2およびERBB3/HER3タンパク質の両方を発現するEFM-19乳がん細胞をレポーター細胞として使用した。CD74-NRG1発現プラスミドまたは空の(対照)プラスミドで一過性にトランスフェクトしたNCI-H1299細胞をPBSで2回洗浄し、無血清培地中でのインキュベーションにより一晩血清飢餓にした。培地を回収し、4℃にて5分間遠心して、細胞片を除去した。サブコンフルエントのEMF-19細胞を、DMSO(ビヒクル対照)またはHER-TKIを補充したこれらの馴化培地と30分間インキュベートした。次いで、全細胞ライセートをSDS-PAGEおよびイムノブロッティングに供した。
EZR-ERBB4もしくはTRIM24-BRAF cDNAsを発現するプラスミドまたは空のプラスミドで安定的に形質導入したNIH3T3細胞を、無血清培地中で一晩維持し、次いで、DMSO(Sigma)または示された阻害剤(DMSOに溶解させた)で2時間処理した。全細胞ライセートをイムノブロット解析に供した。
Complete Protease and PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail(Roche、Mannheim、Germany)を含有するRIPAバッファー中で細胞を溶解させた。タンパク質をSDS-PAGEに供し、その後、ポリビニリデンジフルオライド膜上にイムノブロットした。膜を0.1% Tween 20および1.0% BSAを含有するTBSで1時間ブロッキングし、次いで、一次抗体で調べた。0.1% Tween 20を含有するTBSで洗浄した後、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体とインキュベートし、次いで、エンハンスドケミルミネッセンス試薬(Perkin Elmer、Waltham、MA、USA)で可視化した。LAS3000イメージングシステム(Quansys Biosciences,
West Logan、UT、USA)を使用して、シグナルの強度を算出した。
空のレンチウイルス、またはCD74-NRG1、EZR-ERBB4、もしくはTRIM24-BRAFレンチウイルスで感染させたNIH3T3細胞を、0.6%アガロースの基層上の0.3% SeaPlaqueアガロース(Lonza、Rockland、ME、USA)の上層に、24ウェルプレート中4,000細胞/ウェルで、三連で播種した。DMSOまたはチロシンキナーゼ阻害剤を含有する培地をトップアガーに加え、また0.3%アガロース層の上に加えた。カバー培地は週2回交換した。14日後に、直径が100μmよりも大きいコロニーを数えた。
空ベクターまたはEZR-ERBB4もしくはTRIM24-BRAF融合タンパク質を発現するベクターを有する安定なNIH3T3細胞(5 × 106)を、50% マトリゲル(BD Biosciences、Bedford、MA、USA)を含むPBS中に再懸濁した。細胞を、6週齢の雌のnu/nuマウスの右側腹部に皮下注入した。腫瘍のサイズがおよそ2 cm × 2 cmに達するまで、腫瘍のサイズを週2回測定した。21日目に写真を撮影した。マウスに関する全ての研究は、国立がん研究センターの動物実験に関する倫理委員会によって承認された。
KRAS変異を有する56例(62%)およびKRAS変異を有さない34例(38%)からなる90例の浸潤性粘液性腺がん(invasive mucinous adenocaricinoma(IMA))コホートを準備した。KRAS陰性の34例は、2例のBRAF変異、1例のEGFR変異、および1例EML4-ALK融合を含んでいた。残りの30例は、LADCにおける代表的なドライバー変異に関して全陰性(pan-negative)であった。
CD74-NRG1、SLC3A2-NRG1、EZR-ERBB4、およびTRIM24-BRAFの4つの新規融合遺伝子は、タンパク質キナーゼまたは受容体タンパク質キナーゼのリガンド(NRG1/ニューレグリン/へレグリン)をコードする遺伝子の再構成を含んでおり、当該遺伝子については、肺癌においてがん化をもたらす再構成はこれまで報告されていなかった(図7)。残りの融合遺伝子は、RETがん遺伝子に関わる新規のタイプであった;RETの融合は、LADCの1〜2%に見られる(Drilon A, et al. Cancer Discov. 2013, 3, 630-5; Takeuchi K, et al. Nat Med. 2012, 18, 378-81; Lipson D, et al. Nat Med. 2012, 18, 382-4; Kohno T, et al. Nat Med. 2012, 18, 375-7; Kohno T, et al. Cancer Sci. 2013, 104, 1396-400)。日本人患者からのIMAの特徴を有さない315例のLADCおよびアメリカ人患者からの144例の連続するLADCのスクリーニングにおいて、全ての腫瘍は、NRG1、BRAFおよびERBB4融合、ならびに新規RET融合の全てについて陰性であった。したがって、これらの融合は、IMAの特徴を有するLADCに特異的なドライバー変異であると考えられる。CD74-NRG1、SLC3A2-NRG1、EZR-ERBB4、およびKIAA1468-RETの4つの遺伝子融合は、染色体間転座によって引き起こされた可能性が高く、TRIM24-BRAF遺伝子融合は、動原体を挟まない(paracentric)逆位によって引き起こされた可能性が高い(表4および図7)。このことと一致して、CD74-NRG1融合陽性腫瘍の蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析で、融合陽性腫瘍におけるNRG1の転座部位に隣接する2つのプローブによって生成されたシグナルの分離が観察された(図8)。また、融合タンパク質に保持されているポリペプチドを認識する抗体を用いた免疫組織化学解析によって、NRG1、ERBB4、およびBRAF融合を有する腫瘍細胞において、対応するタンパク質が過剰発現していることも確認した;NRG1、ERBB4、およびBRAFタンパク質の発現は、いくつかの融合陰性例においても観察された(図9)。遺伝子融合を有するIMAは、男性患者および女性患者の両方から得られたが、NRG1融合陽性例は、女性の非喫煙者から優先的に得られた(表4)。
配列番号2:EZR-ERBB4融合ポリペプチド
配列番号3:KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド
配列番号4:KIAA1468-RET融合ポリペプチド
配列番号5:TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド
配列番号6:TRIM24-BRAF融合ポリペプチド
配列番号7:CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド(バリアント1)
配列番号8:CD74-NRG1融合ポリペプチド(バリアント1)
配列番号9:CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド(バリアント2)
配列番号10:CD74-NRG1融合ポリペプチド(バリアント2)
配列番号11〜18:プライマー配列
配列番号19:EZR cDNA
配列番号20:EZRポリペプチド
配列番号21:ERBB4 cDNA
配列番号22:ERBB4ポリペプチド
配列番号23:KIAA1468 cDNA
配列番号24:KIAA1468ポリペプチド
配列番号25:RET cDNA
配列番号26:RETポリペプチド
配列番号27:TRIM24 cDNA
配列番号28:TRIM24ポリペプチド
配列番号29:BRAF cDNA
配列番号30:BRAFポリペプチド
配列番号31:CD74 cDNA
配列番号32:CD74ポリペプチド
配列番号33:NRG1 cDNA
配列番号34:NRG1ポリペプチド
配列番号35:SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチド
配列番号36:SLC3A2-NRG1融合ポリペプチド
配列番号37:プライマー配列
配列番号38:SLC3A2 cDNA
配列番号39:SLC3A2ポリペプチド
Claims (14)
- がんの責任変異(ドライバー変異)である遺伝子融合の検出方法であって、がんを有する被験者由来の単離された試料における下記(a)〜(e)のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法:
(a)EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドであって、EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで該EZRのコイルドコイルドメインの一部は該ポリペプチドを二量体化し得る;
(b)KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドであって、KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで該KIAA1468のコイルドコイルドメインの一部は該ポリペプチドを二量体化し得る;
(c)TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドであって、TRIM24のRINGフィンガードメインの全部及びBRAFのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで該ポリペプチドはBRAFのRaf様Ras結合ドメインを含まない;
(d)CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、CD74の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;ならびに
(e)SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、SLC3A2の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - 融合ポリヌクレオチドが下記(a)〜(e)のいずれかである、請求項1に記載の方法:
(a)下記のポリペプチドをコードするEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド:
(i)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド;
(b)下記のポリペプチドをコードするKIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド:
(i)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号4で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド;
(c)下記のポリペプチドをコードするTRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド:
(i)配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号6で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド;
(d)下記のポリペプチドをコードするCD74-NRG1融合ポリヌクレオチド:
(i)配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号8または10で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド;および
(e)下記のポリペプチドをコードする、SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチド:
(i)配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1〜30個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、または
(iii)配列番号36で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド。 - 融合ポリヌクレオチドが下記(a)〜(e)のいずれかである、請求項1または2に記載の方法:
(a)(i)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと90%以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)(i)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと90%以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)(i)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと90%以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(d)(i)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと90%以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
(e)(i)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(iii)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iv)配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと90%以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - がんが肺がんである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- がんの責任変異(ドライバー変異)である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および/または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法であって、下記の工程を含む、方法:
(1)被験者由来の単離された試料における下記(a)〜(e)のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程:
(a)EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドであって、EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで該EZRのコイルドコイルドメインの一部は該ポリペプチドを二量体化し得る、
(b)KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドであって、KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで該KIAA1468のコイルドコイルドメインの一部は該ポリペプチドを二量体化し得る、
(c)TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドであって、TRIM24のRINGフィンガードメインの全部及びBRAFのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで該ポリペプチドはBRAFのRaf様Ras結合ドメインを含まない、
(d)CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、CD74の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
(e)SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、SLC3A2の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;ならびに
(2)前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および/または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。 - がんの責任変異(ドライバー変異)である遺伝子融合の検出用キットであって、下記(A)〜(C)のいずれかまたはそれらの組合せを含む、キット:
(A)EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド;
(B)EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド;あるいは
(C)EZR-ERBB4融合ポリペプチド、KIAA1468-RET融合ポリペプチド、TRIM24-BRAF融合ポリペプチド、CD74-NRG1融合ポリペプチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、融合点のN末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体と融合点からC末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体の組み合わせである、前記抗体、
ここで、EZR-ERBB4融合ポリペプチドは、EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドであり、ここで該EZRのコイルドコイルドメインの一部は該ポリペプチドを二量体化し得る、
EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドは、EZR-ERBB4融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、
KIAA1468-RET融合ポリペプチドは、KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドであり、ここで該KIAA1468のコイルドコイルドメインの一部は該ポリペプチドを二量体化し得る、
KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドは、KIAA1468-RET融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、
TRIM24-BRAF融合ポリペプチドは、TRIM24のRINGフィンガードメインの全部及びBRAFのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドであり、ここで該ポリペプチドはBRAFのRaf様Ras結合ドメインを含まない、
TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドは、TRIM24-BRAF融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、
CD74-NRG1融合ポリペプチドは、CD74の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドであり、
CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドは、CD74-NRG1融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、
SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドは、SLC3A2の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドであり、
SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドは、SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。 - EZRタンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4タンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたEZR-ERBB4融合ポリペプチドまたはその断片であって、
ここで該EZRタンパク質のコイルドコイルドメインの一部は該ポリペプチドを二量体化し得、
該断片は、融合点の上流および下流の配列を含む連続した部分配列からなり、該上流および下流の配列は、それぞれ融合点から10アミノ酸残基以上を含む、前記ポリペプチドまたはその断片。 - KIAA1468タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたKIAA1468-RET融合ポリペプチドまたはその断片であって、
ここで該KIAA1468タンパク質のコイルドコイルドメインの一部は該ポリペプチドを二量体化し得、
該断片は、融合点の上流および下流の配列を含む連続した部分配列からなり、該上流および下流の配列は、それぞれ融合点から10アミノ酸残基以上を含む、前記ポリペプチドまたはその断片。 - TRIM24タンパク質のRINGフィンガードメインの全部及びBRAFタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたTRIM24-BRAF融合ポリペプチドまたはその断片であって、
ここで該ポリペプチドはBRAFタンパク質のRaf様Ras結合ドメインを含まず、
該断片は、融合点の上流および下流の配列を含む連続した部分配列からなり、該上流および下流の配列は、それぞれ融合点から10アミノ酸残基以上を含む、前記ポリペプチドまたはその断片。 - CD74タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたCD74-NRG1融合ポリペプチドまたはその断片であって、
該断片は、融合点の上流および下流の配列を含む連続した部分配列からなり、該上流および下流の配列は、それぞれ融合点から10アミノ酸残基以上を含む、前記ポリペプチドまたはその断片。 - SLC3A2タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドまたはその断片であって、
該断片は、融合点の上流および下流の配列を含む連続した部分配列からなり、該上流および下流の配列は、それぞれ融合点から10アミノ酸残基以上を含む、前記ポリペプチドまたはその断片。 - 請求項7〜11のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項5に記載の方法によりがんの責任変異(ドライバー変異)である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および/または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすと判定された被験者のためのがんの治療剤であって、前記融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および/または活性を抑制する物質を含む、前記治療剤。
- がん治療剤のスクリーニング方法であって、下記の工程を含む、方法:
(1)請求項7〜11のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程;
(2)前記融合ポリペプチドの発現および/または活性が抑制されるか否かを決定する工程;ならびに
(3)前記融合ポリペプチドの発現および/または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
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