WO2015064621A1 - 新規融合体及びその検出法 - Google Patents
新規融合体及びその検出法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2015064621A1 WO2015064621A1 PCT/JP2014/078729 JP2014078729W WO2015064621A1 WO 2015064621 A1 WO2015064621 A1 WO 2015064621A1 JP 2014078729 W JP2014078729 W JP 2014078729W WO 2015064621 A1 WO2015064621 A1 WO 2015064621A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- ntrk1
- gene
- lmna
- fusion
- protein
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6875—Nucleoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
Definitions
- the present invention relates to a novel fusion protein containing the NTRK1 kinase region, a fusion gene encoding the fusion protein, and methods for detecting them.
- the present invention relates to a novel fusion protein containing at least a part of LMNA or a fusion gene encoding the fusion protein, and a method for detecting them.
- Non-patent Document 1 Patent Document 1
- Patent Document 2 Non-patent Document 2
- NTRK1 neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 1, Trk-A
- NGF nerve growth factor
- the LMNA lamin A / C gene encodes lamin A and lamin C proteins. These lamin proteins are main components of nuclear lamina present in the nuclear membrane of eukaryotic cells (Non-patent Document 3). It is not known that the gene constitutes a fusion gene.
- An object of the present invention is to provide a detection method for a fusion protein or a fusion gene encoding the fusion protein, and a detection method based on the elucidation of a fusion (fusion protein and fusion gene) that is a new causative factor of cancer.
- Method for diagnosing cancer used method for determining subject of application of pharmaceutical composition for cancer treatment, kit and primer set for detection method, inhibitor of activity and / or expression of polypeptide as fusion protein
- a cancer therapeutic method comprising administering the pharmaceutical composition for cancer treatment containing the inhibitor and the pharmaceutical composition for cancer treatment.
- the present inventor isolated and identified a novel fusion gene in which a part of the LMNA gene and a part of the NTRK1 gene, which is a kinase, were fused from a specimen obtained from a colon cancer patient (Examples 1 to 3).
- the present inventors have found that the fusion gene is present in colorectal cancer patient specimens (Examples 4 to 7). Based on these findings, the present inventor provides a method for detecting NTRK1 fusion protein or a fusion gene encoding the protein (Examples 4 to 7), and provides a kit and a primer set therefor.
- Including detecting a gene encoding a fusion protein, thereby enabling determination of a cancer patient to be subjected to drug treatment using an NTRK1 inhibitor, and administering the NTRK1 inhibitor to the cancer patient Provide a method for treating cancer.
- the present inventor provides a method for detecting an LMNA fusion protein or a fusion gene encoding the protein (Examples 4 to 7), and provides a kit and a primer set therefor.
- detecting a fusion gene encoding a fusion protein it is possible to discriminate a cancer patient as a target of drug treatment using an LMNA fusion protein inhibitor, and administering the LMNA fusion protein inhibitor to the cancer patient
- a method for treating cancer comprising the step of:
- the present invention relates to the following inventions: [1] LMNA fusion protein.
- [4] A polynucleotide encoding the fusion protein according to any one of [1] to [3].
- [5] A vector comprising the polynucleotide according to [4].
- [6] A cell transformed with the vector according to [5].
- [7] A method for detecting an LMNA fusion protein or a fusion gene encoding the fusion protein in a sample obtained from a subject.
- the detection method according to [7], wherein the detection method includes a step of detecting cleavage of the LMNA protein or cleavage of a gene encoding the LMNA protein.
- the detection method includes a step of detecting the presence of a fusion protein constructed from an LMNA protein and another protein or the presence of a fusion gene encoding the fusion protein.
- the detection method according to. [10] The detection method according to any one of [7] to [9], wherein the fusion protein is a fusion protein of an LMNA protein and an NTRK1 protein.
- the fusion protein is a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d): (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (B) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, (C) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential.
- an LMNA fusion gene comprising a first probe capable of specifically recognizing the LMNA gene 5 ′ terminal genomic region and a second probe capable of specifically recognizing the LMNA gene 3 ′ terminal genomic region
- a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify the 5 ′ end region of the polynucleotide encoding the LMNA protein, and specifically amplify the 3 ′ end region of the polynucleotide.
- a kit for detecting an LMNA fusion gene comprising a sense primer and an antisense primer designed to be able to.
- a kit for detecting an LMNA-NTRK1 fusion gene comprising a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify a polynucleotide encoding a polypeptide that is a fusion protein of an LMNA protein and an NTRK1 protein.
- An LMNA-NTRK1 fusion gene comprising a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify a polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d) Detection kit: (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (B) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, (C) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential.
- kits for detecting an LMNA fusion protein comprising an anti-LMNA antibody capable of specifically recognizing the N-terminal region of the LMNA protein and an anti-LMNA antibody capable of specifically recognizing the C-terminal region of the LMNA protein.
- An antibody that specifically binds to a polypeptide in the C-terminal region of another protein that constitutes the LMNA fusion protein together with the LMNA protein, and an antibody that specifically binds to a polypeptide in the N-terminal region of the LMNA protein A kit for detecting an LMNA fusion protein.
- a method for detecting a fusion gene of LMNA gene and NTRK1 gene comprising a sense primer designed from a polynucleotide portion encoding LMNA protein and an antisense primer designed from a polynucleotide portion encoding NTRK1 protein
- the antisense primer comprises a nucleic acid molecule that anneals to the polynucleotide described in [22] under stringent conditions
- the sense primer is stringent to the complementary strand of the polynucleotide described in [22].
- Primer set consisting of nucleic acid molecules that anneal under conditions.
- a primer set for detecting a fusion gene of LMNA gene and NTRK1 gene comprising a nucleic acid molecule that anneals to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions
- a primer set comprising a primer and a sense primer comprising a nucleic acid molecule that anneals to a complementary strand of the polynucleotide under stringent conditions.
- a sense primer comprising an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 568 of SEQ ID NO: 1 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 569 to 2259 of SEQ ID NO: 1
- An antisense primer consisting of an oligonucleotide complementary to the nucleotide sequence, or a sense primer consisting of an oligonucleotide having at least 16 bases of nucleotide numbers 1 to 726 of SEQ ID NO: 9 and nucleotide number 727 of SEQ ID NO: 9
- a primer set comprising an antisense primer consisting of an oligonucleotide that is complementary to any contiguous at least 16 base oligonucleotide between 1866.
- [29] The step of bringing the test substance into contact with the polypeptide according to (1) [3] or a cell expressing the polypeptide, (2) analyzing whether or not the activity and / or expression of the polypeptide is inhibited; and (3) selecting the substance that inhibits the activity and / or expression of the polypeptide.
- the screening method according to [29], wherein the substance that inhibits the activity and / or expression of the polypeptide is a therapeutic agent for LMNA fusion-positive cancer.
- the screening method according to [30] wherein the cancer is digestive organ cancer.
- the screening method according to [30], wherein the cancer is gastrointestinal cancer.
- a pharmaceutical composition for treating LMNA fusion-positive cancer comprising a substance that inhibits the activity and / or expression of an LMNA fusion protein.
- the pharmaceutical composition according to [35] wherein the substance that inhibits the activity and / or expression of the LMNA fusion protein is a kinase inhibitor.
- the pharmaceutical composition according to [35] or [36], wherein the LMNA fusion protein is the polypeptide according to [3].
- a vector comprising the polynucleotide according to [45].
- the detection method according to [48], wherein the detection method includes a step of detecting cleavage of the NTRK1 protein or cleavage of a gene encoding the NTRK1 protein.
- the detection method includes a step of detecting the presence of a fusion protein constructed from the NTRK1 protein and other proteins, or the presence of a fusion gene encoding the fusion protein.
- the detection method according to. [51] The detection method according to any one of [48] to [50], wherein the fusion protein is a fusion protein of an LMNA protein and an NTRK1 protein.
- the fusion protein is a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d): (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (B) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, (C) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential.
- NTRK1 fusion gene comprising a first probe capable of specifically recognizing the 5 'end genomic region of NTRK1 gene and a second probe capable of specifically recognizing the 3' end genomic region of NTRK1 gene
- a probe for detecting NTRK1 fusion gene comprising a first probe capable of specifically recognizing the 5 'end genomic region of NTRK1 gene and a second probe capable of specifically recognizing the 3' end genomic region of NTRK1 gene
- a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify the 5 ′ end region of the polynucleotide encoding NTRK1 protein, and specifically amplify the 3 ′ end region of the polynucleotide A kit for detecting an NTRK1 fusion gene, comprising a sense primer and an antisense primer designed to be able to.
- a kit for detecting an LMNA-NTRK1 fusion gene comprising a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify a polynucleotide encoding a polypeptide that is a fusion protein of an LMNA protein and an NTRK1 protein.
- An LMNA-NTRK1 fusion gene comprising a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify a polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d) Detection kit: (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (B) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, (C) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenic potential.
- An NTRK1 fusion protein detection kit comprising an anti-NTRK1 antibody capable of specifically recognizing the N-terminal region of NTRK1 protein and an anti-NTRK1 antibody capable of specifically recognizing the C-terminal region of NTRK1 protein.
- An antibody that specifically binds to a polypeptide in the N-terminal region of another protein that constitutes the NTRK1 fusion protein together with the NTRK1 protein, and an antibody that specifically binds to a polypeptide in the C-terminal region of the NTRK1 protein A kit for detecting NTRK1 fusion protein.
- the kit according to [65] wherein the other protein is an LMNA protein.
- a method for detecting a fusion gene of LMNA gene and NTRK1 gene comprising a sense primer designed from a polynucleotide portion encoding LMNA protein and an antisense primer designed from a polynucleotide portion encoding NTRK1 protein
- the antisense primer comprises a nucleic acid molecule that anneals to the polynucleotide of [63] under stringent conditions
- the sense primer is stringent to the complementary strand of the polynucleotide of [63].
- Primer set consisting of nucleic acid molecules that anneal under conditions.
- An antisense comprising a primer set for detecting a fusion gene of an LMNA gene and an NTRK1 gene, and comprising a nucleic acid molecule that anneals to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions
- a primer set comprising a primer and a sense primer comprising a nucleic acid molecule that anneals to a complementary strand of the polynucleotide under stringent conditions.
- a sense primer composed of an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 568 of SEQ ID NO: 1 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 569 to 2259 of SEQ ID NO: 1
- An antisense primer consisting of an oligonucleotide complementary to the nucleotide sequence, or a sense primer consisting of an oligonucleotide having at least 16 bases of nucleotide numbers 1 to 726 of SEQ ID NO: 9 and nucleotide number 727 of SEQ ID NO: 9
- a primer set comprising an antisense primer consisting of an oligonucleotide that is complementary to any contiguous at least 16 base oligonucleotide between 1866.
- [70] (1) contacting the test substance with the polypeptide according to [44] or a cell expressing the polypeptide, (2) analyzing whether or not the activity and / or expression of the polypeptide is inhibited; and (3) selecting the substance that inhibits the activity and / or expression of the polypeptide.
- the screening method according to [70], wherein the substance that inhibits the activity and / or expression of the polypeptide is a therapeutic agent for NTRK1 fusion-positive cancer.
- the screening method according to [71] wherein the cancer is digestive organ cancer.
- the screening method according to [71], wherein the cancer is gastrointestinal cancer.
- a pharmaceutical composition for treating NTRK1 fusion-positive cancer comprising a substance that inhibits the activity and / or expression of NTRK1 fusion protein.
- the pharmaceutical composition according to [76] wherein the substance that inhibits the activity and / or expression of the NTRK1 fusion protein is a kinase inhibitor.
- [84] Use of a substance that inhibits the activity and / or expression of an LMNA fusion protein in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of LMNA fusion-positive cancer.
- the detection method of the present invention can be used as a method for detecting NTRK1 fusion-positive cancer (particularly digestive organ cancer). Moreover, according to the detection method of the present invention, NTRK1 fusion-positive cancer in a subject can be diagnosed, and further, it can be determined whether or not the subject is an NTRK1 inhibitor application target.
- the detection kit and primer set of the present invention can be used in the detection method of the present invention.
- the inhibitor screening method of the present invention it is possible to screen a drug effective for treating the fusion-positive cancer patient.
- the substance obtained by the screening can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating NTRK1 fusion-positive cancer, and can also be used for treating NTRK1 fusion-positive cancer.
- the detection method of the present invention can be used as a method for detecting LMNA fusion-positive cancer (particularly digestive organ cancer).
- the detection kit and primer set of the present invention can be used in the detection method of the present invention.
- the inhibitor screening method of the present invention it is possible to screen a drug effective for treating the fusion-positive cancer patient.
- the substance obtained by the screening can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating LMNA fusion-positive cancer, and can also be used for treatment of LMNA fusion-positive cancer.
- FIG. 3 is a photomicrograph in place of a drawing showing the state after introduction of the fusion gene LMNA-NTRK1 (G472D) into 3T3 fibroblasts and culturing for 9 days.
- FIG. 5 is a photomicrograph in place of a drawing showing the state after introduction of the fusion gene LMNA-NTRK1 (WT) into 3T3 fibroblasts and culturing for 9 days. It is the microscope picture which replaces drawing which shows the state after processing only a gene introduction
- FIG. 5 is a photograph replacing a drawing, showing the state 16 days after inoculating 3T3 fibroblasts transfected with the fusion gene LMNA-NTRK1 (G472D) subcutaneously into nude mice. It is the photograph replaced with drawing which shows the state 16 days after inoculating 3T3 fibroblast processed only with the gene introduction reagent subcutaneously of a nude mouse.
- 6 is a graph showing changes over time in tumor size 6 to 17 days after inoculation in the nude mice shown in FIGS. 4 and 5.
- FIG. 5 is a photograph replacing a drawing, showing the state 14 days after inoculating 3T3 fibroblasts into which a fusion gene LMNA-NTRK1 (G472D) has been introduced subcutaneously into nude mice. It is a photograph, instead of a drawing, showing a state after 14 days after inoculating 3T3 fibroblasts transfected with the fusion gene LMNA-NTRK1 (WT) subcutaneously into nude mice.
- FIG. 9 is a graph showing changes over time in tumor size 6 to 20 days after inoculation in the nude mice shown in FIGS. 7 and 8.
- FIG. 6 is a graph showing the sensitivity to each NTRK1 inhibitor (BIBF1120, CEP701, foretinib) in Ba / F3 cells expressing an LMNA-NTRK1 (G472D or WT) fusion polypeptide.
- FIG. 6 is a photograph, instead of a drawing, showing the results of Western blotting of extracts from each cultured cell after treating Ba / F3 cells expressing the LMNA-NTRK1 (G472D) fusion polypeptide with each NTRK1 inhibitor.
- FIG. 6 is a photograph, instead of a drawing, showing the results of Western blotting of extracts from each cultured cell after treating Ba / F3 cells expressing LMNA-NTRK1 (WT) fusion polypeptide with each NTRK1 inhibitor.
- the “fusion point in the NTRK1 fusion gene” means a portion where a polynucleotide derived from the NTRK1 gene in the NTRK1 fusion gene and a polynucleotide derived from another gene constructing the fusion gene together with the NTRK1 gene are combined.
- the LMNA-NTRK1 fusion gene represented by SEQ ID NO: 1 it is the position where the 513th base and the 514th base of the base sequence are combined.
- the “fusion point in the NTRK1 fusion protein” means a polypeptide encoded by a polynucleotide derived from the NTRK1 gene in the NTRK1 fusion protein and a polynucleotide derived from the other gene that constructs the fusion gene together with the NTRK1 gene. Means a portion where the polypeptide encoded by is bound.
- the “fusion point in the LMNA fusion gene” means a position where a polynucleotide derived from the LMNA gene in the LMNA fusion gene and a polynucleotide derived from another gene that constructs the fusion gene together with the LMNA gene are combined.
- the LMNA-NTRK1 fusion gene represented by SEQ ID NO: 1 it is the position where the 513th base and the 514th base of the base sequence are combined.
- the “fusion point in the LMNA fusion protein” means a polypeptide encoded by a polynucleotide derived from the LMNA gene in the LMNA fusion protein and a polynucleotide derived from the other gene that constructs the fusion gene together with the LMNA gene. Means a portion where the polypeptide encoded by is bound.
- NTRK1 gene cleavage or “NTRK1 gene is cleaved” means that the continuity of the NTRK1 gene is lost due to translocation or inversion of the gene, ie, NTRK1. It refers to a state where the gene is divided into at least two polynucleotides, a polynucleotide containing the NTRK1 kinase region and other polynucleotides.
- the break point of the NTRK1 gene is not limited as long as the protein encoded by at least one of the polynucleotides formed by cleaving the NTRK1 gene retains the NTRK1 kinase activity.
- “cleaved by a gene other than the NTRK1 gene” or “cleaved by a gene other than the NTRK1 gene” means that the continuity of other genes is lost due to translocation or inversion of the gene. A state in which another gene is divided into at least two polynucleotides.
- NTRK1 protein cleavage or “NTRK1 protein is cleaved” means that the NTRK1 gene is cleaved as described above based on the continuity of NTRK1 protein. Is a state in which the NTRK1 protein is divided into at least two polypeptides, a polypeptide containing the NTRK1 kinase region and another polypeptide.
- the cleavage point of NTRK1 protein is not limited as long as at least one of the polypeptides formed by cleavage of NTRK1 protein retains NTRK1 kinase activity.
- cleaving of a protein other than the NTRK1 protein” or “a protein other than the NTRK1 protein is cleaved” is based on the fact that the other gene is cleaved as described above. , Refers to a state in which the continuity of other proteins is lost, that is, a state in which other proteins are separated into at least two polypeptides.
- LMNA gene cleavage or “LMNA gene cleavage” means that LMNA gene continuity is lost due to gene translocation or inversion, ie, LMNA. It refers to the state where the gene is divided into at least two polynucleotides.
- the break point of the LMNA gene is not limited as long as it retains the tumor forming ability of the LMNA fusion protein encoded by another gene that constructs the LMNA fusion gene together with the LMNA gene.
- cleaved other genes other than LMNA gene or “cleaved other genes other than LMNA gene” means that continuity of other genes is lost due to gene translocation or inversion. A state in which another gene is divided into at least two polynucleotides.
- LMNA protein cleavage or “LMNA protein is cleaved” means that the LMNA gene is cleaved as described above based on the LMNA protein continuity. Is a state in which LMNA protein is divided into at least two polypeptides. Note that the breakpoint of the LMNA protein is a function of other proteins that construct the LMNA fusion protein together with the LMNA protein in order to have the ability of the fusion protein to form a tumor (for example, when the other protein has a kinase domain, It is not limited as long as it retains (kinase activity).
- cleavage of a protein other than the LMNA protein” or “a protein other than the LMNA protein is cleaved” is based on the fact that the other gene is cleaved as described above. , Refers to a state in which the continuity of other proteins is lost, that is, a state in which other proteins are separated into at least two polypeptides.
- the 5 ′ terminal region is a polynucleotide 5 ′ terminal from the fusion point, and in the case of a wild type gene (non-fusion gene), the wild type gene constructs the fusion gene.
- the polynucleotide at the 5 ′ end side from the cleavage point is shown.
- the 5 ′ terminal region may be any region of genomic DNA, mRNA, and cDNA.
- genomic DNA it is also referred to as a 5 ′ terminal genomic region.
- the 3 ′ terminal region is a polynucleotide 3 ′ terminal from the fusion point.
- the wild type gene constructs the fusion gene.
- the polynucleotide at the 3 ′ end side from the cleavage point is shown.
- the 3 ′ terminal region may be a region in any of genomic DNA, mRNA, and cDNA.
- genomic DNA it is also referred to as a 3 ′ terminal genomic region.
- the N-terminal region is a polypeptide at the N-terminal side from the fusion point, and in the case of a wild type protein (a protein that is not a fusion protein), cleavage when the wild type protein constructs a fusion gene.
- the polynucleotide on the N-terminal side from the point is shown.
- the C-terminal region is a polypeptide at the C-terminal side from the fusion point, and in the case of a wild type protein (a protein that is not a fusion protein), the cleavage when the wild type protein constructs a fusion gene
- the polynucleotide on the C-terminal side from the point is shown.
- the 5 ′ end region consists of the first to 513th positions
- the 3 ′ end region consists of the 514th to 1653th base sequences.
- the N-terminal region is a polypeptide encoded by the 5′-terminal region
- the C-terminal region is a polypeptide encoded by the 3′-terminal region.
- ENSNA for LMNA and ENST00000524377 for NTRK1 were used as the cDNA reference sequences for each derived gene, and ENSP00000357283 for LMNA and ENSP00000431418 for NTRK1 as the amino acid reference sequences for the proteins.
- stringent conditions refers to “5 ⁇ SSPE, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 200 ⁇ g / mL sperm DNA, “42 ° C. overnight” and the conditions for cleaning are “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”.
- “More stringent conditions” means “5 ⁇ SSPE, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 200 ⁇ g / mL sperm DNA, over 42 ° C.” “Night”, the conditions for cleaning are “0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”.
- ⁇ Tumorogenicity> It can be confirmed by the method of Example 7 described later that a certain polypeptide “has tumorigenicity”. Specifically, a host (3T3 fibroblast) into which a plasmid expressing the polypeptide has been introduced is inoculated subcutaneously into nude mice, and confirmed by a method of judging the presence or absence of tumor formation.
- the polypeptide of the present invention is a fusion polypeptide (also referred to as “NTRK1 fusion protein”) constructed from a polypeptide derived from the NTRK1 protein and a polypeptide derived from another protein other than the NTRK1 protein, and the NTRK1
- the protein-derived polypeptide includes at least the NTRK1 kinase region polypeptide in the NTRK1 protein, and the polypeptide derived from other proteins other than the NTRK1 protein is not particularly limited as long as it includes at least a part of the polypeptide in other proteins. .
- the constructed NTRK1 fusion protein has tumorigenicity.
- the NTRK1 fusion protein a fusion protein in which the other protein is an LMNA protein is particularly preferable. That is, an LMNA protein and NTRK1 constructed from an LMNA gene-derived polypeptide containing a polypeptide derived from the NTRK1 protein containing at least a polypeptide of the NTRK1 kinase region and a polypeptide derived from at least a part of the LMNA protein. It is preferably a fusion protein with a protein (hereinafter also referred to as LMNA-NTRK1 fusion protein).
- the polypeptide of the present invention is a fusion polypeptide (also referred to as “LMNA fusion protein”) constructed from a polypeptide derived from an LMNA protein and a polypeptide derived from another protein other than the LMNA protein, the LMNA
- the protein-derived polypeptide includes at least a part of the polypeptide in the LMNA protein, and the polypeptide derived from another protein other than the LMNA protein is not particularly limited as long as it includes at least a part of the polypeptide in the other protein. .
- the other protein if the functional domain possessed by the other protein is constantly maintained by fusing with the LMNA protein, and the constructed LMNA fusion protein has a tumor-forming ability.
- the LMNA fusion protein a fusion protein in which the other protein is a protein having a kinase domain is preferable, and a fusion protein that is an NTRK1 protein is particularly preferable.
- LMNA-NTRK1 fusion protein a polypeptide derived from the LMNA gene comprising a polypeptide derived from NTRK1 containing at least a polypeptide in the NTRK1 kinase region, and a polypeptide at least part of the LMNA protein And a fusion protein of LMNA protein and NTRK1 protein (hereinafter also referred to as LMNA-NTRK1 fusion protein).
- the polypeptides described in the following (a) to (d) are particularly preferred: (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (B) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, (C) a polypeptide (hereinafter referred to as a homologous polypeptide) comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) a sequence In the amino acid sequence represented by No. 2, a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenicity (hereinafter referred to as a functional equivalent variant) Called).
- A a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
- B a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity
- C a
- the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 consists of the base sequence from the start codon ATG to exon 2 of the LMNA gene and from the exon 11 to the stop codon of exon 17 of the NTRK1 gene.
- the sequences of base numbers 1 to 513 are derived from the LMNA gene, and the sequences of base numbers 514 to 1653 are derived from the NTRK1 gene.
- the polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is referred to as LMNAex2-NTRK1ex11.
- the number of amino acids that can be substituted, deleted, and / or inserted is 1 to several amino acids, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, and most preferably 1. ⁇ 5.
- “Homologous polypeptide” is a “polypeptide containing an amino acid sequence having an identity of 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity”.
- a polypeptide comprising an amino acid sequence that is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more is preferable.
- the “identity” means a value Identity obtained by using a parameter prepared by default by a NEEDLE program (J Mol Biol 1970; 48: 443-453) search.
- the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention (that is, NTRK1 fusion protein) (also referred to as “NTRK1 fusion gene”).
- NTRK1 fusion protein also referred to as “NTRK1 fusion gene”.
- polynucleotide encoding NTRK1 fusion protein refers to a polynucleotide consisting of only the translation region in the NTRK1 fusion gene, the full-length genomic DNA of the NTRK1 fusion gene, or the mRNA or cDNA of the NTRK1 fusion gene. There may be.
- the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention (ie, LMNA fusion protein) (also referred to as “LMNA fusion gene”).
- the “polynucleotide encoding the LMNA fusion protein” is a polynucleotide consisting only of the translation region in the LMNA fusion gene, the full-length genomic DNA of the LMNA fusion gene, or the mRNA or cDNA of the LMNA fusion gene. There may be.
- the vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide of the present invention.
- an appropriate vector capable of transforming a eukaryotic or prokaryotic host cell. can be prepared.
- the vector can contain a sequence necessary for expression of the polynucleotide, such as a promoter and an enhancer, and can further contain a sequence necessary for confirmation of introduction into the host, such as a drug resistance gene.
- the transformed cell of the present invention can be prepared by transforming a suitable host cell such as a eukaryotic or prokaryotic host cell with the vector of the present invention.
- the transformed cell of the present invention can be used for producing the polypeptide of the present invention.
- the detection method according to the present invention can be suitably used for detection of cancer occurring in a target organ.
- the test site (target organ) of the subject is not limited as long as the fusion according to the present invention is present, but the digestive organ is preferable, the digestive tract is more preferable, the gastrointestinal tract is further preferable, and the lower digestive tract is more preferable. More preferred is the large intestine. More specifically, the detection method according to the present invention is suitable for detection of gastrointestinal cancer, more preferably for detection of gastrointestinal cancer, and more preferably for detection of gastrointestinal cancer. More preferably, it can be used more suitably for detection of colorectal cancer.
- the sample obtained from the subject includes a sample collected from the subject (sample separated from the living body), specifically, any collected body fluid (preferably blood), from the subject affected area. Extracted specimens, biopsy specimens or scraped specimens, feces, urine, gastrointestinal lavage fluid and the like can be used.
- the digestive tract washing solution may be a washing solution for the entire digestive tract, or a washing solution for the digestive tract including at least the test site, for example, a washing solution for the lower digestive tract or a washing solution for the large intestine.
- a sample containing cells at the test site in the target organ is preferable, and an excised specimen or biopsy sample from the test site of the test subject is more preferable.
- the method for detecting an NTRK1 fusion gene or NTRK1 fusion protein comprises preparing a tissue section or a cell suspension of a sample obtained from a subject and applying it to a cell contained in the tissue section or cell suspension.
- it can be carried out by detecting NTRK1 fusion gene or NTRK1 fusion protein by techniques well known to those skilled in the art.
- a lysate is prepared from a sample obtained from the aforementioned subject, and a gene or protein contained therein is extracted. In this extracted sample, the NTRK1 fusion gene or NTRK1 fusion protein may be detected.
- the detection of the NTRK1 fusion gene may be any of detection of genomic DNA of the NTRK1 fusion gene, mRNA which is a transcription product of the genomic DNA, or detection of cDNA obtained using the mRNA as a template.
- the method for detecting an LMNA fusion gene or LMNA fusion protein comprises preparing a tissue section or a cell suspension of a sample obtained from a subject and applying it to a cell contained in the tissue section or cell suspension.
- it can be carried out by detecting the LMNA fusion gene or LMNA fusion protein by techniques well known to those skilled in the art.
- a lysate is prepared from a sample obtained from the aforementioned subject, and a gene or protein contained therein is extracted.
- an LMNA fusion gene or The LMNA fusion protein may be detected.
- the detection of the LMNA fusion gene may be any of detection of genomic DNA of the LMNA fusion gene, mRNA that is a transcription product of the genomic DNA, or detection of cDNA obtained using the mRNA as a template.
- the detection method of the present invention includes a method for detecting an NTRK1 fusion in a sample obtained from a subject, that is, a method for detecting a fusion protein (NTRK1 fusion protein) containing an NTRK1 kinase region, or a fusion encoding the fusion protein.
- a method for detecting a gene (NTRK1 fusion gene) is included.
- the detection method of the present invention includes a method for detecting an LMNA fusion in a sample obtained from a subject, that is, a method for detecting an LMNA fusion protein, or a method for detecting a fusion gene encoding the fusion protein (LMNA fusion gene). Is included.
- the detection method of the present invention includes a detection method comprising a step of detecting cleavage of the NTRK1 gene or cleavage of the polypeptide encoded by the NTRK1 gene in a digestive organ-derived sample obtained from the subject; A detection method comprising a step of detecting the presence of a fusion gene constructed from the NTRK1 gene and another gene in the digestive organ-derived sample or the presence of a fusion protein encoded by the fusion gene. included.
- the detection method of the present invention includes a detection method comprising the steps of detecting cleavage of the LMNA gene or cleavage of the polypeptide encoded by the LMNA gene in a sample obtained from the subject, and in the sample obtained from the subject.
- a detection method comprising a step of detecting the presence of a fusion gene constructed from the LMNA gene and another gene other than the above, or the presence of a fusion protein encoded by the fusion gene.
- NTRK1 fusion gene ⁇ Aspect for detecting NTRK1 fusion gene>
- detection of a specific region of a gene in each of the following embodiments may be performed using a probe or primer designed based on a base sequence analyzed in advance or by sequencing, regardless of the examples. Also good.
- the NTRK1 is detected by detecting the presence of the NTRK1 gene or the NTRK1 protein itself. Fusions can also be detected.
- the NTRK1 fusion gene can be detected.
- the NTRK1 fusion gene can be detected by detecting the presence of only the NTRK1 gene 3 ′ terminal region.
- the NTRK1 fusion gene may be detected by confirming, by the above-mentioned method, the state in which the other gene that is fused with the polynucleotide derived from the NTRK1 gene and constructs the fusion gene is cleaved.
- the NTRK1 fusion gene is detected by specifically detecting the expression levels of the 5′-terminal region and 3′-terminal region of the NTRK1 gene and determining the ratio of the expression levels. Can do. Specifically, for example, when the expression level of the 5 ′ terminal region of the NTRK1 gene is different from the expression level of the NTRK1 gene 3 ′ terminal region, the NTRK1 fusion gene can be detected. Alternatively, the NTRK1 fusion gene may be detected by confirming other genes other than the NTRK1 gene constructing the NTRK1 fusion gene together with the NTRK1 gene by the above method.
- the NTRK1 fusion gene is constructed by fusing a polynucleotide derived from the NTRK1 gene and a polynucleotide derived from another gene other than the NTRK1 gene. Detecting a NTRK1 fusion gene by detecting a fusion polynucleotide comprising at least a part of a polynucleotide derived from the NTRK1 gene and at least a part of a polynucleotide derived from another gene other than the NTRK1 gene be able to.
- a first probe that specifically hybridizes to the 5 ′ end region of a polynucleotide derived from another gene other than the NTRK1 gene, and a hybrid that specifically hybridizes to the 3 ′ end region of the NTRK1 gene The NTRK1 fusion gene can be detected by detecting the proximity of the two gene regions on the chromosome using the second probe.
- the other gene other than the NTRK1 gene is LMNA
- the first probe specifically hybridizes to the 5′-terminal region of the polynucleotide derived from the LMNA gene.
- a probe to be used may be used.
- the NTRK1 fusion gene is constructed based on the fact that the NTRK1 gene-derived polynucleotide is constructed by fusing a polynucleotide derived from another gene other than the NTRK1 gene at the fusion point.
- a fusion polynucleotide in which at least a part of a polynucleotide derived from the NTRK1 gene and at least a part of a polynucleotide derived from another gene other than the NTRK1 gene in the fusion gene are continuously contained including the fusion point is detected.
- the NTRK1 fusion gene can be detected.
- a first primer that specifically anneals to a 5′-terminal region of a polynucleotide derived from another gene other than the NTRK1 gene, and a 3′-terminal region specific to a polynucleotide derived from the NTRK1 gene can be detected by conducting a PCR reaction using a second primer that anneals automatically and confirming that a predetermined PCR product indicating the presence of a fusion point is obtained.
- NTRK1 fusion protein (1-a) As a mode of detecting the NTRK1 fusion protein, when the NTRK1 fusion gene is constructed, the NTRK1 protein encoded by the NTRK1 gene is also cleaved.
- the NTRK1 fusion protein can be detected by detecting that the terminal region and the C-terminal region are cut without being continuous. Specifically, for example, using the first antibody that specifically binds to the N-terminal region of NTRK1 protein and the second antibody that specifically binds to the C-terminal region of NTRK1 protein, the two regions Can be detected in different proteins by detecting NTRK1 fusion protein.
- the NTRK1 fusion protein may be detected by confirming, by the above-described method, a state in which other proteins other than the NTRK1 protein that constitutes the fusion protein together with the NTRK1 protein are cleaved.
- the NTRK1 fusion protein can be detected by specifically detecting the expression levels of the N-terminal region and the C-terminal region of the NTRK1 protein and determining the ratio of the expression levels. .
- NTRK1 fusion protein can be detected using as an index the difference between the expression level of the NTRK1 protein N-terminal region and the NTRK1 protein C-terminal region.
- the NTRK1 fusion protein may be detected by confirming the other protein other than the NTRK1 protein constructing the NTRK1 fusion protein together with the NTRK1 protein by the aforementioned method.
- the NTRK1 fusion protein is constructed by fusing the NTRK1 protein-derived polypeptide with a polypeptide derived from another protein other than the NTRK1 protein.
- the NTRK1 fusion protein can be detected by detecting a fusion polypeptide in which at least a part of the polypeptide derived from the NTRK1 protein and at least a part of the polypeptide derived from the other protein are continuously contained.
- a first antibody that specifically binds to the N-terminal region of a protein other than NTRK1 protein and a second antibody that specifically binds to the C-terminal region of NTRK1 protein are used.
- the NTRK1 fusion protein can be detected by confirming that the two regions are present in the same protein.
- the NTRK1 fusion protein is constructed by fusing the NTRK1 protein-derived polypeptide and a polypeptide derived from another protein other than the NTRK1 protein at the fusion point.
- NTRK1 fusion by detecting a fusion polypeptide in which at least a part of the polypeptide derived from NTRK1 protein containing the fusion point and at least a part of the polypeptide derived from the other protein are continuously contained in the fusion protein Protein can be detected.
- NTRK1 fusion protein can be detected by an immunological assay using an antibody that specifically recognizes a polypeptide containing the fusion point of NTRK1 fusion protein.
- the NTRK1 fusion protein can be detected using the activity of the NTRK1 fusion protein as an index. Specifically, for example, after inhibiting the activity of the wild-type NTRK1 protein using a substance having an inhibitory activity against the wild-type NTRK1 protein, the kinase activity of the NTRK1 protein is measured, and the NTRK1 fusion protein is not included ( The NTRK1 fusion protein can be detected with an index of high activity as compared to the case of including only wild-type NTRK1 protein).
- NTRK1 protein For the measurement of the kinase activity of NTRK1 protein, a method well known to those skilled in the art can be selected as appropriate. For example, the phosphorylation state of a molecule that is phosphorylated by NTRK1 may be detected.
- the NTRK1 fusion protein may be detected by using the presence of the full-length polypeptide constituting the NTRK1 fusion protein or the presence of the polypeptide constituting a part of the NTRK1 fusion protein as an index. It is not limited as far as it can be confirmed.
- ⁇ Mode for detecting LMNA fusion gene> ⁇ Mode for detecting LMNA fusion gene>
- detection of a specific region of a gene in each of the following embodiments may be performed using a probe or primer designed based on a base sequence analyzed in advance or by sequencing, regardless of the examples. Also good.
- Mode for detecting LMNA fusion gene (1) when the LMNA fusion gene is constructed, the LMNA gene is cleaved into two or more polynucleotides based on the fact that the LMNA gene is cleaved, ie, LMNA. By detecting the loss of continuity between the gene 5 ′ terminal region and the LMNA gene 3 ′ terminal region, the LMNA fusion gene can be detected.
- an LMNA fusion gene can be detected.
- the LMNA fusion gene can be detected by detecting the presence of only the LMNA gene 5 ′ terminal region. It should be noted that the LMNA fusion gene may be detected by confirming, by the above method, the state in which the other gene that is fused with the polynucleotide derived from the LMNA gene is constructing the fusion gene.
- the LMNA fusion gene is detected by specifically detecting the expression levels of the 5 ′ terminal region and the 3 ′ terminal region of the LMNA gene and determining the ratio of the expression levels. Can do. Specifically, for example, when the expression level of the LMNA gene 5 ′ terminal region is different from the expression level of the LMNA gene 3 ′ terminal region, the LMNA fusion gene can be detected. Alternatively, the LMNA fusion gene may be detected by confirming the gene other than the LMNA gene constructing the LMNA fusion gene together with the LMNA gene by the aforementioned method.
- a duplicate polynucleotide derived from the LMNA gene when duplication of at least a part of the LMNA gene or other genes other than the LMNA gene is involved, that is, a duplicate polynucleotide derived from the LMNA gene, and
- an LMNA fusion gene is constructed from a duplicated polynucleotide derived from another gene other than the LMNA gene constructing the LMNA fusion gene together with the LMNA gene, the polynucleotide derived from the LMNA gene or from the other gene
- an LMNA fusion gene can be detected.
- the LMNA fusion gene is constructed by fusing a polynucleotide derived from an LMNA gene and a polynucleotide derived from another gene other than the LMNA gene. Detecting an LMNA fusion gene by detecting a fusion polynucleotide comprising at least a part of a polynucleotide derived from the LMNA gene and at least a part of a polynucleotide derived from another gene other than the LMNA gene. be able to.
- a first probe that specifically hybridizes to the 3 ′ terminal region of a polynucleotide derived from a gene other than the LMNA gene, and a hybrid that specifically hybridizes to the 5 ′ terminal region of the LMNA gene The LMNA fusion gene can be detected by detecting that the two gene regions are close to each other on the chromosome using the second probe.
- the other gene other than the LMNA gene is NTRK1
- the first probe specifically hybridizes to the 3 ′ terminal region of the polynucleotide derived from the NTRK1 gene.
- a probe to be used may be used.
- the LMNA fusion gene is constructed based on the fact that the LMNA gene-derived polynucleotide is constructed by fusing a polynucleotide derived from another gene other than the LMNA gene at the fusion point.
- the fusion gene a fusion polynucleotide in which at least a part of the polynucleotide derived from the LMNA gene and at least a part of the polynucleotide derived from another gene other than the LMNA gene are continuously contained including the fusion point is detected.
- the LMNA fusion gene can be detected.
- the LMNA fusion gene can be detected by conducting a PCR reaction using the second primer that anneals and confirming that a predetermined PCR product indicating the presence of the fusion point is obtained.
- ⁇ Mode for detecting LMNA fusion protein (1-a)> As a mode of detecting the LMNA fusion protein, when the LMNA fusion gene is constructed, the LMNA protein encoded by the LMNA gene is also cleaved.
- the LMNA fusion protein can be detected by detecting that the terminal region and the C-terminal region are cleaved without being continuous. Specifically, for example, using the first antibody that specifically binds to the N-terminal region of the LMNA protein and the second antibody that specifically binds to the C-terminal region of the LMNA protein, the two regions Can be detected by confirming that they are present in different proteins.
- the LMNA fusion protein may be detected by confirming, by the above-described method, a state in which a protein other than the LMNA protein constructing the fusion protein together with the LMNA protein is cleaved.
- the LMNA fusion protein can be detected by specifically detecting the expression levels of the N-terminal region and the C-terminal region of the LMNA protein and determining the ratio of the expression levels. .
- the LMNA fusion protein can be detected using as an indicator that the expression level of the N-terminal region of the LMNA protein is different from the expression level of the LMNA protein C-terminal region.
- the LMNA fusion protein may be detected by confirming the protein other than the LMNA protein constructing the LMNA fusion protein together with the LMNA protein by the aforementioned method.
- the LMNA fusion protein is constructed by fusing a polypeptide derived from an LMNA protein and a polypeptide derived from another protein other than the LMNA protein.
- the LMNA fusion protein can be detected by detecting a fusion polypeptide in which at least a part of the polypeptide derived from the LMNA protein and at least a part of the polypeptide derived from the other protein are continuously contained.
- a first antibody that specifically binds to the C-terminal region of a protein other than the LMNA protein and a second antibody that specifically binds to the N-terminal region of the LMNA protein are used.
- LMNA fusion protein can be detected by confirming that the two regions are present in the same protein.
- the LMNA fusion protein is constructed by fusing an LMNA protein-derived polypeptide and a polypeptide derived from another protein other than the LMNA protein at a fusion point, Detecting a fusion polypeptide in which at least part of a polypeptide derived from an LMNA protein containing the fusion point and at least part of a polypeptide derived from another protein other than the LMNA protein are continuously contained in the fusion protein
- the LMNA fusion protein can be detected.
- the LMNA fusion protein can be detected by an immunoassay using an antibody that specifically recognizes a polypeptide containing the fusion point of the LMNA fusion protein.
- the LMNA fusion protein can be detected using the activity of the LMNA fusion protein as an index.
- a protein other than LMNA that constructs a fusion protein together with an LMNA protein is a protein having an enzyme activity
- it is compared with a case where an LMNA fusion protein is not included (including only a wild type LMNA protein).
- the LMNA fusion protein can be detected using the high enzyme activity as an index.
- a method well known to those skilled in the art can be appropriately selected for measuring enzyme activity.
- the other protein is a protein having a kinase activity (preferably NTRK1 protein)
- phosphorylation is performed by an LMNA fusion protein. The phosphorylation state of the molecule undergoing the reaction may be detected.
- the LMNA fusion protein may be detected by using the presence of the full-length polypeptide constituting the LMNA fusion protein or the presence of the polypeptide constituting a part of the LMNA fusion protein as an index. It is not limited as far as it can be confirmed.
- NTRK1 fusion gene genomic DNA, mRNA, or cDNA
- detection of LMNA fusion gene genomic DNA, mRNA, or cDNA
- detection of NTRK1 fusion protein detection of LMNA fusion protein
- detection of LMNA fusion protein detection of LMNA fusion protein
- a suitable technique for detecting a fusion gene or LMNA fusion gene, or NTRK1 fusion protein or LMNA fusion protein can be appropriately selected by those skilled in the art.
- NTRK1 fusion gene or LMNA fusion gene can be detected by detecting genomic DNA of NTRK1 fusion gene or LMNA fusion gene, detecting mRNA that is a transcription product of the genomic DNA, or detecting cDNA obtained using mRNA as a template. There may be.
- hybridization technology using a hybridizing probe such as a nucleic acid probe
- gene amplification technology using a primer that anneals to at least a part of the NTRK1 fusion gene or LMNA fusion gene Any known technique and techniques applying these techniques can be used.
- PCR Linear PCR
- SDA Strand displacement amplification
- NASBA Nucleic acid sequence-based amplification
- ICAN Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids
- LAMP Loop-mediated isothermal amplification
- Any technique may be used, such as a method, a TMA method (Gen-Probe's TMA system), an in situ hybridization method, a microarray method, a Northern hybridization, a Southern hybridization, a dot blot method, an RNA protection method, a DNA sequence, or an RNA sequence .
- an in situ hybridization technique For detection of genomic DNA, an in situ hybridization technique can be suitably used. Detection using an in situ hybridization technique can be performed, for example, according to a known FISH method. Or it can implement by the fusion assay (fusion assay) which combined the chromogenic in situ hybridization (CISH) method and the silver in situ hybridization (SISH) method. Preferably, it can be detected by the FISH method split assay or FISH method fusion assay described in Example 4 or 5.
- fusion assay fusion assay
- CISH chromogenic in situ hybridization
- SISH silver in situ hybridization
- DNA sequencing technology can be suitably used for detecting genomic DNA.
- a sequencer based on the conventional Sanger method may be used, but in consideration of analysis efficiency, it is preferable to use a next-generation sequencer (for example, Metzker ML, Nat Rev Genet. 2010 Jan; 11 (See (1): 31-46).
- Illustrative examples of the next-generation sequencer include MiSeq / HiSeq from Illumina, SOLiD system from Life Technologies, 454 sequence system (GS FLX + / GS Junior) from Roche.
- the efficiency of analysis can be improved by enriching a region where a fusion gene may exist using a sequence capture technique or the like.
- the sequence capture technology include Roche NimbleGen from Roche, Sure Select from Agilent Technologies, and the like.
- representative methods for detecting genomic DNA are exemplified, but the present invention is not limited thereto.
- ⁇ FISH method split assay> In the FISH method split assay of NTRK1 fusion gene, as a probe for detection, as described in detail in Example 6 described later, a polynucleotide covering the 5'-terminal genomic region of NTRK1 gene and fluorescently labeled A combination with a polynucleotide covering the 3′-terminal genomic region of the gene and labeled with another fluorescent dye is used.
- the two gene regions are close to each other, so the two signals overlap ( For example, when red fluorescent dye and green fluorescent dye are used, it is detected as yellow), whereas when two gene regions are cleaved by translocation or inversion, two types of fluorescence are detected. Signals derived from the dye (eg, red and green) are detected lonely. Therefore, in the FISH method split assay, the presence of the NTRK1 fusion gene is detected by detecting that the 5 ′ terminal genomic region of the NTRK1 gene and the NTRK1 gene 3 ′ terminal genomic region are not close to each other on the chromosome. ing.
- the FISH method split assay of the LMNA fusion gene as a probe for detection, as described in detail in Example 6 to be described later, it is a polynucleotide that covers the 5 ′ terminal genomic region of the LMNA gene and is fluorescently labeled. And a combination of a polynucleotide covering the 3′-terminal genomic region of the same gene and labeled with another fluorescent dye.
- the two gene regions are close to each other, so the two signals overlap ( For example, when red fluorescent dye and green fluorescent dye are used, it is detected as yellow), whereas when two gene regions are cleaved by translocation or inversion, two types of fluorescence are detected. Signals derived from the dye (eg, red and green) are detected lonely. Accordingly, in the FISH split assay, the presence of the LMNA fusion gene is detected by detecting that the 5 ′ end genomic region of the LMNA gene and the LMNA gene 3 ′ end genomic region are not close together on the chromosome. ing.
- the NTRK1 fusion gene or the LMNA fusion gene is an LMNA-NTRK1 fusion gene, it is a polynucleotide that covers the 5′-terminal genomic region of the LMNA gene as a detection probe, as shown in Example 6 described later, and is fluorescent.
- a combination of a labeled and a polynucleotide covering the 3 ′ end genomic region of the same gene and labeled with another fluorescent dye, or a polynucleotide covering the 5 ′ end genomic region of the NTRK1 gene LMNA-NTRK1 fusion gene is detected by using a combination of a fluorescently labeled one and a polynucleotide covering the 3′-terminal genomic region of the same gene and labeled with another fluorescent dye can do.
- ⁇ FISH method fusion assay> In the FISH fusion assay of the NTRK1 fusion gene, for example, when the NTRK1 fusion gene is an LMNA-NTRK1 fusion gene, as described in detail in Example 5 below, the LMNA gene 5 ′ end genome A combination of a polynucleotide that covers the region and is fluorescently labeled, and a polynucleotide that covers the 3 ′ terminal genomic region of the NTRK1 gene and is labeled with another fluorescent dye can be used.
- the 5 ′ end of the LMNA gene is used as a detection probe as described in detail in Example 5 below.
- a combination of a polynucleotide covering the side genomic region and fluorescently labeled with a polynucleotide covering the 3 ′ end side genomic region of the NTRK1 gene and labeled with another fluorescent dye it can.
- the above FISH fusion assay and split assay can be simultaneously performed on the same pathological section.
- the NTRK1 fusion gene or the LMNA fusion gene is an LMNA-NTRK1 fusion gene
- a polyprobe that covers the 5 ′ terminal genomic region of the LMNA gene is used as a detection probe as described in detail in Example 7 below.
- Nucleotides that are fluorescently labeled (for example, blue), polynucleotides that cover the 5′-terminal genomic region of the NTRK1 gene and that are labeled with another fluorescent dye (for example, red), and 3 ′ of the NTRK1 gene A combination of a polynucleotide covering the terminal genomic region and labeled with another fluorescent dye (for example, green) can be used. That is, each probe is labeled and used with three different color fluorescent dyes (for example, blue, red, and green).
- the 5 ′ end genomic region of the NTRK1 gene and the 3 ′ end genomic region of the NTRK1 gene are continuous (close), so the 5 ′ end side of the NTRK1 gene
- a signal in which the fluorescence of different fluorescent labels that label the genomic region and the 3 ′ end side genomic region are overlapped is detected, and the 5 ′ end side genomic region of the LMNA gene is labeled
- the signal of the fluorescent dye for example, blue
- the 5 ′ end genomic region of the NTRK1 gene is lost from its original position due to gene translocation, deletion or inversion, and the 5 ′ end of the LMNA gene is lost.
- the side genomic region and the 3 ′ end side genomic region of the NTRK1 gene are continuous (in some cases, including the inserted base in the middle) to form a fusion point.
- a signal in which the fluorescence of the fluorescent dye labeled on the 5 ′ end genomic region of the LMNA gene and the fluorescence of the fluorescent dye labeled on the 3 ′ end genomic region of the NTRK1 gene overlap for example, blue and green overlap). (Blue-green) is detected only at the fusion gene constituent site, and the signal (for example, red) of the fluorescent dye that has labeled the 5′-terminal genomic region of the NTRK1 gene is not detected at the fusion gene constituent site.
- the signal (for example, red) of the fluorescent dye that has labeled the 5 'terminal genomic region of the NTRK1 gene is detected lonely or nowhere.
- This FISH assay in which a fusion assay and a split assay are simultaneously performed on the same pathological section, is suitable from the viewpoint of efficiency and improved determination reliability because the results of both methods can be obtained on one pathological section. is there.
- a probe having a signal (for example, red) that shows loneliness when the fusion gene is constructed is not limited to the 5 ′ end region of the NTRK1 gene, for example, when the fusion gene is the LMNA-NTRK1 gene, but the LMNA gene 5 The same effect can be obtained by designing to hybridize within the genomic region between the 'terminal genomic region and the 3' terminal genomic region of the NTRK1 gene.
- LMNA-NTRK1 fusion gene in the case of the LMNA-NTRK1 fusion gene, four types of probes that are polynucleotides covering the 5 ′ end genomic region or the 3 ′ end genomic region of each constituent gene and are all labeled with different fluorescent dyes Can simultaneously detect the cleavage of the LMNA gene and the NTRK1 gene, and the fusion of the 5 ′ end genomic region of the LMNA gene and the 3 ′ end genomic region of the NTRK1 gene on one pathological section. .
- the probe used for hybridization for detecting the NTRK1 fusion gene may be a hybrid under stringent conditions (preferably under more stringent conditions) to at least some nucleotides of the NTRK1 fusion gene or their complementary strands. Probes that soy are preferred.
- a nucleic acid molecule of at least 32 bases consisting of 16 bases each upstream and downstream across the fusion point of the NTRK1 fusion gene (specifically, May be a probe comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (No. 994 to No. 1025), or a complementary strand thereof.
- the probe used for hybridization for detecting the LMNA fusion gene may be a hybrid under stringent conditions (preferably under more stringent conditions) to at least some nucleotides of the LMNA fusion gene or their complementary strands. Probes that soy are preferred.
- a nucleic acid molecule consisting of at least 32 bases consisting of 16 bases upstream and downstream of the fusion point of the LMNA fusion gene (specifically, May be a probe comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (No. 994 to No. 1025), or a complementary strand thereof.
- the probe that can be used in the FISH fusion assay includes a 5′-terminal genomic region of either the LMNA gene or the NTRK1 gene.
- a second probe capable of specifically recognizing the 3 ′ terminal genomic region of the remaining one gene preferably, the 5 ′ terminal genomic region of the LMNA gene
- a combination of a first probe capable of specifically recognizing and a second probe capable of specifically recognizing the 3′-terminal genomic region of the NTRK1 gene A combination of a first probe capable of specifically recognizing and a second probe capable of specifically recognizing the 3′-terminal genomic region of the NTRK1 gene), and more specifically, Examples described later
- Each combination of BAC clones used in 5 can be mentioned.
- the NTRK1 fusion gene or the LMNA fusion gene is an LMNA-NTRK1 fusion gene
- a probe that can be used in the FISH split assay a first region that can specifically recognize the NTRK1 gene 5′-end genomic region can be used.
- a second probe capable of specifically recognizing the 3 ′ end genomic region of NTRK1 gene, or a first probe capable of specifically recognizing the 5 ′ end genomic region of LMNA gene, and LMNA Combination with a second probe capable of specifically recognizing the 3 ′ terminal genomic region of the gene preferably, a first probe capable of specifically recognizing the 5 ′ terminal genomic region of the NTRK1 gene and 3 ′ of the NTRK1 gene Combination with a second probe that can specifically recognize the terminal genomic region
- Detection of mRNA can be performed by analyzing mRNA itself by Northern hybridization or the like, or by analyzing complementary DNA (cDNA) synthesized using mRNA as a template by methods well known to those skilled in the art. May be.
- a sequencing technique can be suitably used for detection of the RNA.
- a next-generation sequencer it is preferable to use a next-generation sequencer in consideration of analysis efficiency (see, for example, Metzker ML, Nat Rev Genet. 2010 Jan; 11 (1): 31-46).
- Illustrative examples of the next-generation sequencer include MiSeq / HiSeq from Illumina, SOLiD system from Life Technologies, 454 sequence system (GS FLX + / GS Junior) from Roche.
- sequence capture technology examples include Roche NimbleGen from Roche, Sure Select from Agilent Technologies, and the like.
- mRNA can be detected by a gene amplification reaction method using a primer designed to specifically amplify at least a part of the polynucleotide of the NTRK1 fusion gene or LMNA fusion gene to be detected.
- a primer designed to specifically amplify at least a part of the polynucleotide of the NTRK1 fusion gene or LMNA fusion gene to be detected.
- a method for detecting the NTRK1 fusion gene of the present invention in addition to the step of amplifying a specific polynucleotide in a sample obtained from a subject by a gene amplification reaction, whether or not an amplified fragment of a desired size has been obtained is determined.
- a detecting step is included.
- the PCR method is suitable for quantitatively detecting the NTRK1 fusion gene or the LMNA fusion gene. Therefore, as described in ⁇ Aspect for detecting NTRK1 fusion gene (1-b)>, the expression levels of the 5 ′ terminal region and 3 ′ terminal region of NTRK1 gene are specifically detected, It can be suitably used in a method for detecting the NTRK1 fusion gene by determining the ratio of expression levels. Alternatively, the expression levels of the 5 ′ terminal region and the 3 ′ terminal region of other genes other than the NTRK1 gene constructing the NTRK1 fusion gene together with the NTRK1 gene are specifically detected, and the ratio of the expression levels is obtained. Thus, the NTRK1 fusion gene can be detected.
- the expression levels of the LMNA gene 5 ′ terminal region and 3 ′ terminal region are specifically detected. It can use suitably for the method of detecting an LMNA fusion gene by calculating
- the expression levels of the 5 ′ terminal region and the 3 ′ terminal region of other genes other than the LMNA gene constructing the LMNA fusion gene together with the LMNA gene are specifically detected, and the ratio of the expression levels is obtained.
- the LMNA fusion gene can be detected.
- PCR method and the primer design method used therefor can be performed by those skilled in the art according to a known method.
- a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify the 5 ′ end region of the NTRK1 gene, and a sense primer designed to specifically amplify the 3 ′ end region of the NTRK1 gene and Antisense primers can be used.
- a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify the 5 ′ terminal region of the LMNA gene, and a sense primer designed to specifically amplify the 3 ′ terminal region of the LMNA gene and Antisense primers can be used.
- the PCR amplification monitor (real-time PCR) method (Genome Res., 6 (10), 986, 1996) is used to detect NTRK1 fusion gene or LMNA fusion gene. It is possible to perform more quantitative analysis.
- ABI PRISM 7900 PE Biosystems
- Real-time PCR is a known method, and devices and kits for the real-time PCR are commercially available, and can be easily performed using these.
- a sense primer 5′-primer
- an antisense primer 3′-primer
- an antisense primer is designed from any part derived from the NTRK1 gene.
- a sense primer 5′-primer
- Primers (3′-primers) are designed from any part derived from the NTRK1 gene.
- the primer set used in the detection method for detecting the NTRK1 fusion gene of the present invention is not particularly limited as long as it can specifically amplify at least a part of the NTRK1 fusion gene to be detected and can detect the NTRK1 fusion gene. Is not limited, and a person skilled in the art can design based on the base sequence of the polynucleotide to be detected.
- the primer set used in the detection method for detecting the LMNA fusion gene of the present invention is not particularly limited as long as it can specifically amplify at least a part of the LMNA fusion gene to be detected and can detect the LMNA fusion gene.
- Primer design in the PCR amplification monitoring method can be performed using primer design software (eg, Primer Express; PE Biosystems).
- primer design software eg, Primer Express; PE Biosystems.
- the sense primer and the antisense primer should be set so that the size of the amplified product when amplified for mRNA or cDNA is 1 kb or less. Is appropriate.
- mRNA can be detected by a hybridization method using a probe that hybridizes to at least part of the polynucleotide of the NTRK1 fusion gene or LMNA fusion gene to be detected.
- detection using a hybridization technique include Northern hybridization, dot blot method, DNA microarray method, RNA protection method and the like.
- NTRK1 protein for example, as a method used for detecting NTRK1 fusion protein, NTRK1 protein, or an antibody that specifically recognizes other proteins other than NTRK1 protein that constructs NTRK1 fusion protein together with NTRK1 protein, or NTRK1 fusion protein is specifically used.
- Immunoassay immunoassay
- enzyme activity assay ELISA
- 2-antibody sandwich ELISA fluorescence immunoassay
- radioimmunoassay for example, as a method used for detecting NTRK1 fusion protein.
- ELISA enzyme activity assay
- 2-antibody sandwich ELISA 2-antibody sandwich ELISA
- fluorescence immunoassay for example, radioimmunoassay, western blotting, immunohistochemistry
- immunoprecipitation iAEP (intercalated antibody-enhanced polymer) method
- FRET method for example, a mass spectrometry method or an amino acid sequence method can be used in combination with these or alone.
- an antibody specifically recognizing an LMNA protein or another protein other than the LMNA protein that constructs the LMNA fusion protein together with the LMNA protein, or an LMNA fusion protein is specifically used.
- Immunoassay immunoassay
- enzyme activity assay ELISA
- 2-antibody sandwich ELISA fluorescence immunoassay
- radioimmunoassay western blotting
- immunohistochemistry examples thereof include immunoprecipitation, iAEP (intercalated antibody-enhanced polymer) method, and FRET method.
- a mass spectrometry method or an amino acid sequence method can be used in combination with these or alone.
- representative methods for protein detection are exemplified, but the present invention is not limited thereto.
- Typical methods used for detection As a detection method using an antibody, the above-mentioned known method may be used. For example, the following method can be used.
- the NTRK1 fusion protein or LMNA fusion protein to be detected is an LMNA-NTRK1 fusion protein
- immunostaining was performed using an antibody that specifically binds to a polypeptide in the N-terminal region of NTRK1 protein and an antibody that specifically binds to a polypeptide in the C-terminal region of NTRK1 protein. It is also possible to detect the presence of the fusion protein to be detected using the localization without proximity as an index. In addition, immunostaining was performed using an antibody that specifically binds to the polypeptide in the N-terminal region of the LMNA protein and an antibody that specifically binds to the polypeptide in the C-terminal region of the LMNA protein. It is also possible to detect the presence of the fusion protein to be detected using the localization without proximity as an index. Alternatively, the presence of the fusion protein to be detected can be detected by performing immunostaining using an antibody that specifically binds to the polypeptide containing the fusion point.
- ⁇ Western blotting method> when the NTRK1 fusion protein or LMNA fusion protein to be detected is an LMNA-NTRK1 fusion protein, a cell extract in which the fusion protein to be detected may be present is electrophoresed by a method well known to those skilled in the art. The protein in the cell extract is separated and blotted on the membrane. The membrane blotted with the protein is immunostained with an anti-NTRK1 antibody that binds to a polypeptide in the C-terminal region of the NTRK1 protein and an anti-LMNA antibody that binds to the N-terminal region of the LMNA protein.
- the presence of the fusion protein to be detected can also be detected using as an index the binding of the anti-NTRK1 antibody and the anti-LMNA antibody at the desired position above. It is also possible to detect the presence of a fusion protein to be detected using an antibody that specifically binds to a polypeptide containing a fusion point and using as an index that the antibody is bound to a desired position on the membrane. . Alternatively, an anti-NTRK1 antibody can be used to detect the presence of the fusion protein to be detected using as an index that the antibody is bound to the LMNA-NTRK1 fusion protein on the membrane.
- the presence of the fusion protein to be detected may be detected using as an index the binding of the anti-NTRK1 antibody to a position different from the position where the wild type NTRK1 protein is predicted on the membrane.
- An LMNA-NTRK1 fusion protein may be detected using an anti-LMNA antibody and the same principle as when an anti-NTRK1 antibody is used.
- the NTRK1 fusion protein or LMNA fusion protein to be detected is an LMNA-NTRK1 fusion protein
- the CTR-terminal region of the NTRK1 protein is compared with the cell extract in which the fusion protein to be detected may be present.
- Immunoprecipitation is performed with either the anti-NTRK1 antibody that binds to the polypeptide or the anti-LMNA antibody that binds to the polypeptide in the N-terminal region of the LMNA protein, and the remaining antibody is detected against the precipitate.
- the presence of the fusion protein to be detected can also be detected.
- the detection antibody As described above, after immunoprecipitation and detection, it is preferable to further confirm with the detection antibody that the detected polypeptide is the size of the target polypeptide to be detected.
- immunoprecipitation is performed on a cell extract in which the NTRK1 fusion protein to be detected may be present with an anti-NTRK1 antibody that binds to a polypeptide in the C-terminal region of the NTRK1 protein, and the precipitate
- mass spectrometry the presence of a fusion protein to be detected can be detected by confirming the presence of a protein that binds to an anti-NTRK1 antibody having a mass different from that of wild-type NTRK1.
- a cell extract in which the LMNA fusion protein to be detected may be present is immunoprecipitated with an anti-LMNA antibody that binds to a polypeptide in the N-terminal region of the LMNA protein, and mass analysis of the precipitate is performed.
- mass analysis of the precipitate is performed.
- the antibody used in the detection method according to the present invention is not particularly limited as long as it specifically binds to a desired site of NTRK1 fusion protein or LMNA fusion protein, and may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. A combination of a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can also be used.
- the antibody may be an immunoglobulin itself or an antibody fragment that retains antigen binding ability, such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , or Fv. Any label or signal amplification method known to those skilled in the art may be used to detect antibody binding.
- ⁇ Labeling method> In the above gene (genomic DNA, mRNA, cDNA, etc.) and protein detection methods, known techniques may be used for labeling probes, amplification products, antibodies, and the like. For example, fluorescent labels, radioactive labels, enzyme labels and the like can be mentioned.
- the labeling method when a probe is labeled, the labeling method may be a known method as described above. For example, when preparing a labeled nucleic acid probe from a BAC clone, nick translation, A known method such as a random prime method can be used.
- the probe is labeled with biotin using biotin-dUTP (for example, manufactured by Roche Applied Science), and the probe is labeled by further processing phosphors, radioisotopes, enzymes, etc. bound to avidin. can do.
- biotin-dUTP for example, manufactured by Roche Applied Science
- the labeling method may be a known method as described above, and examples thereof include the following labeling methods.
- Staining sensitivity can be increased by placing an intervening antibody between the first antibody that binds to the protein to be detected and the polymer reagent (Takeuchi et al., Clin Cancer Res, 2009 May 1; 15 (9) : 3143-3149).
- FRET probe Fluorescence resonance energy transfer
- the subject is a subject (patient) having an LMNA fusion-positive cancer. And is a target for treatment with LMNA inhibitors.
- the detection kit of the present invention includes a detection kit for the NTRK1 fusion gene to be detected or a detection kit for the NTRK1 fusion protein to be detected.
- the detection kit of the present invention includes a detection kit of a detection target LMNA fusion gene or a detection kit of a detection target LMNA fusion protein, or a detection kit of a detection target NTRK1 fusion gene of the present invention, or
- the LMNA fusion gene detection kit includes a probe that can be used in the FISH fusion assay or FISH split assay in the detection method of the present invention, or the NTRK1 fusion gene or LMNA fusion to be detected in the detection method of the present invention.
- Sense and antisense primers designed to specifically amplify at least a portion of the gene are included.
- the sense and antisense primer set is a set of polynucleotides that are at least a part of the polynucleotides of the NTRK1 fusion gene or the LMNA fusion gene and function as primers for amplification of the polynucleotide to be amplified.
- the detection kit of the present invention for detecting NTRK1 fusion protein or LMNA fusion protein includes an antibody that can be used in the detection method of the present invention.
- the kit for detecting the NTRK1 fusion gene of the present invention has one kind of probe that can hybridize under stringent conditions to at least a part of the polynucleotide of the NTRK1 fusion gene, or its complementary strand, and detect the NTRK1 fusion gene. Or it can contain in the combination of 2 or more types.
- the kit for detecting an LMNA fusion gene of the present invention has one kind of probe that hybridizes under stringent conditions to at least a part of a polynucleotide of the LMNA fusion gene or a complementary strand thereof, and can detect the LMNA fusion gene. Or it can contain in the combination of 2 or more types.
- the probe examples include any one or more of the probes described in ⁇ Technology used in detection method >>.
- the NTRK1 fusion gene or the LMNA fusion gene is an LMNA-NTRK1 fusion gene
- one or more (preferably two or more) probes hybridizing to the NTRK1 gene-derived polynucleotide, or the LMNA gene-derived polynucleotide Even if only one of one or more (preferably two or more) probes that hybridize is included, it hybridizes to one or more probes that hybridize to the NTRK1 gene-derived polynucleotide and to the LMNA gene-derived polynucleotide.
- the kit for detecting the NTRK1 fusion gene of the present invention can specifically amplify at least a part of the NTRK1 fusion gene, and can contain one set of primer sets that can detect the NTRK1 fusion gene, or a combination of two or more sets.
- the kit for detecting an LMNA fusion gene of the present invention can specifically amplify at least a part of the LMNA fusion gene, and can include one set of primer sets that can detect the LMNA fusion gene, or a combination of two or more sets.
- Examples of the primer set include any one or more of the primer sets described in ⁇ Aspect of detection method of the present invention >> or ⁇ Technique used in detection method >>.
- a primer set for detecting a fusion gene between an LMNA gene and an NTRK1 gene comprising a sense primer designed from a portion encoding LMNA and an antisense primer designed from a portion encoding NTRK1
- the antisense primer consists of a nucleic acid molecule (preferably a nucleic acid molecule of at least 16 bases) that anneals to the “polynucleotide to be detected” under stringent conditions (preferably under more stringent conditions).
- a primer set consisting of a nucleic acid molecule (preferably a nucleic acid molecule of at least 16 bases) that anneals to the complementary strand of the “polynucleotide to be detected” under stringent conditions (preferably under more stringent conditions) is included.
- the primer set of the present invention includes the following primer sets (2) and / or (3).
- a sense primer (preferably SEQ ID NO: 6) consisting of any continuous oligonucleotide of at least 16 bases between base numbers 1 to 513 of SEQ ID NO: 1 (LMNAex2-NTRK1ex11) and base numbers 514 to 1653 of SEQ ID NO: 1
- a primer set of antisense primers (preferably SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8) consisting of oligonucleotides complementary to any consecutive at least 16 base oligonucleotides in between.
- a sense primer preferably SEQ ID NO: 6
- an antisense primer preferably SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8
- the base sequence of the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 9 is the base sequence including the untranslated region (UTR) of the fusion gene represented by SEQ ID NO: 1 (LMNAex2-NTRK1ex11). Is an array.
- the distance between the selected positions of the sense primer and the antisense sense primer is 1 kb or less, or the size of the amplification product amplified by the sense primer and the antisense sense primer Is preferably 1 kb or less.
- the primer of the present invention usually has a chain length of 15 to 40 bases, preferably 16 to 24 bases, more preferably 18 to 24 bases, and particularly preferably 20 to 24 bases.
- the primer set of the present invention can be used for amplifying and detecting a polynucleotide to be detected in the detection method of the present invention.
- each primer contained in the primer set of this invention is not specifically limited, For example, it can manufacture by a chemical synthesis method.
- the kit for detecting the NTRK1 fusion protein of the present invention can contain one or more combinations of antibodies that specifically bind to any site of the NTRK1 fusion protein. Specifically, the antibodies described in ⁇ Fusion protein detection> can be exemplified.
- the detection kit for the LMNA fusion protein of the present invention can contain one or more combinations of antibodies that specifically bind to any site of the LMNA fusion protein. Specifically, the antibodies described in ⁇ Fusion protein detection> can be exemplified.
- NTRK1 fusion protein or LMNA fusion protein when NTRK1 fusion protein or LMNA fusion protein is LMNA-NTRK1 fusion protein, it binds to one or more (preferably two or more) antibodies that bind to NTRK1 protein-derived polypeptide, or to LMNA protein-derived polypeptide.
- One or more antibodies that bind to a polypeptide containing the fusion point of NTRK1 fusion protein, or one or more antibodies that bind to a polynucleotide containing the fusion point of the LMNA fusion gene May be included.
- the method for screening an inhibitory substance of the present invention can screen a substance that inhibits the detection target polypeptide, (1) A step of bringing a test substance into contact with a polypeptide to be detected or a cell expressing the polypeptide, (2) analyzing whether or not the polypeptide is inhibited; and (3) selecting a substance that inhibits the polypeptide.
- inhibitortion of polypeptide includes inhibition of activity of polypeptide and inhibition of expression of polypeptide. “Inhibition” means at least partial inhibition.
- the screening method of the present invention includes (A) Using purified or crude polypeptide, the method using in vitro inhibition of polypeptide activity as an index, (B) a method using a cell expressing a polypeptide as an indicator of inhibition of polypeptide activity; (C) A method using the expression of the polypeptide as an index using cells expressing the polypeptide is included.
- a test substance is added to and contacted with a polypeptide in vitro, whether or not the activity of the polypeptide is inhibited by the test substance, a control (polysaccharide not contacted with the test substance).
- a method comprising the step of selecting a substance that inhibits the activity of the polypeptide.
- In vitro polypeptide activity can be measured using a known kinase activity measurement method. For example, the amount of ADP produced by the kinase reaction may be used as an index, or the tyrosine phosphorylation level of the polypeptide may be used as an index. Commercially available kinase activity measurement kits can also be used.
- the method (B) includes a step of adding a test substance to a cell expressing the polypeptide and bringing it into contact; whether the test substance inhibits the activity of the polypeptide; And a method comprising a step of selecting a substance that inhibits the activity of the polypeptide.
- a known kinase activity measurement method can be used for the measurement of the polypeptide activity in the cells.
- the amount of ADP produced by the kinase reaction may be used as an index, or the tyrosine phosphorylation level of the polypeptide may be used as an index.
- a commercially available kinase activity measurement kit can also be used.
- a test substance is added to and contacted with a cell expressing the polypeptide, whether or not the expression of the polypeptide is inhibited by the test substance, a control (contact with the test substance).
- a method comprising a step of selecting a substance that inhibits the expression of a polypeptide.
- Polypeptide expression in the cells can be analyzed by measuring the amount of protein or mRNA.
- ELISA or immunoblotting can be used for measuring the amount of protein
- RT-PCR or Northern blotting can be used for measuring the amount of mRNA.
- the NTRK1 fusion gene is a gene having tumorigenicity. Therefore, the polypeptide inhibitor selected by the inhibitor screening method of the present invention is useful as a therapeutic agent for NTRK1 fusion-positive cancer or a candidate substance thereof. A step of confirming that the fusion-positive cancer has therapeutic activity can be further included.
- the LMNA fusion gene is a gene having tumorigenicity. Therefore, the polypeptide inhibitor selected by the inhibitor screening method of the present invention is useful as a therapeutic agent for LMNA fusion-positive cancer or a candidate substance thereof. A step of confirming that the fusion-positive cancer has therapeutic activity can be further included.
- the confirmation step can be performed using a known evaluation system, and examples thereof include an in vitro evaluation system using cultured cells and an evaluation system using a cancer-bearing model animal transplanted with tumor cells.
- the polypeptide-expressing cell can also be obtained by introducing the polynucleotide of the present invention into a desired cell according to a conventional method (for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Edition (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Specifically, for example, by introducing the NTRK1 fusion gene or LMNA fusion gene cDNA of the present invention into a recombinant vector and further introducing it into a cell, the polypeptide-expressing cell (transformed cell) Obtainable.
- the pharmaceutical composition for treating an NTRK1 fusion-positive cancer (eg, digestive organ cancer) of the present invention contains an inhibitor for the NTRK1 fusion gene or a transcription product thereof.
- an inhibitor for example, a low molecular weight compound, a double-stranded nucleic acid (including siRNA), a protein (including an antibody or an antibody fragment), a peptide, or other compound
- It is contained as an active ingredient, and if desired, a pharmaceutically acceptable carrier can be contained.
- the pharmaceutical composition for treating LMNA fusion-positive cancer of the present invention comprises an inhibitor for the LMNA fusion gene or a transcription product thereof.
- an inhibitor for example, a low molecular weight compound, a double-stranded nucleic acid (including siRNA), a protein (including an antibody or an antibody fragment), a peptide, or other compound) obtained by the inhibitor screening method of the present invention is used. It is contained as an active ingredient, and if desired, a pharmaceutically acceptable carrier can be contained.
- NTRK1 fusion gene or transcript ⁇ NTRK1 fusion gene or transcript, or inhibitor for LMNA fusion gene or transcript>
- the inhibitor for the NTRK1 fusion gene or a transcription product thereof include a kinase inhibitor, for example, an NTRK1 inhibitor, or an inhibitor for the other gene constructing a fusion gene together with the NTRK1 gene or a transcription substance thereof.
- the inhibitor for the LMNA fusion gene or a transcription product thereof include an inhibitor for the LMNA gene or a transcription material thereof, or at least one of the other genes constituting the fusion gene together with the LMNA gene.
- a kinase inhibitor can be exemplified as the inhibitor.
- Low molecular compound include compounds described in AG879 (CAS148741-30-4), International Publications WO2008 / 045627, WO2008 / 073480, and the like.
- inhibitors against the LMNA-NTRK1 fusion gene or a transcription product thereof include BIBF1120 (Selleck Chemicals LLS), CEP701 (Calbiochem® (Merck KGaA)), and foretinib (Selleck Chemicals LLS). .
- a double-stranded nucleic acid consists of a double-stranded nucleic acid (RNA or DNA) portion and preferably an overhang at the 3 ′ end of the sense strand and the antisense strand to induce RNAi.
- RNAi is an evolutionarily conserved phenomenon that occurs via a 21-23 base double-stranded nucleic acid generated by RNase III endonuclease (Genes Dev. 15, 485-490, 2001).
- Each 3 ′ overhang is an arbitrary nucleic acid having 1 or 2 bases, but 2 bases are preferred.
- the number of bases (21 to 23 bases) is the number of bases of each of the sense strand or the antisense strand containing an overhang.
- the sense strand and the antisense strand can have the same number of bases or different numbers of bases, but preferably have the same number of bases.
- ribonucleic acid constituting the 3 ′ overhang of the double-stranded nucleic acid for example, U (uridine), A (adenosine), G (guanosine), or C (cytidine) can be used.
- deoxyribonucleic acid constituting the overhang for example, dT (deoxythymidine), dA (deoxyadenosine), dG (deoxyguanosine), or dC (deoxycytidine) can be used.
- the double-stranded nucleic acid that can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it has an inhibitory action on the NTRK1 fusion gene or an inhibitory action on the LMNA fusion gene.
- it can be designed based on the nucleotide sequence of a polynucleotide in which the double-stranded portion includes a fusion point, for example, the nucleotide sequence including the 513th to 514th of SEQ ID NO: 1.
- the duplex portion can be designed based on the base sequence of the polynucleotide encoding the kinase portion.
- the double-stranded nucleic acid of the present invention can be produced by a conventional method (for example, J. Am. Chem. Soc., 120, 11820-11821, 1998; and Methods, 23, 206-217, 2001).
- companies that consign and manufacture double-stranded nucleic acids for example, RNAi
- RNAi double-stranded nucleic acid
- a double-stranded nucleic acid can be designed by a siRNA sequence design system (commercial siDirect (registered trademark), RNAi).
- the antibody that can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited as long as it inhibits the transcription product of NTRK1 fusion gene or the transcription product of LMNA gene, preferably the transcription product of LMNA-NTRK1 gene.
- Examples thereof include those that inhibit the activity of NTRK1 fusion protein or LMNA fusion protein, preferably kinase activity.
- Example 1 Detection of NTRK1 gene abnormality in clinical specimens by FISH method
- a method for observing gene translocation or inversion etc. by dyeing the 5 'end region and 3' end region of the target gene with different dyes are known.
- This method which is a type of FISH method, is called a split assay.
- the split assay the 5 ′ terminal region and the 3 ′ terminal region of the target gene to be examined for chromosomal translocation or inversion are stained with probes labeled with different fluorescent dyes.
- NTRK1 gene abnormality in clinical specimens was detected by FISH method split assay.
- the FISH method is based on literature (Takeuchi K, Choi YL, Soda M, Inamura K, Togashi Y, Hatano S, Enomoto M, Takada S, Yamashita Y, Satoh Y, Okumura S, Nakagawa K, Ishiano -PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008; 14: 6618-6624.).
- the prepared unstained sections were treated with the Histology FISH accessory kit (Dako), followed by a BAC (bacterial artificial chromosome) clone (clone number) covering the 5 'terminal region of green (FITC) fluorescently labeled NTRK1 gene.
- Hybridization was performed using CTD-2562B9) and a BAC clone (clone number CTD-2219E19) covering the 3 ′ terminal region of the NTRK1 gene labeled with red (TexasRed).
- staining was performed with 4,6-diamino-2-phenylindole.
- a fluorescence microscope BX51 (Olympus) was used. We found a section suggesting an abnormal genomic structure in which green and red signals were observed apart. From examination of about 1500 pathological specimens, one specimen (derived from a colon cancer patient) suggesting an abnormal genomic structure of the NTRK1 gene region was found.
- Example 2 Identification of NTRK1 fusion polynucleotide gene in clinical specimen 5'-RACE kit (SMARTer (TM) RACE cDNA Amplification Kit; According to the protocol of Clonetech), the gene present on the 5 ′ side of the NTRK1 gene kinase region was examined. Specifically, first strand cDNA synthesis was performed using 0.5 ⁇ g of clinical specimen-derived RNA and a reverse primer (SEQ ID NO: 3) designed in the NTRK1 gene kinase coding region.
- SEQ ID NO: 3 reverse primer designed in the NTRK1 gene kinase coding region.
- 5'-RACE rapid amplification of cDNA ends
- PCR is performed by using a UPM primer and a reverse primer (SEQ ID NO: 3) included in the kit to perform a PCR reaction with a DNA polymerase (AmpliTaq Gold (R); Life Technologies Japan Ltd.). went.
- This RACE product was electrophoresed, a DNA fragment in the vicinity of 1-2 kbp was purified, and sequence analysis was performed after TA cloning according to a conventional method. As a result, it was revealed that a part of the LMNA gene was fused to the 5 ′ side of the NTRK1 gene kinase region.
- Example 3 Isolation of LMNA-NTRK1 Fusion Polynucleotide Gene in Clinical Specimen Using a cDNA derived from a colorectal cancer clinical specimen in which NTRK1 genomic structural abnormality was suggested by FISH analysis and the fused gene was identified as a template, PCR was performed using DNA polymerase (PrimeStar HS DNA polymerase), and the amplified product was cloned into pT7Blue-2. As the primer set, a combination of forward primer lmna / ntrk1-A128-F (SEQ ID NO: 4) and reverse primer lmna / ntrk1-2034A-R (SEQ ID NO: 5) was used.
- SEQ ID NO: 4 forward primer lmna / ntrk1-A128-F
- SEQ ID NO: 5 reverse primer lmna / ntrk1-2034A-R
- a polynucleotide comprising the nucleotide sequence from the start codon ATG to exon 2 of the LMNA gene and from the exon 11 to the stop codon of exon 17 of the NTRK1 gene (LMNAex2-NTRK1ex11; SEQ ID NO: 1 ) was obtained.
- amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by LMNAex2-NTRK1ex11
- G226D was observed by comparison with the registered amino acid sequence of NTRK1 (Ensemble database, Protein ID: ENSP00000431418).
- the first amino acid “G” is represented by the amino acid in the registered amino acid sequence
- the subsequent amino acid number “226” is represented by the amino acid number in SEQ ID NO: 2
- the last amino acid “D” is represented by SEQ ID NO: 2.
- G226D can be represented as G472D.
- the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by LMNAex2-NTRK1ex11 may be referred to as LMNA-NTRK1 (G472D) after G472D amino acid substitution.
- Example 4 Detection of LMNA-NTRK1 fusion gene Using the primers shown in Table 1, the fusion gene was detected by RT-PCR that directly amplifies the region containing the fusion region, and the fusion gene cDNA was present in the cancer tissue. I showed that. Specifically, for the specimen-derived RNA template, the forward primer lmna-131-F (SEQ ID NO: 6) designed on the LMNA gene and the reverse primer ntrk1-1455-R (SEQ ID NO: 7) designed on the NTRK1 gene. ) Or ntrk1-1350-R (SEQ ID NO: 8). When the amplified product was electrophoresed, bands of the expected size (762 bp, 658 bp) were observed from each primer setting position, and detection of the fusion gene using clinical specimens designed the primers on these genes. was shown to be possible.
- Example 5 Detection of LMNA-NTRK1 fusion gene in clinical specimens by FISH fusion assay In order to confirm that the fusion gene was fused on the genome, detection was performed by FISH fusion assay.
- two adjacent target gene regions are stained with probes labeled with different fluorescent dyes by chromosomal translocation or inversion. For example, by fluorescently labeling with two types of probes labeled TexasRed (red) and FITC (green), when normal (when the fusion gene has not been constructed), red and green indicate their respective signals (red and red). If the two gene regions are close to each other due to translocation or inversion, the red and green signals are detected as overlapping yellow. .
- BAC clone clone number RP11-838A18
- FITC green fluorescently labeled NTRK1 gene 3 ′ terminal region
- a fluorescence microscope BX51 Olympus
- Example 6 Detection of LMNA gene or NTRK1 gene in clinical samples by FISH method split assay According to the method described in Example 1, FISH method split assay of LMNA gene or NTRK1 gene was performed. A pathological section was prepared in the same manner as in Example 1. The prepared unstained sections were processed with a Histology FISH accessory kit (Dako).
- BAC clone (clone number CTD-2219E19) that covers the 5 'terminal region of NTRK1 gene, labeled with red (TexasRed), and a fluorescent label with green (FITC) Hybridization was performed using a BAC clone (clone number CTD-2562B9) covering the 3 'terminal region of the NTRK1 gene. Subsequently, staining was performed with 4,6-diamino-2-phenylindole. For fluorescence observation, a fluorescence microscope BX51 (Olympus) was used. In the pathological section in which the fusion gene was positive in Example 4, a section in which a 3'-side signal (red in this example) was observed lonely was found, suggesting a genomic structural abnormality.
- Example 7 Detection of LMNA-NTRK1 fusion gene in clinical specimen by combination of FISH fusion assay and split assay FISH fusion assay and split assay were performed on the same pathological sections.
- a pathological section was prepared in the same manner as in Example 1. The prepared unstained sections were processed with a Histology FISH accessory kit (Dako).
- the BAC clone (clone number RP11-838A18) covering the LMNA gene 5 ′ end region labeled with blue (Aqua) and the NTRK1 gene 5 ′ end labeled with red (TexasRed) High using a BAC clone (clone number CTD-2219E19) covering the side region and a BAC clone (clone number CTD-2562B9) covering the 3 'terminal region of the NTRK1 gene labeled with green (FITC). Hybridized. Subsequently, staining was performed with 4,6-diamino-2-phenylindole.
- the LMNA gene 5 ′ is not detected by the fusion assay alone, although no gene translocation has occurred. Since the terminal region and the NTRK1 gene 3 ′ terminal region are close to each other, depending on the viewing angle or the like, a close signal (blue green) is observed, and there is a possibility that a false positive determination may occur. At that time, the signal (red) on the NTRK1 gene 5 ′ end is not close to the site where the signal (blue green) in which the LMNA gene 5 ′ end region and the NTRK1 gene 3 ′ end region are close to each other is observed. By confirming this, this method is suitable in that it can avoid the determination of false positives.
- Example 8 Examination of tumor-forming ability of LMNA-NTRK1 fusion polypeptide
- two types of cDNA were used as cDNAs encoding LMNA-NTRK1 fusion polypeptide, that is, clinical samples of colorectal cancer in Example 3.
- LMNAex2-NTRK1ex11 (hereinafter sometimes referred to as LMNA-NTRK1 (G472D) after G472D amino acid substitution) of SEQ ID NO: 1 obtained from the same sequence except that the amino acid substitution is replaced with the original amino acid “G” LMNAex2-NTRK1ex11 (hereinafter sometimes referred to as LMNA-NTRK1 (WT)) was used to examine the tumor-forming ability of the LMNA-NTRK1 fusion polypeptide.
- G472D LMNA-NTRK1 (G472D) after G472D amino acid substitution
- WT LMNA-NTRK1
- PLenti6-LMNA-NTRK1 obtained by inserting each cDNA into the expression vector pLenti6 (Invitrogen (registered trademark) (Life Technologies) was introduced into the mouse fibroblast cell line NIH3T3 cells and cultured for 10 days.
- pLenti6 Invitrogen (registered trademark) (Life Technologies)
- FIG. 1 LNA-NTRK1 (G472D) fusion polypeptide expression
- FIG. 2 LMNA-NTRK1 (WT) fusion polypeptide expression
- LMNA- Tumor formation was confirmed for either the NTRK1 (G472D) fusion polypeptide (FIG. 7) or the LMNA-NTRK1 (WT) fusion polypeptide (FIG. 8).
- the tumor size in both mice after the 6th day of inoculation is shown in FIG.
- the LMNA-NTRK1 fusion polypeptide was a causative gene of cancer because the LMNA-NTRK1 fusion polypeptide had tumorigenicity regardless of the presence or absence of amino acid substitution of G472D. It was.
- cDNA encoding the full-length NTRK1 polypeptide was introduced into NIH3T3 cells, no transformation focus was observed regardless of the presence or absence of the G472D SNP, and the full-length NTRK1 polypeptide may not have tumorigenicity. confirmed.
- Example 9 Examination of sensitivity of LMNA-NTRK1 fusion polypeptide-expressing cells to each NTRK1 inhibitor
- Mouse lymphoid cell line Ba / F3 cell is an IL-3-dependent cell line that is a growth factor.
- IL-3 is required, it is known that by introducing a canceration gene (for example, a tyrosine kinase fusion gene), it becomes possible to proliferate without adding IL-3 (Daley GQ and Baltimore D. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Dec; 85 (23): 9312-9316.).
- each NTRK1 inhibitor having a predetermined concentration was determined from the state of 2000 cells. (BIBF1120, CEP701, foretinib) was added, and the sensitivity to each NTRK1 inhibitor was examined by counting the number of cells after culturing for 72 hours.
- BIBF1120, CEP701, foretinib was added, and the sensitivity to each NTRK1 inhibitor was examined by counting the number of cells after culturing for 72 hours.
- Example 10 Examination of suppression of autophosphorylation of LMNA-NTRK1 fusion polypeptide by each NTRK1 inhibitor in cells expressing LMNA-NTRK1 fusion polypeptide LMNA-NTRK1 (G472D or G472D or WT) Extracts from each cultured cell treated with each NTRK1 inhibitor to confirm that the growth inhibition of the fusion polypeptide-expressing cells was due to inhibition of the kinase activity of the LMNA-NTRK1 fusion polypeptide Western blotting was performed. The results for the LMNA-NTRK1 (G472D) fusion polypeptide are shown in FIG. As an antibody, an anti-phosphorylated NTRK1 antibody (pNTRK1 in FIG.
- NTRK1 in FIG. 11 an anti-NTRK1 antibody (NTRK1 in FIG. 11 was used.
- the amount of NTRK1 polypeptide whether or not each NTRK1 inhibitor was treated (and treatment concentration)
- phosphorylation of the LMNA-NTRK1 fusion polypeptide was significantly decreased in a concentration-dependent manner by treatment with each NTRK1 inhibitor, and the kinase of the LMNA-NTRK1 fusion polypeptide It was confirmed that the autophosphorylation of the LMNA-NTRK1 fusion polypeptide was suppressed by inhibiting the activity.
- WT LMNA-NTRK1
- G472D LMNA-NTRK1
- a fusion gene of LMNA gene and NTRK1 gene exists in some digestive cancer patients, and that gene causes cancer. That is, it has been clarified that cancer patients to be subjected to NTRK1 inhibitory drug treatment can be selected by detecting the LMNA-NTRK1 fusion gene, preferably by detecting LMNAex2-NTRK1ex11.
- the detection method of the present invention is useful for determining a cancer patient who is positive for NTRK1 fusion.
- the detection kit and primer set of the present invention can be used in the detection method.
- the inhibitor screening method of the present invention can be used for screening a drug effective for treatment of the fusion-positive cancer patient.
- the drug obtained by the screening can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for treating fusion-positive cancer.
- Cancer can be treated by administering the drug to a patient determined to be a fusion-positive cancer patient by the detection method.
- the detection method of the present invention is useful for determination of LMNA fusion-positive cancer patients.
- the detection kit and primer set of the present invention can be used in the detection method.
- the inhibitor screening method of the present invention can be used for screening a drug effective for treatment of the fusion-positive cancer patient.
- the drug obtained by the screening can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for treating fusion-positive cancer.
- Cancer can be treated by administering the drug to a patient determined to be a fusion-positive cancer patient by the detection method.
- the base sequences represented by the sequences of SEQ ID Nos: 3 to 8 in the sequence listing are synthetic primer sequences.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
Abstract
がんの新たな原因因子である融合体(融合タンパク質及びそれをコードする融合遺伝子)を解明し、この知見に基づき、新規の前記融合体、前記誘導体の検出方法、前記検出方法のためのキット及びプライマーセット、前記融合タンパク質であるポリペプチドの活性及び/又は発現の阻害物質のスクリーニング方法、ならびに前記阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物を提供する。 本発明の融合タンパク質は、LMNA融合タンパク質又はNTRK1融合タンパク質である。本発明の検出方法では、被験者から得た試料中の、前記融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出する。
Description
本発明は、NTRK1キナーゼ領域を含む新規の融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及びそれらの検出方法に関する。
本発明は、LMNAの少なくとも一部を含む新規の融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及びそれらの検出方法に関する。
本発明は、LMNAの少なくとも一部を含む新規の融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及びそれらの検出方法に関する。
染色体転座又は逆位等の結果、本来は別々の遺伝子が融合して融合遺伝子が作られる。これまで慢性骨髄性白血病におけるBCR-ABL1融合体や、肺がんにおけるEML4-ALK融合体、肺がんを含む種々のがんにおけるROS1融合体のように、キナーゼ遺伝子の一部を構成要素に含む融合遺伝子はしばしば発がんに本質的な役割を担い、その機能を抑制する薬剤は極めて有効な抗がん剤となることが知られている(非特許文献1、特許文献1及び特許文献2)。
例えば、チロシンキナーゼ阻害剤のイレッサやタルセバの登場により、分子診断とがん治療効果の関係について、臨床で示されつつあり、分子診断による適応患者の選別により、患者を層別化した上での治療薬投与というコンセプトが広がりつつある。
例えば、チロシンキナーゼ阻害剤のイレッサやタルセバの登場により、分子診断とがん治療効果の関係について、臨床で示されつつあり、分子診断による適応患者の選別により、患者を層別化した上での治療薬投与というコンセプトが広がりつつある。
NTRK1(neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 1、Trk-A)は、受容体型チロシンキナーゼであり、NGF(nerve growth factor)と結合する。細胞外ドメイン、1回膜貫通ドメイン及び細胞内キナーゼドメインを有し、神経系細胞の増殖・分化等に関与することが知られている(非特許文献2)。
LMNA(lamin A/C)遺伝子は、ラミンA及びラミンCタンパクをコードする。これらのラミンタンパクは真核細胞の核膜中に存在する核ラミナの主要な構成要素である(非特許文献3)。当該遺伝子が融合遺伝子を構成することは知られていない。
LMNA(lamin A/C)遺伝子は、ラミンA及びラミンCタンパクをコードする。これらのラミンタンパクは真核細胞の核膜中に存在する核ラミナの主要な構成要素である(非特許文献3)。当該遺伝子が融合遺伝子を構成することは知られていない。
Lugo TG et al., Science. 1990 Mar 2;247(4946):1079-1082
Martin-Zanca D et al., Mol Cell Biol. 1989 Jan;9(1):24-33
Fisher D et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 83: 6450-6454, 1986
本発明の課題は、がんの新たな原因因子である融合体(融合タンパク質及び融合遺伝子)を解明したことに基づき、融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法、当該検出方法を用いたがんの診断方法、がん治療用医薬組成物の適用対象者の判定方法、前記検出方法のためのキット及びプライマーセット、前記融合タンパク質であるポリペプチドの活性及び/又は発現の阻害物質のスクリーニング方法、ならびに前記阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物及び前記がん治療用医薬組成物を投与するがん治療方法を提供することにある。
本発明者は、大腸がん患者から得た検体から、LMNA遺伝子の一部と、キナーゼであるNTRK1遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し(実施例1~3)、当該融合遺伝子が大腸がん患者検体に存在することを見出した(実施例4~7)。
本発明者は、これらの知見から、NTRK1融合タンパク質又は当該タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し(実施例4~7)、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする遺伝子を検出することにより、NTRK1阻害物質を用いた薬物治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にNTRK1阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。
本発明者は、これらの知見から、LMNA融合タンパク質又は当該タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し(実施例4~7)、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出することにより、LMNA融合タンパク質阻害物質を用いた薬物治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にLMNA融合タンパク質阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。
本発明者は、これらの知見から、NTRK1融合タンパク質又は当該タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し(実施例4~7)、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする遺伝子を検出することにより、NTRK1阻害物質を用いた薬物治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にNTRK1阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。
本発明者は、これらの知見から、LMNA融合タンパク質又は当該タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し(実施例4~7)、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出することにより、LMNA融合タンパク質阻害物質を用いた薬物治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にLMNA融合タンパク質阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。
本発明は、以下の発明に関する:
[1]LMNA融合タンパク質。
[2]LMNAとNTRK1との融合タンパク質。
[3]以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、[1]に記載の融合タンパク質:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[4][1]~[3]のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[5][4]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[6][5]に記載のベクターで形質転換された細胞。
[7]被験者から得た試料中の、LMNA融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
[8]前記検出方法が、LMNAタンパク質の切断、又は、LMNAタンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、[7]に記載の検出方法。
[9]前記検出方法が、LMNAタンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、[7]に記載の検出方法。
[10]前記融合タンパク質が、LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質である、[7]~[9]のいずれか一項に記載の検出方法。
[11]前記融合タンパク質が、以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、[7]~[10]のいずれか一項に記載の検出方法:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[12]前記LMNA融合遺伝子が、[3]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、[7]~[11]のいずれか一項に記載の検出方法。
[13]前記融合遺伝子が、DNA又はmRNAである、[7]~[12]のいずれか一項に記載の検出方法。
[14]前記試料が、消化器由来試料である、[7]~[13]のいずれか一項に記載の検出方法。
[15]前記消化器が、消化管由来試料である、[14]に記載の検出方法。
[16]前記消化器が、下部消化管である、[14]に記載の検出方法。
[17]前記消化器が、大腸である、[14]に記載の検出方法。
[18]LMNA遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、LMNA遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、LMNA融合遺伝子の検出用キット。
[19]LMNA遺伝子と共にLMNA融合遺伝子を構成する他の遺伝子の3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、LMNA遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、LMNA融合遺伝子の検出用キット。
[20]LMNAタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA融合遺伝子の検出用キット。
[21]LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA-NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
[22]以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA-NTRK1融合遺伝子の検出用キット:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[23]LMNAタンパク質のN末端側領域を特異的に認識できる抗LMNA抗体、及び、LMNAタンパク質のC末端側領域を特異的に認識できる抗LMNA抗体を含む、LMNA融合タンパク質の検出用キット。
[24]LMNAタンパク質と共にLMNA融合タンパク質を構成する他のタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、LMNAタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、LMNA融合タンパク質の検出用キット。
[25]前記他のタンパク質が、NTRK1タンパク質である、[24]に記載のキット。
[26]LMNAタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びNTRK1タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは[22]に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは[22]に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
[27]LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
[28]配列番号1の塩基番号1から568間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号569から2259間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号9の塩基番号1から726の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号9の塩基番号727から1866間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
[29](1)[3]に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(2)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
(3)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
[30]前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質が、LMNA融合体陽性のがんの治療剤である、[29]に記載のスクリーニング方法。
[31]前記がんが消化器がんである、[30]に記載のスクリーニング方法。
[32]前記がんが消化管がんである、[30]に記載のスクリーニング方法。
[33]前記がんが下部消化管がんである、[30]に記載のスクリーニング方法。
[34]前記がんが大腸がんである、[30]に記載のスクリーニング方法。
[35]LMNA融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質を含有する、LMNA融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
[36]前記LMNA融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、[35]に記載の医薬組成物。
[37]前記LMNA融合タンパク質が、[3]に記載のポリペプチドである、[35]又は[36]に記載の医薬組成物。
[38]前記がんが消化器がんである、[35]~[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[39]前記がんが消化管がんである、[35]~[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[40]前記がんが下部消化管がんである、[35]~[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[41]前記がんが大腸がんである、[35]~[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[42]NTRK1融合タンパク質。
[43]LMNAとNTRK1との融合タンパク質。
[44]以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、[42]に記載の融合タンパク質:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[45][42]~[44]のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[46][45]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[47][46]に記載のベクターで形質転換された細胞。
[48]被験者から得た試料中の、NTRK1融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
[49]前記検出方法が、NTRK1タンパク質の切断、又は、NTRK1タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、[48]に記載の検出方法。
[50]前記検出方法が、NTRK1タンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、[48]に記載の検出方法。
[51]前記融合タンパク質が、LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質である、[48]~[50]のいずれか一項に記載の検出方法。
[52]前記融合タンパク質が、以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、48~51のいずれか一項に記載の検出方法:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[53]前記NTRK1融合遺伝子が、[44]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、[48]~[52]のいずれか一項に記載の検出方法。
[54]前記融合遺伝子が、DNA又はmRNAである、[48]~[53]のいずれか一項に記載の検出方法。
[55]前記試料が消化器である、[48]~[54]のいずれか一項に記載の検出方法。
[56]前記消化器が、消化管である、[55]に記載の検出方法。
[57]前記消化器が、下部消化管である、[55]に記載の検出方法。
[58]前記消化器が、大腸である、[55]に記載の検出方法。
[59]NTRK1遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、NTRK1遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
[60]NTRK1遺伝子と共にNTRK1融合遺伝子を構成する他の遺伝子の5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、NTRK1遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
[61]NTRK1タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
[62]LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA-NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
[63]以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA-NTRK1融合遺伝子の検出用キット:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[64]NTRK1タンパク質のN末端側領域を特異的に認識できる抗NTRK1抗体、及び、NTRK1タンパク質のC末端側領域を特異的に認識できる抗NTRK1抗体を含む、NTRK1融合タンパク質の検出用キット。
[65]NTRK1タンパク質と共にNTRK1融合タンパク質を構成する他のタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、NTRK1融合タンパク質の検出用キット。
[66]前記他のタンパク質が、LMNAタンパク質である、[65]に記載のキット。
[67]LMNAタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びNTRK1タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは[63]に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは[63]に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
[68]LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
[69]配列番号1の塩基番号1から568間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号569から2259間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号9の塩基番号1から726の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号9の塩基番号727から1866間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
[70](1)[44]に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(2)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
(3)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
[71]前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質が、NTRK1融合体陽性のがんの治療剤である、[70]に記載のスクリーニング方法。
[72]前記がんが消化器がんである、[71]に記載のスクリーニング方法。
[73]前記がんが消化管がんである、[71]に記載のスクリーニング方法。
[74]前記がんが下部消化管がんである、[71]に記載のスクリーニング方法。
[75]前記がんが大腸がんである、[71]に記載のスクリーニング方法。
[76]NTRK1融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質を含有する、NTRK1融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
[77]前記NTRK1融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、[76]に記載の医薬組成物。
[78]前記NTRK1融合タンパク質が、[44]に記載のポリペプチドである、[76]又は[77]に記載の医薬組成物。
[79]前記がんが消化器がんである、[76]~[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[80]前記がんが消化管がんである、[76]~[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[81]前記がんが下部消化管がんである、[76]~[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[82]前記がんが大腸がんである、[76]~[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[83]LMNA融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、LMNA融合体陽性のがんの治療方法。
[84]LMNA融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質の、LMNA融合体陽性の癌の治療用医薬組成物の製造への使用。
[85]前記ポリペプチドを発現している細胞が、[6]に記載の形質転換細胞である、[29]~[34]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[86]NTRK1融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、NTRK1融合体陽性のがんの治療方法。
[87]NTRK1融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質の、NTRK1融合体陽性の癌の治療用医薬組成物の製造への使用。
[88]前記ポリペプチドを発現している細胞が、[47]に記載の形質転換細胞である、[70]~[75]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[1]LMNA融合タンパク質。
[2]LMNAとNTRK1との融合タンパク質。
[3]以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、[1]に記載の融合タンパク質:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[4][1]~[3]のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[5][4]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[6][5]に記載のベクターで形質転換された細胞。
[7]被験者から得た試料中の、LMNA融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
[8]前記検出方法が、LMNAタンパク質の切断、又は、LMNAタンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、[7]に記載の検出方法。
[9]前記検出方法が、LMNAタンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、[7]に記載の検出方法。
[10]前記融合タンパク質が、LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質である、[7]~[9]のいずれか一項に記載の検出方法。
[11]前記融合タンパク質が、以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、[7]~[10]のいずれか一項に記載の検出方法:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[12]前記LMNA融合遺伝子が、[3]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、[7]~[11]のいずれか一項に記載の検出方法。
[13]前記融合遺伝子が、DNA又はmRNAである、[7]~[12]のいずれか一項に記載の検出方法。
[14]前記試料が、消化器由来試料である、[7]~[13]のいずれか一項に記載の検出方法。
[15]前記消化器が、消化管由来試料である、[14]に記載の検出方法。
[16]前記消化器が、下部消化管である、[14]に記載の検出方法。
[17]前記消化器が、大腸である、[14]に記載の検出方法。
[18]LMNA遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、LMNA遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、LMNA融合遺伝子の検出用キット。
[19]LMNA遺伝子と共にLMNA融合遺伝子を構成する他の遺伝子の3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、LMNA遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、LMNA融合遺伝子の検出用キット。
[20]LMNAタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA融合遺伝子の検出用キット。
[21]LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA-NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
[22]以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA-NTRK1融合遺伝子の検出用キット:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[23]LMNAタンパク質のN末端側領域を特異的に認識できる抗LMNA抗体、及び、LMNAタンパク質のC末端側領域を特異的に認識できる抗LMNA抗体を含む、LMNA融合タンパク質の検出用キット。
[24]LMNAタンパク質と共にLMNA融合タンパク質を構成する他のタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、LMNAタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、LMNA融合タンパク質の検出用キット。
[25]前記他のタンパク質が、NTRK1タンパク質である、[24]に記載のキット。
[26]LMNAタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びNTRK1タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは[22]に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは[22]に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
[27]LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
[28]配列番号1の塩基番号1から568間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号569から2259間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号9の塩基番号1から726の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号9の塩基番号727から1866間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
[29](1)[3]に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(2)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
(3)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
[30]前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質が、LMNA融合体陽性のがんの治療剤である、[29]に記載のスクリーニング方法。
[31]前記がんが消化器がんである、[30]に記載のスクリーニング方法。
[32]前記がんが消化管がんである、[30]に記載のスクリーニング方法。
[33]前記がんが下部消化管がんである、[30]に記載のスクリーニング方法。
[34]前記がんが大腸がんである、[30]に記載のスクリーニング方法。
[35]LMNA融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質を含有する、LMNA融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
[36]前記LMNA融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、[35]に記載の医薬組成物。
[37]前記LMNA融合タンパク質が、[3]に記載のポリペプチドである、[35]又は[36]に記載の医薬組成物。
[38]前記がんが消化器がんである、[35]~[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[39]前記がんが消化管がんである、[35]~[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[40]前記がんが下部消化管がんである、[35]~[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[41]前記がんが大腸がんである、[35]~[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[42]NTRK1融合タンパク質。
[43]LMNAとNTRK1との融合タンパク質。
[44]以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、[42]に記載の融合タンパク質:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[45][42]~[44]のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[46][45]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[47][46]に記載のベクターで形質転換された細胞。
[48]被験者から得た試料中の、NTRK1融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
[49]前記検出方法が、NTRK1タンパク質の切断、又は、NTRK1タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、[48]に記載の検出方法。
[50]前記検出方法が、NTRK1タンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、[48]に記載の検出方法。
[51]前記融合タンパク質が、LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質である、[48]~[50]のいずれか一項に記載の検出方法。
[52]前記融合タンパク質が、以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、48~51のいずれか一項に記載の検出方法:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[53]前記NTRK1融合遺伝子が、[44]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、[48]~[52]のいずれか一項に記載の検出方法。
[54]前記融合遺伝子が、DNA又はmRNAである、[48]~[53]のいずれか一項に記載の検出方法。
[55]前記試料が消化器である、[48]~[54]のいずれか一項に記載の検出方法。
[56]前記消化器が、消化管である、[55]に記載の検出方法。
[57]前記消化器が、下部消化管である、[55]に記載の検出方法。
[58]前記消化器が、大腸である、[55]に記載の検出方法。
[59]NTRK1遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、NTRK1遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
[60]NTRK1遺伝子と共にNTRK1融合遺伝子を構成する他の遺伝子の5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、NTRK1遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
[61]NTRK1タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
[62]LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA-NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
[63]以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA-NTRK1融合遺伝子の検出用キット:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[64]NTRK1タンパク質のN末端側領域を特異的に認識できる抗NTRK1抗体、及び、NTRK1タンパク質のC末端側領域を特異的に認識できる抗NTRK1抗体を含む、NTRK1融合タンパク質の検出用キット。
[65]NTRK1タンパク質と共にNTRK1融合タンパク質を構成する他のタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、NTRK1融合タンパク質の検出用キット。
[66]前記他のタンパク質が、LMNAタンパク質である、[65]に記載のキット。
[67]LMNAタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びNTRK1タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは[63]に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは[63]に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
[68]LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
[69]配列番号1の塩基番号1から568間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号569から2259間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号9の塩基番号1から726の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号9の塩基番号727から1866間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
[70](1)[44]に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(2)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
(3)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
[71]前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質が、NTRK1融合体陽性のがんの治療剤である、[70]に記載のスクリーニング方法。
[72]前記がんが消化器がんである、[71]に記載のスクリーニング方法。
[73]前記がんが消化管がんである、[71]に記載のスクリーニング方法。
[74]前記がんが下部消化管がんである、[71]に記載のスクリーニング方法。
[75]前記がんが大腸がんである、[71]に記載のスクリーニング方法。
[76]NTRK1融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質を含有する、NTRK1融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
[77]前記NTRK1融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、[76]に記載の医薬組成物。
[78]前記NTRK1融合タンパク質が、[44]に記載のポリペプチドである、[76]又は[77]に記載の医薬組成物。
[79]前記がんが消化器がんである、[76]~[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[80]前記がんが消化管がんである、[76]~[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[81]前記がんが下部消化管がんである、[76]~[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[82]前記がんが大腸がんである、[76]~[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[83]LMNA融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、LMNA融合体陽性のがんの治療方法。
[84]LMNA融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質の、LMNA融合体陽性の癌の治療用医薬組成物の製造への使用。
[85]前記ポリペプチドを発現している細胞が、[6]に記載の形質転換細胞である、[29]~[34]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[86]NTRK1融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、NTRK1融合体陽性のがんの治療方法。
[87]NTRK1融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質の、NTRK1融合体陽性の癌の治療用医薬組成物の製造への使用。
[88]前記ポリペプチドを発現している細胞が、[47]に記載の形質転換細胞である、[70]~[75]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
本発明の検出方法は、NTRK1融合体陽性のがん(特に消化器がん)を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、被験者におけるNTRK1融合体陽性のがんを診断することができ、更に、NTRK1阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングにより得られた物質は、NTRK1融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、NTRK1融合体陽性のがんの治療に用いることができる。
本発明の検出方法は、LMNA融合体陽性のがん(特に消化器がん)を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、被験者におけるLMNA融合体陽性のがんを診断することができ、更に、LMNA阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングにより得られた物質は、LMNA融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、LMNA融合体陽性のがんの治療に用いることができる。
本発明の検出方法は、LMNA融合体陽性のがん(特に消化器がん)を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、被験者におけるLMNA融合体陽性のがんを診断することができ、更に、LMNA阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングにより得られた物質は、LMNA融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、LMNA融合体陽性のがんの治療に用いることができる。
≪定義等≫
<融合点>
本明細書における「NTRK1融合遺伝子における融合点」とは、NTRK1融合遺伝子におけるNTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドと、NTRK1遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。例えば、配列番号1で表されるLMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、塩基配列の第513番塩基と第514番の塩基の結合した箇所である。
本明細書における「NTRK1融合タンパク質における融合点」とは、NTRK1融合タンパク質における、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、NTRK1遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。
<融合点>
本明細書における「NTRK1融合遺伝子における融合点」とは、NTRK1融合遺伝子におけるNTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドと、NTRK1遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。例えば、配列番号1で表されるLMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、塩基配列の第513番塩基と第514番の塩基の結合した箇所である。
本明細書における「NTRK1融合タンパク質における融合点」とは、NTRK1融合タンパク質における、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、NTRK1遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。
本明細書における「LMNA融合遺伝子における融合点」とは、LMNA融合遺伝子におけるLMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドと、LMNA遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。例えば、配列番号1で表されるLMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、塩基配列の第513番塩基と第514番の塩基の結合した箇所である。
本明細書における「LMNA融合タンパク質における融合点」とは、LMNA融合タンパク質における、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、LMNA遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。
本明細書における「LMNA融合タンパク質における融合点」とは、LMNA融合タンパク質における、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、LMNA遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。
<NTRK1遺伝子又はNTRK1タンパク質の切断>
更に、本明細書において、「NTRK1遺伝子の切断」又は「NTRK1遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりNTRK1遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、NTRK1遺伝子がNTRK1キナーゼ領域を含むポリヌクレオチドと、それ以外のポリヌクレオチドと、の少なくとも2つのポリヌクレオチドとに分かれている状態を指す。なお、NTRK1遺伝子の切断点(break point)は、NTRK1遺伝子が切断されてできたポリヌクレオチドの少なくとも一つがコードするタンパク質がNTRK1キナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも2つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。
更に、本明細書において、「NTRK1遺伝子の切断」又は「NTRK1遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりNTRK1遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、NTRK1遺伝子がNTRK1キナーゼ領域を含むポリヌクレオチドと、それ以外のポリヌクレオチドと、の少なくとも2つのポリヌクレオチドとに分かれている状態を指す。なお、NTRK1遺伝子の切断点(break point)は、NTRK1遺伝子が切断されてできたポリヌクレオチドの少なくとも一つがコードするタンパク質がNTRK1キナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも2つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。
また、本明細書において、「NTRK1タンパク質の切断」又は「NTRK1タンパク質が切断されている」とは、NTRK1遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、NTRK1タンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、NTRK1タンパク質がNTRK1キナーゼ領域を含むポリペプチドと、それ以外のポリペプチドと、の少なくとも2つのポリペプチドに分かれている状態を指す。なお、NTRK1タンパク質の切断点は、NTRK1タンパク質が切断されてできたポリペプチドの少なくとも一つがNTRK1キナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも2つのポリペプチドに分かれている状態を指す。
また、「NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも2つのポリペプチドに分かれている状態を指す。
<LMNA遺伝子又はLMNAタンパク質の切断>
更に、本明細書において、「LMNA遺伝子の切断」又は「LMNA遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりLMNA遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、LMNA遺伝子が少なくとも2つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。なお、LMNA遺伝子の切断点(break point)は、LMNA遺伝子と共にLMNA融合遺伝子を構築する他の遺伝子によってコードされるLMNA融合タンパク質の腫瘍形成能を保持する範囲で限定されない。
また、「LMNA遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「LMNA遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも2つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。
更に、本明細書において、「LMNA遺伝子の切断」又は「LMNA遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりLMNA遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、LMNA遺伝子が少なくとも2つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。なお、LMNA遺伝子の切断点(break point)は、LMNA遺伝子と共にLMNA融合遺伝子を構築する他の遺伝子によってコードされるLMNA融合タンパク質の腫瘍形成能を保持する範囲で限定されない。
また、「LMNA遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「LMNA遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも2つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。
また、本明細書において、「LMNAタンパク質の切断」又は「LMNAタンパク質が切断されている」とは、LMNA遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、LMNAタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、LMNAタンパク質が少なくとも2つのポリペプチドに分かれている状態を指す。なお、LMNAタンパク質の切断点は、LMNAタンパク質と共にLMNA融合タンパク質を構築する他のタンパク質の、融合タンパク質の腫瘍形成能を有するために必要な機能(例えば、当該他のタンパク質がキナーゼドメインを有する場合、キナーゼ活性)を保持する範囲で限定されない。
また、「LMNAタンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「LMNAタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも2つのポリペプチドに分かれている状態を指す。
また、「LMNAタンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「LMNAタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも2つのポリペプチドに分かれている状態を指す。
<5’末端側領域/3’末端側領域、N末端側領域/C末端側領域>
5’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より5’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子(融合遺伝子でない遺伝子)の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より5’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、5’末端側領域は、ゲノムDNA、mRNA、及びcDNAのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムDNAの場合は、5’末端側ゲノム領域ともいう。
3’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より3’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子(融合遺伝子でない遺伝子)の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より3’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、3’末端側領域は、ゲノムDNA、mRNA、及びcDNAのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムDNAの場合は、3’末端側ゲノム領域ともいう。
N末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりN末端側のポリペプチド、野生型タンパク質(融合タンパク質でないタンパク質)の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりN末端側のポリヌクレオチドを示す。
C末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりC末端側のポリペプチド、野生型タンパク質(融合タンパク質でないタンパク質)の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりC末端側のポリヌクレオチドを示す。
例えば、配列番号1で表されるLMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、5’末端側領域は、第1番~第513番、3’末端側領域は、第514番~1653番の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。LMNA-NTRK1融合タンパク質の場合、N末端側領域は、前記5’末端側領域にコードされるポリペプチドであり、C末端側領域は、前記3’末端側領域にコードされるポリペプチドである。
5’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より5’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子(融合遺伝子でない遺伝子)の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より5’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、5’末端側領域は、ゲノムDNA、mRNA、及びcDNAのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムDNAの場合は、5’末端側ゲノム領域ともいう。
3’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より3’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子(融合遺伝子でない遺伝子)の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より3’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、3’末端側領域は、ゲノムDNA、mRNA、及びcDNAのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムDNAの場合は、3’末端側ゲノム領域ともいう。
N末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりN末端側のポリペプチド、野生型タンパク質(融合タンパク質でないタンパク質)の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりN末端側のポリヌクレオチドを示す。
C末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりC末端側のポリペプチド、野生型タンパク質(融合タンパク質でないタンパク質)の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりC末端側のポリヌクレオチドを示す。
例えば、配列番号1で表されるLMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、5’末端側領域は、第1番~第513番、3’末端側領域は、第514番~1653番の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。LMNA-NTRK1融合タンパク質の場合、N末端側領域は、前記5’末端側領域にコードされるポリペプチドであり、C末端側領域は、前記3’末端側領域にコードされるポリペプチドである。
<リファレンス配列>
また、本明細書において、各由来遺伝子のcDNAリファレンス配列として、LMNAはENST00000368300、NTRK1はENST00000524377を、タンパク質のアミノ酸リファレンス配列としては、LMNAはENSP00000357283、NTRK1はENSP00000431418、を用いた。
また、本明細書において、各由来遺伝子のcDNAリファレンス配列として、LMNAはENST00000368300、NTRK1はENST00000524377を、タンパク質のアミノ酸リファレンス配列としては、LMNAはENSP00000357283、NTRK1はENSP00000431418、を用いた。
<ストリンジェントな条件>
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「5×SSPE、5×Denhardt’s液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、200μg/mL鮭精子DNA、42℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「5×SSPE、5×Denhardt’s液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、200μg/mL鮭精子DNA、42℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「0.2×SSC、0.1%SDS、65℃」の条件である。
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「5×SSPE、5×Denhardt’s液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、200μg/mL鮭精子DNA、42℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「5×SSPE、5×Denhardt’s液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、200μg/mL鮭精子DNA、42℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「0.2×SSC、0.1%SDS、65℃」の条件である。
<腫瘍形成能>
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、後述の実施例7の方法で確認することができる。具体的には、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主(3T3繊維芽細胞)をヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍形成の有無で判断する方法で確認する。
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、後述の実施例7の方法で確認することができる。具体的には、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主(3T3繊維芽細胞)をヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍形成の有無で判断する方法で確認する。
《本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換細胞》
<本発明のポリペプチド(1)>
本発明のポリペプチドは、NTRK1タンパク質由来のポリペプチドと、NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチド(「NTRK1融合タンパク質」ともいう)であって、前記NTRK1タンパク質由来のポリペプチドは、NTRK1タンパク質における少なくともNTRK1キナーゼ領域のポリペプチドを含み、NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
前記他のタンパク質としては、NTRK1キナーゼドメインを含むNTRK1タンパク質の一部と融合することにより、NTRK1キナーゼ活性化が恒常的に維持され、構築されたNTRK1融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。
NTRK1融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、LMNAタンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、少なくともNTRK1キナーゼ領域のポリペプチドを含む、NTRK1タンパク質由来のポリペプチドと、LMNAタンパク質の少なくとも一部のポリペプチドとを含む、LMNA遺伝子由来のポリペプチドと、から構築された、LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質(以下、LMNA-NTRK1融合タンパク質ともいう)であることが好ましい。
<本発明のポリペプチド(1)>
本発明のポリペプチドは、NTRK1タンパク質由来のポリペプチドと、NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチド(「NTRK1融合タンパク質」ともいう)であって、前記NTRK1タンパク質由来のポリペプチドは、NTRK1タンパク質における少なくともNTRK1キナーゼ領域のポリペプチドを含み、NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
前記他のタンパク質としては、NTRK1キナーゼドメインを含むNTRK1タンパク質の一部と融合することにより、NTRK1キナーゼ活性化が恒常的に維持され、構築されたNTRK1融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。
NTRK1融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、LMNAタンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、少なくともNTRK1キナーゼ領域のポリペプチドを含む、NTRK1タンパク質由来のポリペプチドと、LMNAタンパク質の少なくとも一部のポリペプチドとを含む、LMNA遺伝子由来のポリペプチドと、から構築された、LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質(以下、LMNA-NTRK1融合タンパク質ともいう)であることが好ましい。
<本発明のポリペプチド(2)>
本発明のポリペプチドは、LMNAタンパク質由来のポリペプチドと、LMNAタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチド(「LMNA融合タンパク質」ともいう)であって、前記LMNAタンパク質由来のポリペプチドは、LMNAタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含み、LMNAタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、当該他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
前記他のタンパク質としては、LMNAタンパク質と融合することにより、当該他のタンパク質の有する機能性ドメインの活性化が恒常的に維持され、構築されたLMNA融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。
LMNA融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、キナーゼドメインを有するタンパク質である融合タンパク質が好ましく、NTRK1タンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、前記他のタンパク質がNTRK1タンパク質である場合、少なくともNTRK1キナーゼ領域のポリペプチドを含む、NTRK1タンパク質由来のポリペプチドと、LMNAタンパク質の少なくとも一部のポリペプチドとを含む、LMNA遺伝子由来のポリペプチドと、から構築された、LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質(以下、LMNA-NTRK1融合タンパク質ともいう)であることが好ましい。
本発明のポリペプチドは、LMNAタンパク質由来のポリペプチドと、LMNAタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチド(「LMNA融合タンパク質」ともいう)であって、前記LMNAタンパク質由来のポリペプチドは、LMNAタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含み、LMNAタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、当該他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
前記他のタンパク質としては、LMNAタンパク質と融合することにより、当該他のタンパク質の有する機能性ドメインの活性化が恒常的に維持され、構築されたLMNA融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。
LMNA融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、キナーゼドメインを有するタンパク質である融合タンパク質が好ましく、NTRK1タンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、前記他のタンパク質がNTRK1タンパク質である場合、少なくともNTRK1キナーゼ領域のポリペプチドを含む、NTRK1タンパク質由来のポリペプチドと、LMNAタンパク質の少なくとも一部のポリペプチドとを含む、LMNA遺伝子由来のポリペプチドと、から構築された、LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質(以下、LMNA-NTRK1融合タンパク質ともいう)であることが好ましい。
本発明のポリペプチドの好適態様である「LMNA-NTRK1融合タンパク質」としては、下記(a)~(d)に記載のポリペプチドが特に好ましい:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド(以下、相同ポリペプチドと称する)、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド(以下、機能的等価改変体と称する)。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド(以下、相同ポリペプチドと称する)、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド(以下、機能的等価改変体と称する)。
配列番号2で表されるアミノ酸配列は、配列番号1で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号1で表される塩基配列は、LMNA遺伝子の開始コドンATGからエクソン2までとNTRK1遺伝子のエクソン11からエクソン17の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号1で表される塩基配列の内、塩基番号1~513の配列はLMNA遺伝子に由来し、塩基番号514~1653の配列はNTRK1遺伝子に由来する。以下、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをLMNAex2-NTRK1ex11と称する。
「機能的等価改変体」において置換、欠失、及び/又は挿入可能なアミノ酸数は、1~数個であるが、好ましくは1~10個、更に好ましくは1~7個、最も好ましくは1~5個である。
「相同ポリペプチド」は、「配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「同一性」とは、NEEDLE program(J Mol Biol 1970; 48: 443-453)検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Identityを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Gap penalty = 10
Extend penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
Gap penalty = 10
Extend penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
<本発明のポリヌクレオチド(1)>
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド(すなわち、NTRK1融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチド(「NTRK1融合遺伝子」ともいう)である限り、特に限定されるものではない。なお、「NTRK1融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、NTRK1融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、NTRK1融合遺伝子のゲノムDNA全長であっても、NTRK1融合遺伝子のmRNAやcDNAであってもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド(すなわち、NTRK1融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチド(「NTRK1融合遺伝子」ともいう)である限り、特に限定されるものではない。なお、「NTRK1融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、NTRK1融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、NTRK1融合遺伝子のゲノムDNA全長であっても、NTRK1融合遺伝子のmRNAやcDNAであってもよい。
<本発明のポリヌクレオチド(2)>
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド(すなわち、LMNA融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチド(「LMNA融合遺伝子」ともいう)である限り、特に限定されるものではない。なお、「LMNA融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、LMNA融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、LMNA融合遺伝子のゲノムDNA全長であっても、LMNA融合遺伝子のmRNAやcDNAであってもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド(すなわち、LMNA融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチド(「LMNA融合遺伝子」ともいう)である限り、特に限定されるものではない。なお、「LMNA融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、LMNA融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、LMNA融合遺伝子のゲノムDNA全長であっても、LMNA融合遺伝子のmRNAやcDNAであってもよい。
<本発明のベクター>
また、本発明のベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換できる適当なベクターに当該ポリヌクレオチドを組み込むことにより調製することができる。前記ベクターは、当該ポリヌクレオチドの発現に必要な配列、例えば、プロモーター、エンハンサーを含むことができ、更に、宿主への導入確認に必要な配列、例えば、薬剤耐性遺伝子を含むことができる。
また、本発明のベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換できる適当なベクターに当該ポリヌクレオチドを組み込むことにより調製することができる。前記ベクターは、当該ポリヌクレオチドの発現に必要な配列、例えば、プロモーター、エンハンサーを含むことができ、更に、宿主への導入確認に必要な配列、例えば、薬剤耐性遺伝子を含むことができる。
<本発明の形質転換細胞>
本発明の形質転換細胞は、本発明のベクターにより、適当な宿主細胞、例えば、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換することにより調製することができる。本発明の形質転換細胞は、本発明のポリペプチドを製造するのに用いることができる。
本発明の形質転換細胞は、本発明のベクターにより、適当な宿主細胞、例えば、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換することにより調製することができる。本発明の形質転換細胞は、本発明のポリペプチドを製造するのに用いることができる。
≪本発明の検出方法に係る試料≫
<対象臓器>
本発明に係る検出方法は、対象臓器に生じるがんの検出に好適に用いることができる。被験者の被験部位(対象臓器)としては、本発明に係る融合体が存在している範囲で限定されないが、消化器が好ましく、消化管がより好ましく、胃腸が更に好ましく、下部消化管が更に好ましく、大腸が更に好ましい。
より具体的には、本発明に係る検出方法は、消化器がんの検出に好適に、消化管がんの検出により好適に、胃腸がんの検出に更に好適に、下部消化管がんの検出に更に好適に、大腸がんの検出に更に好適に用いることができる。
<対象臓器>
本発明に係る検出方法は、対象臓器に生じるがんの検出に好適に用いることができる。被験者の被験部位(対象臓器)としては、本発明に係る融合体が存在している範囲で限定されないが、消化器が好ましく、消化管がより好ましく、胃腸が更に好ましく、下部消化管が更に好ましく、大腸が更に好ましい。
より具体的には、本発明に係る検出方法は、消化器がんの検出に好適に、消化管がんの検出により好適に、胃腸がんの検出に更に好適に、下部消化管がんの検出に更に好適に、大腸がんの検出に更に好適に用いることができる。
<被験者からの採取物>
本発明に係る検出方法における、被験者から得た試料としては、被験者からの採取物(生体から分離した試料)、具体的には、任意の採取された体液(好ましくは血液)、被験者患部からの摘出検体、生検試料又は擦過検体、糞便、尿、消化管洗浄液等を用いることができる。前記消化管洗浄液は、消化管全体の洗浄液であっても、あるいは、少なくとも被験部位を含む消化管の洗浄液、例えば、下部消化管の洗浄液、大腸の洗浄液であってもよい。検出感度を考慮すると、前記対象臓器における被験部位の細胞が含まれる試料が好ましく、被験者の被験部位からの摘出検体又は生検試料が更に好ましい。
本発明に係る検出方法における、被験者から得た試料としては、被験者からの採取物(生体から分離した試料)、具体的には、任意の採取された体液(好ましくは血液)、被験者患部からの摘出検体、生検試料又は擦過検体、糞便、尿、消化管洗浄液等を用いることができる。前記消化管洗浄液は、消化管全体の洗浄液であっても、あるいは、少なくとも被験部位を含む消化管の洗浄液、例えば、下部消化管の洗浄液、大腸の洗浄液であってもよい。検出感度を考慮すると、前記対象臓器における被験部位の細胞が含まれる試料が好ましく、被験者の被験部位からの摘出検体又は生検試料が更に好ましい。
<採取物の調製>
本発明に係るNTRK1融合遺伝子、又は、NTRK1融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、NTRK1融合遺伝子、又は、NTRK1融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、NTRK1融合遺伝子、又は、NTRK1融合タンパク質を検出してもよい。なお、NTRK1融合遺伝子の検出とは、NTRK1融合遺伝子のゲノムDNAの検出、当該ゲノムDNAの転写産物であるmRNA、又は、mRNAを鋳型として得られるcDNAの検出のいずれであってもよい。
本発明に係るNTRK1融合遺伝子、又は、NTRK1融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、NTRK1融合遺伝子、又は、NTRK1融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、NTRK1融合遺伝子、又は、NTRK1融合タンパク質を検出してもよい。なお、NTRK1融合遺伝子の検出とは、NTRK1融合遺伝子のゲノムDNAの検出、当該ゲノムDNAの転写産物であるmRNA、又は、mRNAを鋳型として得られるcDNAの検出のいずれであってもよい。
本発明に係るLMNA融合遺伝子、又は、LMNA融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、LMNA融合遺伝子、又は、LMNA融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、LMNA融合遺伝子、又は、LMNA融合タンパク質を検出してもよい。なお、LMNA融合遺伝子の検出とは、LMNA融合遺伝子のゲノムDNAの検出、当該ゲノムDNAの転写産物であるmRNA、又は、mRNAを鋳型として得られるcDNAの検出のいずれであってもよい。
≪本発明の検出方法に係る検出対象≫
<NTRK1融合体:NTRK1融合遺伝子とNTRK1融合タンパク質>
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、NTRK1融合体の検出方法、すなわち、NTRK1キナーゼ領域を含む融合タンパク質(NTRK1融合タンパク質)の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子(NTRK1融合遺伝子)の検出方法が含まれる。
<LMNA融合体:LMNA融合遺伝子とLMNA融合タンパク質>
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、LMNA融合体の検出方法、すなわち、LMNA融合タンパク質の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子(LMNA融合遺伝子)の検出方法が含まれる。
<NTRK1融合体:NTRK1融合遺伝子とNTRK1融合タンパク質>
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、NTRK1融合体の検出方法、すなわち、NTRK1キナーゼ領域を含む融合タンパク質(NTRK1融合タンパク質)の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子(NTRK1融合遺伝子)の検出方法が含まれる。
<LMNA融合体:LMNA融合遺伝子とLMNA融合タンパク質>
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、LMNA融合体の検出方法、すなわち、LMNA融合タンパク質の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子(LMNA融合遺伝子)の検出方法が含まれる。
≪本発明の検出方法の態様(融合タンパク質及び融合遺伝子の検出方法)≫
本発明の検出方法には、被験者から得た消化器由来試料中の、NTRK1遺伝子の切断、又は、NTRK1遺伝子にコードされるポリペプチドの切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た消化器由来試料中の、NTRK1遺伝子とそれ以外の他の遺伝子とから構築される融合遺伝子の存在、又は、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。
本発明の検出方法には、被験者から得た消化器由来試料中の、NTRK1遺伝子の切断、又は、NTRK1遺伝子にコードされるポリペプチドの切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た消化器由来試料中の、NTRK1遺伝子とそれ以外の他の遺伝子とから構築される融合遺伝子の存在、又は、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、LMNA遺伝子の切断、又は、LMNA遺伝子にコードされるポリペプチドの切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た試料中の、LMNA遺伝子とそれ以外の他の遺伝子とから構築される融合遺伝子の存在、又は、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。
<NTRK1融合遺伝子を検出する態様>
以下、NTRK1融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。
ここで、正常試料(がんに罹患していない組織由来試料)には、NTRK1融合体のみならずNTRK1遺伝子又はNTRK1タンパク質も存在しないので、NTRK1遺伝子又はNTRK1タンパク質自体の存在を検出することによってNTRK1融合体を検出することもできる。
以下、NTRK1融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。
ここで、正常試料(がんに罹患していない組織由来試料)には、NTRK1融合体のみならずNTRK1遺伝子又はNTRK1タンパク質も存在しないので、NTRK1遺伝子又はNTRK1タンパク質自体の存在を検出することによってNTRK1融合体を検出することもできる。
〔NTRK1融合遺伝子を検出する態様(1)〕
〈NTRK1融合遺伝子を検出する態様(1-a)〉
NTRK1融合遺伝子を検出する一態様として、NTRK1融合遺伝子が構築されているとき、NTRK1遺伝子が2つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、NTRK1遺伝子が切断されている状態、すなわち、NTRK1遺伝子5’末端側領域とNTRK1遺伝子3’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1遺伝子5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、NTRK1遺伝子3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で近接していないことを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。あるいは、NTRK1遺伝子3’末端側領域のみが存在することを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
なお、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、NTRK1融合遺伝子を検出してもよい。
〈NTRK1融合遺伝子を検出する態様(1-a)〉
NTRK1融合遺伝子を検出する一態様として、NTRK1融合遺伝子が構築されているとき、NTRK1遺伝子が2つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、NTRK1遺伝子が切断されている状態、すなわち、NTRK1遺伝子5’末端側領域とNTRK1遺伝子3’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1遺伝子5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、NTRK1遺伝子3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で近接していないことを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。あるいは、NTRK1遺伝子3’末端側領域のみが存在することを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
なお、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、NTRK1融合遺伝子を検出してもよい。
〈NTRK1融合遺伝子を検出する態様(1-b)〉
他の一態様として、NTRK1遺伝子の、5’末端側領域と、3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、NTRK1遺伝子の5’末端側領域の発現量と、NTRK1遺伝子3’末端側領域の発現量とが異なる場合、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、NTRK1遺伝子と共にNTRK1融合遺伝子を構築しているNTRK1遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、NTRK1融合遺伝子を検出してもよい。
他の一態様として、NTRK1遺伝子の、5’末端側領域と、3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、NTRK1遺伝子の5’末端側領域の発現量と、NTRK1遺伝子3’末端側領域の発現量とが異なる場合、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、NTRK1遺伝子と共にNTRK1融合遺伝子を構築しているNTRK1遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、NTRK1融合遺伝子を検出してもよい。
〈NTRK1融合遺伝子を検出する態様(1-c)〉
他の一態様として、NTRK1融合体の形成過程において、NTRK1遺伝子又はNTRK1遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製(duplication)を伴う場合、すなわち、NTRK1遺伝子由来の重複したポリヌクレオチド、及び、NTRK1遺伝子と共にNTRK1融合遺伝子を構築しているNTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとから、NTRK1融合遺伝子が構築されている場合、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
他の一態様として、NTRK1融合体の形成過程において、NTRK1遺伝子又はNTRK1遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製(duplication)を伴う場合、すなわち、NTRK1遺伝子由来の重複したポリヌクレオチド、及び、NTRK1遺伝子と共にNTRK1融合遺伝子を構築しているNTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとから、NTRK1融合遺伝子が構築されている場合、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
〔NTRK1融合遺伝子を検出する態様(2)〕
NTRK1融合遺伝子を検出する一態様として、NTRK1融合遺伝子が、NTRK1遺伝子由来ポリヌクレオチドと、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが融合して構築されていることに基づき、NTRK1融合遺伝子における、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、NTRK1遺伝子3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子が、LMNAの場合、すなわちNTRK1融合遺伝子がLMNA-NTRK1融合遺伝子である場合、第1のプローブはLMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。
NTRK1融合遺伝子を検出する一態様として、NTRK1融合遺伝子が、NTRK1遺伝子由来ポリヌクレオチドと、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが融合して構築されていることに基づき、NTRK1融合遺伝子における、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、NTRK1遺伝子3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子が、LMNAの場合、すなわちNTRK1融合遺伝子がLMNA-NTRK1融合遺伝子である場合、第1のプローブはLMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。
〔NTRK1融合遺伝子を検出する態様(3)〕
NTRK1融合遺伝子を検出する一態様として、NTRK1融合遺伝子が、NTRK1遺伝子由来ポリヌクレオチドと、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、NTRK1融合遺伝子における、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にアニールする第1のプライマーと、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にアニールする第2のプライマーとを用いてPCR反応を行い、融合点の存在を示す所定のPCR産物が得られることを確認することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
NTRK1融合遺伝子を検出する一態様として、NTRK1融合遺伝子が、NTRK1遺伝子由来ポリヌクレオチドと、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、NTRK1融合遺伝子における、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にアニールする第1のプライマーと、NTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にアニールする第2のプライマーとを用いてPCR反応を行い、融合点の存在を示す所定のPCR産物が得られることを確認することにより、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
<NTRK1融合タンパク質を検出する態様>
以下、NTRK1タンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
以下、NTRK1タンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
〔NTRK1融合タンパク質を検出する態様(1)〕
〈NTRK1融合タンパク質を検出する態様(1-a)〉
NTRK1融合タンパク質を検出する態様として、NTRK1融合遺伝子が構築されているとき、NTRK1遺伝子にコードされるNTRK1タンパク質も切断されることに基づき、NTRK1タンパク質が切断されている状態、すなわち、NTRK1タンパク質のN末端側領域とC末端側領域とが連続せずに切断されていることを検出することにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1タンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、NTRK1タンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、異なるタンパク質に存在することを確認することにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、NTRK1タンパク質と共に融合タンパク質を構築しているNTRK1タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、NTRK1融合タンパク質を検出してもよい。
〈NTRK1融合タンパク質を検出する態様(1-a)〉
NTRK1融合タンパク質を検出する態様として、NTRK1融合遺伝子が構築されているとき、NTRK1遺伝子にコードされるNTRK1タンパク質も切断されることに基づき、NTRK1タンパク質が切断されている状態、すなわち、NTRK1タンパク質のN末端側領域とC末端側領域とが連続せずに切断されていることを検出することにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1タンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、NTRK1タンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、異なるタンパク質に存在することを確認することにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、NTRK1タンパク質と共に融合タンパク質を構築しているNTRK1タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、NTRK1融合タンパク質を検出してもよい。
〈NTRK1融合タンパク質を検出する態様(1-b)〉
他の一態様として、NTRK1タンパク質の、N末端側領域と、C末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、NTRK1タンパク質のN末端側領域の発現量と、NTRK1タンパク質C末端側領域の発現量とが異なることを指標として、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、NTRK1タンパク質と共にNTRK1融合タンパク質を構築しているNTRK1タンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、NTRK1融合タンパク質を検出してもよい。
他の一態様として、NTRK1タンパク質の、N末端側領域と、C末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、NTRK1タンパク質のN末端側領域の発現量と、NTRK1タンパク質C末端側領域の発現量とが異なることを指標として、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、NTRK1タンパク質と共にNTRK1融合タンパク質を構築しているNTRK1タンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、NTRK1融合タンパク質を検出してもよい。
〔NTRK1融合タンパク質を検出する態様(2)〕
NTRK1融合タンパク質を検出する一態様では、NTRK1融合タンパク質が、NTRK1タンパク質由来ポリペプチドと、NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、NTRK1融合タンパク質における、NTRK1タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、NTRK1タンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
NTRK1融合タンパク質を検出する一態様では、NTRK1融合タンパク質が、NTRK1タンパク質由来ポリペプチドと、NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、NTRK1融合タンパク質における、NTRK1タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、NTRK1タンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
〔NTRK1融合タンパク質を検出する態様(3)〕
NTRK1融合タンパク質を検出する一態様では、NTRK1融合タンパク質が、NTRK1タンパク質由来ポリペプチドと、NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、NTRK1融合タンパク質における、前記融合点を含むNTRK1タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
NTRK1融合タンパク質を検出する一態様では、NTRK1融合タンパク質が、NTRK1タンパク質由来ポリペプチドと、NTRK1タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、NTRK1融合タンパク質における、前記融合点を含むNTRK1タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、NTRK1融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、NTRK1融合タンパク質を検出することができる。
〔NTRK1融合タンパク質を検出する態様(4)〕
NTRK1融合タンパク質を検出する一態様では、NTRK1融合タンパク質の活性を指標にNTRK1融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、野生型NTRK1タンパク質に対して阻害活性のある物質を用いて野生型NTRK1タンパク質の活性を阻害した上で、NTRK1タンパク質のキナーゼ活性を測定し、NTRK1融合タンパク質を含まない(野生型NTRK1タンパク質のみを含む)場合に比較して、活性が高いことを指標にNTRK1融合タンパク質を検出することができる。なお、NTRK1タンパク質のキナーゼ活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、NTRK1によりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。
NTRK1融合タンパク質を検出する一態様では、NTRK1融合タンパク質の活性を指標にNTRK1融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、野生型NTRK1タンパク質に対して阻害活性のある物質を用いて野生型NTRK1タンパク質の活性を阻害した上で、NTRK1タンパク質のキナーゼ活性を測定し、NTRK1融合タンパク質を含まない(野生型NTRK1タンパク質のみを含む)場合に比較して、活性が高いことを指標にNTRK1融合タンパク質を検出することができる。なお、NTRK1タンパク質のキナーゼ活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、NTRK1によりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。
なお、NTRK1融合タンパク質の検出は、NTRK1融合タンパク質を構成する全長ポリペプチドの存在、あるいは、NTRK1融合タンパク質の一部を構成するポリペプチドの存在を指標として行ってもよく、NTRK1融合タンパク質の存在が確認できる範囲で制限されない。
<LMNA融合遺伝子を検出する態様>
以下、LMNA融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。
以下、LMNA融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。
〔LMNA融合遺伝子を検出する態様(1)〕
〈LMNA融合遺伝子を検出する態様(1-a)〉
LMNA融合遺伝子を検出する一態様として、LMNA融合遺伝子が構築されているとき、LMNA遺伝子が2つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、LMNA遺伝子が切断されている状態、すなわち、LMNA遺伝子5’末端側領域とLMNA遺伝子3’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNA遺伝子5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、LMNA遺伝子3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で近接していないことを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。あるいは、LMNA遺伝子5’末端側領域のみが存在することを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
なお、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、LMNA融合遺伝子を検出してもよい。
〈LMNA融合遺伝子を検出する態様(1-a)〉
LMNA融合遺伝子を検出する一態様として、LMNA融合遺伝子が構築されているとき、LMNA遺伝子が2つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、LMNA遺伝子が切断されている状態、すなわち、LMNA遺伝子5’末端側領域とLMNA遺伝子3’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNA遺伝子5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、LMNA遺伝子3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で近接していないことを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。あるいは、LMNA遺伝子5’末端側領域のみが存在することを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
なお、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、LMNA融合遺伝子を検出してもよい。
〈LMNA融合遺伝子を検出する態様(1-b)〉
他の一態様として、LMNA遺伝子の、5’末端側領域と、3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、LMNA遺伝子の5’末端側領域の発現量と、LMNA遺伝子3’末端側領域の発現量とが異なる場合、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、LMNA遺伝子と共にLMNA融合遺伝子を構築しているLMNA遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、LMNA融合遺伝子を検出してもよい。
他の一態様として、LMNA遺伝子の、5’末端側領域と、3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、LMNA遺伝子の5’末端側領域の発現量と、LMNA遺伝子3’末端側領域の発現量とが異なる場合、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、LMNA遺伝子と共にLMNA融合遺伝子を構築しているLMNA遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、LMNA融合遺伝子を検出してもよい。
〈LMNA融合遺伝子を検出する態様(1-c)〉
他の一態様として、LMNA融合体の形成過程において、LMNA遺伝子又はLMNA遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製(duplication)を伴う場合、すなわち、LMNA遺伝子由来の重複したポリヌクレオチド、及び、LMNA遺伝子と共にLMNA融合遺伝子を構築しているLMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとから、LMNA融合遺伝子が構築されている場合、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
他の一態様として、LMNA融合体の形成過程において、LMNA遺伝子又はLMNA遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製(duplication)を伴う場合、すなわち、LMNA遺伝子由来の重複したポリヌクレオチド、及び、LMNA遺伝子と共にLMNA融合遺伝子を構築しているLMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとから、LMNA融合遺伝子が構築されている場合、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
〔LMNA融合遺伝子を検出する態様(2)〕
LMNA融合遺伝子を検出する一態様として、LMNA融合遺伝子が、LMNA遺伝子由来ポリヌクレオチドと、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが融合して構築されていることに基づき、LMNA融合遺伝子における、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、LMNA遺伝子5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。LMNA遺伝子以外の他の遺伝子が、NTRK1の場合、すなわちLMNA融合遺伝子がLMNA-NTRK1融合遺伝子である場合、第1のプローブはNTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。
LMNA融合遺伝子を検出する一態様として、LMNA融合遺伝子が、LMNA遺伝子由来ポリヌクレオチドと、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが融合して構築されていることに基づき、LMNA融合遺伝子における、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、LMNA遺伝子5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。LMNA遺伝子以外の他の遺伝子が、NTRK1の場合、すなわちLMNA融合遺伝子がLMNA-NTRK1融合遺伝子である場合、第1のプローブはNTRK1遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。
〔LMNA融合遺伝子を検出する態様(3)〕
LMNA融合遺伝子を検出する一態様として、LMNA融合遺伝子が、LMNA遺伝子由来ポリヌクレオチドと、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、LMNA融合遺伝子における、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にアニールする第1のプライマーと、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にアニールする第2のプライマーとを用いてPCR反応を行い、融合点の存在を示す所定のPCR産物が得られることを確認することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
LMNA融合遺伝子を検出する一態様として、LMNA融合遺伝子が、LMNA遺伝子由来ポリヌクレオチドと、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、LMNA融合遺伝子における、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNA遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にアニールする第1のプライマーと、LMNA遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にアニールする第2のプライマーとを用いてPCR反応を行い、融合点の存在を示す所定のPCR産物が得られることを確認することにより、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
<LMNA融合タンパク質を検出する態様>
以下、LMNAタンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
以下、LMNAタンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
〔LMNA融合タンパク質を検出する態様(1)〕
〈LMNA融合タンパク質を検出する態様(1-a)〉
LMNA融合タンパク質を検出する態様として、LMNA融合遺伝子が構築されているとき、LMNA遺伝子にコードされるLMNAタンパク質も切断されることに基づき、LMNAタンパク質が切断されている状態、すなわち、LMNAタンパク質のN末端側領域とC末端側領域とが連続せずに切断されていることを検出することにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNAタンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、LMNAタンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、異なるタンパク質に存在することを確認することにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、LMNAタンパク質と共に融合タンパク質を構築しているLMNAタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、LMNA融合タンパク質を検出してもよい。
〈LMNA融合タンパク質を検出する態様(1-a)〉
LMNA融合タンパク質を検出する態様として、LMNA融合遺伝子が構築されているとき、LMNA遺伝子にコードされるLMNAタンパク質も切断されることに基づき、LMNAタンパク質が切断されている状態、すなわち、LMNAタンパク質のN末端側領域とC末端側領域とが連続せずに切断されていることを検出することにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNAタンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、LMNAタンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、異なるタンパク質に存在することを確認することにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、LMNAタンパク質と共に融合タンパク質を構築しているLMNAタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、LMNA融合タンパク質を検出してもよい。
〈LMNA融合タンパク質を検出する態様(1-b)〉
他の一態様として、LMNAタンパク質の、N末端側領域と、C末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、LMNAタンパク質のN末端側領域の発現量と、LMNAタンパク質C末端側領域の発現量とが異なることを指標として、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、LMNAタンパク質と共にLMNA融合タンパク質を構築しているLMNAタンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、LMNA融合タンパク質を検出してもよい。
他の一態様として、LMNAタンパク質の、N末端側領域と、C末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、LMNAタンパク質のN末端側領域の発現量と、LMNAタンパク質C末端側領域の発現量とが異なることを指標として、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、LMNAタンパク質と共にLMNA融合タンパク質を構築しているLMNAタンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、LMNA融合タンパク質を検出してもよい。
〔LMNA融合タンパク質を検出する態様(2)〕
LMNA融合タンパク質を検出する一態様では、LMNA融合タンパク質が、LMNAタンパク質由来ポリペプチドと、LMNAタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、LMNA融合タンパク質における、LMNAタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNAタンパク質以外の他のタンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、LMNAタンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
LMNA融合タンパク質を検出する一態様では、LMNA融合タンパク質が、LMNAタンパク質由来ポリペプチドと、LMNAタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、LMNA融合タンパク質における、LMNAタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNAタンパク質以外の他のタンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、LMNAタンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
〔LMNA融合タンパク質を検出する態様(3)〕
LMNA融合タンパク質を検出する一態様では、LMNA融合タンパク質が、LMNAタンパク質由来ポリペプチドと、LMNAタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、LMNA融合タンパク質における、前記融合点を含むLMNAタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記LMNAタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNA融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
LMNA融合タンパク質を検出する一態様では、LMNA融合タンパク質が、LMNAタンパク質由来ポリペプチドと、LMNAタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、LMNA融合タンパク質における、前記融合点を含むLMNAタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記LMNAタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNA融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、LMNA融合タンパク質を検出することができる。
〔LMNA融合タンパク質を検出する態様(4)〕
LMNA融合タンパク質を検出する一態様では、LMNA融合タンパク質の活性を指標にLMNA融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNAタンパク質と共に融合タンパク質を構築するLMNA以外の他のタンパク質が酵素活性を有するタンパク質である場合、LMNA融合タンパク質を含まない(野生型LMNAタンパク質のみを含む)場合に比較して、当該酵素活性が高いことを指標に、LMNA融合タンパク質を検出することができる。なお、酵素活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記他のタンパク質がキナーゼ活性を有するタンパク質(好ましくはNTRK1タンパク質)である場合、LMNA融合タンパク質によりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。
LMNA融合タンパク質を検出する一態様では、LMNA融合タンパク質の活性を指標にLMNA融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、LMNAタンパク質と共に融合タンパク質を構築するLMNA以外の他のタンパク質が酵素活性を有するタンパク質である場合、LMNA融合タンパク質を含まない(野生型LMNAタンパク質のみを含む)場合に比較して、当該酵素活性が高いことを指標に、LMNA融合タンパク質を検出することができる。なお、酵素活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記他のタンパク質がキナーゼ活性を有するタンパク質(好ましくはNTRK1タンパク質)である場合、LMNA融合タンパク質によりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。
なお、LMNA融合タンパク質の検出は、LMNA融合タンパク質を構成する全長ポリペプチドの存在、あるいは、LMNA融合タンパク質の一部を構成するポリペプチドの存在を指標として行ってもよく、LMNA融合タンパク質の存在が確認できる範囲で制限されない。
≪検出方法に用いる技法≫
以下、NTRK1融合遺伝子(ゲノムDNA、mRNA、又はcDNA)の検出、LMNA融合遺伝子(ゲノムDNA、mRNA、又はcDNA)の検出、NTRK1融合タンパク質の検出、LMNA融合タンパク質の検出の工程及び検出技法について、より詳細に説明するが、これらに制限されるものではない。
なお、被験者から得た試料から、遺伝子(ゲノムDNA、又は、mRNA)又は、タンパク質を抽出した場合、あるいは、組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成した場合において、調製された試料においてNTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子、あるいは、NTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質を検出するために好適な技法は、当業者が適宜選択することができる。
以下、NTRK1融合遺伝子(ゲノムDNA、mRNA、又はcDNA)の検出、LMNA融合遺伝子(ゲノムDNA、mRNA、又はcDNA)の検出、NTRK1融合タンパク質の検出、LMNA融合タンパク質の検出の工程及び検出技法について、より詳細に説明するが、これらに制限されるものではない。
なお、被験者から得た試料から、遺伝子(ゲノムDNA、又は、mRNA)又は、タンパク質を抽出した場合、あるいは、組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成した場合において、調製された試料においてNTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子、あるいは、NTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質を検出するために好適な技法は、当業者が適宜選択することができる。
<融合遺伝子の検出>
NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の検出は、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子のゲノムDNAの検出、当該ゲノムDNAの転写産物であるmRNAの検出、又は、mRNAを鋳型として得られるcDNAの検出のいずれであってもよい。
被験者から得た試料中の、NTRK1融合遺伝子(ゲノムDNA、又は、mRNA)又はLMNA融合遺伝子(ゲノムDNA、又は、mRNA)を検出する技法としては、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブ(核酸プローブ等)を使用したハイブリダイゼーション技術、あるいは、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部にアニールするプライマーを用いた遺伝子増幅技術等、遺伝子の検出に用いられる当業者に周知のいかなる技法、及び、これらの技法を応用した技法を用いることができる。
すなわち、PCR、LCR(Ligase chain reaction)、SDA(Strand displacement amplification)、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)、ICAN(Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids)、LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法、TMA法(Gen-Probe’s TMA system)、インサイチュハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、RNAプロテクション法、DNAシーケンス、RNAシーケンス等のいかなる技法を用いてもよい。
NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の検出は、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子のゲノムDNAの検出、当該ゲノムDNAの転写産物であるmRNAの検出、又は、mRNAを鋳型として得られるcDNAの検出のいずれであってもよい。
被験者から得た試料中の、NTRK1融合遺伝子(ゲノムDNA、又は、mRNA)又はLMNA融合遺伝子(ゲノムDNA、又は、mRNA)を検出する技法としては、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブ(核酸プローブ等)を使用したハイブリダイゼーション技術、あるいは、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部にアニールするプライマーを用いた遺伝子増幅技術等、遺伝子の検出に用いられる当業者に周知のいかなる技法、及び、これらの技法を応用した技法を用いることができる。
すなわち、PCR、LCR(Ligase chain reaction)、SDA(Strand displacement amplification)、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)、ICAN(Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids)、LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法、TMA法(Gen-Probe’s TMA system)、インサイチュハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、RNAプロテクション法、DNAシーケンス、RNAシーケンス等のいかなる技法を用いてもよい。
〔ゲノムDNAの検出〕
ゲノムDNAの検出には、インサイチュハイブリダイゼーション技術を好適に用いることができる。インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、公知のFISH法に従って実施することができる。又は、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション(CISH)法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション(SISH)法を組み合わせたフュージョンアッセイ(fusion assay)で実施することができる。好適には、実施例4又は5に記載のFISH法スプリットアッセイ、又は、FISH法フュージョンアッセイで検出することができる。
ゲノムDNAの検出には、インサイチュハイブリダイゼーション技術を好適に用いることができる。インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、公知のFISH法に従って実施することができる。又は、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション(CISH)法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション(SISH)法を組み合わせたフュージョンアッセイ(fusion assay)で実施することができる。好適には、実施例4又は5に記載のFISH法スプリットアッセイ、又は、FISH法フュージョンアッセイで検出することができる。
あるいは、ゲノムDNAの検出には、DNAシーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、従来のサンガー法に基づくシーケンサーを使用してもよいが、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい(例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照)。次世代シーケンサーとしては、Illumina社のMiSeq/HiSeq、Life Technogies社のSOLiDシステム、Roche社の454シーケンスシステム(GS FLX+/GS Junior)等が例示できる。シーケンシングにおいては、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮(enrich)することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Roche社のRoche NimbleGen、Agilent Technologies社のSure Select等が例示できる。
以下に、ゲノムDNAの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
以下に、ゲノムDNAの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
〈FISH法スプリットアッセイ〉
NTRK1融合遺伝子のFISH法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、後述の実施例6で詳細に説明するように、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合(野生型NTRK1遺伝子の場合)には、2つの遺伝子領域(各遺伝子ごとの5’末端側領域と3’末端側領域)が近接しているため、2つのシグナルが重なった色(例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色)として検出されるのに対して、転座又は逆位等により2つの遺伝子領域が切断されている場合は、2種類の蛍光色素に由来するシグナル(例えば、赤色と緑色)が孤在性に検出される。従って、FISH法スプリットアッセイでは、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域とNTRK1遺伝子3’末端側ゲノム領域とが染色体上で近接していないことを検出することにより、NTRK1融合遺伝子の存在を検出している。
NTRK1融合遺伝子のFISH法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、後述の実施例6で詳細に説明するように、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合(野生型NTRK1遺伝子の場合)には、2つの遺伝子領域(各遺伝子ごとの5’末端側領域と3’末端側領域)が近接しているため、2つのシグナルが重なった色(例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色)として検出されるのに対して、転座又は逆位等により2つの遺伝子領域が切断されている場合は、2種類の蛍光色素に由来するシグナル(例えば、赤色と緑色)が孤在性に検出される。従って、FISH法スプリットアッセイでは、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域とNTRK1遺伝子3’末端側ゲノム領域とが染色体上で近接していないことを検出することにより、NTRK1融合遺伝子の存在を検出している。
また、LMNA融合遺伝子のFISH法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、後述の実施例6で詳細に説明するように、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合(野生型LMNA遺伝子の場合)には、2つの遺伝子領域(各遺伝子ごとの5’末端側領域と3’末端側領域)が近接しているため、2つのシグナルが重なった色(例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色)として検出されるのに対して、転座又は逆位等により2つの遺伝子領域が切断されている場合は、2種類の蛍光色素に由来するシグナル(例えば、赤色と緑色)が孤在性に検出される。従って、FISH法スプリットアッセイでは、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域とLMNA遺伝子3’末端側ゲノム領域とが染色体上で近接していないことを検出することにより、LMNA融合遺伝子の存在を検出している。
NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子が、LMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例6に示すように、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせ、あるいは、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することにより、LMNA-NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
〈FISH法フュージョンアッセイ〉
NTRK1融合遺伝子のFISH法フュージョンアッセイでは、例えば、NTRK1融合遺伝子がLMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例5で詳細に説明するように、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、NTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することができる。正常な場合(野生型NTRK1遺伝子の場合)には、2種類の蛍光色素に由来するシグナル(例えば、赤色と緑色)が別々に離れて検出されるのに対して、転座又は逆位等により2つの遺伝子領域が近接している場合は、2つのシグナルが重なった色(例えば、黄色)として検出される。
NTRK1融合遺伝子のFISH法フュージョンアッセイでは、例えば、NTRK1融合遺伝子がLMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例5で詳細に説明するように、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、NTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することができる。正常な場合(野生型NTRK1遺伝子の場合)には、2種類の蛍光色素に由来するシグナル(例えば、赤色と緑色)が別々に離れて検出されるのに対して、転座又は逆位等により2つの遺伝子領域が近接している場合は、2つのシグナルが重なった色(例えば、黄色)として検出される。
また、LMNA融合遺伝子のFISH法フュージョンアッセイでは、例えば、LMNA融合遺伝子がLMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例5で詳細に説明するように、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、NTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することができる。正常な場合(野生型LMNA遺伝子の場合)には、2種類の蛍光色素に由来するシグナル(例えば、赤色と緑色)が孤在性に検出されるのに対して、転座又は逆位等により2つの遺伝子領域が近接している場合は、2つのシグナルが重なった色(例えば、黄色)として検出される。
〈FISH法スプリットアッセイとフュージョンアッセイの組み合わせ〉
上記、FISH法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイは、同一の病理切片に対して同時におこなうこともできる。
例えば、NTRK1融合遺伝子またはLMNA融合遺伝子が、LMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例7で詳細に説明するように、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識(例えば青色)したものと、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素(例えば赤色)で標識したものと、NTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであってさらに別の蛍光色素(例えば緑色)で標識したものと、の組み合わせを使用することができる。すなわち、異なる3色の蛍光色素(例えば、青色、赤色、緑色)でそれぞれのプローブを標識して用いる。
上記、FISH法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイは、同一の病理切片に対して同時におこなうこともできる。
例えば、NTRK1融合遺伝子またはLMNA融合遺伝子が、LMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例7で詳細に説明するように、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識(例えば青色)したものと、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素(例えば赤色)で標識したものと、NTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであってさらに別の蛍光色素(例えば緑色)で標識したものと、の組み合わせを使用することができる。すなわち、異なる3色の蛍光色素(例えば、青色、赤色、緑色)でそれぞれのプローブを標識して用いる。
正常な場合(野生型NTRK1遺伝子の場合)には、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域とNTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域が連続(近接)しているため、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域と3’末端側ゲノム領域を標識したそれぞれ異なる蛍光標識の蛍光が重なったシグナル(例えば、赤色と緑色が重なった黄色)が検出され、かつ、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素のシグナル(例えば青色)が、孤在性に検出される。
一方、LMNA-NTRK1融合遺伝子が構成されている場合、遺伝子転座、欠失又は逆位等により、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域が、本来の位置から失われ、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域とNTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域が連続(挿入塩基を間に含んで連続する場合もある)して、融合点を形成することになる。このため、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素の蛍光と、NTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素の蛍光とが重なったシグナル(例えば、青色と緑色が重なった青緑色)のみが、当該融合遺伝子構成部位において検出され、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素のシグナル(例えば赤色)は、当該融合遺伝子構成部位においては検出されなくなる。
なお、このとき、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素のシグナル(例えば赤色)は、孤在性に検出されるか、または、どこにも検出されないことになる。フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイを同一の病理切片に対して同時におこなう本FISHアッセイは、両手法の結果を一つの病理切片上で得られるため、効率性、および、判定の信頼性向上の観点から好適である。
一方、異なる蛍光色素で標識された2つのプローブを用い、前述の〈FISH法スプリットアッセイ〉と〈FISHフュージョンアッセイ〉によって、融合遺伝子を構築する2つの遺伝子の切断と融合をそれぞれ検出する場合、複数の病理切片が必要になる。
特に、融合遺伝子を構成する遺伝子同士が同一染色体上の近い距離に位置する場合(例えば、LMNAとNTRK1等)、フュージョンアッセイだけを行った場合では、遺伝子転座、欠失又は逆位等が起きていないにも関わらず、融合遺伝子を構成する一つの遺伝子の5’末端側領域と、融合遺伝子を構成する他の遺伝子の3’末端側領域が近いために、見る角度等によっては、近接したシグナル(例えば青緑色)が観察され、偽陽性の判定が生じる恐れがある。その際、融合遺伝子を構成する他の遺伝子(LMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、NTRK1遺伝子)の5’末端側のシグナル(例えば赤色)が、融合遺伝子構成部位に、近接して検出されないことを確認することにより、偽陽性の判定を回避することができるため、好ましい。
特に、融合遺伝子を構成する遺伝子同士が同一染色体上の近い距離に位置する場合(例えば、LMNAとNTRK1等)、フュージョンアッセイだけを行った場合では、遺伝子転座、欠失又は逆位等が起きていないにも関わらず、融合遺伝子を構成する一つの遺伝子の5’末端側領域と、融合遺伝子を構成する他の遺伝子の3’末端側領域が近いために、見る角度等によっては、近接したシグナル(例えば青緑色)が観察され、偽陽性の判定が生じる恐れがある。その際、融合遺伝子を構成する他の遺伝子(LMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、NTRK1遺伝子)の5’末端側のシグナル(例えば赤色)が、融合遺伝子構成部位に、近接して検出されないことを確認することにより、偽陽性の判定を回避することができるため、好ましい。
なお、融合遺伝子が構成された時に孤在性を示すシグナル(例えば赤色)のプローブは、例えば、融合遺伝子がLMNA-NTRK1遺伝子の場合、NTRK1遺伝子の5’末端領域に限らず、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域と、NTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域との間のゲノム領域内にハイブリダイズするよう設計すれば、同様の効果を得ることができる。
また、例えばLMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、それぞれの構成遺伝子の5’末端側ゲノム領域または3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって、すべて異なる蛍光色素で標識された4種のプローブを同時に用いれば、LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子それぞれの切断、および、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域とNTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域との融合を一つの病理切片上で検出することができる。
〈検出に用いるプローブ(ゲノム用)〉
NTRK1融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、NTRK1融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で(好ましくはよりストリンジェントな条件下で)ハイブリダイズするプローブが好ましい。
NTRK1融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、NTRK1融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で(好ましくはよりストリンジェントな条件下で)ハイブリダイズするプローブが好ましい。
例えば、融合点を含むNTRK1融合遺伝子のゲノムDNAを検出する場合、NTRK1融合遺伝子の融合点をはさんでその上流及び下流のそれぞれ16塩基からなる、連続した少なくとも32塩基の核酸分子(具体的には、配列番号1で表される塩基配列の第994番~第1025番)、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いてもよい。
LMNA融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、LMNA融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で(好ましくはよりストリンジェントな条件下で)ハイブリダイズするプローブが好ましい。
例えば、融合点を含むLMNA融合遺伝子のゲノムDNAを検出する場合、LMNA融合遺伝子の融合点をはさんでその上流及び下流のそれぞれ16塩基からなる、連続した少なくとも32塩基の核酸分子(具体的には、配列番号1で表される塩基配列の第994番~第1025番)、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いてもよい。
例えば、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子が、LMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、FISH法フュージョンアッセイに用いることのできるプローブとしては、LMNA遺伝子又はNTRK1遺伝子のいずれか一方の遺伝子の5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、残る一方の遺伝子の3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとの組み合わせ(好ましくは、LMNA遺伝子の5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、NTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとの組み合わせ)を用いることができ、より具体的には、後述の実施例5で使用したBACクローンの各組み合わせを挙げることができる。
一方、例えば、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子が、LMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、FISH法スプリットアッセイに用いることのできるプローブとしては、NTRK1遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、NTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとの組み合わせ、あるいは、LMNA遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、LMNA遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとの組み合わせ(好ましくは、NTRK1遺伝子の5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、NTRK1遺伝子の3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとの組み合わせ)を用いることができ、より具体的には、後述の実施例6で使用したBACクローンの各組み合わせを挙げることができる。
〔mRNAの検出〕
mRNAの検出は、ノーザンハイブリダイゼーション法等によりmRNA自体を解析することにより行っても、又は、当業者に周知の方法によりmRNAを鋳型として合成した、相補的DNA(cDNA)を解析することにより行ってもよい。
上記RNAの検出には、シーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい(例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照)。次世代シーケンサーとしては、Illumina社のMiSeq/HiSeq、Life Technogies社のSOLiDシステム、Roche社の454シーケンスシステム(GS FLX+/GS Junior)等が例示できる。シーケンシングにおいては、後述の遺伝子増幅反応方法、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮(enrich)することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Roche社のRoche NimbleGen、Agilent Technologies社のSure Select等が例示できる。
mRNAの検出は、ノーザンハイブリダイゼーション法等によりmRNA自体を解析することにより行っても、又は、当業者に周知の方法によりmRNAを鋳型として合成した、相補的DNA(cDNA)を解析することにより行ってもよい。
上記RNAの検出には、シーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい(例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照)。次世代シーケンサーとしては、Illumina社のMiSeq/HiSeq、Life Technogies社のSOLiDシステム、Roche社の454シーケンスシステム(GS FLX+/GS Junior)等が例示できる。シーケンシングにおいては、後述の遺伝子増幅反応方法、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮(enrich)することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Roche社のRoche NimbleGen、Agilent Technologies社のSure Select等が例示できる。
〈遺伝子増幅反応方法による検出〉
mRNAは、検出対象であるNTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いた、遺伝子増幅反応方法にて検出することができる。以下に、mRNAの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
mRNAは、検出対象であるNTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いた、遺伝子増幅反応方法にて検出することができる。以下に、mRNAの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
==PCR法==
例えば、PCR法では、PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子が存在していたことになる。このように、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子を検出することができる。
本発明のNTRK1融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドを遺伝子増幅反応により増幅する工程に加え、更に目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。
例えば、PCR法では、PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子が存在していたことになる。このように、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子を検出することができる。
本発明のNTRK1融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドを遺伝子増幅反応により増幅する工程に加え、更に目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。
PCR法は、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子を定量的に検出することに適している。
従って、前述の<NTRK1融合遺伝子を検出する態様(1-b)>に記載のように、NTRK1遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってNTRK1融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、NTRK1遺伝子と共にNTRK1融合遺伝子を構築しているNTRK1遺伝子以外の他の遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
また、前述の<LMNA融合遺伝子を検出する態様(1-b)>に記載のように、LMNA遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってLMNA融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、LMNA遺伝子と共にLMNA融合遺伝子を構築しているLMNA遺伝子以外の他の遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
従って、前述の<NTRK1融合遺伝子を検出する態様(1-b)>に記載のように、NTRK1遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってNTRK1融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、NTRK1遺伝子と共にNTRK1融合遺伝子を構築しているNTRK1遺伝子以外の他の遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、NTRK1融合遺伝子を検出することができる。
また、前述の<LMNA融合遺伝子を検出する態様(1-b)>に記載のように、LMNA遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってLMNA融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、LMNA遺伝子と共にLMNA融合遺伝子を構築しているLMNA遺伝子以外の他の遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、LMNA融合遺伝子を検出することができる。
なお、PCR法、及び、これに用いるプライマー設計法は、公知の方法に従って当業者が行うことができる。
例えば、NTRK1遺伝子の5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、NTRK1遺伝子の3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
例えば、LMNA遺伝子の5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、LMNA遺伝子の3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
例えば、NTRK1遺伝子の5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、NTRK1遺伝子の3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
例えば、LMNA遺伝子の5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、LMNA遺伝子の3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
==リアルタイムPCR法==
更には、PCR法においては、遺伝子の増幅過程においてPCR増幅モニター(リアルタイムPCR)法(Genome Res., 6(10), 986, 1996)を用いることにより、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の検出において、より定量的な解析を行うことが可能である。PCR増幅モニター法としては、例えば、ABI PRISM7900(PEバイオシステムズ社)を用いることが出来る。リアルタイムPCRは公知の方法であり、そのための装置及びキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。
更には、PCR法においては、遺伝子の増幅過程においてPCR増幅モニター(リアルタイムPCR)法(Genome Res., 6(10), 986, 1996)を用いることにより、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の検出において、より定量的な解析を行うことが可能である。PCR増幅モニター法としては、例えば、ABI PRISM7900(PEバイオシステムズ社)を用いることが出来る。リアルタイムPCRは公知の方法であり、そのための装置及びキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。
より具体的には、例えばNTRK1融合遺伝子がLMNA-NTRK1融合遺伝子であって、mRNAを指標にしてNTRK1融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー(5’-プライマー)を、LMNA遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー(3’-プライマー)を、NTRK1遺伝子由来の任意の部分から設計する。
また、例えばLMNA融合遺伝子がLMNA-NTRK1融合遺伝子であって、mRNAを指標にしてLMNA融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー(5’-プライマー)を、LMNA遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー(3’-プライマー)を、NTRK1遺伝子由来の任意の部分から設計する。
また、例えばLMNA融合遺伝子がLMNA-NTRK1融合遺伝子であって、mRNAを指標にしてLMNA融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー(5’-プライマー)を、LMNA遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー(3’-プライマー)を、NTRK1遺伝子由来の任意の部分から設計する。
==マルチプレックスPCR==
NTRK1融合遺伝子を検出するためのPCR法では、NTRK1遺伝子と融合してNTRK1融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、1反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスPCR(Multiplex PCR)を設計することもできる。
LMNA融合遺伝子を検出するためのPCR法では、LMNA遺伝子と融合してLMNA融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、1反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスPCR(Multiplex PCR)を設計することもできる。
NTRK1融合遺伝子を検出するためのPCR法では、NTRK1遺伝子と融合してNTRK1融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、1反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスPCR(Multiplex PCR)を設計することもできる。
LMNA融合遺伝子を検出するためのPCR法では、LMNA遺伝子と融合してLMNA融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、1反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスPCR(Multiplex PCR)を設計することもできる。
==質量分析による検出==
上記遺伝子増幅反応方法を用いた検出方法において、増幅断片の解析のために、特開2012-100628記載の質量分析法を用いることができる。
上記遺伝子増幅反応方法を用いた検出方法において、増幅断片の解析のために、特開2012-100628記載の質量分析法を用いることができる。
==検出に用いるプライマーセット==
本発明のNTRK1融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるNTRK1融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、NTRK1融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
本発明のLMNA融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるLMNA融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、LMNA融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
PCR増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア(例えば、Primer Express; PE Biosystems)などを利用してできる。また、PCR産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、mRNA又はcDNAを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが1kb以下になるように設定するのが適切である。
本発明のNTRK1融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるNTRK1融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、NTRK1融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
本発明のLMNA融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるLMNA融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、LMNA融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
PCR増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア(例えば、Primer Express; PE Biosystems)などを利用してできる。また、PCR産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、mRNA又はcDNAを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが1kb以下になるように設定するのが適切である。
〈ハイブリダイゼーション法による検出〉
mRNAは、検出対象であるNTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いた、ハイブリダイゼーション法にて検出することができる。
ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、DNAマイクロアレイ法、RNAプロテクション法などが挙げられる。
mRNAは、検出対象であるNTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いた、ハイブリダイゼーション法にて検出することができる。
ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、DNAマイクロアレイ法、RNAプロテクション法などが挙げられる。
==プローブ(mRNA用)==
ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝の少なくとも一部又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で(好ましくはよりストリンジェントな条件下で)ハイブリダイズするプローブが好ましい。
ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝の少なくとも一部又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で(好ましくはよりストリンジェントな条件下で)ハイブリダイズするプローブが好ましい。
<融合タンパク質の検出>
被験者から得た試料中の、NTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質を検出する技法としては、タンパク質を解析するために用いられる当業者に周知いかなる技法、又は、これらの技法を応用したいかなる技法を用いてもよい。
被験者から得た試料中の、NTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質を検出する技法としては、タンパク質を解析するために用いられる当業者に周知いかなる技法、又は、これらの技法を応用したいかなる技法を用いてもよい。
例えば、NTRK1融合タンパク質の検出に用いる方法としては、NTRK1タンパク質、又は、NTRK1タンパク質と共にNTRK1融合タンパク質を構築するNTRK1タンパク質以外の他のタンパク質を特異的に認識する抗体、あるいは、NTRK1融合タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法(イムノアッセイ法)、酵素活性測定法(ELISA法)、2抗体サンドイッチELISA法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫沈降法、iAEP(intercalated antibody-enhanced polymer)法、FRET法を例示することができる。あるいは、これらと組み合わせて、又は単独で、質量分析法、アミノ酸シーケンス法を用いることができる。
例えば、LMNA融合タンパク質の検出に用いる方法としては、LMNAタンパク質、又は、LMNAタンパク質と共にLMNA融合タンパク質を構築するLMNAタンパク質以外の他のタンパク質を特異的に認識する抗体、あるいは、LMNA融合タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法(イムノアッセイ法)、酵素活性測定法(ELISA法)、2抗体サンドイッチELISA法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫沈降法、iAEP(intercalated antibody-enhanced polymer)法、FRET法を例示することができる。あるいは、これらと組み合わせて、又は単独で、質量分析法、アミノ酸シーケンス法を用いることができる。
以下に、タンパク質の検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
以下に、タンパク質の検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
〔検出に用いる代表的な手法〕
抗体を用いる検出方法としては、上記公知の方法によればよいが、例えば以下の方法を用いることができる。
抗体を用いる検出方法としては、上記公知の方法によればよいが、例えば以下の方法を用いることができる。
〈免疫組織化学法〉
例えば、検出対象のNTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質が、LMNA-NTRK1融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある組織切片に対し、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗NTRK1抗体及びLMNAタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに結合する抗LMNA抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、NTRK1タンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接せずに局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、LMNAタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、LMNAタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接せずに局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
例えば、検出対象のNTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質が、LMNA-NTRK1融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある組織切片に対し、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗NTRK1抗体及びLMNAタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに結合する抗LMNA抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、NTRK1タンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接せずに局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、LMNAタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、LMNAタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接せずに局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
〈ウェスタンブロッティング法〉
例えば、検出対象のNTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質がLMNA-NTRK1融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液を、当業者に周知の方法により電気泳動して細胞抽出液中のタンパク質を分離した後、メンブレンにブロッティングする。
そして、タンパク質がブロッティングされたメンブレンに対し、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗NTRK1抗体及びLMNAタンパク質のN末端側領域に結合する抗LMNA抗体を用いた免疫染色を行い、メンブレン上の所望の位置に、抗NTRK1抗体と抗LMNA抗体が結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用い、当該抗体がメンブレン上の所望の位置に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
あるいは、抗NTRK1抗体を用い、当該抗体が、メンブレン上のLMNA-NTRK1融合タンパク質に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。この際、メンブレン上で野生型NTRK1タンパク質が予測される位置とは異なる位置に抗NTRK1抗体が結合することを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出してもよい。
抗LMNA抗体を用い、抗NTRK1抗体を用いた場合と同じ原理で、LMNA-NTRK1融合タンパク質を検出してもよい。
例えば、検出対象のNTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質がLMNA-NTRK1融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液を、当業者に周知の方法により電気泳動して細胞抽出液中のタンパク質を分離した後、メンブレンにブロッティングする。
そして、タンパク質がブロッティングされたメンブレンに対し、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗NTRK1抗体及びLMNAタンパク質のN末端側領域に結合する抗LMNA抗体を用いた免疫染色を行い、メンブレン上の所望の位置に、抗NTRK1抗体と抗LMNA抗体が結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用い、当該抗体がメンブレン上の所望の位置に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
あるいは、抗NTRK1抗体を用い、当該抗体が、メンブレン上のLMNA-NTRK1融合タンパク質に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。この際、メンブレン上で野生型NTRK1タンパク質が予測される位置とは異なる位置に抗NTRK1抗体が結合することを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出してもよい。
抗LMNA抗体を用い、抗NTRK1抗体を用いた場合と同じ原理で、LMNA-NTRK1融合タンパク質を検出してもよい。
〈免疫沈降法〉
例えば、検出対象のNTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質が、LMNA-NTRK1融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗NTRK1抗体又はLMNAタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに結合する抗LMNA抗体のいずれか一方の抗体で免疫沈降を行い、その沈降物に対して残るもう一方の抗体で検出することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。上記の通り、免疫沈降と検出をした後、更には、検出抗体により、検出したポリペプチドが目的の検出対象ポリペプチドの大きさであることを確認することが好ましい。
あるいは、検出対象のNTRK1融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗NTRK1抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型NTRK1と異なる質量の抗NTRK1抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。検出対象のLMNA融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、LMNAタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに結合する抗LMNA抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型LMNAと異なる質量の抗LMNA抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
例えば、検出対象のNTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質が、LMNA-NTRK1融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗NTRK1抗体又はLMNAタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに結合する抗LMNA抗体のいずれか一方の抗体で免疫沈降を行い、その沈降物に対して残るもう一方の抗体で検出することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。上記の通り、免疫沈降と検出をした後、更には、検出抗体により、検出したポリペプチドが目的の検出対象ポリペプチドの大きさであることを確認することが好ましい。
あるいは、検出対象のNTRK1融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗NTRK1抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型NTRK1と異なる質量の抗NTRK1抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。検出対象のLMNA融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、LMNAタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに結合する抗LMNA抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型LMNAと異なる質量の抗LMNA抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
〔検出に用いる抗体〕
なお、本発明に係る検出方法に用いる抗体は、NTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質の所望の部位に特異的に結合する範囲で特に制限されず、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を組みあわせて用いることもできる。前記抗体としては、免疫グロブリンそれ自体であっても、抗原結合能を保持した抗体断片、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、又はFvでもよい。また、抗体の結合を検出するため、当業者に周知のいかなる標識やシグナル増幅法が用いられてもよい。
なお、本発明に係る検出方法に用いる抗体は、NTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質の所望の部位に特異的に結合する範囲で特に制限されず、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を組みあわせて用いることもできる。前記抗体としては、免疫グロブリンそれ自体であっても、抗原結合能を保持した抗体断片、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、又はFvでもよい。また、抗体の結合を検出するため、当業者に周知のいかなる標識やシグナル増幅法が用いられてもよい。
<標識手法>
上記遺伝子(ゲノムDNA、mRNA、cDNA等)及びタンパク質の検出方法において、プローブ、増幅産物、抗体等の標識は公知の技術を用いればよい。例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素標識等を挙げることができる。
プローブを用いた検出方法において、プローブを標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよく、例えば、BACクローンから、標識された核酸プローブを作製する場合、ニックトランスレーション、ランダムプライム法等の公知手法を用いることができる。またその際、ビオチン-dUTP(例えば、Roche Applied Science社製)を用いてプローブをビオチン標識し、アビジンと結合させた、蛍光体、放射性同位体、酵素等、をさらに処理することでプローブを標識することができる。
抗体を用いた検出方法において、抗体を標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよいが、例えば、下記の標識方法が挙げられる。
上記遺伝子(ゲノムDNA、mRNA、cDNA等)及びタンパク質の検出方法において、プローブ、増幅産物、抗体等の標識は公知の技術を用いればよい。例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素標識等を挙げることができる。
プローブを用いた検出方法において、プローブを標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよく、例えば、BACクローンから、標識された核酸プローブを作製する場合、ニックトランスレーション、ランダムプライム法等の公知手法を用いることができる。またその際、ビオチン-dUTP(例えば、Roche Applied Science社製)を用いてプローブをビオチン標識し、アビジンと結合させた、蛍光体、放射性同位体、酵素等、をさらに処理することでプローブを標識することができる。
抗体を用いた検出方法において、抗体を標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよいが、例えば、下記の標識方法が挙げられる。
〔iAEP(intercalated antibody-enhanced polymer)法〕
検出対象となるタンパク質に結合する第一抗体と、ポリマー試薬の間に介在抗体を入れることにより、染色感度を上げることが可能である(Takeuchiら、Clin Cancer Res, 2009 May 1; 15(9):3143-3149)。
検出対象となるタンパク質に結合する第一抗体と、ポリマー試薬の間に介在抗体を入れることにより、染色感度を上げることが可能である(Takeuchiら、Clin Cancer Res, 2009 May 1; 15(9):3143-3149)。
〔蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)〕
2つの抗体の近接を検出する手法として、例えば、FRET現象を利用したプローブ(FRETプローブ)を用いることができる。抗体の一つをドナー蛍光物質(CFP等)で標識し、他の抗体をアクセプター蛍光物質(YFP等)で標識した場合、両者が十分に近い距離にあると、FRET現象により、YFPが励起状態となり、基底状態に戻る際に蛍光を発する。この蛍光を検出することで、2つの抗体が近接していることを検出することができる。
2つの抗体の近接を検出する手法として、例えば、FRET現象を利用したプローブ(FRETプローブ)を用いることができる。抗体の一つをドナー蛍光物質(CFP等)で標識し、他の抗体をアクセプター蛍光物質(YFP等)で標識した場合、両者が十分に近い距離にあると、FRET現象により、YFPが励起状態となり、基底状態に戻る際に蛍光を発する。この蛍光を検出することで、2つの抗体が近接していることを検出することができる。
≪NTRK1阻害物質による治療の適用対象の判定≫
本発明の検出方法における検出対象のNTRK1融合遺伝子又は検出対象のNTRK1融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、NTRK1融合体陽性のがんを有する対象(患者)であり、NTRK1阻害物質による治療の適用対象となる。
本発明の検出方法における検出対象のNTRK1融合遺伝子又は検出対象のNTRK1融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、NTRK1融合体陽性のがんを有する対象(患者)であり、NTRK1阻害物質による治療の適用対象となる。
≪LMNA阻害物質による治療の適用対象の判定≫
本発明の検出方法における検出対象のLMNA融合遺伝子又は検出対象のLMNA融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、LMNA融合体陽性のがんを有する対象(患者)であり、LMNA阻害物質による治療の適用対象となる。
本発明の検出方法における検出対象のLMNA融合遺伝子又は検出対象のLMNA融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、LMNA融合体陽性のがんを有する対象(患者)であり、LMNA阻害物質による治療の適用対象となる。
≪検出用キット≫
本発明の検出用キットには、検出対象のNTRK1融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のNTRK1融合タンパク質の検出用キットが含まれる。
本発明の検出用キットには、検出対象のLMNA融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のLMNA融合タンパク質の検出用キットが含まれる
本発明の検出対象のNTRK1融合遺伝子の検出用キット、又は、LMNA融合遺伝子の検出用キットには、本発明の検出方法においてFISH法フュージョンアッセイ又はFISH法スプリットアッセイに用いることのできるプローブ、あるいは、本発明の検出方法における検出対象のNTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドであり、かつ、増幅対象であるポリヌクレオチドの増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
また、本発明の検出対象のNTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質の検出用キットには、本発明の検出方法において用いることができる抗体が含まれる。
本発明の検出用キットには、検出対象のNTRK1融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のNTRK1融合タンパク質の検出用キットが含まれる。
本発明の検出用キットには、検出対象のLMNA融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のLMNA融合タンパク質の検出用キットが含まれる
本発明の検出対象のNTRK1融合遺伝子の検出用キット、又は、LMNA融合遺伝子の検出用キットには、本発明の検出方法においてFISH法フュージョンアッセイ又はFISH法スプリットアッセイに用いることのできるプローブ、あるいは、本発明の検出方法における検出対象のNTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドであり、かつ、増幅対象であるポリヌクレオチドの増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
また、本発明の検出対象のNTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質の検出用キットには、本発明の検出方法において用いることができる抗体が含まれる。
<プローブ>
本発明のNTRK1融合遺伝子の検出用キットは、NTRK1融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記NTRK1融合遺伝子を検出できるプローブを1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のLMNA融合遺伝子の検出用キットは、LMNA融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記LMNA融合遺伝子を検出できるプローブを1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のNTRK1融合遺伝子の検出用キットは、NTRK1融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記NTRK1融合遺伝子を検出できるプローブを1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のLMNA融合遺伝子の検出用キットは、LMNA融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記LMNA融合遺伝子を検出できるプローブを1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。
プローブとして、前述の≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか1種類以上のプローブが例示できる。
例えば、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子が、LMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、NTRK1遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上の(好ましくは2種類以上の)プローブ、又は、LMNA遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上の(好ましくは2種類以上の)プローブ、のいずれかのみを含んでも、NTRK1遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブ、及び、LMNA遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブ、の両方を含んでも、あるいは、NTRK1融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブ、又は、LMNA融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブを含んでもよい。
例えば、NTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子が、LMNA-NTRK1融合遺伝子の場合、NTRK1遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上の(好ましくは2種類以上の)プローブ、又は、LMNA遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上の(好ましくは2種類以上の)プローブ、のいずれかのみを含んでも、NTRK1遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブ、及び、LMNA遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブ、の両方を含んでも、あるいは、NTRK1融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブ、又は、LMNA融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブを含んでもよい。
<プライマーセット>
本発明のNTRK1融合遺伝子の検出用キットは、NTRK1融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、NTRK1融合遺伝子を検出できるプライマーセットを1セット、あるいは、2セット以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のLMNA融合遺伝子の検出用キットは、LMNA融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、LMNA融合遺伝子を検出できるプライマーセットを1セット、あるいは、2セット以上の組み合わせで含むことができる。
プライマーセットとして、前述の≪本発明の検出方法の態様≫又は≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか1種類以上のプライマーセットが例示できる。
本発明のNTRK1融合遺伝子の検出用キットは、NTRK1融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、NTRK1融合遺伝子を検出できるプライマーセットを1セット、あるいは、2セット以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のLMNA融合遺伝子の検出用キットは、LMNA融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、LMNA融合遺伝子を検出できるプライマーセットを1セット、あるいは、2セット以上の組み合わせで含むことができる。
プライマーセットとして、前述の≪本発明の検出方法の態様≫又は≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか1種類以上のプライマーセットが例示できる。
本発明のプライマーセットには、好ましくは、
(1)LMNAをコードする部分から設計されるセンスプライマー及びNTRK1をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でアニールする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でアニールする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなるプライマーセット、が含まれる。
(1)LMNAをコードする部分から設計されるセンスプライマー及びNTRK1をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でアニールする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でアニールする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなるプライマーセット、が含まれる。
また、前記プライマーセット(1)のより具体的な態様として、本発明のプライマーセットには、以下の(2)及び/又は(3)のプライマーセットが含まれる。
(2)配列番号1(LMNAex2-NTRK1ex11)の塩基番号1から513間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー(好ましくは配列番号6)及び配列番号1の塩基番号514から1653間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー(好ましくは配列番号7または配列番号8)のプライマーセット。
(3)配列番号9の塩基番号1から726の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー(好ましくは配列番号6)及び配列番号9の塩基番号727から1866間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー(好ましくは配列番号7または配列番号8)のプライマーセット。
なお、配列番号9で表されるポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1(LMNAex2-NTRK1ex11)で表される融合遺伝子の塩基配列について、さらにその非翻訳領域(untranslated region;UTR)をも含む塩基配列である。
これらのプライマーセット(1)~(3)においては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が1kb以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが1kb以下であることが好ましい。
また、本発明のプライマーは、通常、15~40塩基、好ましくは16~24塩基、更に好ましくは18~24塩基、特に好ましくは20~24塩基の鎖長を有する。
また、本発明のプライマーは、通常、15~40塩基、好ましくは16~24塩基、更に好ましくは18~24塩基、特に好ましくは20~24塩基の鎖長を有する。
本発明のプライマーセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを増幅及び検出するために用いることができる。また、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
<抗体>
本発明のNTRK1融合タンパク質の検出用キットには、NTRK1融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の<融合タンパク質の検出>に記載した抗体が例示できる。
本発明のLMNA融合タンパク質の検出用キットには、LMNA融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の<融合タンパク質の検出>に記載した抗体が例示できる。
例えば、NTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質が、LMNA-NTRK1融合タンパク質の場合、NTRK1タンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の(好ましくは2種類以上の)抗体、又は、LMNAタンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の(好ましくは2種類以上の)抗体、のいずれかのみを含んでも、NTRK1タンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の抗体、及び、LMNAタンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の抗体、の両方を含んでも、あるいは、NTRK1融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドに結合する1種類以上の抗体、又は、LMNA融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドに結合する1種類以上の抗体を含んでもよい。
本発明のNTRK1融合タンパク質の検出用キットには、NTRK1融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の<融合タンパク質の検出>に記載した抗体が例示できる。
本発明のLMNA融合タンパク質の検出用キットには、LMNA融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の<融合タンパク質の検出>に記載した抗体が例示できる。
例えば、NTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質が、LMNA-NTRK1融合タンパク質の場合、NTRK1タンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の(好ましくは2種類以上の)抗体、又は、LMNAタンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の(好ましくは2種類以上の)抗体、のいずれかのみを含んでも、NTRK1タンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の抗体、及び、LMNAタンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の抗体、の両方を含んでも、あるいは、NTRK1融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドに結合する1種類以上の抗体、又は、LMNA融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドに結合する1種類以上の抗体を含んでもよい。
≪阻害物質のスクリーニング方法≫
<ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングする工程>
本発明の、阻害物質のスクリーニング方法は、前記検出対象ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングすることができ、
(1)検出対象ポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(2)前記ポリペプチドが阻害されるか否かを分析する工程、及び
(3)前記ポリペプチドを阻害する物質を選択する工程
を含む。
<ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングする工程>
本発明の、阻害物質のスクリーニング方法は、前記検出対象ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングすることができ、
(1)検出対象ポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(2)前記ポリペプチドが阻害されるか否かを分析する工程、及び
(3)前記ポリペプチドを阻害する物質を選択する工程
を含む。
本明細書において、「ポリペプチドの阻害」には、ポリペプチドの活性の阻害と、ポリペプチドの発現の阻害とが含まれる。また、「阻害」は、少なくとも一部の阻害を意味する。
<阻害物質スクリーニング工程とその指標>
本発明のスクリーニング方法には、
(A)精製又は粗製のポリペプチドを用いて、インビトロでポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
(B)ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
(C)ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの発現阻害を指標とする方法
が含まれる。
本発明のスクリーニング方法には、
(A)精製又は粗製のポリペプチドを用いて、インビトロでポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
(B)ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
(C)ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの発現阻害を指標とする方法
が含まれる。
〔(A)精製又は粗製ポリペプチドを用い、活性阻害を指標とする方法〕
前記方法(A)には、インビトロでポリペプチドに試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照(試験物質を接触させなかったポリペプチド)と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
インビトロにおけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するADP量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。
前記方法(A)には、インビトロでポリペプチドに試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照(試験物質を接触させなかったポリペプチド)と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
インビトロにおけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するADP量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。
〔(B)ポリペプチド発現細胞を用い、活性阻害を指標とする方法〕
前記方法(B)には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照(試験物質を接触させなかった細胞)と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するADP量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。
前記方法(B)には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照(試験物質を接触させなかった細胞)と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するADP量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。
〔(C)ポリペプチド発現細胞を用い、発現阻害を指標とする方法〕
前記方法(C)には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの発現が阻害されたか否かを、対照(試験物質を接触させなかった細胞)と比較して分析する工程、ポリペプチドの発現を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチドの発現は、タンパク質又はmRNAの量を測定することにより分析することができる。タンパク質量の測定には、例えば、ELISA法、イムノブロット法を用いることができ、mRNA量の測定には、例えば、RT-PCR法、ノーザンブロット法を用いることができる。
前記方法(C)には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの発現が阻害されたか否かを、対照(試験物質を接触させなかった細胞)と比較して分析する工程、ポリペプチドの発現を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチドの発現は、タンパク質又はmRNAの量を測定することにより分析することができる。タンパク質量の測定には、例えば、ELISA法、イムノブロット法を用いることができ、mRNA量の測定には、例えば、RT-PCR法、ノーザンブロット法を用いることができる。
ここで、NTRK1融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、NTRK1融合体陽性のがんの治療薬又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がNTRK1融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。
また、LMNA融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、LMNA融合体陽性のがんの治療薬又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がLMNA融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。
また、LMNA融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、LMNA融合体陽性のがんの治療薬又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がLMNA融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。
前記確認工程は、公知の評価系を用いて実施することができ、例えば、培養細胞を用いるインビトロ評価系、腫瘍細胞を移植した担がんモデル動物を用いる評価系などを挙げることができる。
前記ポリペプチド発現細胞は、本発明のポリヌクレオチドを、常法にしたがって、所望の細胞に導入することで得ることもできる(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Edition(2012)、Cold Spring Harbor Laboratory Press参照)。具体的には、例えば、本発明のNTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子であるcDNAを、組換えベクターに導入し、これをさらに細胞に導入することで、前記ポリペプチド発現細胞(形質転換細胞)を得ることができる。
前記ポリペプチド発現細胞は、本発明のポリヌクレオチドを、常法にしたがって、所望の細胞に導入することで得ることもできる(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Edition(2012)、Cold Spring Harbor Laboratory Press参照)。具体的には、例えば、本発明のNTRK1融合遺伝子又はLMNA融合遺伝子であるcDNAを、組換えベクターに導入し、これをさらに細胞に導入することで、前記ポリペプチド発現細胞(形質転換細胞)を得ることができる。
≪阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物≫
本発明の、NTRK1融合体陽性のがん(例えば、消化器がん)の治療用医薬組成物は、NTRK1融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質(例えば、低分子化合物、二重鎖核酸(siRNAを含む)、タンパク質(抗体又は抗体断片を含む)、ペプチド、又はそれ以外の化合物)を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
本発明のLMNA融合体陽性のがんの治療用医薬組成物は、LMNA融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質(例えば、低分子化合物、二重鎖核酸(siRNAを含む)、タンパク質(抗体又は抗体断片を含む)、ペプチド、又はそれ以外の化合物)を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
本発明の、NTRK1融合体陽性のがん(例えば、消化器がん)の治療用医薬組成物は、NTRK1融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質(例えば、低分子化合物、二重鎖核酸(siRNAを含む)、タンパク質(抗体又は抗体断片を含む)、ペプチド、又はそれ以外の化合物)を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
本発明のLMNA融合体陽性のがんの治療用医薬組成物は、LMNA融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質(例えば、低分子化合物、二重鎖核酸(siRNAを含む)、タンパク質(抗体又は抗体断片を含む)、ペプチド、又はそれ以外の化合物)を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
<NTRK1融合遺伝子又は転写産物、あるいは、LMNA融合遺伝子又は転写産物に対する阻害物質>
NTRK1融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、キナーゼ阻害剤、例えば、NTRK1阻害物質、又は、NTRK1遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子又はその転写物質に対する阻害物質を挙げることができる。
LMNA融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、LMNA遺伝子又はその転写物質、あるいは、LMNA遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子の少なくともいずれか一方に対する阻害物質を挙げることができる。例えば、前記もう一方の遺伝子がNTRK1遺伝子の場合、阻害物質としてキナーゼ阻害剤を例示できる。
NTRK1融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、キナーゼ阻害剤、例えば、NTRK1阻害物質、又は、NTRK1遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子又はその転写物質に対する阻害物質を挙げることができる。
LMNA融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、LMNA遺伝子又はその転写物質、あるいは、LMNA遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子の少なくともいずれか一方に対する阻害物質を挙げることができる。例えば、前記もう一方の遺伝子がNTRK1遺伝子の場合、阻害物質としてキナーゼ阻害剤を例示できる。
〔低分子化合物〕
前記阻害物質のうち、低分子化合物の具体例としては、AG879(CAS148741-30-4)、国際公開公報WO2008/045627、WO2008/073480に記載の化合物等を挙げることができる。
前記阻害物質のうち、低分子化合物の具体例としては、AG879(CAS148741-30-4)、国際公開公報WO2008/045627、WO2008/073480に記載の化合物等を挙げることができる。
また、LMNA-NTRK1融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、例えば、BIBF1120(Selleck Chemicals LLS)、CEP701(Calbiochem(登録商標)(Merck KGaA))、フォレチニブ(Selleck Chemicals LLS)を挙げることができる。
〔二重鎖核酸〕
二重鎖核酸は、二重鎖の核酸(RNA又はDNA)部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の3’末端のオーバーハングとからなり、RNAiを誘導する。RNAiは進化的に保存された現象で、RNaseIIIエンドヌクレアーゼによって生じる21~23塩基の二重鎖核酸を介して起こる(Genes Dev. 15, 485-490, 2001)。3’側のオーバーハングはそれぞれ1又は2塩基の任意の核酸であるが、2塩基が好ましい。なお、前記塩基数(21~23塩基)は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。
二重鎖核酸は、二重鎖の核酸(RNA又はDNA)部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の3’末端のオーバーハングとからなり、RNAiを誘導する。RNAiは進化的に保存された現象で、RNaseIIIエンドヌクレアーゼによって生じる21~23塩基の二重鎖核酸を介して起こる(Genes Dev. 15, 485-490, 2001)。3’側のオーバーハングはそれぞれ1又は2塩基の任意の核酸であるが、2塩基が好ましい。なお、前記塩基数(21~23塩基)は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。
二重鎖核酸の3’側オーバーハングを構成するリボ核酸としては、例えば、U(ウリジン)、A(アデノシン)、G(グアノシン)、又はC(シチジン)を用いることができ、3’側のオーバーハングを構成するデオキシリボ核酸としては、例えば、dT(デオキシチミジン)、dA(デオキシアデノシン)、dG(デオキシグアノシン)、又はdC(デオキシシチジン)を用いることができる。
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる二重鎖核酸は、NTRK1融合遺伝子に対する阻害作用又はLMNA融合遺伝子に対する阻害作用を有するものであれば、特に限定されない。例えば、二重鎖部分が融合点を含むポリヌクレオチドの塩基配列、例えば、配列番号1の第513番~第514番を含む塩基配列に基づいて設計することができる。あるいは、二重鎖部分が、キナーゼ部分をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。本発明の二重鎖核酸は、常法(例えば、J. Am. Chem. Soc., 120, 11820-11821, 1998; 及びMethods, 23, 206-217, 2001)により製造することができる。また、二重鎖核酸を委託製造する会社(例えば、RNAi社)は、当業者によく知られており、二重鎖核酸の製造に利用できる。また、siRNA配列設計システム(商用siDirect(登録商標)、RNAi社)により、二重鎖核酸を設計することができる。
〔タンパク質・抗体〕
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる抗体は、NTRK1融合遺伝子の転写産物又はLMNA遺伝子の転写産物、好ましくは、LMNA-NTRK1遺伝子の転写産物を阻害するものであれば、限定されない。例えば、NTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質の活性、好ましくはキナーゼ活性を阻害するものが挙げられる。
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる抗体は、NTRK1融合遺伝子の転写産物又はLMNA遺伝子の転写産物、好ましくは、LMNA-NTRK1遺伝子の転写産物を阻害するものであれば、限定されない。例えば、NTRK1融合タンパク質又はLMNA融合タンパク質の活性、好ましくはキナーゼ活性を阻害するものが挙げられる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
[実施例1]臨床検体でのNTRK1遺伝子異常のFISH法による検出
目的遺伝子の5’末端側領域及び3’末端側領域を異なる色素で染め、遺伝子の転座又は逆位等を観察する方法が知られている。FISH法の一種であるこの方法はスプリットアッセイ(split assay)と呼ばれている。スプリットアッセイでは、染色体転座又は逆位等を調べたい目的遺伝子の5’末端側領域及び3’末端側領域のそれぞれを異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、テキサスレッド(TexasRed)(赤)標識及びFITC(緑)標識した2種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合(融合遺伝子が構築されていない場合)は1つの黄色のシグナル(緑色と赤色のシグナルが近傍に存在している状態)として検出され、転座又は逆位等が起きている場合は、緑色と赤色のシグナルが孤在性に検出される。
目的遺伝子の5’末端側領域及び3’末端側領域を異なる色素で染め、遺伝子の転座又は逆位等を観察する方法が知られている。FISH法の一種であるこの方法はスプリットアッセイ(split assay)と呼ばれている。スプリットアッセイでは、染色体転座又は逆位等を調べたい目的遺伝子の5’末端側領域及び3’末端側領域のそれぞれを異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、テキサスレッド(TexasRed)(赤)標識及びFITC(緑)標識した2種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合(融合遺伝子が構築されていない場合)は1つの黄色のシグナル(緑色と赤色のシグナルが近傍に存在している状態)として検出され、転座又は逆位等が起きている場合は、緑色と赤色のシグナルが孤在性に検出される。
臨床検体でのNTRK1遺伝子異常をFISH法スプリットアッセイで検出した。手術により摘出され、20%ホルマリンで固定化されパラフィンに包埋された大腸がん組織を4μmの厚さで切り、スライドガラス上に乗せ病理切片を作製した。FISH法は文献(Takeuchi K, Choi YL, Soda M, Inamura K, Togashi Y, Hatano S, Enomoto M, Takada S, Yamashita Y, Satoh Y, Okumura S, Nakagawa K, Ishikawa Y, Mano H. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008;14:6618-6624.)の方法に従い行った。作製した未染色の切片は、Histology FISHアクセサリーキット(Dako社)で処理し、続いて、緑(FITC)の蛍光標識したNTRK1遺伝子5’末端側領域をカバーするBAC(bacterial artificial chromosome)クローン(クローン番号 CTD-2562B9)と、赤(TexasRed)の蛍光標識したNTRK1遺伝子3’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 CTD-2219E19)とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて4,6-ジアミノ-2-フェニルインドール(4,6-diamino-2-phenylindole)で染色を行った。蛍光観察は蛍光顕微鏡BX51(Olympus社)を使用した。緑と赤のシグナルが離れて観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。約1500例の病理検体での検討から1例のNTRK1遺伝子領域のゲノム構造異常を示唆する検体(結腸がん患者由来)を見出した。
[実施例2]臨床検体でのNTRK1融合ポリヌクレオチド遺伝子の同定
FISH法解析によりNTRK1ゲノム構造異常が示唆された組織由来のRNAをテンプレートに5’-RACEキット(SMARTer(TM) RACE cDNA Amplification Kit; Clonetech社)のプロトコールに従い、NTRK1遺伝子キナーゼ領域の5’側に存在する遺伝子を調べた。具体的には、ファーストストランドcDNA(1st strand cDNA)合成は、臨床検体由来のRNA0.5μgとNTRK1遺伝子キナーゼコード領域に設計したリバースプライマー(配列番号3)を用いて行った。5’-RACE(rapid amplification of cDNA ends)PCRは、キットに含まれるUPMプライマー及びリバースプライマー(配列番号3)を用いてDNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold(R);ライフテクノロジーズジャパン株式会社)によるPCR反応を行った。
本RACE産物を電気泳動し、1-2kbp付近のDNA断片を精製し、常法に従いTAクローニング後にシーケンス解析した。その結果、LMNA遺伝子の一部がNTRK1遺伝子キナーゼ領域の5’側に融合していることが明らかとなった。
FISH法解析によりNTRK1ゲノム構造異常が示唆された組織由来のRNAをテンプレートに5’-RACEキット(SMARTer(TM) RACE cDNA Amplification Kit; Clonetech社)のプロトコールに従い、NTRK1遺伝子キナーゼ領域の5’側に存在する遺伝子を調べた。具体的には、ファーストストランドcDNA(1st strand cDNA)合成は、臨床検体由来のRNA0.5μgとNTRK1遺伝子キナーゼコード領域に設計したリバースプライマー(配列番号3)を用いて行った。5’-RACE(rapid amplification of cDNA ends)PCRは、キットに含まれるUPMプライマー及びリバースプライマー(配列番号3)を用いてDNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold(R);ライフテクノロジーズジャパン株式会社)によるPCR反応を行った。
本RACE産物を電気泳動し、1-2kbp付近のDNA断片を精製し、常法に従いTAクローニング後にシーケンス解析した。その結果、LMNA遺伝子の一部がNTRK1遺伝子キナーゼ領域の5’側に融合していることが明らかとなった。
[実施例3]臨床検体でのLMNA-NTRK1融合ポリヌクレオチド遺伝子の単離
FISH法解析によりNTRK1ゲノム構造異常が示唆され、融合する遺伝子が同定された大腸がん臨床検体由来のcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(PrimeStar HS DNAポリメラーゼ)を用いてPCRを行い、増幅産物をpT7Blue-2にクローニングした。プライマーセットとしては、フォワードプライマーlmna/ntrk1-A128-F(配列番号4)とリバースプライマーlmna/ntrk1-2034A-R(配列番号5)との組合せを用いた。
得られた増幅産物の配列を確認した結果、LMNA遺伝子の開始コドンATGからエクソン2までとNTRK1遺伝子のエクソン11からエクソン17の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド(LMNAex2-NTRK1ex11;配列番号1)が取得できた。
FISH法解析によりNTRK1ゲノム構造異常が示唆され、融合する遺伝子が同定された大腸がん臨床検体由来のcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(PrimeStar HS DNAポリメラーゼ)を用いてPCRを行い、増幅産物をpT7Blue-2にクローニングした。プライマーセットとしては、フォワードプライマーlmna/ntrk1-A128-F(配列番号4)とリバースプライマーlmna/ntrk1-2034A-R(配列番号5)との組合せを用いた。
得られた増幅産物の配列を確認した結果、LMNA遺伝子の開始コドンATGからエクソン2までとNTRK1遺伝子のエクソン11からエクソン17の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド(LMNAex2-NTRK1ex11;配列番号1)が取得できた。
なお、LMNAex2-NTRK1ex11がコードするアミノ酸配列(配列番号2)に関して、NTRK1の登録アミノ酸配列(Ensemble database, Protein ID: ENSP00000431418)との比較により、G226Dのアミノ酸置換が認められた。なお、前記アミノ酸置換において、最初のアミノ酸「G」は登録アミノ酸配列におけるアミノ酸を、その後のアミノ酸番号「226」は配列番号2におけるアミノ酸番号を、最後のアミノ酸「D」は配列番号2で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸を、それぞれ、意味する。
上記アミノ酸置換について、NTRK1-007の登録アミノ酸配列(Ensemble database, Protein ID: ENSP00000431418)における相当箇所のアミノ酸番号で示した場合、前記G226Dは、G472Dと表すことができる。LMNAex2-NTRK1ex11がコードするアミノ酸配列(配列番号2)を、G472Dアミノ酸置換にちなんでLMNA-NTRK1(G472D)と称することがある。
上記アミノ酸置換について、NTRK1-007の登録アミノ酸配列(Ensemble database, Protein ID: ENSP00000431418)における相当箇所のアミノ酸番号で示した場合、前記G226Dは、G472Dと表すことができる。LMNAex2-NTRK1ex11がコードするアミノ酸配列(配列番号2)を、G472Dアミノ酸置換にちなんでLMNA-NTRK1(G472D)と称することがある。
[実施例4]LMNA-NTRK1融合遺伝子の検出
表1に示すプライマーを用いて、融合部を含む領域を直接増幅するRT-PCRで融合遺伝子の検出を行い、融合遺伝子cDNAががん組織に存在していることを示した。具体的には、検体由来RNAテンプレートに対して、LMNA遺伝子上に設計したフォワードプライマーlmna-131-F(配列番号6)と、NTRK1遺伝子上に設計したリバースプライマーntrk1-1455-R(配列番号7)又はntrk1-1350-R(配列番号8)とを使用してPCRを行った。増幅産物を電気泳動したところ、それぞれのプライマー設定位置から予想されるサイズのバンド(762bp、658bp)が観察され、臨床検体を用いた融合遺伝子の検出が、これらの遺伝子上にプライマーを設計することによって可能であることが示された。
表1に示すプライマーを用いて、融合部を含む領域を直接増幅するRT-PCRで融合遺伝子の検出を行い、融合遺伝子cDNAががん組織に存在していることを示した。具体的には、検体由来RNAテンプレートに対して、LMNA遺伝子上に設計したフォワードプライマーlmna-131-F(配列番号6)と、NTRK1遺伝子上に設計したリバースプライマーntrk1-1455-R(配列番号7)又はntrk1-1350-R(配列番号8)とを使用してPCRを行った。増幅産物を電気泳動したところ、それぞれのプライマー設定位置から予想されるサイズのバンド(762bp、658bp)が観察され、臨床検体を用いた融合遺伝子の検出が、これらの遺伝子上にプライマーを設計することによって可能であることが示された。
[実施例5]臨床検体でのLMNA-NTRK1融合遺伝子のFISH法フュージョンアッセイによる検出
融合遺伝子がゲノム上で融合していることを確認するため、FISH法フュージョンアッセイにて検出を行った。
融合遺伝子がゲノム上で融合していることを確認するため、FISH法フュージョンアッセイにて検出を行った。
FISH法フュージョンアッセイでは染色体転座又は逆位等によって近接する二つの目的遺伝子領域を異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、TexasRed(赤)標識及びFITC(緑)標識した2種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合(融合遺伝子が構築されていない場合)は赤と緑はそれぞれのシグナル(赤色と緑色のシグナルが離れて存在している状態)として検出され、転座又は逆位等が起きることにより2つの遺伝子領域が近接している場合は、赤色と緑色のシグナルが重なり黄色として検出される。
具体的には、赤(TexasRed)蛍光標識をした、LMNA遺伝子5’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 RP11-838A18)と、緑(FITC)の蛍光標識したNTRK1遺伝子3’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 CTD-2562B9)との組み合わせを使用した。
蛍光観察は蛍光顕微鏡BX51(Olympus社)を使用した。実施例4において融合遺伝子が陽性であった病理切片上でのフュージョンアッセイの結果、LMNA遺伝子5’末端側領域とNTRK1遺伝子3’末端側領域との近接したシグナル(黄)が観察され、融合遺伝子が染色体転座又は逆位等により生成されたことが確かめられた。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。
具体的には、赤(TexasRed)蛍光標識をした、LMNA遺伝子5’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 RP11-838A18)と、緑(FITC)の蛍光標識したNTRK1遺伝子3’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 CTD-2562B9)との組み合わせを使用した。
蛍光観察は蛍光顕微鏡BX51(Olympus社)を使用した。実施例4において融合遺伝子が陽性であった病理切片上でのフュージョンアッセイの結果、LMNA遺伝子5’末端側領域とNTRK1遺伝子3’末端側領域との近接したシグナル(黄)が観察され、融合遺伝子が染色体転座又は逆位等により生成されたことが確かめられた。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。
[実施例6]臨床検体でのLMNA遺伝子又はNTRK1遺伝子のFISH法スプリットアッセイによる検出
実施例1に記載の方法にしたがい、LMNA遺伝子又はNTRK1遺伝子のFISH法スプリットアッセイを実施した。病理切片の作製は、実施例1と同様に実施した。作製した未染色の切片は、Histology FISHアクセサリーキット(Dako社)で処理した。
実施例1に記載の方法にしたがい、LMNA遺伝子又はNTRK1遺伝子のFISH法スプリットアッセイを実施した。病理切片の作製は、実施例1と同様に実施した。作製した未染色の切片は、Histology FISHアクセサリーキット(Dako社)で処理した。
NTRK1遺伝子を対象としたスプリットアッセイの場合、赤(TexasRed)の蛍光標識をした、NTRK1遺伝子5’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 CTD-2219E19)と、緑(FITC)の蛍光標識をした、NTRK1遺伝子3’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 CTD-2562B9)とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて4,6-ジアミノ-2-フェニルインドール(4,6-diamino-2-phenylindole)で染色を行った。
蛍光観察は蛍光顕微鏡BX51(Olympus社)を使用した。実施例4において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、3’側のシグナル(本実施例では赤)が孤在性に観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。
蛍光観察は蛍光顕微鏡BX51(Olympus社)を使用した。実施例4において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、3’側のシグナル(本実施例では赤)が孤在性に観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。
LMNA遺伝子を対象としたスプリットアッセイの場合、緑(FITC)の蛍光標識をした、LMNA遺伝子5’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 RP11-838A18)と、赤(TexasRed)の蛍光標識をした、LMNA遺伝子3’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 RP11-16C15)とを用いた染色により、5’側のシグナル(本実施例では緑)が孤在性に観察される結果を得ることができる。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。
[実施例7]臨床検体でのLMNA-NTRK1融合遺伝子のFISH法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイの組み合わせによる検出
FISH法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイを、同一の病理切片に対しておこなった。病理切片の作製は、実施例1と同様に実施した。作製した未染色の切片は、Histology FISHアクセサリーキット(Dako社)で処理した。
FISH法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイを、同一の病理切片に対しておこなった。病理切片の作製は、実施例1と同様に実施した。作製した未染色の切片は、Histology FISHアクセサリーキット(Dako社)で処理した。
具体的には、青(Aqua)の蛍光標識をしたLMNA遺伝子5’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 RP11-838A18)と、赤(TexasRed)の蛍光標識をした、NTRK1遺伝子5’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 CTD-2219E19)と、緑(FITC)の蛍光標識をした、NTRK1遺伝子3’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 CTD-2562B9)とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて4,6-ジアミノ-2-フェニルインドール(4,6-diamino-2-phenylindole)で染色を行った。
蛍光観察は蛍光顕微鏡BX51(Olympus社)を使用した。実施例4において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、LMNA遺伝子5’末端側領域とNTRK1遺伝子3’末端側領域との近接したシグナル(青緑)と、このシグナルから離れた孤在性のNTRK1遺伝子5’末端側のシグナル(赤)が観察され、融合遺伝子の生成を伴うゲノム構造異常が示された。よって、この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使用できる。
蛍光観察は蛍光顕微鏡BX51(Olympus社)を使用した。実施例4において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、LMNA遺伝子5’末端側領域とNTRK1遺伝子3’末端側領域との近接したシグナル(青緑)と、このシグナルから離れた孤在性のNTRK1遺伝子5’末端側のシグナル(赤)が観察され、融合遺伝子の生成を伴うゲノム構造異常が示された。よって、この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使用できる。
特に、LMNAとNTRK1のように、融合遺伝子を構成する遺伝子同士が同一染色体上の近い距離に位置する場合、フュージョンアッセイだけでは、遺伝子転座等が起きていないにも関わらず、LMNA遺伝子5’末端側領域とNTRK1遺伝子3’末端側領域が近いために、見る角度等によっては、近接したシグナル(青緑)が観察され、偽陽性の判定が生じる恐れがある。その際、NTRK1遺伝子5’末端側のシグナル(赤)が、LMNA遺伝子5’末端側領域とNTRK1遺伝子3’末端側領域とが近接したシグナル(青緑)が観察される部位に近接していないことを確認することにより、偽陽性の判定を回避できる点で、本手法は好適である。
[実施例8]LMNA-NTRK1融合ポリペプチドの腫瘍形成能の検討
本実施例では、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドをコードするcDNAとして、2種類のcDNA、すなわち、実施例3において大腸がん臨床検体から取得した配列番号1のLMNAex2-NTRK1ex11(以下、G472Dアミノ酸置換にちなんでLMNA-NTRK1(G472D)と称することがある)と、前記アミノ酸置換を元のアミノ酸「G」に置換した以外は同一配列からなるLMNAex2-NTRK1ex11(以下、LMNA-NTRK1(WT)と称することがある)とを使用して、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドの腫瘍形成能を検討した。各cDNAを発現ベクターpLenti6(Invitrogen(登録商標)(Life Technologies社))に挿入して得られたpLenti6-LMNA-NTRK1(G472D又はWT)をマウス繊維芽細胞株NIH3T3細胞に導入し10日間培養したところ、図1(LMNA-NTRK1(G472D)融合ポリペプチド発現)、図2(LMNA-NTRK1(WT)融合ポリペプチド発現)に示すように形質転換フォーカスが観察された。遺伝子導入試薬のみの処理をしたNIH3T3細胞(control(図3))及び、LacZを導入したNIH3T3細胞(図示せず)においては、形質転換フォーカスは認められなかった。すなわち、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドを発現するベクターを導入した場合に限り、形質転換フォーカスが観察された。
本実施例では、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドをコードするcDNAとして、2種類のcDNA、すなわち、実施例3において大腸がん臨床検体から取得した配列番号1のLMNAex2-NTRK1ex11(以下、G472Dアミノ酸置換にちなんでLMNA-NTRK1(G472D)と称することがある)と、前記アミノ酸置換を元のアミノ酸「G」に置換した以外は同一配列からなるLMNAex2-NTRK1ex11(以下、LMNA-NTRK1(WT)と称することがある)とを使用して、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドの腫瘍形成能を検討した。各cDNAを発現ベクターpLenti6(Invitrogen(登録商標)(Life Technologies社))に挿入して得られたpLenti6-LMNA-NTRK1(G472D又はWT)をマウス繊維芽細胞株NIH3T3細胞に導入し10日間培養したところ、図1(LMNA-NTRK1(G472D)融合ポリペプチド発現)、図2(LMNA-NTRK1(WT)融合ポリペプチド発現)に示すように形質転換フォーカスが観察された。遺伝子導入試薬のみの処理をしたNIH3T3細胞(control(図3))及び、LacZを導入したNIH3T3細胞(図示せず)においては、形質転換フォーカスは認められなかった。すなわち、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドを発現するベクターを導入した場合に限り、形質転換フォーカスが観察された。
LMNA-NTRK1(G472D)融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したNIH3T3細胞又は遺伝子導入試薬処理のみをおこなったNIH3T3細胞(control)をヌードマウスの皮下に1×106個ずつ接種したところ、14日以降には融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したNIH3T3細胞を接種したマウスにおいて腫瘍形成が確認された(図4)。遺伝子導入試薬処理のみをおこなったNIH3T3細胞(control)を接種したマウスにおいては、腫瘍形成は確認されなかった(図5)。接種6日目以降の両マウスにおける腫瘍サイズを図6に示す。
また、LMNA-NTRK1(G472D)融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したNIH3T3細胞と、LMNA-NTRK1(WT)融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したNIH3T3細胞との比較を行ったところ、LMNA-NTRK1(G472D)融合ポリペプチド(図7)又はLMNA-NTRK1(WT)融合ポリペプチド(図8)のいずれについても、腫瘍形成が確認された。接種6日目以降の両マウスにおける腫瘍サイズを図9に示す。
この結果より、G472Dのアミノ酸置換の有無にかかわらず、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドが腫瘍形成能を持っていたことから、LMNA-NTRK1融合ポリヌクレオチドは、がんの原因遺伝子であることが示された。
なお、全長のNTRK1ポリペプチドをコードするcDNAをNIH3T3細胞に導入したところ、G472DのSNPの有無にかかわらず、形質転換フォーカスは観察されず、全長のNTRK1ポリペプチドは腫瘍形成能を有しないことが確認された。
また、LMNA-NTRK1(G472D)融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したNIH3T3細胞と、LMNA-NTRK1(WT)融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したNIH3T3細胞との比較を行ったところ、LMNA-NTRK1(G472D)融合ポリペプチド(図7)又はLMNA-NTRK1(WT)融合ポリペプチド(図8)のいずれについても、腫瘍形成が確認された。接種6日目以降の両マウスにおける腫瘍サイズを図9に示す。
この結果より、G472Dのアミノ酸置換の有無にかかわらず、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドが腫瘍形成能を持っていたことから、LMNA-NTRK1融合ポリヌクレオチドは、がんの原因遺伝子であることが示された。
なお、全長のNTRK1ポリペプチドをコードするcDNAをNIH3T3細胞に導入したところ、G472DのSNPの有無にかかわらず、形質転換フォーカスは観察されず、全長のNTRK1ポリペプチドは腫瘍形成能を有しないことが確認された。
[実施例9]LMNA-NTRK1融合ポリペプチド発現細胞の各NTRK1阻害剤に対する感受性の検討
マウスリンパ系細胞株Ba/F3細胞は、増殖因子であるIL-3依存性細胞株であり、その増殖にIL-3を必要とするが、がん化遺伝子(例えば、チロシンキナーゼ融合遺伝子)を導入することにより、IL-3を添加しなくても増殖できるようになることが知られている(Daley GQ and Baltimore D. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Dec;85(23):9312-9316.)。
本実施例では、親株Ba/F3細胞及び実施例8で作製したpLenti6-LMNA-NTRK1(G472D又はWT)を導入したBa/F3細胞について、細胞数2000の状態から、所定濃度の各NTRK1阻害剤(BIBF1120、CEP701、フォレチニブ)を添加し、72時間培養した後の細胞数をカウントすることにより、各NTRK1阻害剤に対する感受性を検討した。より具体的な試験方法については、例えば、Katayamaらの文献(Katayama R et al., Sci Transl Med, 2012(4):120ra17)を参照することができる。
マウスリンパ系細胞株Ba/F3細胞は、増殖因子であるIL-3依存性細胞株であり、その増殖にIL-3を必要とするが、がん化遺伝子(例えば、チロシンキナーゼ融合遺伝子)を導入することにより、IL-3を添加しなくても増殖できるようになることが知られている(Daley GQ and Baltimore D. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Dec;85(23):9312-9316.)。
本実施例では、親株Ba/F3細胞及び実施例8で作製したpLenti6-LMNA-NTRK1(G472D又はWT)を導入したBa/F3細胞について、細胞数2000の状態から、所定濃度の各NTRK1阻害剤(BIBF1120、CEP701、フォレチニブ)を添加し、72時間培養した後の細胞数をカウントすることにより、各NTRK1阻害剤に対する感受性を検討した。より具体的な試験方法については、例えば、Katayamaらの文献(Katayama R et al., Sci Transl Med, 2012(4):120ra17)を参照することができる。
結果を図10に示す。コントロールである親株Ba/F3細胞(IL-3濃度=0.5ng/mL)では、各NTRK1阻害剤の濃度が細胞毒性を示す過剰量を超えない場合には、細胞増殖能に影響は認められなかった。一方、pLenti6-LMNA-NTRK1(G472D又はWT)を導入したBa/F3細胞(IL-3非添加)では、いずれのNTRK1阻害剤においても、濃度依存的に細胞増殖が顕著に抑制された。
この結果は、NTRK1阻害剤が、LMNA-NTRK1融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効であることを示すと同時に、pLenti6-LMNA-NTRK1を導入したBa/F3細胞を用いる本評価系が、当該融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするために用いることができることを示すものである。
この結果は、NTRK1阻害剤が、LMNA-NTRK1融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効であることを示すと同時に、pLenti6-LMNA-NTRK1を導入したBa/F3細胞を用いる本評価系が、当該融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするために用いることができることを示すものである。
[実施例10]LMNA-NTRK1融合ポリペプチド発現細胞における各NTRK1阻害剤によるLMNA-NTRK1融合ポリペプチドの自己リン酸化抑制の検討
実施例9で確認した、各NTRK1阻害剤によるLMNA-NTRK1(G472D又はWT)融合ポリペプチド発現細胞の増殖抑制が、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドのキナーゼ活性が阻害されたことによるものであることを確認するために、各NTRK1阻害剤で処理した各培養細胞由来抽出物のウェスタンブロッティングを行った。
LMNA-NTRK1(G472D)融合ポリペプチドの結果を図11に示す。抗体としては、抗リン酸化NTRK1抗体(図11におけるpNTRK1;pY674)、抗NTRK1抗体(図11のNTRK1を使用した。NTRK1のポリペプチド量については、各NTRK1阻害剤の処理の有無(及び処理濃度)に関してほとんど差異は認められなかった。一方、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドのリン酸化は、各NTRK1阻害剤による処理により、濃度依存的に顕著に減少しており、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドのキナーゼ活性が阻害されることにより、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドの自己リン酸化が抑制されることが確認された。
LMNA-NTRK1(WT)融合ポリペプチドにおいても、上記LMNA-NTRK1(G472D)融合ポリペプチドと同様の結果が得られた。結果の一部を図12に示す。
実施例9で確認した、各NTRK1阻害剤によるLMNA-NTRK1(G472D又はWT)融合ポリペプチド発現細胞の増殖抑制が、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドのキナーゼ活性が阻害されたことによるものであることを確認するために、各NTRK1阻害剤で処理した各培養細胞由来抽出物のウェスタンブロッティングを行った。
LMNA-NTRK1(G472D)融合ポリペプチドの結果を図11に示す。抗体としては、抗リン酸化NTRK1抗体(図11におけるpNTRK1;pY674)、抗NTRK1抗体(図11のNTRK1を使用した。NTRK1のポリペプチド量については、各NTRK1阻害剤の処理の有無(及び処理濃度)に関してほとんど差異は認められなかった。一方、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドのリン酸化は、各NTRK1阻害剤による処理により、濃度依存的に顕著に減少しており、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドのキナーゼ活性が阻害されることにより、LMNA-NTRK1融合ポリペプチドの自己リン酸化が抑制されることが確認された。
LMNA-NTRK1(WT)融合ポリペプチドにおいても、上記LMNA-NTRK1(G472D)融合ポリペプチドと同様の結果が得られた。結果の一部を図12に示す。
以上より、本発明において、一部の消化器がん患者においてLMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子が存在し、その遺伝子ががんの原因となっていることが明らかとなった。即ち、NTRK1阻害薬物治療の対象となるがん患者を、LMNA-NTRK1融合遺伝子を検出することで、好ましくは、LMNAex2-NTRK1ex11を検出することで選別できることが明らかとなった。
本発明の検出方法は、NTRK1融合体陽性のがん患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。本発明の阻害物質スクリーニング方法は、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするのに用いることができる。前記スクリーニングにより得られる薬剤は、当該融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができる。前記検出方法により、当該融合体陽性のがん患者と判定された患者に、前記薬剤を投与することにより、がんを治療することができる。
本発明の検出方法は、LMNA融合体陽性のがん患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。本発明の阻害物質スクリーニング方法は、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするのに用いることができる。前記スクリーニングにより得られる薬剤は、当該融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができる。前記検出方法により、当該融合体陽性のがん患者と判定された患者に、前記薬剤を投与することにより、がんを治療することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
配列表の配列番号3~8の配列で表される塩基配列は、合成プライマー配列である。
Claims (57)
- LMNA融合タンパク質。
- LMNAとNTRK1との融合タンパク質。
- 以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項1に記載の融合タンパク質:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - 請求項1~3のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項5に記載のベクターで形質転換された細胞。
- 被験者から得た試料中の、LMNA融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
- 前記検出方法が、LMNAタンパク質の切断、又は、LMNAタンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、請求項7に記載の検出方法。
- 前記検出方法が、LMNAタンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、請求項7に記載の検出方法。
- 前記融合タンパク質が、LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質である、請求項7~9のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記融合タンパク質が、以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項7~10のいずれか一項に記載の検出方法:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - 前記LMNA融合遺伝子が、請求項3に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項7~11のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記融合遺伝子が、DNA又はmRNAである、請求項7~12のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記試料が、消化器由来試料である、請求項7~13のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記消化器が、消化管由来試料である、請求項14に記載の検出方法。
- 前記消化器が、下部消化管である、請求項14に記載の検出方法。
- 前記消化器が、大腸である、請求項14に記載の検出方法。
- LMNA遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、LMNA遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、LMNA融合遺伝子の検出用キット。
- LMNA遺伝子と共にLMNA融合遺伝子を構成する他の遺伝子の3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、LMNA遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、LMNA融合遺伝子の検出用キット。
- LMNAタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA融合遺伝子の検出用キット。
- LMNAタンパク質とNTRK1タンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA融合遺伝子又はNTRK1融合遺伝子の検出用キット。
- 以下の(a)~(d)からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、LMNA融合遺伝子又はNTRK1融合遺伝子の検出用キット:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - LMNAタンパク質のN末端側領域を特異的に認識できる抗LMNA抗体、及び、LMNAタンパク質のC末端側領域を特異的に認識できる抗LMNA抗体を含む、LMNA融合タンパク質の検出用キット。
- LMNAタンパク質と共にLMNA融合タンパク質を構成する他のタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、LMNAタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、LMNA融合タンパク質の検出用キット。
- 前記他のタンパク質が、NTRK1タンパク質である、請求項24に記載のキット。
- LMNAタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びNTRK1タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは請求項22に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは請求項22に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
- LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
- 配列番号1の塩基番号1から568間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号569から2259間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号9の塩基番号1から726の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号9の塩基番号727から1866間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
- (1)請求項3に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(2)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
(3)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。 - 前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質が、LMNA融合体陽性のがんの治療剤である、請求項29に記載のスクリーニング方法。
- LMNA融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質を含有する、LMNA融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
- 前記LMNA融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、請求項31に記載の医薬組成物。
- 前記LMNA融合タンパク質が、請求項3に記載のポリペプチドである、請求項31又は32に記載の医薬組成物。
- 前記がんが消化器がんである、請求項31~33のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが消化管がんである、請求項31~33のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが下部消化管がんである、請求項31~33のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが大腸がんである、請求項31~33のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 被験者から得た消化器由来試料中の、NTRK1融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
- 前記検出方法が、NTRK1タンパク質の切断、又は、NTRK1タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、請求項38に記載の検出方法。
- 前記検出方法が、NTRK1タンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、請求項38に記載の検出方法。
- 前記融合遺伝子が、DNA又はmRNAである、請求項38~40のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記消化器が、消化管である、請求項38~41のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記消化器が、下部消化管である、請求項38~41のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記消化器が、大腸である、請求項38~41のいずれか一項に記載の検出方法。
- NTRK1遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、NTRK1遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
- NTRK1遺伝子と共にNTRK1融合遺伝子を構成する他の遺伝子の5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、NTRK1遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
- NTRK1タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、NTRK1融合遺伝子の検出用キット。
- NTRK1タンパク質のN末端側領域を特異的に認識できる抗NTRK1抗体、及び、NTRK1タンパク質のC末端側領域を特異的に認識できる抗NTRK1抗体を含む、NTRK1融合タンパク質の検出用キット。
- NTRK1タンパク質と共にNTRK1融合タンパク質を構成する他のタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、NTRK1タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、NTRK1融合タンパク質の検出用キット。
- 前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質が、NTRK1融合体陽性のがんの治療剤である、請求項29に記載のスクリーニング方法。
- NTRK1融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質を含有する、NTRK1融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
- 前記NTRK1融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、請求項51に記載の医薬組成物。
- 前記NTRK1融合タンパク質が、請求項3に記載のポリペプチドである、請求項51又は52に記載の医薬組成物。
- 前記がんが消化器がんである、請求項51~53のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが消化管がんである、請求項51~53のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが下部消化管がんである、請求項51~53のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが大腸がんである、請求項51~53のいずれか一項に記載の医薬組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015545258A JPWO2015064621A1 (ja) | 2013-10-29 | 2014-10-29 | 新規融合体及びその検出法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013-224561 | 2013-10-29 | ||
JP2013224561 | 2013-10-29 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2015064621A1 true WO2015064621A1 (ja) | 2015-05-07 |
Family
ID=53004221
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2014/078729 WO2015064621A1 (ja) | 2013-10-29 | 2014-10-29 | 新規融合体及びその検出法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2015064621A1 (ja) |
WO (1) | WO2015064621A1 (ja) |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017122815A1 (ja) * | 2016-01-15 | 2017-07-20 | 公益財団法人がん研究会 | 新規融合体及びその検出法 |
US10588908B2 (en) | 2016-04-04 | 2020-03-17 | Loxo Oncology, Inc. | Methods of treating pediatric cancers |
US10590139B2 (en) | 2008-09-22 | 2020-03-17 | Array Biopharma Inc. | Method of treatment using substituted imidazo[1,2b]pyridazine compounds |
US10647730B2 (en) | 2010-05-20 | 2020-05-12 | Array Biopharma Inc. | Macrocyclic compounds as TRK kinase inhibitors |
US10655186B2 (en) | 2015-10-26 | 2020-05-19 | Loxo Oncology, Inc. | Point mutations in TRK inhibitor-resistant cancer and methods relating to the same |
US10668072B2 (en) | 2016-04-04 | 2020-06-02 | Loxo Oncology, Inc. | Liquid formulations of (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-difluorophenyl)-pyrrolidin-1-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide |
US10688100B2 (en) | 2017-03-16 | 2020-06-23 | Array Biopharma Inc. | Macrocylic compounds as ROS1 kinase inhibitors |
US10758542B2 (en) | 2009-07-09 | 2020-09-01 | Array Biopharma Inc. | Substituted pyrazolo[l,5-a]pyrimidine compounds as Trk kinase inhibitors |
US10774085B2 (en) | 2008-10-22 | 2020-09-15 | Array Biopharma Inc. | Method of treatment using substituted pyrazolo[1,5-A] pyrimidine compounds |
US10799505B2 (en) | 2014-11-16 | 2020-10-13 | Array Biopharma, Inc. | Crystalline form of (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-difluorophenyl)-pyrrolidin-1-yl)-pyrazolo[1,5-A]pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide hydrogen sulfate |
US11091486B2 (en) | 2016-10-26 | 2021-08-17 | Array Biopharma, Inc | Process for the preparation of pyrazolo[1,5-a]pyrimidines and salts thereof |
US11214571B2 (en) | 2016-05-18 | 2022-01-04 | Array Biopharma Inc. | Process for the preparation of (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-difluorophenyl)pyrrolidin-1-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide and salts thereof |
CN114848848A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-08-05 | 重庆文理学院 | 一种逆转非小细胞肺癌耐药性的基因药物 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009100783A (ja) * | 2006-10-11 | 2009-05-14 | Astellas Pharma Inc | Eml4−alk融合遺伝子 |
WO2011043220A1 (ja) * | 2009-10-06 | 2011-04-14 | 富士レビオ株式会社 | 融合遺伝子の測定方法 |
WO2013059740A1 (en) * | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Foundation Medicine, Inc. | Novel alk and ntrk1 fusion molecules and uses thereof |
WO2014071419A2 (en) * | 2012-11-05 | 2014-05-08 | Foundation Medicine, Inc. | Novel fusion molecules and uses thereof |
-
2014
- 2014-10-29 WO PCT/JP2014/078729 patent/WO2015064621A1/ja active Application Filing
- 2014-10-29 JP JP2015545258A patent/JPWO2015064621A1/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009100783A (ja) * | 2006-10-11 | 2009-05-14 | Astellas Pharma Inc | Eml4−alk融合遺伝子 |
WO2011043220A1 (ja) * | 2009-10-06 | 2011-04-14 | 富士レビオ株式会社 | 融合遺伝子の測定方法 |
WO2013059740A1 (en) * | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Foundation Medicine, Inc. | Novel alk and ntrk1 fusion molecules and uses thereof |
WO2014071419A2 (en) * | 2012-11-05 | 2014-05-08 | Foundation Medicine, Inc. | Novel fusion molecules and uses thereof |
Cited By (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10590139B2 (en) | 2008-09-22 | 2020-03-17 | Array Biopharma Inc. | Method of treatment using substituted imidazo[1,2b]pyridazine compounds |
US11267818B2 (en) | 2008-10-22 | 2022-03-08 | Array Biopharma Inc. | Method of treatment using substituted pyrazolo[1,5-a] pyrimidine compounds |
US10774085B2 (en) | 2008-10-22 | 2020-09-15 | Array Biopharma Inc. | Method of treatment using substituted pyrazolo[1,5-A] pyrimidine compounds |
US10758542B2 (en) | 2009-07-09 | 2020-09-01 | Array Biopharma Inc. | Substituted pyrazolo[l,5-a]pyrimidine compounds as Trk kinase inhibitors |
US10647730B2 (en) | 2010-05-20 | 2020-05-12 | Array Biopharma Inc. | Macrocyclic compounds as TRK kinase inhibitors |
US10813936B2 (en) | 2014-11-16 | 2020-10-27 | Array Biopharma, Inc. | Crystalline form of (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-difluorophenyl)-pyrrolidin-1-YL)-pyrazolo[1,5-A]pyrimidin-3-YL)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide hydrogen sulfate |
US10799505B2 (en) | 2014-11-16 | 2020-10-13 | Array Biopharma, Inc. | Crystalline form of (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-difluorophenyl)-pyrrolidin-1-yl)-pyrazolo[1,5-A]pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide hydrogen sulfate |
US10655186B2 (en) | 2015-10-26 | 2020-05-19 | Loxo Oncology, Inc. | Point mutations in TRK inhibitor-resistant cancer and methods relating to the same |
US10907215B2 (en) | 2015-10-26 | 2021-02-02 | Loxo Oncology, Inc. | Point mutations in TRK inhibitor-resistant cancer and methods relating to the same |
US10724102B2 (en) | 2015-10-26 | 2020-07-28 | Loxo Oncology, Inc. | Point mutations in TRK inhibitor-resistant cancer and methods relating to the same |
WO2017122815A1 (ja) * | 2016-01-15 | 2017-07-20 | 公益財団法人がん研究会 | 新規融合体及びその検出法 |
US10668072B2 (en) | 2016-04-04 | 2020-06-02 | Loxo Oncology, Inc. | Liquid formulations of (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-difluorophenyl)-pyrrolidin-1-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide |
US11191766B2 (en) | 2016-04-04 | 2021-12-07 | Loxo Oncology, Inc. | Methods of treating pediatric cancers |
US10588908B2 (en) | 2016-04-04 | 2020-03-17 | Loxo Oncology, Inc. | Methods of treating pediatric cancers |
US11484535B2 (en) | 2016-04-04 | 2022-11-01 | Loxo Oncology, Inc. | Liquid formulations of (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-difluorophenyl)-pyrrolidin-1-yl)-pyrazolo[1,5-a] pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide |
US11214571B2 (en) | 2016-05-18 | 2022-01-04 | Array Biopharma Inc. | Process for the preparation of (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-difluorophenyl)pyrrolidin-1-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide and salts thereof |
US11091486B2 (en) | 2016-10-26 | 2021-08-17 | Array Biopharma, Inc | Process for the preparation of pyrazolo[1,5-a]pyrimidines and salts thereof |
US10688100B2 (en) | 2017-03-16 | 2020-06-23 | Array Biopharma Inc. | Macrocylic compounds as ROS1 kinase inhibitors |
US10966985B2 (en) | 2017-03-16 | 2021-04-06 | Array Biopharma Inc. | Macrocyclic compounds as ROS1 kinase inhibitors |
CN114848848A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-08-05 | 重庆文理学院 | 一种逆转非小细胞肺癌耐药性的基因药物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2015064621A1 (ja) | 2017-03-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2015064621A1 (ja) | 新規融合体及びその検出法 | |
JP6871869B2 (ja) | 新規融合体及びその検出法 | |
JP6534930B2 (ja) | Ntrk3融合体の検出法 | |
US9216172B2 (en) | Method for determining effectiveness of cancer treatment by assessing the presence of a KIF5B-RET chimeric gene | |
JP6493681B2 (ja) | 肺がんで見出された新規融合遺伝子 | |
KR102106962B1 (ko) | 신규 fgfr3 융합체 | |
JP5861244B2 (ja) | 新規ros1融合体の検出法 | |
WO2013141266A1 (ja) | 新規ret融合体の検出法 | |
US20130137111A1 (en) | Detection method of novel ret fusion | |
US12055538B2 (en) | Fusions and method for detecting same | |
WO2022244807A1 (ja) | Ltk融合遺伝子 | |
JP6806440B2 (ja) | 新規融合体及びその検出法 | |
JP6731254B2 (ja) | 新規融合体及びその検出法 | |
JP7410480B2 (ja) | がんにおける融合遺伝子 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 14856869 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2015545258 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 14856869 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |